BR112012001152B1

BR112012001152B1 - polinucleotídeos, polipeptídeos, e métodos para a produção de ácido láctico, piruvato, succinato, formato, acetato, etanol, acetoína ou 2,3-butanodiol, e para a construção de uma cepa de bacillus moderadamente termofílica capaz de crescer entre 37 °c e 65 °c e de utilizar sacarose como uma fonte de carbono

Info

Publication number: BR112012001152B1
Application number: BR112012001152-9A
Authority: BR
Inventors: Richard Van Kranenburg; Mariska Van Hartskamp
Original assignee: Purac Biochem B.V
Priority date: 2009-07-17
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2020-12-01
Also published as: DK2275436T3; JP6055064B2; JP2012533287A; EP2275436A1; ES2394749T3; US8663954B2; EP2275436B1; PL2275436T3; CN102482335A; WO2011006966A9; PT2275436E; KR101745333B1; CN104694564A; MY155616A; BR112012001152A8; JP5878464B2; CN102482335B; KR20120102584A; JP2016047060A; BR112012001152A2

Abstract

FERMENTAÇÃO DE BACILOS MODERADAMENTE TERMOFÍLICOS EM SACAROSE. A presente invenção refere-se a um método para a construção de uma cepa de Bacillus moderadamente termofílica capaz de utilizar sacarose como o uma fonte de carbono, compreendendo a transformação de uma cepa de Bacillus moderadamente termofílica parental que não é capaz de utilizar sacarose como uma fonte de carbono com um polinucleotídeo que compreende uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo que tem atividade de fosfotransferase específica de sacarose, e tendo (i) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 1, ou (ii) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 70% à sequência de aminoácidos que codifica um polipeptídeo que tem atividade de sacarose-6-fosfato hidrolase e tendo (iii) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 2, ou (iv) uma sequência de aminoácidos como uma identidade de pelo menos 70% à sequência de SEQ ID N°: 2. A presente invenção descreve ainda um método para a produção de um composto de interesse compreendendo o cultivo da cepa de Bacillus moderadamente termofílica transformada em uma fonte de carbono que contém sacarose. Finalmente, são descritos polipeptídeos e polinucleotídeos novos que permitem autilização de sacarose.

Description

[0001]A presente invenção refere-se à modificação genética de cepas de Bacillus moderadamente termofílicas para proporcionar a capacidade de utilizar sacarose para cepas de Bacillus que originalmente não possuíam esta capacidade.

[0002]As espécies de Bacillus moderadamente termofílicas, de preferência aquelas espécies que são anaeróbicas facultativas e ho- moláticas, são organismos ideais para a fabricação industrial de ácido lático.

[0003]No contexto desta invenção, as espécies de Bacillus mode radamente termofílicas são capazes de crescer em uma temperatura entre 37 e 65°C, e permitem a fermentação industrial em temperaturas acima de 50°C. Esta alta temperatura de fermentação tem várias vantagens quando se está fermentando em escala industrial: menos risco de infecções, e assim sendo, pureza mais alta do produto, reações mais rápidas, etc. Além disso, as necessidades nutritivas destas bactérias são menos demandantes do que aquelas de bactérias do ácido lático tais como as espécies de Lactobacillus, o que possibilita também processos industriais relativamente baratos.

[0004]As espécies de Bacillus moderadamente termofílicas inclu em espécies aeróbicas e espécies anaeróbicas facultativas. O uso de espécies anaeróbicas facultativas é preferido, pois estas espécies possibilitam a fermentação sob condições anaeróbicas, ou pelo menos sob uma baixa pressão parcial de oxigênio, o que para escala industrial é desejável. Tais condições impedem a demanda por aeração onerosa e possibilitam o uso de meios de baixo custo, e ao mesmo tempo, minimizando riscos de contaminação ou mesmo possibilitando procedimentos de produção não estéreis.

[0005]Prefere-se também usar espécies de Bacillus moderada mente termofílicas que são homoláticas. A natureza homolática permite a produção de ácido lático a partir de fontes hidrocarbônicas (incluindo os açúcares hexose e pentose; vide documento no WO 04/063382) sem a formação de mais do que 15% em peso de subprodutos tais como ácido fórmico e ácido acético. A modificação genética do fenótipo homolático pode ser aplicada para converter cepas homo- láticas em cepas de produção homofermentativas para produtos industriais deriváveis de glicólise, tais como fosfoenolpiruvato e/ou piruvato. Os exemplos destes compostos são piruvato, acetolactato, diacetila, acetoína, 2,3-butanodiol, 1,2-propanodiol, acetato, formiato, acetaldeí- do, etanol, L-alanina, oxaloacetato, S-malato, succinato, fumarato, 2- oxoglutarato, oxalossuccinato, isocitrato, citrato, glioxilato.

[0006]De preferência, essas cepas produtoras são deficientes em esporulação.

[0007]Os exemplos de espécies de Bacillus moderadamente ter- mofílicas e anaeróbicas facultativas são Bacillus coagulans, Bacillus smithii, Bacillus thermoamylovorans, e Bacillus thermocloacae, sendo pelos menos as duas primeiras espécies homoláticas. Uma espécie preferida é Bacillus coagulans.

[0008]É desejável em fermentações industriais usar matérias- primas baratas nos meios de fermentação. Por exemplo, sacarose ou substratos que contêm sacarose são usados frequentemente como fontes de carbono de baixo custo para fermentações industriais. Entretanto, descobriu-se que nem todas cepas de Bacillus moderadamente termofílicas usadas para fermentações industriais possuem a capaci- dade de utilizar sacarose como uma fonte de carbono. Isso é uma desvantagem, especialmente se essas cepas sofreram adaptações para melhorar capacidade de fermentação ou potencial de produção em uma escala industrial.Por exemplo, a cepa de Bacillus coagulans DSM 1 pareceu ser um fermentador muito deficiente de sacarose. Um apenas escasso crescimento e formação de ácido é observado usando sacarose como única fonte de carbono, o que se deve provavelmente à atividade inespecífica de sistemas para utilização de outros açúcares.

[0009]Na literatura, B. coagulans é mencionada como sendo vari ável na capacidade de utilização de sacarose (De Clerck, E., M. Rodri- guez-Diaz, G. Forsyth, L. Lebbe, N. Logan, "Polyphasic characterization of Bacillus coagulans strains", Syst. Appl. Microbiol.27:50-60 (2004)). Entretanto, não há informações disponíveis sobre genes envolvidos no catabolismo de sacarose e não há genes anotados para o catabolismo de sacarose na sequência genômica de B. coagulans 36D1 (HTTP://genome.jgi-psf.org/draft microbes/bacco/bacco.home.- html).

[00010] Assim sendo, um objeto da presente invenção é modificar geneticamente uma cepa de Bacillus moderadamente termofílica que originalmente não era capaz de utilizar sacarose como uma fonte de carbono para produzir a cepa com a capacidade de utilizar sacarose como uma fonte de carbono. Outro objeto da invenção é se aproveitar de um método para produzir um composto de interesse, compreendendo o cultivo de uma cepa de Bacillus moderadamente termofílica em uma fonte de carbono que contém sacarose.

[00011] Uma cepa de Bacillus moderadamente termofílica incapaz de utilizar sacarose como uma fonte de carbono pode ser deficiente em um ou mais genes envolvidos na utilização de sacarose.

[00012] A presente invenção revela agora genes e polipeptídeos novos envolvidos no catabolismo de sacarose e obteníveis a partir de espécies de Bacillus moderadamente termofílicas, de preferência a partir de espécies de Bacillus moderadamente termofílicas e anaeróbi- cas facultativas, mais preferivelmente a partir de espécies de Bacillus moderadamente termofílicas e anaeróbicas facultativas que são homo- láticas.

[00013] Os polipeptídeos novos surpreendentemente apresentam uma homologia bastante baixa com polipeptídeo correspondentes de outras espécies de Bacillus, enquanto que uma homologia mais alta é observada com polipeptídeos correspondentes de espécies de Lactobacillus. Os genes e polipeptídeos novos permitem a introdução de capacidade de utilização de sacarose em cepas de Bacillus moderadamente termofílicas sem capacidade de utilização de sacarose da mesma espécie (ou espécie estreitamente relacionada) como as espécies a partir das quais os genes e polipeptídeos novos são obteníveis. Particularmente, os genes novos permitem a introdução de material genético por meio de autoclonagem, isto é, usando material genético específico da espécie.

[00014] Assim sendo, em um aspecto desta invenção, fornece-se um método para a construção de uma cepa de Bacillus moderadamente termofílica capaz de utilizar sacarose como uma fonte de carbono, a partir de uma cepa de Bacillus parental moderadamente termofílica incapaz de utilizar sacarose como uma fonte de carbono.

[00015] Particularmente, a cepa de Bacillus moderadamente termo- fílica capaz de utilizar sacarose como um fonte de carbono é derivada de uma cepa de Bacillus parental moderadamente termofílica incapaz de utilizar sacarose como uma fonte de carbono por transformação da dita cepa parental com um polinucleotídeo (gene) necessário para conseguir a utilização de sacarose. Como aqui descrito, este polinu- cleotídeo necessário compreende uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo que tem atividade de fosfotransferase específica de sacarose, e tendo (i) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 1, ou (ii) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75, 80, 85, 90, 95% à sequência de SEQ ID N°: 1 e/ou compreende uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo que tem atividade de sacarose-6-fosfato hidro- lase, e tendo (iii) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 2, ou (iv) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75, 80, 85, 90, 95% à sequência de SEQ ID N°: 2.

[00016] A introdução do polinucleotídeo para conseguir utilização de sacarose na cepa de Bacillus moderadamente termofílica de interesse pode ser feita usando qualquer procedimento de transformação apropriado conhecido pelos versados nessas técnicas, incluindo transformação de protoplastos ou fusão de protoplastos, eletroporação, transformação biolística, conjugação, ou transformação de células competentes naturais. Por exemplo, um procedimento de transformação como aquele descrito no documento no WO 2007/085443, que é aqui incorporado como referência, pode ser usado.

[00017] O polinucleotídeo para conseguir utilização de sacarose pode ser introduzido usando um plasmídeo autonomamente replicador ou por integração cromossômica. Este último procedimento é preferido para aplicação industrial, pois a integração cromossômica é tida genericamente como mais estável e assegurará uma distribuição estável da polinucleotídeo sobre as células da progênie. A fermentação da sacarose em si pode ser pressão de seleção para manutenção do polinu- cleotídeo a fim de conseguir a utilização de sacarose. A introdução do polinucleotídeo no cromossoma pode ser feita por recombinação não- homóloga bem como homóloga.

[00018] A recombinação homóloga é preferida, pois ela enceta a oportunidade para introduzir, remover ou simultaneamente introduzir e remover uma funcionalidade do cromossoma bacteriano. Quando a recombinação homóloga é pretendida, o polinucleotídeo transformador contém ainda uma sequência de DNA que é homóloga a uma sequência genômica-alvo da Bacillus específica a ser obtida por engenharia genética. Quaisquer sequências genômicas-alvo apropriadas podem ser selecionadas para este propósito. As sequências genômicas-alvo apropriadas estão localizadas, por exemplo, em uma região não- codificadora do genoma. Os versados nessas técnicas devem entender que nenhuma identidade de 100% é necessária para obter recom- binação homóloga.Uma identidade percentual de cerca de 90% também será suficiente.Genericamente, a sequência de DNA de interesse a ser inserida no cromossoma por recombinação homóloga é flanqueada por sequências homólogas com um comprimento suficiente para permitir a recombinação homóloga. Este comprimento pode ser de pelo menos cerca de 100 pares de bases (pb), por exemplo, entre cerca de 200 e cerca de 1.000 pb.

[00019] Para conseguir a expressão do polinucleotídeo a fim de conseguir a utilização de sacarose, a sequência codificadora do poli- nucleotídeo é dotada das sequências reguladoras necessárias. Estas sequências reguladoras podem ser as sequências reguladoras nativas ou podem ser heterólogas à sequência codificadora em questão.

[00020] Em outro aspecto, são fornecidos polipeptídeos novos, Ito é, um polipeptídeo que tem atividade de fosfotransferase especifica de sacarose e um polipeptídeo que tem atividade de sacarose-6-fosfato hidrolase. O polipeptídeo que tem atividade de fosfotransferase específica de sacarose tem (i) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 1, ou (ii) uma sequência de aminoácidos com um identidade de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente ainda pelo menos 90%, e com a maior preferência pelo menos 95% com a sequência de SEQ ID N°:1. O polipeptídeo que tem atividade de sacarose-6-fosfato hidrolase tem (i) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 2, ou (ii) uma sequência de aminoácidos com um identidade de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente ainda pelo menos 90%, e com a maior preferência pelo menos 95% com a sequência de SEQ ID N°: 2.

[00021] O polipeptídeo de fosfotransferase específica de sacarose, que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 1 compartilha homologia significativa com componentes EIIBCA do sistema de PTS específico de sacarose de Pediococcus pentosaceus e Lactobacillus plantarum (ambas 62% de identidade em nível de proteína) e outras bactérias do ácido lático. Surpreendentemente, a homologia a outras espécies de Bacillus é muito mais baixa, tendo identidade mais lata com o homólogo de Bacillus clausii (44% de identidade em nível de proteína).

[00022] O polipeptídeo de sacarose-6-fosfato hidrolase que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2 compartilha homolo- gia significativa com sacarose-6-fosfato hidrolases de Lactobacillus sakei (50% de identidade em nível de proteína) e outras bactérias do ácido lático. Além disso, para este polipeptídeo foi surpreendente observar que a homologia com outros homólogos de Bacillus foi mais baixa do que com bactérias do ácido lático. O homólogo mais próximo de Bacillus foi da Bacillus clausii (41% de identidade em nível de proteína).

[00023] Para o propósito da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos refere-se à porcentagem de aminoácidos que são idênticos entre as duas sequências. O grau de identidade é determinado usando o algoritmo BLAST, que está descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O software para realizar análises BLAST está disponível para o público no NationalCenterforBiotechnologyInformation (HTTP://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLAST usa como omissões: Tamanho da palavra3; Valor esperado: 10; Tamanho da lista de acertos 100; Custos de lacunas: 11,1; Matriz: BLOSUM62.

[00024] Em ainda outro aspecto, são fornecidos polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos do aspecto anterior, por exemplo, um polinucleotídeo que tem uma sequência de acordo com SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4.

[00025] Os polipeptídeos e polinucleotídeos dos aspectos acima são utilizáveis para construir uma cepa de Bacillus moderadamente termofílica capaz de utilizar sacarose como uma fonte de carbono, como aqui descrito.

[00026] Em ainda outro aspecto, fornece-se um método para a produção de um composto de interesse, compreendendo o cultivo de uma cepa de Bacillus moderadamente termofílica em uma fonte de carbono que contém sacarose. O método é distinguido pelo fato de que a cepa de Bacillus moderadamente termofílica a ser cultivada é derivada de uma cepa de Bacillus parental moderadamente termofílica incapaz de utilizar sacarose como uma fonte de carbono dotando a cepa parental da capacidade de utilizar sacarose como uma fonte de carbono.

[00027] A cepa de Bacillus moderadamente termofílica parental que não é capaz de utilizar sacarose como uma fonte de carbono é dotada da capacidade de utilizar sacarose como uma fonte de carbono usando o método e o(s) polinucleotídeos(s) descritos nos aspectos anteriores. Usando este método e o(s) polinucleotídeo(s), a presente invenção permite vantajosamente o cultivo em uma fonte de carbono que contém sacarose de cepas de Bacillus moderadamente termofílicas que são adaptadas para condições indus-triais de cultivo e/ou selecionadas para possuir um alto potencial de produção e que originalmente não possuem a capacidade de utilizar sacarose.

[00028] A fonte de carbono usada para o cultivo da cepa de Bacillus moderadamente termofílica pode conter sacarose em um nível de pelo menos 0,5% em peso, baseado no peso total da fonte de carbono. É possível também usar sacarose como única fonte de carbono.

[00029] O cultivo pode ser ainda realizado sob condições convencionais comumente conhecidas pelos versados nessas técnicas.

[00030] Depois do cultivo, o composto de interesse formado é opcionalmente isolado do meio de fermentação e purificado quando necessário. Os métodos de purificação/isolamento convencionais, por exemplo, para ácido lático, são destilação, extração, eletrodiálise, ad- sorção, troca iônica, cristalização e similares, e combinações dos métodos de purificação/isolamento supramencionados.

[00031] O composto de interesse pode ser ácido lático. O termo "ácido lático" significa o ácido 2-hidróxi-propiônico na sua forma livre ou na forma de sal. O ácido lático contém um átomo de carbono quiral, e por esta razão, pode existir como enantiômero (R) e (S). O termo "ácido lático", como utilizado neste pedido de patente, inclui os isôme- ros (R) e (S) puros, e misturas deles, incluindo a mistura racêmica. Para a produção de R-lactato, pode ser usada uma cepa produtora que é geneticamente modificada como descrito no documento no WO 2007/085443, que é aqui incorporado como referência.

[00032] O composto de interesse pode ser ainda piruvato, usando uma cepa na qual a conversão de piruavato em lactato é bloqueada. O composto de interesse pode ser ainda um composto derivável a partir de usando uma cepa na qual o piruvato é redirecionado para a produ- ção de um composto, incluindo acetolactato, diacetila, acetoína, 2,3- butanodiol, 1,2-propanodiol, acetato, formiato, acetaldeído, etanol, L- alanina, oxaloacetato, S-malato, succinato, fumarato, 2-oxoglutarato, oxalossuccinato, isocitrato, citrato, glioxilato.

Breve Descrição das Figuras

[00033] A Figura 1 ilustra o mapa genômico do óperon de sacarose a partir de Bacillus coagulans, representando o gene da enzima PTS de sacarose II (scrA) e o gene de sacarose-6-fosfato hidrolase (scrB).

[00034] A Figura 2 ilustra um mapa plasmídico de pMH84. Os genes de replicação (repA e repB), o gene de resistência a cloranfenicol (cat), o gene da enzima PTS de sacarose II (scrA) e o gene de sacaro- se-6-fosfato hidrolase (scrB) estão representados por setas. As regiões a montante (us) e a jusante (ds) de homologia para recombinação cruzada dupla (cinza), região do promotor de Bacillus coagulans (Bco; branco) e sítios lox (lox 71 e lox 66; preto) estão entre colchetes. Para BglII e NcoI apenas os sítios relevantes para a construção estão incluídos.

Exemplos Cepas e Condições de Cultura

[00035] B. coagulans DSM 1 foi obtida na empresa DSMZ, Braunschweig, Alemanha. B. coagulans foi desenvolvida rotineiramente a 50oC sob condições aeróbicas (120 rpm) em caldo BC (documento no 2007/085443) contendo 50 g/L de glicose.Caso apropriado, o meio foi suplementado com cloranfenicol a 7 mg/L. As placas BC foram preparadas com Gelrite como descrito anteriormente (documento no 2007/085443). Para a avaliação do uso de carbono, B. coagulans foi desenvolvida sobre um meio quimicamente definido (CDM) contendo por litro 2,0 g de (NH4)2HPO4, 3,5 g de (NH4)2SO4, 10 g de tampão BisTris (bis-[2-hidróxi-metil]imino-tris[hidróxi-metil]-metano), 0,5 g de KCl, 0,234 g de L-arginina, 0,304 g de ácido L-aspártico, 0,026 g de L- cisteína, 0,470 g de ácido glutâmico, 0,093 g de L-histidina, 0,360 g de L-isoleucina, 0,581 g de L-leucina, 0,111 g de L-metionina, 0,197 g de L-prolina, 0,308 g de L-serina, 0,350 g de L-treonina, 0,345 g de L- valina, 0,2 g de MgChSteO, 50 mg de CaCh2H2O, 16 mg de MnCl2, 7 mg de FeSO4√H2O, 0,1 mg de tiamina, 0,5 mg de ácido nicotínico, 0,1 mg de ácido pantotênico, 0,5 mg de piridoxamina, 0,5 mg de piri- doxal, 0,1 mg de D-biotina, 0,1 mg de ácido fólico, 0,1 mg de ácido p- aminobenzoico, 0,1 mg de cobalamina. Caso apropriado, o CDM foi suplementado com 5 g de glicose ou 5 g de sacarose por litro.Lactococcus lactis MG1363 foi descrita por Gasson (Gasson, M. J., "Plasmid complements of Streptococcus lactis NCDO 712 and other lactic streptococci after protoplast-induce curing", J. Bacteriol. 154:1-9 (1983)).L. lactis foi cultivada rotineiramente a 30°C em caldo M17 (Difco) contendo 5 g/L de glicose.

[00036] As bactérias forma estocadas em insumos de glicerina usando 15% em volume de glicerina, a -80°C.

Técnicas de Manipulação de DNA

[00037] Técnicas usuais de manipulação de DNA foram realizadas como descrito por Sambrook e Russell (J. Sambrook e D. W. Russel, "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 3a edição, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).

[00038] O isolamento em larga escala do DNA plasmídico a partir de 100 mL de cultura foi realizado usando o Kit Jetstar 2.0 Plasmid Maxiprep® (Genomed) seguindo as instruções do fabricante. O isolamento em pequena escala do DNA plasmídico a partir de 1 mL de cultura foi realizado usando o kit Nucleospin Plasmid Quick Pure® (Ma- chery-Nagel) seguindo as instruções do fabricante.

[00039] L. lactis serviu como hospedeiro intermediário durante a construção do plasmídeo de integração pMH84 (Figura 2). A preparação de células competentes de L. lactis e a eletroporação foram reali- zadas como descrito por Holo e Ness (Holo, H. e I. F. Ness, "High- frequency transformation, by electroporation, of Lactobacillus lactis subsp. Cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media", Appl. Envoron. Microbiol. 55: 3119-3123 (1989)).

[00040] B. coagulans foi transformada por eletroporação como descrito no documento no WO 2007/085443.

[00041] As reações PCR com propósito de clonagem foram realizadas com Pwo polimerase de alta fidelidade (Roche) seguindo as instruções do fabricante.

[00042] A análise por PCR de colônia foi usada para demonstrar a presença de pNW33N nas colônias resistentes a cloranfenicol como descrito no documento no WO 2007/085443.

Fermentações

[00043] As fermentações em batelada de B. coagulans foram realizadas em tubos com tampa de atarraxar (13 mL) com 10 mL de caldo BC ou CDM a 50°C.

[00044] As amostras foram retiradas ao final da fermentação para medição de turbidez a 600 nm, pH, e teor de ácido orgânico no caldo de fermentação. No caso deste último, as amostras foram centrifugadas e os restos remanescentes no sobrenadante foram removidos por filtração usando um filtro Millex® GP de 0,22 pm (Millipore). O filtrado foi congelado até análise posterior.

[00045] Os ácidos orgânicos (ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, etanol, ácido butírico, ácido pirúvico, ácido lático, ácido 2- hidróxi-butírico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido sórbico, ácido fu- márico, ácido succínico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido málico, ácido cítrico) foram medidos usando uma transformação e GLC. Os R- lactatos e S-lactados foram metilados para lactato e metila e medidos por análise do espaço vazio em uma coluna quiral.

Exemplo 1: Construção de um plasmídeo de integração com utilizaçãode sacarose por B. coagulans

[00046] A análise de sequências aleatórias de uma cepa de B. coa- gulans fermentadora de sacarose selecionada revelou uma região de dois genes com homologia de sequências com os genes da enzima PTS de sacarose II e de sacarose-6-fosfato hidrolase (scrA e scrB, respectivamente). Um mapa genético da região está ilustrado na Figura 1. Um fragmento de DNA que contém o agrupamento de genes scrAB e seus promotores (representados em SEQ ID N°: 5) foi gerado com PCR de alta fidelidade usando os iniciadores 5'- AGTACTGCATGCTTAAAGAGTAGCTTTCGGTGTTAAAGTG-3' (introduzindo um sítio SphI, SEQ ID N°:6) e 5'- AGTACTGAGCTCCTATTT ATTAATAGAATGAAGACTCCAGTAGTT- CCC-3' (introduzindo SacI, SEQ ID N°: 7) em combinação com o DNA genômico de uma cepa de B. coagulans fermentadora de sacarose como DNA modelo. Alternativamente, o agrupamento de genes scrAV pode ser gerado como DNA sintético, tendo a sequência representada em SEQ ID N°: 5. Um plasmídeo de integração de B. coagulans foi modificado para permitir a integração do agrupamento de genes scrAB no cromossoma de B. coagulans DSM 1. Fragmentos de 1,0 kb a montante e a jusante do sítio de integração cromos- sômico foram usados para a recombinação. O vetor de integração, pMH84 (Figura 2), baseia-se no vetor de clonagem lactocócico pMHs (documento no WO 2007/085443) e tem um replicon termos- sensível em B. coagulans. O primeiro promotor cat foi substituído por um promotor de B. coagulans. Para esta finalidade, o fragmento BglII-SalI de pMH3 que contém o gene de cat foi substituído por um produto de fusão da PCR de um promotor de B. coagulans constitutivo fundido de forma traduzida ao gene de cat, introduzindo simultaneamente um sítio NcoI sobreposto ao códon iniciador de cat (SEQ ID N°: 18). A parte do promotor foi gerada usando umacombinaçãode iniciadores (direto) 5'- CGCGTCGACTGTGGATAAGACAACAGGA TTCGTATG-3' (introduzindo um sítio NcoI, SEQ ID N°:10) e (reverso) 5'-CGCAGATCTCCTTCTTCTTCAACTAACGGG-3' (introduzindo um sítio BglII, SEQ ID N°: 11) usando pMH3 como modelo. Ambos produtos foram usados como modelo em uma nova reação PCR usando o promotor direto e iniciadores reversos de cat. Este fragmento pode ser gerado também como DNA sintético, tendo a sequência representada em SEQ ID N°: 18. O plasmídeo resultante foi designado pMH71. Para permitir múltiplos usos do sistema Cre-lox, os sítios lox66 e lox71 (Langer, S. J., A. P. Ghafoori, M. Byrd, e L. Leinwand, "A genetic screen identifies novel non-compatible loxP sites", Nucleic Acids Res. 30:3067-3077 (2002); Lambert, J. M., R. S. Bongers e M. Kleerebe- zem, "Crelox-based system for multiple gene deletions and selectable- marker removal in Lactobacillus plantarum", Appl. Environ. Microbiol. 73:1126-1135 (2007)) que flanqueiam a região cat do promotor foram introduzidos por PCR usandos os iniciadores 5'- CCCGTCGACGCTAGC TACCGTTCGTATAATGTATGCTATA- CGAAGTTATGTGGATAAGACAACAGGATTCG-3' (introduzindo os sítios lox66, SalI e NheI, SEQ ID N°:12) e 5'- CGCAGATCTTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTA- TCCTTCT TCAACTAACGGGGCAGGTTAG-3' (introduzindo os sítios lox71 e BglII, SEQ ID N°: 13) e pMH71 como modelo. O produto da PCR resultante foi digerido com BglII-SalI e usado para trocar pela região do promotor cat BglII-SalI de pMH71, resultando no plasmídeo pMH77. O fragmento a montante do sítio de integração foi gerado por PCRusandoosiniciadores5'- CGCCTCGAGAGATCTGGCCGGGCTTTATGGGAGG-3' (introduzindo os sítios XhoI e BglII, SEQ ID N°:14) e 5'- GCCGAGCTCGCATGCCCCTGA TCAACCGGGTCAGTGC (introdu- zindo os sítios SacI e SphI, SEQ ID N°: 15) e o DNA cromossômico de B. coagulans DSM 1 como modelo. O produto da PCR foi clonado em pMH77 usando SacI e XhoI. Isto resultou em pMH82. O fragmento a jusante do sítio de integração foi gerado por PCR usando os iniciadores 5'-CCCGCTAGCCGTTTCAATCACATAGTCGTATTG (introduzindo o sítio Nhel, SEQ ID N°:16) e 5'- CCGGTCGACGGCCTTCATGTGC TTTTGCCGCAAATTC (introduzindo um sítio SallI, SEQ ID N°: 17) e o DNA cromossômico de B. coagu- lans DSM 1 como modelo. O produto da PCR resultante foi clonado em pMH82 como fragmento SalI-NheI, resultando em pMH83. O fragmento de DNA que contém os genes scrAB foi como fragmento de SphI e SacI em pMH83 digerido com as mesmas enzimas, o que resultou no vetor de integração pMH84 (Figura 2). O plasmídeo pMH84 foi isolado e a integridade do agrupamento de genes scrAB, as regiões a montante e a jusante, e os sítios lox foi confirmado por análise de sequências de DNA.

Exemplo 2: Integração genômica de scrAB em B. coagulans DSM 1

[00047] Para a integração genômica dos genes scrAB em B. coagu- lans DSM 1, o plasmídeo pMH84 foi transformado nesta cepa por ele- troporação e plaqueado sobre placas BC suplementadas com cloran- fenicol. Os transformantes foram triados quanto à presença do plasmí- deo por PCR de colônia. As colônias positivas foram cultivadas para isolamento do plasmídeo e a integridade do plasmídeo foi confirmada por análise de restrição. Um transformante foi selecionado para experimentos adicionais.A integração dos genes de sacarose por troca cruzada dupla foi estabelecida depois do cultivo a 60°C e seleção quanto às colônias resistentes a cloranfenicol. Um integrante foi sele-cionado para estudos adicionais e estocado como insumo de glicerina. A integração correta foi conformada por análise por PCR e análise de sequências dos sítios de fusão. Esta cepa foi designada B. coagulans DSM 1::scrAB.

Exemplo 2: Fermentação de sacarose com B. coagulans

[00048] Neste experimento, foi demonstrado como as cepas de B. coagulans que não são capazes de fermentação eficiente de sacarose podem ser modificadas para se tornarem fermentadoras de sacarose. As cepas de B. coagulans DSM 1 e DSM 1::scrAB foram inoculadas com o insumo de glicerina em 10 mL de caldo BC sem açúcar e incubadas a 50°C a 120 rpm. As culturas da noite inteira foram transferidas (2% em volume) para 10 mL de CDM suplementado com glicose. Depois da incubação de um dia para o outro, as culturas foi peletizadas e os péletes foram recolocados em suspensão em 10 mL de CDM sem açúcar. Para cada cepa três parcelas em triplicata de 10 mL de CDM suplementado com 5 g de glicose por litro, 5 g de sacarose por litro, ou nenhum açúcar, foram inoculadas (2% em volume) com as culturas da nova suspensão. Depois de 50 h de incubação estática em tubos com tampa de atarraxar, a turbidez a 600 nm, o pH, e o teor de ácido orgânico do sobrenadante foram determinados (Tabela 1). Os resultados demonstram que o açúcar é necessário para o crescimento anaeróbico apropriado e que B. coagulans DSM 1::scrAB é capaz de fermentar sacarose para dar ácido lático, enquanto que B. coagulans DSM 1 não o é. A ausência de açúcar resultou em nenhum crescimento e nenhuma acidificação para ambas cepas de B. coagulans. Na presença de sacarose, DSM 1 não apresentou crescimento e nenhuma acidifica- ção, enquanto que B. coagulans DSM 1::scrAB teve bom crescimento e acidificação. O ácido lático foi o único ácido orgânico detectado nos sobrenadantes das culturas. Isto demonstra que a introdução do cassete do gene de B. coagulans scrAB é suficiente para a fermentação eficiente de sacarose com B. coagulans.Tabela 1Características da fermentação depois de 50 h de incubaçãoa

Claims

1.Método para a produção de um composto de interesse selecionado dentre o grupo consistindo de ácido láctico, piruvato, suc- cinato, formato, acetato, etanol, acetoína e 2,3-butanodiol, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de uma cepa de Bacillus moderadamente termofílica em uma fonte de carbono que contém sacarose, em que a cepa de Bacillus moderadamente termofílica é capaz de crescer entre 37° C e 65° C, em que a cepa de Bacillus moderadamente termofílica é derivada de uma cepa de Bacillus moderadamente termofílica parental que é capaz de crescer entre 37° C e 65° C, mas não é capaz de utilizar sacarose como uma fonte de carbono por transformação da dita cepa parental com um polinucleotídeo que com-preende uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo que tem atividade de fosfotransferase específica de sacarose e tendo (i) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 1, e compreendendo uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo que tem atividade de sacarose-6-fosfato hidrolase e tendo (ii) uma sequência de aminoáci- dos de SEQ ID N°: 2.

2.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto de interesse é ácido lático.

3.Método para a construção de uma cepa de Bacillus mo-deradamente termofílica capaz de crescer entre 37° C e 65° C e de utilizar sacarose como uma fonte de carbono, caracterizado pelo fato de que compreende a transformação de uma cepa de Bacillus moderadamente termofílica parental que é capaz de crescer entre 37° C e 65° C, mas não é capaz de utilizar sacarose como uma fonte de carbono por transformação da dita cepa parental com um polinucleotídeo que compreende uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo que tem atividade de fosfotransferase específica de sacarose e tendo (i) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 1, e compreendendo uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo que tem atividade de sacarose-6-fosfato hidrolase e tendo (ii) uma sequência de ami- noácidos de SEQ ID N°: 2.

4.Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a cepa de Bacillus moderadamente termofílica é anaeróbica facultativa.

5.Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a cepa de Bacillus moderadamente termofílica é homolática.

6.Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a cepa de Bacillus moderadamente termofílica é Bacillus coagulans.

7.Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que tem atividade de fosfotransferase específica de sacarose e tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 1.

8.Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência de SEQ ID N°: 3 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam o mesmo polipeptídeo.