CN104694564A - 中度嗜热芽孢杆菌对蔗糖的发酵 - Google Patents

中度嗜热芽孢杆菌对蔗糖的发酵 Download PDF

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Abstract

本发明公开了构建能够利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌株的方法，包括用多核苷酸转化不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热芽孢杆菌菌株，所述多核苷酸包括编码具有蔗糖-特异性磷酸转移酶活性和具有i)SEQ ID NO:1的氨基酸序列或ii)与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽的DNA序列和/或包括编码具有蔗糖-6-磷酸水解酶活性和具有iii)SEQ ID NO:2的氨基酸序列或iv)与SEQ ID NO:2的序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。本发明进一步公开了用于生产目标化合物的方法，包括依靠含蔗糖碳源培养转化的中度嗜热芽孢杆菌菌株。最后，公开了能够利用蔗糖的新的多肽和多核苷酸。

Description

中度嗜热芽孢杆菌对蔗糖的发酵
本申请是申请号为201080037269.7中国专利申请的分案申请。
本发明涉及中度嗜热芽孢杆菌(Bacillus)菌株的遗传修饰，以将利用蔗糖的能力提供给最初不具有该能力的芽孢杆菌菌株。
中度嗜热芽孢杆菌菌种，优选为兼性厌氧和同型乳酸的那些菌种，是用于乳酸的工业生产的理想生物体。
在本发明的内容中，中度嗜热芽孢杆菌菌种能够在37至65℃下生长，并且可以在高于50℃的温度下进行工业发酵。这种高发酵温度在以工业规模发酵时具有几个优点：感染的风险较低，并且因此产物纯度较高、反应较快等等。此外，这些细菌的营养需求比那些乳酸细菌(如，乳杆菌属(Lactobacillus)菌种)的需求要低，这还使得工业过程相对廉价。
中度嗜热芽孢杆菌菌种包括需氧菌种和兼性厌氧菌种。优选使用兼性厌氧菌种，因为这些菌种使得可以在厌氧条件下，或至少在低氧分压下进行发酵，这对于工业规模是理想的。这样的条件不需要高成本的通风，并且能够使用低成本培养基，同时最小化污染风险，乃至允许非无菌生产程序。
还优选使用同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌菌种。同型乳酸性质使得可以从烃源(包括己糖和戊糖；参见WO04/063382)生产乳酸，而没有形成超过15wt％的副产物，如甲酸和乙酸。同型乳酸表型的遗传修饰可以用于将同型乳酸菌株转化成同型发酵菌株，用于可从糖酵解，如从磷酸烯醇丙酮酸和/或丙酮酸获得的其他工业产物。这些化合物的实例是丙酮酸、乙酰乳酸、双乙酰、醋偶姻、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、醋酸、甲酸盐、乙醛、乙醇、L-丙氨酸、草酰乙酸、S-苹果酸、琥珀酸盐、延胡索酸、2-酮戊二酸、草酰琥珀酸、异柠檬酸、柠檬酸、乙醛酸。
优选地，这些生产菌株是产孢缺陷型的。
中度嗜热且兼性厌氧芽孢杆菌菌种的实例是凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、热嗜淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)和热阴沟芽孢杆菌(Bacillus thermocloacae)，至少头两种菌种也是同型乳酸的。优选的菌种是凝结芽孢杆菌。
在工业发酵中，理想的是在发酵培养基中使用廉价的原材料。例如，蔗糖或含蔗糖物质常常被用作用于工业发酵的低成本碳源。然而，发现了不是所有用于工业发酵的中度嗜热芽孢杆菌菌株都具有利用蔗糖作为碳源的能力。这是个缺陷，尤其是如果这样的菌株已经经过改造来提高它们以工业规模的发酵能力或生产潜能。例如，凝结芽孢杆菌菌株DSM 1看来是非常差的蔗糖发酵菌。使用蔗糖作为唯一碳源时，观察到仅有很少的生长和酸形成，这可能是由于系统对利用其他糖的非特异性活性引起的。
在文献中，提及凝结芽孢杆菌的蔗糖利用能力是可变的(De Clerck，E.，M.Rodriguez-Diaz，G.Forsyth，L.Lebbe，N.Logan，2004：Polyphasic characterization of Bacillus coagulans strains.(凝结芽孢杆菌菌株的多相表征))，Syst.Appl.Microbiol.27:50-60)。然而，没有任何可获得的关于蔗糖分解代谢中所涉及的基因的信息，并且在凝结芽孢杆菌36D1基因组序列中不存在任何为蔗糖分解代谢注释的基因(http://genome.jgi-psf.org/draft  microbes/bacco/bacco.home.html)。
因此，本发明的一个目的是对最初不能利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌株进行遗传修饰，以提供具有利用蔗糖作为碳源的能力的菌株。本发明的另一个目的是利用一种方法来生产目标化合物，包括依靠含蔗糖的碳源来培养中度嗜热芽孢杆菌菌株。
不能利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌株可能缺少一个或多个蔗糖利用中所涉及的基因。
现在本发明公开了蔗糖分解代谢中所涉及的并且可获自中度嗜 热芽孢杆菌菌种的新的基因和多肽，优选获自中度嗜热且兼性厌氧的芽孢杆菌菌种，最优选获自是同型乳酸的中度嗜热且兼性厌氧的芽孢杆菌菌种。
新的多肽令人惊讶地展示出与来自其他芽孢杆菌菌种的相应多肽具有相当低的同源性，而观察到与来自乳杆菌菌种的相应多肽具有较高的同源性。新的基因和多肽可以将蔗糖利用能力引入与从其可以获得新基因和多肽的菌种相同(或密切相关)的菌种的非蔗糖利用中度嗜热芽孢杆菌菌株中。特别地，新基因可以通过自体无性繁殖(即，利用物种特异性遗传物质)来引入遗传物质。
因此，在本发明的一个方面中，提供了从不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热芽孢杆菌菌株构建能够利用蔗糖作为碳源的中度嗜热杆菌菌株的方法。
特别地，通过用实现蔗糖的利用必需的多核苷酸(基因)转化不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热芽孢杆菌菌株从所述亲本菌株产生能够利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌株。如在此所公开的，这种必需多核苷酸包括编码如下多肽的DNA序列，所述多肽具有蔗糖特异性磷酸转移酶活性和具有i)SEQ ID NO:1的氨基酸序列或ii)与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％，优选至少75、80、85、90、95％同一性的氨基酸序列，和/或包括编码如下多肽的DNA序列，所述多肽具有蔗糖-6-磷酸水解酶活性和具有iii)SEQ ID NO:2的氨基酸序列或iv)与SEQ ID NO:2的序列具有至少70％，优选至少75、80、85、90、95％同一性的氨基酸序列。
可以使用本领域技术人员已知的任何合适的转化程序来进行将用于实现蔗糖的利用的多核苷酸引入目标中度嗜热芽孢杆菌菌株中，所述转化程序包括原生质体转化或原生质体融合、电穿孔、生物射弹转化、接合或天然感受态细胞的转化。例如，可以使用如WO2007/085443中公开的转化程序，在此将该文献引入作为参考。
可以使用自主复制质粒或通过染色体整合来引入用于实现蔗糖的利用的多核苷酸。对于工业应用，优选后者，因为通常认为染色体 整合更稳定，并且将确保多核苷酸在后代细胞中的稳定分配。蔗糖发酵自身可能是维持用于实现蔗糖的利用的多核苷酸的选择压力。可以通过非同源性以及同源性重组来进行多核苷酸引入染色体中。
优选同源性重组，因为其打开了将功能性引入细菌染色体中、从细菌染色体中除去功能性或同时将功能性引入细菌染色体中和从细菌染色体中除去功能性的机会。当试图进行同源性重组时，转化多核苷酸进一步含有与待工程化的特定芽孢杆菌的基因组目标序列同源的DNA序列。对于该目的，可以选择任何合适的目标序列。例如，合适的基因组目标序列位于基因组的非编码区。本领域技术人员将理解不需要100％的同一性来获得同源性重组。约90％的同一性百分比也将满足要求。通常，待通过同源性重组插入染色体中的目标DNA序列两侧为具有足够长度的同源性序列，以能够进行同源性重组。这样的长度可以是至少约100bp，例如，约200至约1500bp，优选约200至约1000bp。
为了完成用于实现蔗糖的利用的多核苷酸的表达，给多核苷酸的编码序列提供了必需的调控序列。这些调控序列可以是天然调控序列或可以是与所讨论的编码序列异源的。
在进一步的方面中，提供了新的多肽，即，具有蔗糖特异性磷酸转移酶活性的多肽和具有蔗糖-6-磷酸水解酶活性的多肽。具有蔗糖特异性磷酸转移酶活性的多肽具有i)SEQ ID NO:1的氨基酸序列或ii)与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，再更优选至少85％，再更优选至少90％，最优选至少95％同一性的氨基酸序列。具有蔗糖-6-磷酸水解酶活性的多肽具有i)SEQ ID NO:2的氨基酸序列或ii)与SEQ ID NO:2的序列具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，再更优选至少85％，再更优选至少90％，最优选至少95％同一性的氨基酸序列。
具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蔗糖特异性磷酸转移酶多肽与来自戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(在蛋白质水平上都是62％的同一性) 以及其他乳酸细菌的蔗糖特异性PTS系统EIIBCA组成部分享有显著的同源性。令人惊讶地，与其他芽孢杆菌菌种的同源性低得多，与克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)同源物具有最高的同一性(在蛋白质水平上为44％同一性)。
具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蔗糖-6-磷酸水解酶多肽与来自清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)(在蛋白质水平为50％同一性)以及其他乳酸细菌的蔗糖-6-磷酸水解酶享有显著的同源性。对于这种多肽，也令人惊讶地看到了与其他芽孢杆菌同源物的同源性低于与乳酸细菌的。最接近的芽孢杆菌同源物来自克劳氏芽孢杆菌(在蛋白质水平上为41％同一性)。
对于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的同一性程度指的是两个序列之间相同氨基酸的百分比。使用BLAST算法确定同一性程度，所述算法描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。用于进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)可公开获得。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTP算法作为缺省值使用：字长：3；预期值：10；Hitlist大小100；Gapcosts：11,1；矩阵：BLOSUM62。
在进一步的方面中，提供了编码前一方面的多肽的多核苷酸，例如，具有根据SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列的多核苷酸。
以上方面的多肽和多核苷酸可用于构建如在此所述的能够利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌株。
在进一步的方面中，提供了生产目标化合物的方法，包括依靠含蔗糖碳源培养中度嗜热芽孢杆菌菌株。该方法的特征在于通过给不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热芽孢杆菌菌株提供利用蔗糖作为碳源的能力，从所述亲本菌株产生待培养的中度嗜热芽孢杆菌菌株。
使用之前方面中所述的方法和多核苷酸，给不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热芽孢杆菌菌株提供利用蔗糖作为碳源的能力。使用这种方法和多核苷酸，本发明有利地可以依靠含蔗糖碳源培养适应 工业培养条件和/或选择以具有高生产潜能和最初不具有利用蔗糖能力的中度嗜热芽孢杆菌菌株。
用于培养中度嗜热芽孢杆菌菌株的碳源可以含有至少0.5％(w/w)水平的蔗糖，基于碳源的总重。还可以使用蔗糖作为唯一碳源。
可以在本领域技术人员公知的常规条件下进行进一步的培养。
培养后，当需要时，任选地从发酵培养基中分离出所形成的目标化合物并纯化。常规纯化/分离方法，例如，用于乳酸的，是蒸馏、萃取、电渗析、吸附、离子交换、结晶等，以及上述纯化/分离方法的组合。
目标化合物可以是乳酸。术语“乳酸”意指游离酸或盐形式的2-羟基-丙酸。乳酸含有手性碳原子，并且为此以(R)和(S)对映异构体存在。如本申请中所用的术语“乳酸”包括纯的(R)和(S)异构体，及其混合物，包括外消旋混合物。对于R-乳酸的生产，可以使用按照WO2007/085443中所述的进行遗传修饰的生产菌株，在此将该文献引入作为参考。
目标化合物可以进一步地是丙酮酸，使用其中丙酮酸转化成乳酸被阻断的菌株。目标化合物可以进一步地是源自丙酮酸的化合物，使用其中使丙酮酸改变方向朝着产生这种化合物的方向的菌株，所述化合物包括乙酰乳酸、双乙酰、醋偶姻、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、醋酸、甲酸盐、乙醛、乙醇、L-丙氨酸、草酰乙酸、S-苹果酸、琥珀酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、草酰琥珀酸、异柠檬酸、柠檬酸、乙醛酸。
实施例
菌株和培养条件
凝结芽孢杆菌DSM1获自德国DSMZ，Braunschweig。将凝结芽孢杆菌在含有50g/l葡萄糖的BC-培养液(WO 2007/085443)中，在需氧条件(120rpm)下，在50℃下，常规地生长。如果合适，给培养基补充7mg/l的氯霉素。按照之前所述的(WO 2007/085443)，用Gelrite制备BC平板。为了评价碳利用，将凝结芽孢杆菌生长在化学限定培养 基(CDM)中，所述培养基每升含有2.0g(NH4)2HPO4、3.5g(NH4)2SO4、10g Bis-Tris缓冲剂(二[2-羟甲基]亚氨基三[羟甲基]-甲烷)、0.5gKCl、0.234g L-精氨酸、0.304g L-天冬氨酸、0.026g L-胱氨酸、0.470g谷氨酸、0.093g L-组氨酸、0.360g L-异亮氨酸、0.581g L-亮氨酸、0.111g L-甲硫氨酸、0.197g L-脯氨酸、0.308g L-丝氨酸、0.350g L-苏氨酸、0.345g L-缬氨酸、0.2g MgCl2·6H2O、50mg CaCl2·2H2O、16mg MnCl2、7mg FeSO4·7H2O、0.1mg硫胺素、0.5mg烟酸、0.1mg泛酸、0.5mg吡哆胺、0.5mg吡哆醛、0.1mg D-生物素、0.1mg叶酸、0.1mgp-氨基苯甲酸、0.1mg钴胺素。如果合适，给CDM补充每升5g葡萄糖或5g蔗糖。Gasson描述了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1363(Gasson，M.J.，1983:Plasmid complements of Streptococcus lactis NCDO 712and other lactic streptococci after protoplast-induced curing，J.Bacteriol.154:1-9)。在含有5g/l葡萄糖的M17培养液(Difco)中，在30℃下，常规地培养乳酸乳球菌。
将细菌贮存在甘油储液中，使用15％(v/v)甘油，在-80℃下。
DNA操纵技术
按照Sambrook和Russell(J.Sambrook和D.W.Russell.2001: Molecular Cloning,a laboratory manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)所述的，进行了标准DNA操纵技术。
按照制造商的说明，使用Jetstar 2.0Plasmid Maxiprep(Genomed)，进行了从100mL培养物的大规模质粒DNA分离。按照制造商的说明，使用Nucleospin Plasmid Quick(Macherey-Nagel)试剂盒，进行了从1mL培养物的小规模质粒DNA分离。
在整合质粒pMH84的构建过程中，乳酸乳球菌用作中间宿主。按照Holo和Nes(Holo，H.和I.F.Nes，1989：High-frequency  transformation,by electroporation,of Lactococcus lactis subsp.cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media，Appl.Environ.Microbiol.55:3119-3123)所述的，进行了乳酸乳球菌感受态细胞的制备和电穿孔。
按照WO 2007/085443中所述的，通过电穿孔来转化凝结乳杆菌。
按照制造商的说明，使用高保真度Pwo聚合酶(Roche)，进行了用于克隆目的的PCR反应。
按照WO 2007/085443中所述的，使用菌落-PCR分析来证明氯霉素抗性菌落中pNW33N的存在。
发酵
在50℃下，使用10ml BC培养液或CDM，在螺帽试管(13mL)中进行凝结芽孢杆菌分批发酵。在发酵结束时，取出样品，用于测量发酵培养液在600nm下的浊度、pH和有机酸含量。对于后者，将样品离心，并通过使用Millex GP 0.22μm滤器(Millipore)的过滤来除去上清液中剩余的碎片。将滤液冷冻，直至进一步的分析。
使用衍生和GLC来测量有机酸(甲酸、乙酸、丙酸、乙醇、丁酸、丙酮酸、乳酸、2-羟基丁酸、乙醇酸、草酸、山梨酸、富马酸、琥珀酸、苯甲酸、马来酸、苹果酸、柠檬酸)。将R-和S-乳酸甲基化成甲基-乳酸，并通过手性柱上的顶部空间分析来测量。
实施例1.凝结芽孢杆菌蔗糖利用整合质粒的构建
选定蔗糖发酵凝结芽孢杆菌菌株的随机序列分析揭示了与蔗糖PTS酶II和蔗糖-6-磷酸水解酶基因具有序列同源性的两个基因的区域(分别为scrA和scrB)。使用引物5′-AGTACTGCATGCTTAAAGAGTAGCTTTCGGTGTTAAAGTG-3′(引入SphI位点，SEQ ID NO:6)和5′-AGTACTGAGCTCCTATTTATTAATAGAATGAAGACTCCAGTAGTTCCC-3′(引入SacI位点，SEQ ID NO:7)，与来自蔗糖发酵凝结芽孢杆菌菌株的基因组DNA作为模板DNA结合，用高保真 度PCR产生了含有scrAB基因簇及其启动子(SEQ ID NO:5中所述)的DNA片段。或者scrAB基因簇可以作为具有SEQ ID NO：5中所示序列的合成DNA产生。将凝结芽孢杆菌整合质粒进行了修饰，使得可以在凝结芽孢杆菌DSM 1染色体中整合scrAB基因簇。将染色体整合位点的1.0kb上游和下游片段用于重组。整合载体pMH84是基于乳球菌克隆载体pMH3(WO 2007/085443)并且具有在凝结芽孢杆菌中的热敏复制子。首先，通过凝结芽孢杆菌启动子替代cat启动子。为此，通过翻译融合至cat基因的组成型凝结芽孢杆菌启动子的融合PCR产物替代含有cat基因的pMH3Bg1II-SalI片段，同时引入与cat起始密码子(SEQ ID NO:18)重叠的NcoI位点。使用引物组合(正向)5′-CGCGTCGACTGTGGATAAGACAACAGGATTCGTATG-3′(引入SalI位点，SEQ ID NO:8)和(反向)5′-CTAAATCAATTTTATTAAAGTCCATGGGTCCACCCCGTTCTTTTCTTTTTGTG-3′(引入NcoI位点，SEQ ID NO:9)，以及来自蔗糖发酵凝结芽孢杆菌菌株的基因组DNA作为模板DNA，产生了启动子部分。使用引物组合(正向)5′-CACAAAAAGAAAAGAACGGGGTGGACCCATGGACTTTAATAAAATTGATTTAG-3′(引入NcoI位点，SEQ ID NO:10)和(反向)5′-CGCAGATCTCCTTCTT CAACTAACGGG-3′(引入BglII位点，SEQ ID NO:11)，使用pMH3作为模板，产生了cat基因。将两个产物都用作新PCR反应中的模板，使用启动子正向和cat反向引物。该片段还可以作为具有SEQ ID NO:18中所示序列的合成DNA产生。将所得到质粒命名为pMH71。为了能够多重使用Cre-lox系统，使用引物5′-CCCGTCGACGCTAGCTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTGGATAAGACAACAGGATTCG-3′(引入lox66，SalI和NheI位点，SEQ ID NO:12)和5′-CGCAGATCTTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGTTAG-3′(引入lox71和BglII位点，SEQ ID NO:13)以及pMH71作为模板，通过PCR，在启动子-cat片段两侧引入了lox66和lox71位点(Langer，S.J.，A.P.Ghafoori，M.Byrd，和L.Leinwand，2002:A genetic screen identifies novel non-compatible loxP sites，Nucleic Acids Res.30:3067-3077.， Lambert，J.M.，R.S.Bongers，和M.Kleere-bezem，2007： Cre-lox-based system for multiple gene deletions and selectable-market removal in Lactobacillus plantarum，Appl.Environ.Microbiol.73:1126-1135)。所得到的PCR产物用BglII-SalI消化并用于与pMH71的BglII-SalI启动子-cat片段交换，产生质粒pMH77。使用引物5′-CGCCTCGAGAGATCTGGCCGGGCTTTATGGGAGG-3′(引入XhoI和BglII位点，SEQ ID NO:14)和5′-GCCGAGCTCGCATGCCCCTGATCAACCGGGTCAGTGC(引入SacI和SphI位点，SEQ ID NO:15)以及凝结芽孢杆菌DSM 1染色体DNA作为模板，通过PCR，产生了整合位点的上游片段。使用SacI和XhoI，在pMH77中克隆PCR产物。这产生了pMH82。使用引物5′-CCCGCTAGCCGTTTCAATCACATAGTCGTATTG(引入NheI位点，SEQ ID NO:16)和5′-CCGGTCGACGGCCTTCATGTGCTTTTGCCGCAAATTC(引入SalI位点，SEQ ID NO:17)以及凝结芽孢杆菌DSM 1染色体DNA作为模板，通过PCR，产生了整合位点的下游片段。作为SalI-NheI片段，在pMH82中克隆了PCR产物，产生pMH83。在用相同的酶消化的pMH83中，作为SphI和SacI片段，克隆了含有scrAB基因的DNA片段，这产生了整合载体pMH84。分离质粒pMH84并且通过DNA序列分离证实了scrAB基因簇、上游和下游区域以及lox位点的完整性。
实施例2.凝结芽孢杆菌DSM1中scrAB的基因组整合
为了scrAB基因通过基因组整合至凝结芽孢杆菌DSM1中，通过电穿孔将质粒pMH84转化至该菌株中，并涂布于补充了氯霉素的BC平板上。通过菌落PCR筛选转化体中质粒的存在。将阳性菌落进行培养，用于质粒分离，并通过限制性分析证实了质粒的完整性。选择一个转化体用于进一步的实验。在60℃下培养并且选择氯霉素抗性菌落后，建立了通过双重交叉交换的蔗糖基因的整合。选择一个整合体用于进一步的研究并且作为甘油储液进行贮存。通过融合位点的PCR分析和序列分离证实了该正确的整合。将该菌株命名为凝结芽孢杆菌 DSM 1::scrAB。
实施例3.使用凝结芽孢杆菌的蔗糖发酵
在该实施例中，发明人证明了怎样能够修饰不能有效蔗糖发酵的凝结芽孢杆菌菌株以变成蔗糖发酵的。将来自甘油储液的凝结芽孢杆菌DSM 1和DSM 1::scrAB接种于10ml不含糖的BC肉汤中，并且在120rpm下，在50℃下培养。将过夜培养物转移(2％v/v)至10ml补充了葡萄糖的CDM中。过夜培养后，使培养物成团，并且将团状物重悬浮于10ml不含糖的CDM中。对于每个菌株，从重悬浮的培养物接种(2％v/v)10ml CDM的三个重复部分中，所述CDM补充了5g葡萄糖/升，5g蔗糖/升，或不含糖。在螺帽试管中50小时静止培养后，测定了肉汤上清液在600nm处的浊度、pH和有机酸含量(表1)。结果证明了适当的厌氧生长需要糖，并且凝结芽孢杆菌DSM 1::scrAB能够将蔗糖发酵成乳酸，而凝结芽孢杆菌DSM1不能。糖的不存在导致两种凝结芽孢杆菌菌株都没有生长且没有酸化。在蔗糖的存在下，DSM 1显示出没有生长且没有酸化，而凝结芽孢杆菌DSM 1::scrAB具有良好的生长和酸化。乳酸是培养物上清液中检测到的唯一一种有机酸。这证明了引入凝结芽孢杆菌scrAB基因盒对于使用凝结芽孢杆菌的有效蔗糖发酵是足够的。
表1.50小时培养后的发酵特征a
a数据是来自3次发酵的平均值。有机酸浓度以％(w/w)给出。N.D.，未测定。甲酸(<0.02％)、乙酸(<0.02％)、丙酸(<0.02％)、丁酸(<0.01％)、丙酮酸(<0.02％)、2-羟基丁酸(<0.01％)、乙醇酸(<0.20％)、草酸(<0.02％)、山梨酸(<0.01％)、富马酸(<0.02％)、琥珀酸(<0.02％)、苯甲酸(<0.03％)和马来酸(<0.02％)都低于检测极限。

Claims (10)

1.用于生产目标化合物的方法，包括依靠含蔗糖碳源培养中度嗜热芽孢杆菌菌株，其特征在于，通过用多核苷酸转化不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热芽孢杆菌菌株从所述亲本菌株产生所述中度嗜热芽孢杆菌菌株，所述多核苷酸包括编码具有蔗糖-特异性磷酸转移酶活性和具有i)SEQ ID NO:1的氨基酸序列或ii)与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽的DNA序列和包括编码具有蔗糖-6-磷酸水解酶活性和具有iii)SEQ ID NO:2的氨基酸序列或iv)与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
2.根据权利要求1的方法，其中目标化合物是乳酸。
3.用于构建能够利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌株的方法，包括用多核苷酸转化不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热芽孢杆菌菌株，所述多核苷酸包括编码具有蔗糖-特异性磷酸转移酶活性和具有i)SEQ ID NO:1的氨基酸序列或ii)与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽的DNA序列和包括编码具有蔗糖-6-磷酸水解酶活性和具有iii)SEQ ID NO:2的氨基酸序列或iv)与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
4.根据之前任一项权利要求的方法，其中中度嗜热芽孢杆菌菌株是兼性厌氧的。
5.根据之前任一项权利要求的方法，其中中度嗜热芽孢杆菌菌株是同型乳酸的。
6.根据之前任一项权利要求的方法，其中中度嗜热芽孢杆菌菌株是凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
7.多肽，具有蔗糖-特异性磷酸转移酶活性和具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
8.多肽，具有蔗糖-6-磷酸水解酶活性和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
9.编码权利要求7或8的多肽的多核苷酸。
10.权利要求9的多核苷酸，具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列。
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