JP5878464B2 - 中等度好熱性Ｂａｃｉｌｌｉのスクロースでの発酵 - Google Patents
中等度好熱性Ｂａｃｉｌｌｉのスクロースでの発酵 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5878464B2 JP5878464B2 JP2012520040A JP2012520040A JP5878464B2 JP 5878464 B2 JP5878464 B2 JP 5878464B2 JP 2012520040 A JP2012520040 A JP 2012520040A JP 2012520040 A JP2012520040 A JP 2012520040A JP 5878464 B2 JP5878464 B2 JP 5878464B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sucrose
- sequence
- acid
- polypeptide
- thermophilic bacillus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 title claims description 63
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 title claims description 63
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 title claims description 63
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title description 16
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title description 16
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 title 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 40
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 27
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 claims description 26
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 24
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 19
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 19
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 16
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 7
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 claims description 7
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 7
- ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N Acetoin Chemical compound CC(O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diol Chemical compound CC(O)C(C)O OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N hydroxymethyl propionaldehyde Natural products CCC(=O)CO GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 5
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 241000283913 Bacillus coagulans DSM 1 = ATCC 7050 Species 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 6
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 description 6
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 6
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 5
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 5
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 3
- -1 pentose sugars Chemical class 0.000 description 3
- 108010093591 phosphoenolpyruvate-sucrose phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 101150030355 scrB gene Proteins 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- AFENDNXGAFYKQO-VKHMYHEASA-N (S)-2-hydroxybutyric acid Chemical compound CC[C@H](O)C(O)=O AFENDNXGAFYKQO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxypropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC(C)=O WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001328122 Bacillus clausii Species 0.000 description 2
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N D-lactic acid Chemical compound C[C@@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N Diacetyl Chemical group CC(=O)C(C)=O QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 2
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 2
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N Pyridoxal Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N acetaldehyde Chemical compound [14CH]([14CH3])=O IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N 0.000 description 2
- JABXMSSGPHGCII-UHFFFAOYSA-N acetic acid;propane-1,2-diol Chemical compound CC(O)=O.CC(O)CO JABXMSSGPHGCII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 2
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N isocitric acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 2
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 2
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFSCUAXLTRFIDC-UHFFFAOYSA-N oxalosuccinic acid Chemical compound OC(=O)CC(C(O)=O)C(=O)C(O)=O UFSCUAXLTRFIDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- NHZMQXZHNVQTQA-UHFFFAOYSA-N pyridoxamine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CN)=C1O NHZMQXZHNVQTQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 2
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 2
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HYRHLJWTFKJITA-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)propanamide Chemical compound NC(=O)C(CO)CO HYRHLJWTFKJITA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPEKGGXMPWTOCB-UHFFFAOYSA-N 8beta-(2,3-epoxy-2-methylbutyryloxy)-14-acetoxytithifolin Natural products COC(=O)C(C)O LPEKGGXMPWTOCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100301559 Bacillus anthracis repS gene Proteins 0.000 description 1
- 241000725603 Bacillus coagulans 36D1 Species 0.000 description 1
- 241000193399 Bacillus smithii Species 0.000 description 1
- 241001495667 Bacillus thermoamylovorans Species 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100247969 Clostridium saccharobutylicum regA gene Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 1
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101100412434 Escherichia coli (strain K12) repB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100184605 Escherichia coli mobA gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000740205 Homo sapiens Sal-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 239000004158 L-cystine Substances 0.000 description 1
- 235000019393 L-cystine Nutrition 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000186612 Lactobacillus sakei Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191996 Pediococcus pentosaceus Species 0.000 description 1
- 101100391699 Pseudomonas viridiflava gacA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100037204 Sal-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101100114425 Streptococcus agalactiae copG gene Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241001468250 [Bacillus] thermocloacae Species 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- ASARMUCNOOHMLO-WLORSUFZSA-L cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2s)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O ASARMUCNOOHMLO-WLORSUFZSA-L 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- ODQWQRRAPPTVAG-GZTJUZNOSA-N doxepin Chemical compound C1OC2=CC=CC=C2C(=C/CCN(C)C)/C2=CC=CC=C21 ODQWQRRAPPTVAG-GZTJUZNOSA-N 0.000 description 1
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011087 fumaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 229940057867 methyl lactate Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 229960003581 pyridoxal Drugs 0.000 description 1
- 235000008164 pyridoxal Nutrition 0.000 description 1
- 239000011674 pyridoxal Substances 0.000 description 1
- 235000008151 pyridoxamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011699 pyridoxamine Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 101150044854 repA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150055347 repA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150107738 repB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000012027 sterile manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/56—Lactic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、スクロースを利用する能力を、この能力を元は有さないＢａｃｉｌｌｕｓ株に与える為の中等度好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ株の遺伝子改変に関する。
中等度好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、好ましくは通性嫌気性且つホモ乳酸的であるそれらの種が、乳酸の産業的製造にとって理想的な有機体である。
本発明の文脈において、中等度好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ種は、３７〜６５℃で増殖することができ、且つ、５０℃超の温度での産業的発酵を許す。この高い発酵温度は、産業的規模での発酵の場合に、いくつかの利点を有する：感染のより低いリスク、そしてすなわちより高い産物純度、より速い反応など。さらに、これらのバクテリアの栄養要求は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種（これも比較的高価でない産業的プロセスを許す）などの乳酸バクテリアのものと比べて、より少なく要求するものである。
中等度好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ種は、好気性種及び通性嫌気性種を含む。通性嫌気性種のの使用が好ましく、というのも、これらの種は、嫌気性条件下、又は、少なくとも酸素の低分圧下での発酵を許し、これは産業的規模にとって望ましいからである。そのような条件は、費用のかかるエアレーションの要求を防ぎ、そして、低コスト媒体の使用を可能とし、一方でコンタミネーションリスクを最小化し又は非滅菌的製造手順を許しさえする。
ホモ乳酸的である中等度好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ種を使用することもまた好ましい。ホモ乳酸的性質は、炭水化物源（ヘキソース及びペントース糖を含む；国際公開第０４／０６３３８２号パンフレットを参照）からの、１５ｗｔ％超の副産物、例えばギ酸及び酢酸など、の形成の無い、乳酸の製造を許す。ホモ乳酸的表現型の遺伝子改変は、ホモ乳酸的株を、解糖から、例えばホスホエノールピルベート及び／又はピルベートから誘導可能な他の産業的産物の為のホモ発酵的生産株へと転化する為に適用されうる。これらの化合物の例は、ピルベート、アセトラクテート、ジアセチル、アセトイン、２，３−ブタンジオール、１，２−プロパンジオール、アセテート、ホルメート、アセトアルデヒド、エタノール、Ｌ−アラニン、オキサロアセテート、Ｓ−マレート、サクシネート、フマレート、２−オキソグルタレート、オキサロサクシネート、イソシトレート、シトレート、グリオキシレートである。
好ましくは、これらの生産株は胞子形成欠損である。
中等度好熱的且つ通性嫌気性のBacillus種の例は、Bacillus coagulans、Bacillus smithii、Bacillus thermoamylovorans、及びBacillus thermocloacaeであり、少なくとも最初の２つの種は、ホモ乳酸的でもある。好ましい種は、Bacillus coagulansである。
発酵媒体において安い未加工の原料を用いることが産業的発酵において望ましい。例えば、スクロース又はスクロース含有基質がしばしば、低コスト炭素源として産業的発酵の為に用いられる。しかしながら、産業的発酵の為に用いられる中等度好熱的Bacillus株の全てが、炭素源としてスクロースを利用する能力を有するわけではないことが発見された。これは、特にはもしそのような株が、産業的スケールでのそれらの発酵能力又は生産能力を改善する為の適応を受けたならば、不利である。例えば、Bacillus coagulans株DSM 1は、スクロースの非常に乏しい発酵体であるとみえた。乏しい増殖及び酸形成だけが、唯一の炭素源としてスクロースを用いて観察され、これはおそらく他の糖の利用の為の系の非特異的活性に起因する。
文献において、B. coagulansは、スクロース利用能力において可変であると言及されている(De Clerck, E., M. Rodriguez- Diaz, G. Forsyth, L. Lebbe, N. Logan, 2004: Polyphasic characterization of Bacillus coagulans strains. Syst. Appl. Microbiol. 27:50-60)。しかしながら、スクロース異化に関与する遺伝子について利用可能な情報は無く、且つ、B. coagulans 36D1ゲノム配列におけるスクロース異化についてアノテートされた遺伝子は無い(http: //genome.jgi- psf.org/draft microbes/bacco/bacco.home.html)。
すなわち、本発明の一つの目的は、元はスクロースを炭素源として利用できない中等度好熱的Bacillus株を遺伝子的に改変して、該株にスクロースを炭素源として利用する能力を備えることである。本発明の他の目的は、中等度好熱性Bacillus株のスクロース含有炭素源での培養を含む、関心のある化合物を生産する為の方法を利用することである。
スクロースを炭素源として利用することができない中等度好熱性Bacillus株は、スクロース利用に関与する１又はそれより多くの遺伝子を欠くものでありうる。
本発明は今、スクロース異化に関与し、且つ、中等度好熱性Bacillus種から、好ましくは中等度好熱性且つ通性嫌気性Bacillus種から、最も好ましくはホモ乳酸的である中等度好熱性且つ通性嫌気性Bacillus種から得られる新規遺伝子及びポリペプチドを開示する。
該新規ポリペプチドは、驚くべきことに、他のBacillus種からの対応するポリペプチドとかなり低いホモロジーを示すが、Lactobacillus種からの対応するポリペプチドとのより高いホモロジーが観察される。該新規遺伝子及びポリペプチドは、該新規遺伝子及びポリペプチドが入手可能である種と同じ（又は近縁の）種の非スクロース利用性の中等度好熱性Bacillus株へのスクロース利用能力の導入を許す。特に、該新規遺伝子は、セルフクローニングによる、すなわち種特異的遺伝子材料を用いる、遺伝子材料の導入を許す。
すなわち、この発明の一つの局面において、スクロースを炭素源として利用することができない中等度好熱性Bacillus親株からの、スクロースを炭素源として利用することができる中等度好熱性Bacillus株の構築の為の方法が提供される。
特に、スクロースを炭素源として利用することができる該中等度好熱性Bacillus株は、スクロースを炭素源として利用することができない中等度好熱性Bacillus親株を、スクロースの利用を得る為に必要なポリヌクレオチド（遺伝子）により形質転換することにより得られる。本明細書内に開示されるとおり、この必要なポリヌクレオチドは、ａ）スクロース特異的ホスホトランスフェラーゼ活性を有し且つ配列ID N0:1のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、且つｂ）スクロース−６−ホスフェートヒドロラーゼ活性を有し且つ配列ID NO: 2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。
スクロースの利用を得る為の該ポリヌクレオチドの関心のある該中等度好熱性Bacillus株への導入は、当技術分野の当業者に知られている任意の適切な形質転換手順を用いて行われてよく、当該手順はプロトプラスト形質転換又はプロトプラスト融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃(biolistic)形質転換、接合（conjugation）、又は天然のコンピテント細胞の形質転換を包含する。例えば、国際公開第2007/085443号パンフレット中に開示されたとおりの形質転換手順が用いられてよく、これは引用することにより本明細書に組み込まれる。
スクロースの利用を得る為の該ポリヌクレオチドは、自律的に複製するプラスミドを用いて又は染色体組み込みにより導入されうる。後者は、産業的適用にとって好ましく、というのも染色体組み込みは、一般に、より安定であるとみなされており、そして、子孫細胞にわたる該ポリヌクレオチドの安定な分配を確保するであろうからである。スクロース発酵それ自体が、スクロースの利用を得る為の該ポリヌクレオチドの維持のための選択圧でありうる。該ポリヌクレオチドの該染色体への導入は、非相同的組み換え並びに相同組み換えにより行われうる。
相同組み換えが好ましく、というのも、それは、該バクテリア染色体から／該バクテリア染色体へ、機能を導入すること、除去すること、又は同時に導入及び除去することの機会を開くからである。相同組み換えが意図される場合、該形質転換するポリヌクレオチドはさらに、改変される該特定のBacillusのゲノム標的配列と相同であるＤＮＡ配列を含む。任意の適切なゲノム標的配列が、この目的の為に選択されうる。適切なゲノム標的配列は、例えば、該ゲノムの非コード領域に位置している。当業者は、１００％の同一性は相同組み換えを得る為に要求されないことを理解するであろう。また、約９０％の同一性パーセンテージが十分であろう。一般に、相同組み換えにより該染色体中に挿入されるべき関心のある該ＤＮＡ配列は、相同組み換えを可能とするのに十分な長さを有する相同配列に隣接される。そのような長さは、少なくとも約100 bp、例えば約200〜約1500bp、好ましくは約200〜約1000 bpでありうる。
スクロースの利用を得る為の該ポリヌクレオチドの発現を達成する為に、該ポリヌクレオチドの該コーディング配列は、必要な制御配列を備えられる。これらの制御配列は、生来の制御配列であってよく、又は、問題の該コーディング配列と異種のものであってもよい。
さらなる局面において、新規ポリペプチド、すなわちスクロース特異的ホスホトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド及びスクロース−6−ホスフェートヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドが提供される。スクロース特異的ホスホトランスフェラーゼ活性を有する該ポリペプチドは、配列ID NO:1のアミノ酸配列を有する。該スクロース−6−ホスフェートヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列ID NO: 2のアミノ酸配列を有する。
配列ID NO:1のアミノ酸配列を有する該スクロース特異的ホスホトランスフェラーゼポリペプチドは、Pediococcus pentosaceus及びLactobacillus plantarum (タンパク質レベルで両方とも62%の同一性)並びに他の乳酸バクテリアからのスクロース特異的PTS系EIIBCA成分との有意な相同性を共有する。驚くべきことに、他のBacillus種との相同性ははるかにより低く、Bacillus clausiiホモログとの最も高い同一性を有する（タンパク質レベルでの44%同一性）。
配列ID NO: 2のアミノ酸配列を有するスクロース−６−ホスフェートヒドロラーゼポリペプチドは、Lactobacillus sakei (タンパク質レベルで50%同一性)及び他の乳酸バクテリアからのスクロース−６−ホスフェートヒドロラーゼとの有意な相同性を共有する。また、このポリペプチドについて、他のBacillusホモログとの相同性が、該乳酸バクテリアとの相同性よりも低いことが分かることは驚くべきことであった。最も近いBacillusホモログは、Bacillus clausii (タンパク質レベルで41%同一性)からのものであった。
本発明の目的の為に、２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度は、該２つの配列の間で同一であるアミノ酸のパーセンテージをいう。該同一性の程度は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定され、これは、Altschul, et al., J. MoI. Biol. 215: 403- 410 (1990)、において記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施する為のソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通じて、公に利用可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度（sensitivity）及び速さを決定する。BLASTPプログラムは、デフォルトとして、Word size: 3; Expect value: 10; Hitlist size 100; Gapcosts: 11,1; Matrix: BLOSUM62、を用いる。
さらなる局面においてさらに、前の局面の該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列ID N0:3又は配列ID N0:4に従う配列を有するポリヌクレオチドが提供される。
上記局面の該ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、本明細書内に記載されたとおりの、炭素源としてスクロースを利用できる中等度好熱性Bacillus株を構築する為に使用可能である。
さらなる局面においてさらに、関心のある化合物の製造方法であって、スクロース含有炭素源での中等度好熱性Bacillus株の培養を含む前記方法が提供される。該方法は、培養される該中等度好熱性Bacillus株が、炭素源としてスクロースを利用することができない中等度好熱性Bacillus親株から、スクロースを炭素源として利用する為の能力を該親株に備えることにより得られることを特徴とする。
スクロースを炭素源として利用することができない該中等度好熱性Bacillus親株は、前の局面において記載されたとおりの方法及びポリヌクレオチドを用いて、炭素源としてスクロースを利用する能力を備えられる。この方法及びポリヌクレオチドを用いることにより、本発明は有利には、産業的培養条件に適応されており及び／又は高い生産能力を有する為に選択されており、且つ、元はスクロースを利用する能力を有さない中等度好熱性Bacillus株の、スクロース含有炭素源での培養を許す。
該中等度好熱性Bacillus株の培養の為に用いられる炭素源は、該炭素源の全重量に基づき、少なくとも0.5% (w/w)のレベルで、スクロースを含みうる。スクロースを唯一の炭素源として用いることも可能である。
該培養はさらに、当技術分野の当業者に一般に知られている慣用の条件下で実施されうる。
培養後、関心のある形成された化合物は、任意的に、発酵培地から分離され、そして、必要な場合には、精製されうる。例えば乳酸の為の、慣用の精製／分離方法は、蒸留、抽出、電気透析、吸着、イオン交換、結晶化、及び同様のもの、並びに、上記言及された精製／分離方法の組み合わせである。
該関心のある化合物は乳酸でありうる。語「乳酸」は、遊離酸又は塩のいずれかの形にある2-ヒドロキシ-プロピオン酸を意味する。乳酸は、不斉炭素原子を有し、そして、その故に、(R)及び(S)エナンチオマーとして存在しうる。この出願で用いられるときに、語「乳酸」は、純粋な(R)及び(S)異性体、及び、ラセミ混合物を包含するそれらの混合物を包含する。R-ラクテートの製造の為に、国際公開第2007/085443号パンフレット（これは引用することにより本明細書に組み込まれる）に記載されたとおりの遺伝子改変された生産株が用いられうる。
該関心のある化合物はさらに、ピルベートのラクテートへの転化がブロックされる株を用いて、ピルベートであってよい。該関心のある化合物はさらに、ピルベートから誘導可能な化合物であってよく、そのような化合物の生産にピルベートが向けなおされるところの株を用い、該化合物はアセトラクテート、ジアセチル、アセトイン、2, 3-ブタンジオール、1, 2-プロパンジオール、アセテート、ホルメート、アセトアルデヒド、エタノール、L-アラニン、オキサロアセテート、S-マレート、サクシネート、フマレート、2-オキソグルタレート、オキサロサクシネート、イソシトレート、シトレート、グリオキシレートを含む。
実施例
株及び培養条件
B. coagulans DSM 1が、DSMZ、Braunschweig、ドイツ、から得られた。B. coagulansは、50 g/lグルコースを含むＢＣ培地(国際公開第2007/085443号パンフレット)中で、好気的条件下で(120 rpm)、５０℃で、普通に増殖させられた。適切な場合には、該培地は、クロラムフェニコールを7 mg/lで補われた。Gelriteを有するＢＣプレートが、前に記載されたとおりに(国際公開第2007/085443号パンフレット)用意された。炭素使用の評価の為に、B. coagulansは、１リットル当たり2.O g (NH4) 2HPO4、3.5 g (NH4)2SO4、10 g Bis-Trisバッファー(ビス[2-ヒドロキシメチル] イミノトリス[ヒドロキシメチル]-メタン)、0.5 g KCl、0.234 g L-アルギニン、0.304 g L-アスパラギン酸、0.026 g L-シスチン、0.470 g グルタミン酸、0.093 g L- ヒスチジン、0.360 g L-イソロイシン、0.581 g L-ロイシン、0.111 g L- メチオニン、0.197 g L-プロリン、0.308 g L-セリン、0.350 g L-スレオニン、0.345 g L-バリン、0.2 g MgCl2・ 6 H2O、50 mg CaCl2・2 H2O、16 mg MnCl2、7 mg FeSO4・ 7 H2O、0.1 mg チアミン、0.5 mg ニコチン酸、0.1 mg パントテン酸、0.5 mg ピリドキサミン、0.5 mg ピリドキサール、 0.1 mg D-ビオチン、0.1 mg 葉酸、0.1 mg p- アミノ安息香酸、0.1 mg コバラミンを含む、化学的に規定された培地（ＣＤＭ）で増殖させられた。適切な場合には、該ＣＤＭは、１リットル当たり５ｇのグルコース又は５ｇのスクロースを補われた。
Lactococcus lactis MG1363が、Gasson(Gasson, M. J., 1983: Plasmid complements of Streptococcus lactis NCDO 712 and other lactic streptococci after protoplast-induced curing, J. Bacteriol. 154:1-9)により記載された。L.lactisは、5 g/lグルコースを含むM17培地(Difco)中で、30℃で普通に培養された。
バクテリアは、１５％(v/v)グリセロールを用いて、−８０℃で、グリセロールストックで貯蔵された。
ＤＮＡ操作技術
標準的なＤＮＡ操作技術が、Sambrook及びRussell (J. Sambrook and D. W. Russell. 2001: Molecular Cloning, a laboratory manual. 3 rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)により記載されたとおりに実施された。
１００mL培養物からのラージスケールプラスミドＤＮＡ分離が、Jetstar 2.0 Plasmid Maxiprep Kit（商標）(Genomed)を用いて、製造者の指示に従い、実施された。１ｍｌ培養物からのスモールスケールプラスミドＤＮＡ分離が、Nucleospin Plasmid Quick Pure（商標）(Macherey-Nagel)キットを用いて、製造者の指示に従い、実施された。
L.lactisが、組み込みプラスミドpMH84の構築の間の中間宿主として働いた（図２）。L. lactisコンピテント細胞の調製及びエレクトロポレーションは、Holo及びNes(Holo, H. and I. F. Nes, 1989: High-frequency transformation, by electroporation, of Lactococcus lactis subsp. cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media, Appl. Environ. Microbiol. 55:3119-3123)により記載されたとおりに実施された。
B. coagulansは、国際公開第2007/085443号パンフレットに記載されたとおりに、エレクトロポレーションにより形質転換された。
クローニング目的の為のＰＣＲ反応が、ハイフィデリティPwoポリメラーゼ（Roche）により、製造者の指示に従い、実施された。
コロニーＰＣＲ分析が、国際公開第2007/085443号パンフレットに記載されたとおりに、クロラムフェニコール耐性コロニー中でpNW33Nの存在を実証する為に用いられた。
発酵
B. coagulansバッチ発酵が、10mlのBC培地又はCDMを有するスクリューキャップチューブ(13 mL)中で、５０℃で実施された。
試料が、発酵の終わりで、６００ｎｍでの濁度、ｐＨ、発酵培地中の有機酸含有量の測定のために引き取られた。後者のために、試料は、遠心され、そして、上清中の残存するデブリがMillex GP 0.22μmフィルター（商標）(Millipore)を用いたろ過により除去された。ろ液が、さらなる分析まで凍結された。
有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、エタノール、酪酸、ピルビン酸、乳酸、２−ヒドロキシ酪酸、グリコール酸、シュウ酸、ソルビン酸、フマル酸、コハク酸、安息香酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸）が、誘導体化及びＧＬＳを用いて測定された。Ｒ−ラクテート及びＳ−ラクテートが、メチル−ラクテートへとメチル化され、そして、キラルカラムでのヘッドスペース分析により測定された。
B. coagulansスクロース利用組み込みプラスミドの構築
選択されたスクロース発酵性B. coagulans株のランダム配列分析が、スクロースPTS酵素II遺伝子及びスクロース-6-ホスフェートヒドロラーゼ遺伝子（それぞれscrA及びscrB）との配列相同性を有する２つの遺伝子の領域を明らかにした。該領域の遺伝子マップが図１に示される。scrAB遺伝子クラスター及びそれらのプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列ID NO: 5に示される）が、
鋳型ＤＮＡとしてのスクロース発酵性B. coagulans株からのゲノムＤＮＡと一緒に、
プライマー
（SphＩ部位を導入する、配列ID NO: 6)
及び
(SacＩ部位を導入する、配列ID NO: 7)
を用いた高忠実度（ハイフィデリティ）ＰＣＲにより生成された。代わりに、scrAB遺伝子クラスターが、配列ID NO: 5に示される配列を有する合成ＤＮＡとして生成されうる。B. coagulans組み込みプラスミドが改変されて、該scrAB遺伝子クラスターの該B. coagulans DSM 1染色体における組み込みを許した。該染色体組み込み部位の1.0 kb上流断片及び下流断片が、組み換えの為に用いられた。組み込みベクターpMH84(図２)は、ラクトコッカスのクローニングベクターpMH3（国際公開第2007/085443号パンフレット）に基づき、且つ、B. coagulansにおける熱感受性レプリコンを有する。第一に、catプロモーターが、B. coagulansプロモーターにより置き換えられた。この目的の為に、該cat遺伝子を有する該pMH3 BglII-SalI断片が、該cat開始コドンとオーバーラップするNcoＩ部位を同時に導入する該cat遺伝子に翻訳的に連結された構成的B. coagulansプロモーターの融合ＰＣＲ産物により置き換えられた（配列IDNO:18）。該プロモーター部分が、鋳型ＤＮＡとしてのスクロース発酵性B.coagulans株からのゲノムＤＮＡと一緒に、
プライマーコンビネーション
（フォワード）
（SalＩ部位を導入する、配列ID NO: 8）
及び
（リバース）
（NcoＩ部位を導入する、配列ID NO: 9）
を用いて、生成された。該cat遺伝子が、鋳型としてのpMH3を用いて、プライマーコンビネーション
（フォワード）
（NcoＩ部位を導入する、配列IDNO: 10)
及び
（リバース）
（BglII部位を導入する、配列ID NO: 11）
を用いて生成された。両方の産物が、鋳型として、該プロモーターフォワードプライマー及びcatリバースプライマーを用いた新たなＰＣＲ反応において用いられた。この断片もまた、配列ID NO: 18において描かれる配列を有する合成ＤＮＡとして生成されうる。得られたプラスミドは、pMH71と呼ばれた。Cre-loxシステムの複数の使用を可能とする為に、プロモーター-cat領域に隣接するlox66部位及びlox71部位 (Langer, S. J., A. P. Ghafoori, M. Byrd, and L. Leinwand, 2002: A genetic screen identifies novel non-compatible loxP sites, Nucleic Acids Res. 30:3067-3077., Lambert, J. M., R. S. Bongers, and M. Kleere- bezem, 2007: Cre-lox-based system for multiple gene deletions and selectable-marker removal in Lactobacillus plantarum, Appl. Environ. Microbiol. 73:1126-1135.)が、
プライマー
（lox66、Sal1、およびNheI部位を導入する、配列ID NO:12)
及び
プライマー
(lox71及びBglII部位を導入する、配列ID NO: 13)
並びに鋳型としてpMH71を用いたＰＣＲにより導入された。得られたＰＣＲ産物が、BglII-SalIにより消化され、そして、pMH71の該BglII-SalIプロモーター-cat領域と交換する為に用いられ、プラスミドpMH77を結果した。組み込み部位の上流断片が、
プライマー
（XhoI及びBglII部位を導入する、配列ID NO: 14）
及び
プライマー
（SacI及びSphI部位を導入する、配列ID NO: 15）
並びに、B. coagulans DSM1染色体DNAを鋳型として用いたＰＣＲにより生成された。ＰＣＲ産物が、SacI及びXhoIを用いてpMH77中にクローン化された。これが、pMH82を結果した。該組み込み部位の下流断片が、
プライマー
（NheI部位を導入する、配列ID NO: 16）
及び
プライマー
（SalI部位を導入する、配列ID NO: 17）
並びに鋳型としてB. coagulans DSM 1染色体DNAを用いたＰＣＲにより生成された。ＰＣＲ産物が、SalI-NheI断片としてpMH82中にクローン化され、pMH83を結果した。該scrAB遺伝子を含む該ＤＮＡ断片が、SphI及びSacI断片として、同じ酵素により消化されたpMH83中にクローン化され、これが、組み込みベクターpMH84を結果した（図２）。プラスミドpMH84が分離され、そして、scrAB遺伝子クラスター、該上流領域及び下流領域、並びにlox部位の完全性が、ＤＮＡ配列分析により確認された。
鋳型ＤＮＡとしてのスクロース発酵性B. coagulans株からのゲノムＤＮＡと一緒に、
プライマー
及び
を用いた高忠実度（ハイフィデリティ）ＰＣＲにより生成された。代わりに、scrAB遺伝子クラスターが、配列ID NO: 5に示される配列を有する合成ＤＮＡとして生成されうる。B. coagulans組み込みプラスミドが改変されて、該scrAB遺伝子クラスターの該B. coagulans DSM 1染色体における組み込みを許した。該染色体組み込み部位の1.0 kb上流断片及び下流断片が、組み換えの為に用いられた。組み込みベクターpMH84(図２)は、ラクトコッカスのクローニングベクターpMH3（国際公開第2007/085443号パンフレット）に基づき、且つ、B. coagulansにおける熱感受性レプリコンを有する。第一に、catプロモーターが、B. coagulansプロモーターにより置き換えられた。この目的の為に、該cat遺伝子を有する該pMH3 BglII-SalI断片が、該cat開始コドンとオーバーラップするNcoＩ部位を同時に導入する該cat遺伝子に翻訳的に連結された構成的B. coagulansプロモーターの融合ＰＣＲ産物により置き換えられた（配列IDNO:18）。該プロモーター部分が、鋳型ＤＮＡとしてのスクロース発酵性B.coagulans株からのゲノムＤＮＡと一緒に、
プライマーコンビネーション
（フォワード）
及び
（リバース）
を用いて、生成された。該cat遺伝子が、鋳型としてのpMH3を用いて、プライマーコンビネーション
（フォワード）
及び
（リバース）
を用いて生成された。両方の産物が、鋳型として、該プロモーターフォワードプライマー及びcatリバースプライマーを用いた新たなＰＣＲ反応において用いられた。この断片もまた、配列ID NO: 18において描かれる配列を有する合成ＤＮＡとして生成されうる。得られたプラスミドは、pMH71と呼ばれた。Cre-loxシステムの複数の使用を可能とする為に、プロモーター-cat領域に隣接するlox66部位及びlox71部位 (Langer, S. J., A. P. Ghafoori, M. Byrd, and L. Leinwand, 2002: A genetic screen identifies novel non-compatible loxP sites, Nucleic Acids Res. 30:3067-3077., Lambert, J. M., R. S. Bongers, and M. Kleere- bezem, 2007: Cre-lox-based system for multiple gene deletions and selectable-marker removal in Lactobacillus plantarum, Appl. Environ. Microbiol. 73:1126-1135.)が、
プライマー
及び
プライマー
並びに鋳型としてpMH71を用いたＰＣＲにより導入された。得られたＰＣＲ産物が、BglII-SalIにより消化され、そして、pMH71の該BglII-SalIプロモーター-cat領域と交換する為に用いられ、プラスミドpMH77を結果した。組み込み部位の上流断片が、
プライマー
及び
プライマー
並びに、B. coagulans DSM1染色体DNAを鋳型として用いたＰＣＲにより生成された。ＰＣＲ産物が、SacI及びXhoIを用いてpMH77中にクローン化された。これが、pMH82を結果した。該組み込み部位の下流断片が、
プライマー
及び
プライマー
並びに鋳型としてB. coagulans DSM 1染色体DNAを用いたＰＣＲにより生成された。ＰＣＲ産物が、SalI-NheI断片としてpMH82中にクローン化され、pMH83を結果した。該scrAB遺伝子を含む該ＤＮＡ断片が、SphI及びSacI断片として、同じ酵素により消化されたpMH83中にクローン化され、これが、組み込みベクターpMH84を結果した（図２）。プラスミドpMH84が分離され、そして、scrAB遺伝子クラスター、該上流領域及び下流領域、並びにlox部位の完全性が、ＤＮＡ配列分析により確認された。
B. coagulans DSM 1におけるscrABのゲノム組み込み
scrAB遺伝子のB.coagulans DSM 1へのゲノム組み込みの為に、プラスミドpMH84が、この株へと、エレクトロポレーションにより形質転換され、そして、クロラムフェニコールを補われたＢＣプレートにプレートされた。形質転換体が、コロニーＰＣＲにより、該プラスミドの存在についてスクリーニングされた。陽性コロニーが、プラスミド分離の為に培養され、そして、該プラスミドの完全性が、制限分析により確認された。一つの形質転換体が、さらなる実験の為に選択された。二重クロスオーバー交換（double crossover exchange）による該スクロース遺伝子の組み込みが、６０℃での培養及びクロラムフェニコール耐性コロニーについての選択の後に確立された。一つの組み込み体が、さらなる研究の為に選択され、そして、グリセロールストックとして保存された。正確な組み込みが、該融合部位のＰＣＲ分析及び配列分析により確認された。この株は、B. coagulans DSM 1:: scrABと称された。
ａ データは、３つの発酵からの平均である。有機酸濃度は、％（ｗ／ｗ）で与えられる。Ｎ．Ｄ．、決定されていない。ギ酸（＜０．０２％）、酢酸（＜０．０２％）、プロピオン酸（＜０．０２％）、酪酸（＜０．０１％）、ピルビン酸（＜０．０２％）、２−ヒドロキシ酪酸（＜０．０１％）、グリコール酸（＜０．２０％）、シュウ酸（＜０．０２％）、ソルビン酸（＜０．０１％）、フマル酸（＜０．０２％）、コハク酸（＜０．０２％）、安息香酸（＜０．０３％）、及びマレイン酸（＜０．０２％）が、検出限界より下であった。
B. coagulansによるスクロース発酵
この実験において、本発明者らは、効率的なスクロース発酵ができないB.coagulans株が、どのように改変されることができて、スクロース発酵性となりうるかを示す。B.coagulans株DSM 1及びDSM 1: : scrABが、グリセロールストックから、糖を有さない１０ｍｌＢＣ培地に植菌され、そして、５０℃で１２０ｒｐｍでインキュベートされた。一晩培養物が、グルコースを補われた１０ｍｌＣＤＭに移された(2% v/v)。一晩のインキュベーション後、培養物がペレット化され、そして、該ペレットが、糖を有さない１０ｍｌＣＤＭに再懸濁された。それぞれの株について、１リットル当たり５ｇのグルコースを補われた、１リットル当たり５ｇのスクロースを補われた、又は糖を補われていない１０ｍｌＣＤＭの３つの三通りの部分が、該再懸濁された培養物から植菌された（2% v/v）。スクリューキャップチューブ中での５０時間の静的インキュベーション後、６００ｎｍでの濁度、ｐＨ、及び培養上清の有機酸含有量が、決定された（表１）。その結果は、糖が、適切な嫌気的増殖にとって要求されること、及び、B. coagulans DSM 1:: scrABが、スクロースを乳酸へと発酵することができる一方でB. coagulans DSM 1が当該発酵をすることができないことを示す。糖の不在は、両方のB. coagulans株についての増殖無し及び酸性化無しを結果した。スクロースの存在下において、DSM 1は、増殖及び酸性化のいずれも示さなかった一方で、B. coagulans DSM 1:: scrABは、良好な増殖及び酸性化を有した。乳酸は、該培養物上清において検出された唯一の有機酸であった。これは、B. coagulansのscrAB遺伝子カセットを導入することが、B. coagulansによる効率的なスクロース発酵にとって十分であることを示す。
Claims (10)
- スクロース含有炭素源での中等度好熱性Bacillus株の培養を含む、乳酸、ピルベート、サクシネート、ホルメート、アセテート、エタノール、アセトイン、及び2, 3-ブタンジオールからなる群から選ばれる関心のある化合物の製造方法であって、
該中等度好熱性Bacillus株が、スクロースを炭素源として利用できない中等度好熱性Bacillus親株を、ａ）スクロース特異的ホスホトランスフェラーゼ活性を有し且つ配列ID N0:1のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、且つｂ）スクロース−６−ホスフェートヒドロラーゼ活性を有し且つ配列ID NO: 2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドにより形質転換することによって得られたものであることを特徴とする、前記方法。 - 該関心のある化合物が乳酸である、請求項１に記載の方法。
- スクロースを炭素源として利用することができる中等度好熱性Bacillus株を構築する方法であって、スクロースを炭素源として利用できない中等度好熱性Bacillus親株を、ａ）スクロース特異的ホスホトランスフェラーゼ活性を有し且つ配列ID N0:1のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、且つｂ）スクロース−６−ホスフェートヒドロラーゼ活性を有し且つ配列ID NO: 2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドにより形質転換することを含む、前記方法。
- 該中等度好熱性Bacillus株が通性嫌気性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 該中等度好熱性Bacillus株がホモ乳酸的である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 該中等度好熱性Bacillus株がＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- スクロース特異的ホスホトランスフェラーゼ活性を有し且つ配列ID N0:1のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
- スクロース−６−ホスフェートヒドロラーゼ活性を有し且つ配列ID NO: 2のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
- 請求項７又は８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列ＩＤ ＮＯ：３又は配列ＩＤ ＮＯ：４の配列を有する、請求項９のポリヌクレオチド。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP09165828.6 | 2009-07-17 | ||
| EP09165828A EP2275436B1 (en) | 2009-07-17 | 2009-07-17 | Fermentation of moderately thermophilic Bacilli on sucrose |
| PCT/EP2010/060220 WO2011006966A1 (en) | 2009-07-17 | 2010-07-15 | Fermentation of moderately thermophilic bacilli on sucrose |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015214984A Division JP6055064B2 (ja) | 2009-07-17 | 2015-10-30 | 中等度好熱性Ｂａｃｉｌｌｉのスクロースでの発酵 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012533287A JP2012533287A (ja) | 2012-12-27 |
| JP5878464B2 true JP5878464B2 (ja) | 2016-03-08 |
Family
ID=41055041
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012520040A Expired - Fee Related JP5878464B2 (ja) | 2009-07-17 | 2010-07-15 | 中等度好熱性Ｂａｃｉｌｌｉのスクロースでの発酵 |
| JP2015214984A Active JP6055064B2 (ja) | 2009-07-17 | 2015-10-30 | 中等度好熱性Ｂａｃｉｌｌｉのスクロースでの発酵 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015214984A Active JP6055064B2 (ja) | 2009-07-17 | 2015-10-30 | 中等度好熱性Ｂａｃｉｌｌｉのスクロースでの発酵 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8663954B2 (ja) |
| EP (1) | EP2275436B1 (ja) |
| JP (2) | JP5878464B2 (ja) |
| KR (1) | KR101745333B1 (ja) |
| CN (2) | CN104694564A (ja) |
| BR (1) | BR112012001152B1 (ja) |
| DK (1) | DK2275436T3 (ja) |
| ES (1) | ES2394749T3 (ja) |
| MY (1) | MY155616A (ja) |
| PL (1) | PL2275436T3 (ja) |
| PT (1) | PT2275436E (ja) |
| WO (1) | WO2011006966A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102703351B (zh) * | 2012-01-21 | 2013-05-08 | 大地绿源环保科技(北京)有限公司 | 一株芽孢杆菌utm03及其应用 |
| JP2021052607A (ja) * | 2019-09-27 | 2021-04-08 | 株式会社ダイセル | 機能性物質の製造方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1437415A1 (en) | 2003-01-13 | 2004-07-14 | PURAC Biochem BV | Preparation of lactic acid from a pentose-containing substrate |
| ES2371828T3 (es) * | 2006-01-24 | 2012-01-10 | Purac Biochem Bv | Modificación genética de bacilos termofílicos homolácticos. |
| EP1989309B1 (en) | 2006-01-24 | 2011-08-31 | PURAC Biochem BV | Genetic modification of homolactic thermophilic bacilli |
| EP1953234A1 (fr) * | 2007-01-31 | 2008-08-06 | Galactic S.A. | Procédé de production d'acide lactique par fermentation d'un milieu autosuffisant à base de jus vert de canne |
-
2009
- 2009-07-17 DK DK09165828.6T patent/DK2275436T3/da active
- 2009-07-17 EP EP09165828A patent/EP2275436B1/en active Active
- 2009-07-17 PL PL09165828T patent/PL2275436T3/pl unknown
- 2009-07-17 ES ES09165828T patent/ES2394749T3/es active Active
- 2009-07-17 PT PT91658286T patent/PT2275436E/pt unknown
-
2010
- 2010-07-15 WO PCT/EP2010/060220 patent/WO2011006966A1/en active Application Filing
- 2010-07-15 MY MYPI2012000199A patent/MY155616A/en unknown
- 2010-07-15 US US13/384,527 patent/US8663954B2/en active Active
- 2010-07-15 CN CN201510103715.4A patent/CN104694564A/zh active Pending
- 2010-07-15 JP JP2012520040A patent/JP5878464B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-07-15 CN CN201080037269.7A patent/CN102482335B/zh active Active
- 2010-07-15 BR BR112012001152-9A patent/BR112012001152B1/pt active IP Right Grant
- 2010-07-15 KR KR1020127004095A patent/KR101745333B1/ko active IP Right Grant
-
2015
- 2015-10-30 JP JP2015214984A patent/JP6055064B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK2275436T3 (da) | 2012-11-26 |
| JP6055064B2 (ja) | 2016-12-27 |
| JP2012533287A (ja) | 2012-12-27 |
| EP2275436A1 (en) | 2011-01-19 |
| ES2394749T3 (es) | 2013-02-05 |
| US8663954B2 (en) | 2014-03-04 |
| EP2275436B1 (en) | 2012-09-12 |
| PL2275436T3 (pl) | 2013-02-28 |
| CN102482335A (zh) | 2012-05-30 |
| WO2011006966A9 (en) | 2011-04-28 |
| PT2275436E (pt) | 2012-12-06 |
| KR101745333B1 (ko) | 2017-06-09 |
| CN104694564A (zh) | 2015-06-10 |
| MY155616A (en) | 2015-11-13 |
| BR112012001152B1 (pt) | 2020-12-01 |
| BR112012001152A8 (pt) | 2018-06-05 |
| CN102482335B (zh) | 2015-08-12 |
| KR20120102584A (ko) | 2012-09-18 |
| JP2016047060A (ja) | 2016-04-07 |
| BR112012001152A2 (pt) | 2016-11-22 |
| US20120208248A1 (en) | 2012-08-16 |
| WO2011006966A1 (en) | 2011-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9169499B2 (en) | Flux to acetolactate-derived products in lactic acid bacteria | |
| JP5363119B2 (ja) | ホモ乳酸的好熱性バチルスの遺伝子改変 | |
| US20160304917A1 (en) | Modified Microorganism for Improved Production of Alanine | |
| CN113249347B (zh) | 丙酮酸脱氢酶的突变体及其用于生产l-氨基酸的方法 | |
| AU2016335266A1 (en) | High-level production of diacetyl in a metabolically engineered lactic acid bacterium | |
| KR102109763B1 (ko) | 2,3―부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3―부탄디올의 생산 방법 | |
| JP6055064B2 (ja) | 中等度好熱性Ｂａｃｉｌｌｉのスクロースでの発酵 | |
| JP4463200B2 (ja) | 酢酸菌のアルコール脱水素酵素遺伝子 | |
| CN106635945B (zh) | 重组菌株及其制备方法和生产l-苏氨酸的方法 | |
| CN113846132B (zh) | 苏氨酸生产菌种的构建及生产苏氨酸的方法 | |
| US9605280B2 (en) | Escherichia coli containing mutated lpdA gene and application thereof | |
| WO2016030373A1 (en) | Modified microorganism for improved production of fine chemicals on sucrose | |
| JPWO2007037300A1 (ja) | 有用物質の製造法 | |
| JP6412509B2 (ja) | ポリペプチドの組換え生産のためのアミノ酸栄養要求性除去原核生物株の使用 | |
| EP3015547B1 (en) | Rna polymerase sigma factor 32 variant and production method for l-threonine using a microorganism expressing the variant | |
| CN115572704A (zh) | 重组微生物及其构建方法和应用 | |
| CN115572703A (zh) | 重组菌株及其生产氨基酸的方法 | |
| CN117946228A (zh) | Cey17_04535突变体及其应用 | |
| JPWO2006085589A1 (ja) | 微生物の糖代謝活性を改善する方法 | |
| JP2005046071A (ja) | 酢酸耐性に関与する遺伝子 | |
| JP2005040098A (ja) | 酢酸耐性に関与する遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130627 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140925 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20141222 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150123 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20150123 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150702 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151030 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20151224 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160119 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160128 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5878464 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |