JP6528295B1 - ヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体 - Google Patents
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Abstract
Description
2015年採択のパリ協定は、世界全体の温室効果ガスの排出量を迅速に削減することを定めている。これに従い、日本は2030年までに、二酸化炭素やメタンなどの温室効果ガス排出量を2013年に比べて26%削減することを目標としている。
従来、バイオ燃料としては、エタノール、n-ブタノール、イソブタノールが使用されており、その効率的な製造方法が求められている。炭素数4のブタノールは、炭素数2のエタノールより燃料効率が高く、ガソリン(炭素数4〜10)やディーゼルエンジンへの混合が容易であるため既存のエンジンや給油設備をそのまま使用でき、空気中の水分の吸収が少ないため設備が腐食し難いといったメリットがある。中でも、イソブタノールはドロップイン型バイオジェット燃料の原料としてASTM規格に認証されており、航空分野における二酸化炭素排出量削減の取り組みとして、実用化に向けた技術開発が進められている。
非特許文献1は、エシェリヒア コリ(Escherichia coli)に、ラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)のkivD遺伝子と、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のadh2遺伝子を導入した形質転換体を用いることを教えている。
非特許文献2は、エシェリヒア コリに、ラクトコッカス ラクティスのkivD遺伝子と、ラクトコッカス ラクティスのadhA遺伝子を導入した形質転換体を用いることを教えている。
非特許文献3は、バチルス サブチリス(Bacillus subtilis)に、ラクトコッカス ラクティスのkivD遺伝子と、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のadh2遺伝子を導入した形質転換体を用いることを教えている。
非特許文献4は、シェワネラ オネイデンシス(Shewanella oneidensis)に、ラクトコッカス ラクティスのkivD遺伝子と、ラルストニア ユートロファ(Ralstonia eutropha)のadh遺伝子を導入した形質転換体を用いることを教えている。
非特許文献5は、シアノバクテリアのシネココッカス エロンガタス(Synechococcus elongatus)に、ラクトコッカス ラクティスのkivD遺伝子と、エシェリヒア コリのyqhD遺伝子を導入した形質転換体を用いることを教えている。
非特許文献6は、ラルストニア ユートロファ(Ralstonia eutropha)に、ラクトコッカス ラクティスのkivD遺伝子と、ラルストニア ユートロファ(Ralstonia eutropha)のadh遺伝子を高発現するプラスミドを導入した形質転換体を用いることを教えている。
非特許文献7は、ジオバチルス サーモグルコシダシウス(Geobacillus thermoglucosidasius)に、ラクトコッカス ラクティスのkivD遺伝子と、ジオバチルス サーモグルコシダシウスのadhA遺伝子を高発現するプラスミドを導入した形質転換体を用いることを教えている。
ここで、非特許文献5の方法は、光合成細菌であるシアノバクテリアを宿主として用い、炭酸水素ナトリウムを炭素源として用いてイソブタノールを製造する方法である。シアノバクテリアは、植物に比べると炭酸固定能力は高いが、十分な炭酸固定能力ではないため、シアノバクテリアを宿主として用いる方法は、工業的なイソブタノール製造方法として実用化されていない。
従来、燃料、工業原料、飲料などとして用いられるエタノールの多くは、デンプンや各種のバイオマス資源由来の糖類を微生物を用いて発酵させることにより製造されている。
組み換え微生物を用いたエタノール生産方法としては、ピルビン酸を脱炭酸してアセトアルデヒドを生成する反応を触媒するピルビン酸 デカルボキシラーゼ(以下、「PDC」と言うことがある)(EC 4.1.1.1)遺伝子、及び/又はアセトアルデヒドからエタノールへの反応を触媒するアルコール デヒドロゲナーゼ(以下、「ADH」と言うことがある)(EC 1.1.1.1)遺伝子を導入した形質転換体を用いる方法が知られている。
その他の細菌のPDC遺伝子及びADH遺伝子を利用する方法として、非特許文献8は、エシェリヒア コリにサルシナ ベントリキュリ(Sarcina ventriculi)のpdc遺伝子及びラクトバチルス ブレビス(Lactobacillus brevis)のadh遺伝子を導入した形質転換体を用いてエタノールを製造する方法を開示している。
また、非特許文献9は、バチルス メガテリウム(Bacillus megaterium)にサルシナ ベントリキュリのpdc遺伝子と、ジオバチルス ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)のadh遺伝子を導入した形質転換体を用いてエタノールを製造する方法を開示している。
ピルビン酸 デカルボキシラーゼ遺伝子としては上記以外にも、グルコノバクター オキシダンス(Gluconobacter oxydans)、グルコノアセトバクター ジアゾトロフィカス(Gluconoacetobacter diazotrophicus)、アセトバクター パスツリアヌス(Acetobacter pasteurianus)、クロストリジウム アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、ザイモバクター パルマエ(Zymobacter palmae)のピルビン酸 デカルボキシラーゼ遺伝子を利用することが知られている。また、アルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子としては上記以外にも、多様な微生物種のアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することが知られている。
しかし、これらの文献記載の方法は、糖を炭素原料として用いてエタノールを生成する方法であって、二酸化炭素を炭素原料として用いてエタノールを生成する方法ではない。
また、非特許文献11は、シネココッカス属細菌に、ザイモモナス モビリスのpdc遺伝子とシネコシスティス(Synechocystis)属細菌のNADPH依存性ADH遺伝子(slr1192)を導入した形質転換体を用いてエタノールを製造する方法を開示している。
前述した通り、シアノバクテリアの炭酸固定能力は工業的に利用するほどは高くないため、シアノバクテリアを宿主として用いる方法は、工業的なエタノール製造方法として実用化されていない。
アセチルCoAからアセトアルデヒドを介してエタノールを生成する反応は、嫌気条件下でのエタノール生産に重要であることから、一般に、嫌気条件で生育する微生物を宿主としてアルコール生産を行う場合に、アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が使われている。
例えば、非特許文献12は、嫌気条件下で生育するパイロコッカス フリオサス(Pyrococcus furiosus)に、アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子であるadhE遺伝子を導入した形質転換体を用いてエタノールを製造する方法を教えている。
また、非特許文献13は、嫌気条件下で生育するカルディセルロシラプター ベッシー(Caldicellulosiruptor bescii)にadhE遺伝子を導入した形質転換体を用いてエタノールを製造する方法を教えている。
しかし、これらの文献記載の方法は、糖を炭素原料として用いてエタノールを生成する方法であって、二酸化炭素を炭素原料として用いてエタノールを生成する方法ではない。
アラニンは、医薬、食品、又は化学工業原料として重要なアミノ酸であり、その需要が増加している。アラニン製造には、アラニン デヒドロゲナーゼ(EC 1.4.1.1)が利用されている。この酵素は、ピルビン酸とアンモニアとNADHからアラニンを生成する反応を触媒する。
微生物を用いてアラニンを製造する技術として、非特許文献14は、エシェリヒア コリに、バチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)(現在のジオバチルス ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus))のアラニン デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して得た形質転換体を用いてアラニンを生成する方法を教えている。
特許文献3は、エシェリヒア(Escherichia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、又はブレビバクテリウム(Brevibacterium)属細菌に、アースロバクター(Arthrobacter)属細菌のアラニン デヒドロゲナーゼ遺子を導入して得た形質転換体を用いてアラニンを生成する方法を教えている。
非特許文献15は、エシェリヒア コリに、バチルス スフェリカス(Bacillus sphaericus)(現在のリジニバチルス スフェリカス(Lysinibacillus sphaericus))のアラニン デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して得た形質転換体を用いてアラニンを生成する方法を教えている。
非特許文献16は、ザイモモナス モビリスに、バチルス スフェリカス(現在のリジニバチルス スフェリカス)のアラニン デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して得た形質転換体を用いてアラニンを生成する方法を教えている。
非特許文献17は、ラクトコッカス ラクティスに、バチルス スフェリカス(現在のリジニバチルス スフェリカス)のアラニン デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して得た形質転換体を用いてアラニンを生成する方法を教えている。
非特許文献18は、コリネバクテリウム グルタミカムに、バチルス スフェリカス(現在のリジニバチルス スフェリカス)のアラニン デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して得た形質転換体を用いてアラニンを生成する方法を教えている。
しかし、上記方法は何れも、糖を炭素原料として用いてアラニンを生成する方法であって、二酸化炭素を炭素原料として用いてアラニンを生成する方法ではない。
本発明は、二酸化炭素を唯一の炭素源として利用して効率よくエタノールを製造することができるヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体、及びこの形質転換体を用いて効率よくエタノールを製造する方法を提供することを第2の課題とする。
本発明は、二酸化炭素を唯一の炭素源として利用して効率よくアラニンを製造することができるヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体、この形質転換体を用いて効率よくアラニンを製造する方法、及びヒドロゲノフィラス属細菌による高効率なアラニン製造を可能とする遺伝子を提供することを第3の課題とする。
宿主と遺伝子との適合性
ヒドロゲノフィラス属細菌は水素エネルギーを利用して二酸化炭素から有機物質を生成して生育する水素細菌である。一般的に水素細菌の生育速度は極めて遅いが、ヒドロゲノフィラス属細菌は生育速度が速く、植物や光合成細菌に比べて、炭酸固定能力が格段に高い。ヒドロゲノフィラス属細菌は、本来、イソブタノール、エタノールを生成しないため、これらの化合物の生成能を付与するためには、これらの化合物を生成する反応を触媒する酵素の遺伝子を導入する必要がある。また、ヒドロゲノフィラス属細菌は、アラニンを生成するが、工業規模でのアラニン生成能を付与するためには、アラニンを生成する反応を触媒する酵素の遺伝子を導入する必要がある。
しかし、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するベクターを用いて異種遺伝子をヒドロゲノフィラス属細菌に自然界の塩基配列のまま導入しても、機能するタンパク質を発現しない又は十分には発現しない場合が多い。
(i) ヒドロゲノフィラス属細菌は、本来、イソブタノールを生成せず、2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子を持たない。ヒドロゲノフィラス属細菌に、2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子として、ラクトコッカス ラクティスのkivD遺伝子、バチルス サブチリスのalsS遺伝子、ジオバチルス サーモグルコシダシウスのGeoth_3495遺伝子、ジオバチルス サーモデニトリフィカンスのGtng_0348遺伝子、又はクレブシェラ ニューモニエのipdC遺伝子を導入しても、機能しない。特に、ラクトコッカス ラクティスのkivD遺伝子は、種々の宿主内で機能して高活性を発現するため、イソブタノール生成方法に多用されている遺伝子であるが、ヒドロゲノフィラス属細菌内では機能しない。このように、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するベクターを用いて異種遺伝子をヒドロゲノフィラス属細菌に導入しても、機能するタンパク質を発現しない又は十分には発現しない場合が多い。
この点に関して、本発明者は、ヒドロゲノフィラス属細菌における多様な微生物由来の遺伝子の発現可否のデータを蓄積し、この情報蓄積をさらに進め系統化することにより、ラクトコッカス ラクティスのkivD遺伝子のコドン使用をヒドロゲノフィラス属細菌のコドン使用頻度に最適化し、配列番号1の塩基配列からなるコドン最適化kivD遺伝子をヒドロゲノフィラス属細菌に導入することにより、高活性の2-ケト酸デカルボキシラーゼを発現させることに成功した。
(ii) ヒドロゲノフィラス属細菌は、本来、イソブタノールを生成せず、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を持たない。
しかし、ヒドロゲノフィラス属細菌に異種微生物のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、高活性のアルコールデヒドロゲナーゼを発現する。中でも、クレブシェラ ニューモニエのadhP遺伝子、ジオバチルス サーモカテニュラタス(Geobacillus thermocatenulatus)のadhP遺伝子、ジオバチルス サーモグルコシダシウスのadhA遺伝子、及びadhP遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で特に高活性のアルコールデヒドロゲナーゼを発現する。
(iii) ヒドロゲノフィラス属細菌に、上記(i)に記載のコドン最適化2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子と、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して得た形質転換体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として用いて効率よくイソブタノールを生成する。
第1のエタノール生成能を有する形質転換体
(i) ヒドロゲノフィラス属細菌は、本来、エタノールを生成せず、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を持たない。ヒドロゲノフィラス属細菌に、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子として、従来エタノール生成の報告があるザイモモナス モビリスのpdc遺伝子や、ザイモバクター パルマエのpdc遺伝子、又はアセトバクター パスツリアヌスのpdc遺伝子を導入しても、ヒドロゲノフィラス属細菌内では機能しない。
一方、グルコノバクター オキシダンスのpdc遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、高活性のピルビン酸デカルボキシラーゼを発現する。
(ii) ヒドロゲノフィラス属細菌は、本来、エタノールを生成せず、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を持たない。
しかし、ヒドロゲノフィラス属細菌に異種微生物のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、高活性のアルコールデヒドロゲナーゼを発現する。中でも、クレブシェラ ニューモニエのadhP遺伝子、ジオバチルス サーモカテニュラタスのadhP遺伝子、ジオバチルス サーモグルコシダシウスのadhA遺伝子、及びadhP遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で特に高活性のアルコールデヒドロゲナーゼを発現する。
(iii) ヒドロゲノフィラス属細菌に、グルコノバクター オキシダンスのpdc遺伝子と、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して得た形質転換体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として用いて効率よくエタノールを生成する。
(i) ヒドロゲノフィラス属細菌は、本来、エタノールを生成せず、アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を持たない。
しかし、ヒドロゲノフィラス属細菌に異種微生物のアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、高活性のアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼを発現する。中でも、エシェリヒア コリ、又はクロストリジウム サーモセラム(Clostridium thermocellum)のadhE遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で、特に高活性のアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼを発現する。その結果、得られた形質転換体は、効率よくエタノールを生成する。
(ii) アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼは好気条件下で活性が阻害されるが、エシェリヒア コリのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のGluをLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、又はHisに置換した変異アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ、及びクロストリジウム サーモセラムのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの575番目のAspをAsnに置換した変異アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼは、好気条件下で活性を示す。これらの変異アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼをコードする変異adhE遺伝子であるadhE(E568K、E568A、E568L、E568N、E568G、E568S、E568R、及びE568H)並びにadhE(D575N)のそれぞれを導入したヒドロゲノフィラス属細菌は、好気条件下で、高活性のアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼを発現する。
ヒドロゲノフィラス属細菌は、嫌気条件下では生育できないため、ヒドロゲノフィラス属細菌を用いた物質生産は好気条件で行う必要がある。この点、これらの変異adhE遺伝子を導入したヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として用いて、好気条件下で一層効率良くエタノールを生成できる。
(i) ヒドロゲノフィラス属細菌は、生存に必要な量のアラニンを生成するが、工業的に利用できる量のアラニンは生成しない。ヒドロゲノフィラス属細菌に異種微生物のアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、高活性のアラニンデヒドロゲナーゼを発現し、得られた形質転換体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として用いて効率よくアラニンを生成する。中でも、ジオバチルス ステアロサーモフィラスのalaD1遺伝子、若しくはalaD2遺伝子、又はサーマス サーモフィラス(Thermus thermophilus)のalaD1遺伝子、若しくはalaD2遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で、特に高活性のアラニンデヒドロゲナーゼを発現する。
(ii) アラニンデヒドロゲナーゼのN末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分のアミノ酸配列を付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、このアミノ酸配列を付加していないアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に比べて、ヒドロゲノフィラス属細菌内で高い酵素活性を発現する。その結果、この修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として用いて一層効率良くアラニンを生成する。
項1. 下記の(a1)、(a2)、又は(a3)のDNA。
(a1)配列番号1の塩基配列からなるDNA
(a2)配列番号1と90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(a3)配列番号1と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項2. ヒドロゲノフィラス属細菌に、(a)項1に記載のDNA、及び(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体。
項3. (b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)、又は(b6)のDNAである項2に記載の形質転換体。
(b1)配列番号2、3、4、若しくは5の塩基配列からなるDNA
(b2)配列番号2、3、4、若しくは5と90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b3)配列番号2、3、4、若しくは5と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b4)配列番号6、7、8、若しくは9のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(b5)配列番号6、7、8、若しくは9と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b6)配列番号6、7、8、若しくは9のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項4. ヒドロゲノフィラス属細菌がヒドロゲノフィラス サーモルテオラスである項2又は3に記載の形質転換体。
項5. 項2〜4の何れかに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むイソブタノールの製造方法。
(c1)配列番号10の塩基配列からなるDNA
(c2)配列番号10と90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c3)配列番号10と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c4)配列番号11のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(c5)配列番号11と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c6)配列番号11のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項7. (b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)、又は(b6)のDNAである項6に記載の形質転換体。
(b1)配列番号2、3、4、若しくは5の塩基配列からなるDNA
(b2)配列番号2、3、4、若しくは5と90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b3)配列番号2、3、4、若しくは5と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b4)配列番号6、7、8、若しくは9のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(b5)配列番号6、7、8、若しくは9と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b6)配列番号6、7、8、若しくは9のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項8. ヒドロゲノフィラス属細菌がヒドロゲノフィラス サーモルテオラスである項6又は7に記載の形質転換体。
項9. 項6〜8の何れかに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むエタノールの製造方法。
項11. (d)アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記(d1)、(d2)、(d3)、(d4)、(d5)、(d6)、(d7)、(d8)、又は(d9)のDNAである項10に記載の形質転換体。
(d1)配列番号12、又は13の塩基配列からなるDNA
(d2)配列番号12、又は13と90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d3)配列番号12、又は13と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d4)配列番号14、又は15のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(d5)配列番号14、又は15と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d6)配列番号14、又は15のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d7)配列番号16、17、18、19、20、21、22、23、又は24のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(d8)配列番号16、17、18、19、20、21、22、若しくは23と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド(但し、アミノ酸番号568のアミノ酸はLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、若しくはHisである)をコードするDNA、又は配列番号24と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド(但し、アミノ酸番号575のアミノ酸はAsnである)をコードするDNA
(d9)配列番号16、17、18、19、20、21、22、若しくは23において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド(但し、アミノ酸番号568のアミノ酸はLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、若しくはHisである)をコードするDNA、又は配列番号24において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド(但し、アミノ酸番号575のアミノ酸はAsnである)をコードするDNA
項12. (d7)のDNAが、配列番号25、26、27、又は28の塩基配列からなるDNAである項11に記載の形質転換体。
項13. ヒドロゲノフィラス属細菌がヒドロゲノフィラス サーモルテオラスである項10〜12の何れかに記載の形質転換体。
項14. 項10〜13の何れかに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むエタノールの製造方法。
(d7’)配列番号24のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(d8’)配列番号24と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
(d9’)配列番号24のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
項16. 下記の(d10’)、(d11’)、又は(d12’)のDNAからなるアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(但し、(d11’)及び(d12’)のDNAの5'末端から1723〜1725番目の3ヌクレオチドはAAC又はAATである)。
(d10’)配列番号27、又は28の塩基配列からなるDNA
(d11’)配列番号27、又は28と90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d12’)配列番号27、又は28と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
項18. (e)アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記(e1)、(e2)、(e3)、(e4)、(e5)、(e6)、(e7)、(e8)、(e9)、(e10)、(e11)、又は(e12)のDNAである項17に記載の形質転換体。
(e1)配列番号29、30、31、又は32の塩基配列からなるDNA
(e2)配列番号29、30、31、又は32と90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e3)配列番号29、30、31、又は32と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e4)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(e5)配列番号33、34、35、又は36と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e6)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e7)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列のN末端に配列番号37のアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(e8)配列番号33、34、35、又は36と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列のN末端に配列番号37のアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e9)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列のN末端に配列番号37のアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e10)配列番号29、30、31、又は32の塩基配列の5’末端に配列番号38の塩基配列を付加した塩基配列からなるDNA
(e11)配列番号29、30、31、又は32と90%以上の同一性を有する塩基配列の5’末端に配列番号38の塩基配列を付加した塩基配列からなるDNAであり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e12)配列番号29、30、31、又は32と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAの塩基配列の5’末端に配列番号38の塩基配列を付加した塩基配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項19. ヒドロゲノフィラス属細菌がヒドロゲノフィラス サーモルテオラスである項17、又は18に記載の形質転換体。
項20. 項17〜19の何れかに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むアラニンの製造方法。
項22. 配列番号39のアミノ酸配列からなる項21に記載の修飾アラニンデヒドロゲナーゼ。
項23. アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’末端に配列番号38の塩基配列からなるポリヌクレオチドを付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子。
項24. 配列番号40の塩基配列からなる項23に記載の修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子。
二酸化炭素は、物理的又は化学的に固定することもできるが、生物を利用して二酸化炭素を固定すれば、それにより食料、飼料、燃料などとして利用できる有機物を生産することができる。即ち、二酸化炭素そのものを資源として直接的に有価化学品に変換することができる。これにより、二酸化炭素の増加による地球温暖化と、食料、飼料、燃料の確保困難という2つの問題を共に解決できる。
上記の通り、ヒドロゲノフィラス属細菌は、二酸化炭素固定能力を有する生物の中でも、特に優れた二酸化炭素固定能力を有するため、本発明の形質転換体を用いれば、工業的に、二酸化炭素を固定してイソブタノール、エタノール、又はアラニンを製造することができる。
(1)イソブタノール生成能を有する形質転換体
本発明のコドン最適化2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、ラクトコッカス ラクティスの2-ケト酸デカルボキシラーゼのコドンを最適化したものであり、ラクトコッカス ラクティスの2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子(kivD)とは塩基配列が異なっている。この遺伝子は、配列番号1の塩基配列からなるDNAである。このコドン最適化2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能して、2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を発現することができる。
なお、このコドン最適化2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子から発現する2-ケト酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列は、ラクトコッカス ラクティスの2-ケト酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列(配列番号41)と同じである。
本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYX ver.17(GENETYX 株式会社ゼネティックス製)により算出した値である。
本発明において、「ストリンジェントな条件」は、6×SSCの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、50〜60℃の温度条件下、16時間ハイブリダイゼーションを行い、0.1×SSCの塩濃度の溶液中で洗浄を行う条件をいう。
本発明は、上記コドン最適化2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子又はそのホモログを含むベクター(特に、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するベクター)も包含する。
従って、本発明は、宿主のヒドロゲノフィラス属細菌に、(a)(a1)配列番号1の塩基配列からなるDNA、(a2)配列番号1と90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、又は(a3)配列番号1と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、及び(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子であるDNAを導入することにより得られる形質転換体を包含する。換言すれば、この形質転換体は、外来性の上記(a)及び(b)のDNAを有する。
配列番号6、7、8、及び9は、それぞれ、クレブシェラ ニューモニエ、ジオバチルス サーモカテニュラタス、ジオバチルス サーモグルコシダシウスのアルコールデヒドロゲナーゼADHP、及びジオバチルス サーモグルコシダシウスのアルコールデヒドロゲナーゼADHAのアミノ酸配列である。
本発明において、アミノ酸配列の同一性は、GENETYX ver.17(GENETYX 株式会社ゼネティックス製)により算出した値である。
本発明において、複数個としては、1〜5個、中でも1〜3個、中でも1〜2個、特に1個が挙げられる。
第1のエタノール生成能を有する形質転換体
本発明は、宿主のヒドロゲノフィラス属細菌に、(c)(c1)配列番号10の塩基配列からなるDNA、(c2)配列番号10と90%以上、中でも95%以上、中でも98%以上、中でも99%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、又は(c3)配列番号10と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、及び(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のDNAを導入することにより得られる形質転換体を包含する。換言すれば、この形質転換体は、外来性の(c)及び(b)のDNAを有する。この形質転換体は、(c)及び(b)のDNAを有することにより、エタノールを生成することができる。
配列番号11は、グルコノバクター オキシダンスのピルビン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号6、7、8、及び9は、それぞれ、クレブシェラ ニューモニエ、ジオバチルス サーモカテニュラタス、ジオバチルス サーモグルコシダシウスのアルコールデヒドロゲナーゼADHP、及びジオバチルス サーモグルコシダシウスのアルコールデヒドロゲナーゼADHAのアミノ酸配列である。
本発明は、宿主のヒドロゲノフィラス属細菌に、(d)アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のDNAを導入することにより得られる形質転換体を包含する。換言すれば、この形質転換体は、外来性の(d)アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のDNAを有する。この形質転換体は、(d)のDNAを有することにより、エタノールを生成することができる。
また、(d2)配列番号12又は13の塩基配列からなるDNAと90%以上、中でも95%以上、中でも98%以上、中でも99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAや、(d3)配列番号12又は13と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも好ましく用いることができる。
配列番号14は、エシェリヒア コリのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ(ADHE)のアミノ酸配列であり、配列番号15は、クロストリジウム サーモセラムのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ(ADHE)のアミノ酸配列である。
その結果、エシェリヒア コリのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ(ADHE)のアミノ酸配列である配列番号14において、アミノ酸番号568のGluがLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、又はHisに置換された変異ADHEは、ヒドロゲノフィラス属細菌内で、好気条件下で高活性を発現できることが分かった。アミノ酸番号568のGluがそれぞれLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、及びHisに置換された変異ADHEのアミノ酸配列を配列番号16、17、18、19、20、21、22、及び23に示す。
中でも、配列番号14において、アミノ酸番号568のGluがLysに置換された配列番号16のアミノ酸配列からなる変異ADHE(E568K)が特に好ましい。
但し、(d8)及び(d9)に記載のポリペプチドにおいて、アミノ酸番号568のアミノ酸は、それぞれ又は上記順で、Lys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、又はHisである。
また、発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がAlaとなるadhEの塩基配列は、配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがGCT、GCC、GCA、又はGCGに置換された塩基配列である。
また、発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がLeuとなるadhEの塩基配列は、配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGに置換された塩基配列である。
また、発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がAsnとなるadhEの塩基配列は、配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがAAT又はAACに置換された塩基配列である。
また、発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がGlyとなるadhEの塩基配列は、配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがGGT、GGC、GGA、又はGGGに置換された塩基配列である。
また、発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がSerとなるadhEの塩基配列は、配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCに置換された塩基配列である。
また、発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がArgとなるadhEの塩基配列は、配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがCGT、CGC、CGA、AGA、又はAGGに置換された塩基配列である。
また、発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がHisとなるadhEの塩基配列は、配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがCAT又はCACに置換された塩基配列である。
中でも、ヒドロゲノフィラス属細菌によるエタノール生成効率が良い点で、配列番号25又は26が好ましく、配列番号25がより好ましい。
即ち、アミノ酸番号568がLysであるエシェリヒア コリの変異ADHEをコードするDNAの上記ホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはAAG又はAAAである。
アミノ酸番号568がAlaであるエシェリヒア コリの変異ADHEをコードするDNAのホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはGCT、GCC、GCA、又はGCGである。
アミノ酸番号568がLeuであるエシェリヒア コリの変異ADHEをコードするDNAの上記ホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGである。
アミノ酸番号568がAsnであるエシェリヒア コリの変異ADHEをコードするDNAの上記ホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはAAT又はAACである。
アミノ酸番号568がGlyであるエシェリヒア コリの変異ADHEをコードするDNAの上記ホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはGGT、GGC、GGA、又はGGGである。
アミノ酸番号568がSerであるエシェリヒア コリの変異ADHEをコードするDNAの上記ホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCである。
アミノ酸番号568がArgであるエシェリヒア コリの変異ADHEをコードするDNAの上記ホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはGCT、CGC、CGA、AGA、又はAGGである。
アミノ酸番号568がHisであるエシェリヒア コリの変異ADHEをコードするDNAの上記ホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはCAT又はCACである。
但し、(d8)及び(d9)に記載のクロストリジウム サーモセラムの変異ADHEのホモログにおいて、アミノ酸番号575のアミノ酸はAsnである。
発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの575番目のアミノ酸がAsnとなる変異adhEの塩基配列は、クロストリジウム サーモセラムのadhE遺伝子の塩基配列である配列番号13の塩基番号1723〜1725のGACがAAC又はAATに置換された塩基配列である(配列番号27又は28)。中でも、配列番号27の塩基配列からなるDNAが好ましい。
但し、配列番号27又は28の塩基配列からなるクロストリジウム サーモセラムの変異adhEのホモログにおいて、塩基番号1723〜1725のヌクレオチドはAAC又はAATである。
このポリペプチドは、ヒドロゲノフィラス属細菌内で発現させて、エタノール生成に好適に用いることができ、或いは、酵素反応によるエタノール生成に用いることもできる。
また、本発明は、このアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクター(特に、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するベクター)を包含する。
このアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びそれを含むベクターは、ヒドロゲノフィラス属細に導入して、エタノール生成に好適に用いることができる。
本発明では、被験ポリペプチドが、アセチルCoAを基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性とアセトアルデヒドを基質とするアルコールデヒドロゲナーゼ活性の両方を示す場合にアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼがあると判定する。
本発明において、ポリペプチドがアセチルCoAを基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有することは、被験ポリペプチドを、NADHの共存下でアセチルCoAと反応させ、340nmの吸光度の減少を検出することにより確認する。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、アセチルCoAからアセトアルデヒドを生成し、それに伴いNADHがNADに変換されるため、NADH量の減少を340nmの吸光度減少を指標に検出する。被験ポリペプチドが少しでも340nmの吸光度を減少させればアセチルCoAを基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性があると判定する。
ポリペプチドがアセトアルデヒドを基質とするアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有することは、被験ポリペプチドを、NADHの共存下でアセトアルデヒドと反応させ、340nmの吸光度の減少を検出することにより確認する。アルコールデヒドロゲナーゼは、アセトアルデヒドからエタノールを生成し、それに伴いNADHがNADに変換されるため、NADH量の減少を340nmの吸光度減少を指標に検出する。具体的には、実施例の項目に記載の方法を実施する。被験ポリペプチドが少しでも340nmの吸光度を減少させればアセトアルデヒドを基質とするアルコールデヒドロゲナーゼ活性があると判定する。
本発明は、宿主のヒドロゲノフィラス属細菌に、(e)アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体を包含する。換言すれば、この形質転換体は、外来性のアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する。ヒドロゲノフィラス属細菌は生存に必要な分のアラニンを生成するが、その量は工業的に利用できるものではない。本発明の形質転換体は、外来性のアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を有することにより、アラニンの生成量が向上している。
ジオバチルス ステアロサーモフィラスのalaD1の塩基配列は配列番号29であり、ジオバチルス ステアロサーモフィラスのalaD2の塩基配列は配列番号30である。また、サーマス サーモフィラスのalaD1の塩基配列は配列番号31であり、サーマス サーモフィラスのalaD2の塩基配列は配列番号32である。
中でも、ジオバチルス ステアロサーモフィラスのalaD2(配列番号30)が、特にヒドロゲノフィラス属細菌内でアラニンデヒドロゲナーゼ活性を高発現するため好ましい。
配列番号33は、ジオバチルス ステアロサーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD1のアミノ酸配列であり、配列番号34は、ジオバチルス ステアロサーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD2のアミノ酸配列である。また、配列番号35は、サーマス サーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD1のアミノ酸配列であり、配列番号36は、サーマス サーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD2のアミノ酸配列である。
中でも、ジオバチルス ステアロサーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD2が好ましい。
この場合、マルトース結合タンパク質のN末端部分のC末端がアラニンデヒドロゲナーゼのN末端と連結するように付加する。また、マルトース結合タンパク質のN末端部分をコードするDNAの3’末端がアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’末端と連結するように付加する。
詳述すれば、(e7)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列のN末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分のアミノ酸配列(配列番号37)が付加された修飾アミノ酸配列をコードするDNAをヒドロゲノフィラス属細菌の形質転換に好ましく用いることができる。ジオバチルス ステアロサーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD2(配列番号34)のN末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分(配列番号37)を付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は配列番号39である。
さらに、(e11)配列番号29、30、31、又は32と90%以上、中でも95%以上、中でも98%以上、中でも99%以上の同一性を有する塩基配列の5’末端に、マルトース結合タンパク質のN末端部分をコードする塩基配列(配列番号38)が付加された塩基配列からなるDNAであり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAや、(e12)配列番号29、30、31、又は32と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAの塩基配列の5’末端に、マルトース結合タンパク質のN末端部分をコードする塩基配列(配列番号38)が付加された塩基配列からなるDNAであり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを用いることもできる。
この修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、及びそれを含むベクターは、ヒドロゲノフィラス属細菌に導入して、アラニンを生成させるのに好適に使用できる。
この修飾アラニンデヒドロゲナーゼは、ヒドロゲノフィラス属細菌内で発現させて、アラニン生成に好適に用いることができ、或いは、酵素反応によるアラニン生成に用いることもできる。
また、本発明において、ある活性を有するポリペプチドの「ホモログ」は、そのポリペプチドに類似したアミノ酸配列を有し(中でも、そのポリペプチドのアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつその活性を有するポリペプチドや、そのポリペプチドのアミノ酸配列において1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつその活性を有するポリペプチドをいう。
次に、ヒドロゲノフィラス属細菌に、上記イソブタノール生成のための遺伝子、上記エタノール生成のための遺伝子、又は上記アラニン生成のための遺伝子を導入して形質転換体を得る方法について説明する。
宿主
ヒドロゲノフィラス属細菌としては、ヒドロゲノフィラス サーモルテオラス(Hydrogenophilus thermoluteolus)、ヒドロゲノフィラス ハロラブダス(Hydrogenophilus halorhabdus)、ヒドロゲノフィラス デニトリフィカンス(Hydrogenophilus denitrificans)、ヒドロゲノフィラス ハルシ(Hydrogenophilus hirschii)、ヒドロゲノフィラス アイランディカス(Hydrogenophilus islandicus)、ヒドロゲノフィラス属細菌Mar3株(Hydrogenophilus sp. Mar3)が挙げられる。中でも、炭酸固定微生物としてトップレベルの生育速度ひいては炭酸固定能力を有する点で、ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスが好ましい。
ヒドロゲノフィラス属細菌は地球上のいたる所から簡単に分離できる。ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスの好ましい株として、TH-1(NBRC 14978)株が挙げられる。ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスTH-1(NBRC 14978)株は、炭酸固定微生物としてトップの生育速度を示す〔Agricultural and Biological Chemistry, 41, 685-690 (1977)〕。ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスNBRC 14978株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
上記DNAを宿主に導入するためのプラスミドベクターは、ヒドロゲノフィラス属細菌内での自律複製機能を司るDNAを含めば良く、例えば、広宿主域ベクターであるpRK415(GenBank: EF437940.1)、pBHR1(GenBank: Y14439.1)、pMMB67EH(ATCC 37622)、pCAR1(NCBI Reference Sequence: NC_004444.1) 、pC194(NCBI Reference Sequence: NC_002013.1)、pK18mobsacB(GenBank: FJ437239.1)、pUB110(NCBI Reference Sequence: NC_001384.1)などが挙げられる。
また、好ましいプロモーターとしては、tacプロモーター、lacプロモーター、trcプロモーター、又はOxford Genetics社OXB1,OXB11〜OXB20の各プロモーターなどが挙げられ、好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、バクテリオファージλt0転写ターミネーターなどが挙げられる。
形質転換は、塩化カルシウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション法、電気パルス法などの公知の方法で行える。
何れの場合も、水素、酸素、及び二酸化炭素を含む混合ガス、好ましくは水素、酸素、及び二酸化炭素からなる混合ガスを供給しながら培養すればよい。有機培地を使用する場合は、水素、酸素、及び二酸化炭素を含む混合ガス、例えば空気の通気で良い。二酸化炭素ガスを供給しない場合は、炭素源として炭酸塩を含む培地を用いればよい。混合ガスは、密閉された培養容器に封入又は連続供給して、振盪培養することで培地内に溶解させてもよく、培養容器を密閉型又は開放型とし、かつバブリングにより培地内に溶解させてもよい。
供給ガス中の水素、酸素、二酸化炭素の容量比(水素:酸素:二酸化炭素)は、1.75〜7.5:1:0.25〜3が好ましく、5〜7.5:1:1〜2がより好ましく、6.25〜7.5:1:1.5がさらにより好ましい。また、ヒドロゲノフィラス属細菌は好熱細菌であるため、培養温度は、35〜55℃が好ましく、37〜52℃がより好ましく、50〜52℃がさらにより好ましい。
上記説明したヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体を用いてイソブタノール、エタノール、又はアラニンを製造するに当たっては、水素、酸素、及び二酸化炭素を含む混合ガスを供給しながら、無機培地又は有機培地を用いて形質転換体を培養すればよい。
供給されるガスは、水素、酸素、及び二酸化炭素からなる混合ガスとすることが好ましいが、効率的にイソブタノール、エタノール、又はアラニンを生成できる範囲で異種ガスが混入していてもよい。
ヒドロゲノフィラス属細菌は、水素をエネルギー源として、二酸化炭素を唯一の炭素源として生育できるため、特に、炭素源として実質的に二酸化炭素だけを用いて(特に、二酸化炭素だけを用いて)上記化合物を製造することにより、効率的に二酸化炭素を固定できる。従って、有機物や炭酸塩などの炭素源を含まない無機培地を用いること、即ち、実質的に二酸化炭素だけを炭素源として(特に、二酸化炭素だけを炭素源として)培養することが好ましい。「炭素源として実質的に二酸化炭素だけを用いる」ことは、不可避の量の他の炭素源が混入する場合も包含する。なお、二酸化炭素を供給せず、糖、有機酸、アミノ酸などの有機物や炭酸塩を含む培地を用いることもできる。
培地のpHは、6.2〜8が好ましく、6.4〜7.4がより好ましく、6.6〜7がさらにより好ましい。この範囲であれば、菌の生育及び混合ガスの培地中への溶解が良く、目的化合物を効率よく製造できる。
供給ガス中の水素、酸素、二酸化炭素の容量比(水素:酸素:二酸化炭素)は、1.75〜7.5:1:0.25〜3が好ましく、5〜7.5:1:1〜2がより好ましく、6.25〜7.5:1:1.5がさらにより好ましい。この範囲であれば、菌の生育が良く、目的化合物を効率よく製造できる。
混合ガス又は原料ガスの供給速度は、培地1L当たり、10.5〜60 L/時間、中でも10.5〜40 L/時間、中でも10.5〜21 L/時間とすればよい。この範囲であれば、形質転換体の生育が良く、目的化合物を効率よく製造できると共に、混合ガスの無駄が抑えられる。
培養温度は、35〜55℃が好ましく、37〜52℃がより好ましく、50〜52℃がさらにより好ましい。この範囲であれば、形質転換体の生育が良く、目的化合物を効率よく製造できる。
上記のようにして培養することにより、反応液中に目的化合物であるイソブタノール、エタノール、又はアラニンが生成される。反応液を回収することにより目的化合物を回収できるが、さらに、公知の方法で目的化合物を反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、エタノール、イソブタノールについては、分留、抽出、超音波霧化分離などが挙げられ、アラニンについては、各種クロマトグラフィー、晶析などが挙げられる。
イソブタノール生成能付与のための遺伝子、エタノール生成能付与のための遺伝子、及びアラニン生成能付与のための遺伝子の導入に共通して用いたプラスミドベクターの構築方法を、以下に説明する。
先ず、広宿主域ベクターpRK415(GenBank: EF437940.1)〔Gene, 70, 191-197 (1998)〕を鋳型として、PCRを行った。テトラサイクリン遺伝子領域を除く残りのプラスミド領域のDNA断片を増幅すべく、下記の一対のプライマーを合成し、使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。
pRK415プラスミド配列増幅用プライマー
(a-1) 5’-CGTGGCCAACTAGGCCCAGCCAGATACTCCCGATC-3’(配列番号42)
(b-1) 5’-TGAGGCCTCATTGGCCGGAGCGCAACCCACTCACT-3’(配列番号43)
なお、プライマー(a-1)及び(b-1)には、SfiI制限酵素部位が付加されている。
nptII遺伝子配列増幅用プライマー
(a-2) 5’-ctgGGCCTAGTTGGCCacgtagaaagccagtccgc-3’(配列番号44)
(b-2) 5’-tccGGCCAATGAGGCCtcagaagaactcgtcaaga-3’(配列番号45)
なお、プライマー(a-2)及び(b-2)には、SfiI制限酵素部位が付加されている。
このようにして調製したDNA断片をそれぞれ制限酵素SfiIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を反応させてライゲーション液を得た。得られたライゲーション液で、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159-162 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出した。このプラスミドDNAを制限酵素SfiIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、pRK415プラスミドに由来する約2.0-kb及び3.0-kb及び3.7-kbのDNA断片に加え、nptII遺伝子配列の約1.1-kb DNA断片が認められた。
構築されたプラスミドをpCYK01と命名した。
(2-1)λt0ターミネーター配列のDNA断片の調製
λt0ターミネーター配列のDNAを作成するため、下記の一対のプライマーを合成し、PCRに使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて行った。各プライマー同士のエクステンションとするため、鋳型のDNAは含んでいない。
λt0ターミネーター配列調製用プライマー
(a-3) 5’-GCATTAATCcttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccg -3’(配列番号46)
(b-3) 5’-caccgtgcagtcgatgGATctggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggag -3’(配列番号47)
プライマー(a-3)及び(b-3)の3’側の塩基配列は互いに相補的になっている。
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、λt0ターミネーター配列に相当する、約0.13-kbのDNA断片が検出された。
Tacプロモーターを含有するプラスミドpMAL-c5X(ニュー・イングランド・バイオラボ社製)を鋳型として、PCRを行った。PCRに際して、tacプロモーター配列を増幅するべく、下記の一対のプライマーを合成し、使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法で行った。
tacプロモーター配列増幅用プライマー
(a-4) 5’-TTATTGGTGAGAATCCAGATCCATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCT-3’(配列番号48)
(b-4) 5’-gcaagcttggagtgatcatcgtATGCATATGCGTTTCTCCTCCAGATCCctgtttcctgtgtgaaattgt
-3’(配列番号49)
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、tacプロモーターに相当する約0.3-kbのDNA断片が検出された。
上記(2-1)及び(2-2)で調製したDNA断片をアガロースゲルから切り出し、ゲルを凍結及び融解することで、ゲルからDNAを回収した。回収したλt0ターミネーター配列及びtacプロモーター配列に相当するDNA断片を混合して鋳型とし、オーバーラップエクステンションPCR(overlap extension PCR)を行った。オーバーラップエクステンションPCRに際しては、λt0ターミネーターの下流にtacプロモーターが連結したDNAを作成するべく、上記の(a-3)と(b-4)のプライマーの組み合わせを使用した。なお、鋳型DNA断片を増幅する際に用いたプライマーである(b-3)及び(a-4)の5’側の塩基配列は互いに相補的になっている。また、プライマー(a-3)及び(b-4)には、それぞれPshBI、HindIII制限酵素部位が付加されている。
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、λt0ターミネーターの下流にtacプロモーターが連結したDNAに相当する、約0.4-kbのDNA断片が検出された。
得られたライゲーション液で、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出した。このプラスミドDNAを制限酵素PshBI及びHindIIIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK01の約9.6-kbのDNA断片に加え、λt0ターミネーターの下流にtacプロモーターが連結した約0.4-kbのDNA断片が認められた。
rrnBターミネーター配列を含有するプラスミドpMAL-c5X(ニュー・イングランド・バイオラボ社製)を鋳型として、PCRを行った。PCRに際して、rrnBターミネーター配列を増幅するべく、下記の一対のプライマーを合成し、使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法で行った。
rrnBターミネーター配列増幅用プライマー
(a-5) 5’-ctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtg-3’(配列番号50)
(b-5) 5’-CGCAATTGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATC-3’(配列番号51)
なお、プライマー(a-5)及び(b-5)には、それぞれ、EcoRI及びMunI制限酵素部位が付加されている。
生成した反応液を1%アガロースゲルにより電気泳動に供した結果、rrnBターミネーター配列に相当する約0.6-kbのDNA断片が検出された。
得られたライゲーション液で、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、このプラスミドを制限酵素EcoRI及びMunIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記(2-3)のプラスミドの約10.0-kbのDNA断片に加え、rrnBターミネーター配列に相当する約0.6-kbのDNA断片が認められた。
構築された遺伝子発現用クローニングベクターをpCYK21と命名した。
(3-1)ラクトコッカス ラクティスの2-ケト酸 デカルボキシラーゼ遺伝子のコドン最適化
ラクトコッカス ラクティスの2-ケト酸 デカルボキシラーゼ(2-keto acid decarboxylase)をコードする遺伝子kivDのコドン使用をヒドロゲノフィラス サーモルテオラスTH-1株(NBRC 14978)のコドン使用頻度に最適化し、その塩基配列のDNA断片(配列番号1)をジェンスクリプトジャパン株式会社にて遺伝子合成した。
合成したコドン最適化遺伝子の約1.7-kbのDNA断片及び上述のクローニングベクターpCYK21の約10.6-kbのDNA断片を各々制限酵素NdeI及びHindIIIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
A固体培地上の生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地〔(NH4)2SO4 3.0 g、KH2PO4 1.0 g、K2HPO4 2.0 g、NaCl 0.25 g、FeSO4・7H2O 0.014 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、CaCl2 0.03 g、MoO3 4.0 mg、ZnSO4・7H2O 28 mg、CuSO4・5H2O 2.0 mg、H3BO3 4.0 mg、MnSO4・5H2O 4.0 mg、CoCl2・6H2O 4.0 mgを蒸留水1Lに溶解(pH 7.0)〕5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、このプラスミドを制限酵素NdeI及びHindIIIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、コドン最適化遺伝子の約1.7-kbのDNA断片が認められた。
コドン最適化ラクトコッカス ラクティスkivD遺伝子を含むプラスミドをpC-opt-kivDと命名した。pC-opt-kivDを有するヒドロゲノフィラス サーモルテオラス組み換え株をKDC01株と命名した。
ラクトコッカス ラクティスNBRC 100933、バチルス サブチリスNBRC 13719、ジオバチルス サーモグルコシダシウスNBRC 107763、ジオバチルス サーモデニトリフィカンスATCC 29492、及びクレブシェラ ニューモニエNBRC 14940から、常法に従い、ゲノムDNAを抽出した。
(a-6) 5’-GCACATATGTATACAGTAGGAGATTACCTATTAGA-3’(配列番号52)
(b-6) 5’-GCAGGATCCTTATGATTTATTTTGTTCAGCAAATA-3’(配列番号53)
なお、プライマー(a-6)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-6)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。
バチルス サブチリスalsS遺伝子増幅用プライマー
(a-7) 5’-GCACATATGACAAAAGCAACAAAAGAACAAAAATC-3’(配列番号54)
(b-7) 5’-GCAGGATCCTAGAGAGCTTTCGTTTTCATGAGTTC-3’(配列番号55)
なお、プライマー(a-7)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-7)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。
ジオバチルス サーモグルコシダシウスGeoth_3495遺伝子増幅用プライマー
(a-8) 5’-CGAGTCCATATGAAACAGACTATCCGCAATATCAG-3’(配列番号56)
(b-8) 5’-GCAGGATCCTTACCGAGAATTCGAGCGCTTTCGCA-3’(配列番号57)
なお、プライマー(a-8)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-8)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。
ジオバチルス サーモデニトリフィカンスGtng_0348遺伝子増幅用プライマー
(a-9) 5’-CGAGTCCATATGAAAAAGCGGGTGATGCGTGGCCT-3’(配列番号58)
(b-9) 5’-GCAGGATCCTCATCTGTCTGACAGTCTCATCGTCA-3’(配列番号59)
なお、プライマー(a-9)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-9)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。
クレブシェラ ニューモニエipdC遺伝子増幅用プライマー
(a-10) 5’-CGAGTCCATATGCAACCGACCTACACTATTGGGGA-3’(配列番号60)
(b-10) 5’-CGCGGATCCTTAAACGCGGCTGTTTCGCTCCTCAA-3’(配列番号61)
なお、プライマー(a-10)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-10)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。
A固体培地上の各生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、これらのプラスミドを制限酵素NdeI及びBamHI切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、ラクトコッカス ラクティスkivD遺伝子、バチルス サブチリスalsS遺伝子、ジオバチルス サーモグルコシダシウスGeoth_3495遺伝子、ジオバチルス サーモデニトリフィカンスGtng_0348遺伝子、クレブシェラ ニューモニエipdC遺伝子のそれぞれの長さ約1.7-kbの挿入断片が認められた。
クレブシェラ ニューモニエNBRC 14940、ジオバチルス サーモカテニュラタスNBRC 15316、及びジオバチルス サーモグルコシダシウスNBRC 107763から、常法に従い、ゲノムDNAを抽出した。
(a-11) 5’-CGAGTCCATATGAAGGCAGCTGTTGTTACCCACGA-3’(配列番号62)
(b-11) 5’-CGCGAATTCTTAGCTACGCAGATCGATAACCATAC-3’(配列番号63)
なお、プライマー(a-11)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-11)には、EcoRI制限酵素部位が付加されている。
ジオバチルス サーモカテニュラタスadhP遺伝子増幅用プライマー
(a-12) 5’-CGAGTCCATATGAAAGCCGCCGTTGTTCACAAATT-3’(配列番号64)
(b-12) 5’-GCAGGATCCTTACATTGTTAAAACAATGCGGCCAT-3’(配列番号65)
なお、プライマー(a-12)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-12)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。
ジオバチルス サーモグルコシダシウスadhP遺伝子増幅用プライマー
(a-13) 5’-CGAGTCCATATGAAAGCGGCAGTTGTCAACGATTT-3’(配列番号66)
(b-13) 5’-CGCGAATTCTTAACGGTTGACACCGATGGTTAAAA-3’(配列番号67)
なお、プライマー(a-13)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-13)には、EcoRI制限酵素部位が付加されている。
ジオバチルス サーモグルコシダシウスadhA遺伝子増幅用プライマー
(a-14) 5’-CGAGTCCATATGAAAGCACTTACATACCTAGGGCC-3’(配列番号68)
(b-14) 5’-GCAGGATCCTTAACTGTTGGAAATAATGACTTTTA-3’(配列番号69)
なお、プライマー(a-14)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-14)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。
また、PCRにより増幅したクレブシェラ ニューモニエadhP遺伝子、ジオバチルス サーモグルコシダシウスadhP遺伝子のそれぞれを含む約1.0-kbのDNA断片及び上述のクローニングベクターpCYK21の約10.6-kbのDNA断片を、各々制限酵素NdeI及びEcoRIで切断し、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
A固体培地上の各生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、これらのプラスミドを制限酵素NdeI及びBamHI、又はNdeI及びEcoRIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、クレブシェラ ニューモニエadhP遺伝子、ジオバチルス サーモカテニュラタスadhP遺伝子、ジオバチルス サーモグルコシダシウスadhP遺伝子、ジオバチルス サーモグルコシダシウスadhA遺伝子のそれぞれの長さ約1.0-kbの挿入断片が認められた。
各ヒドロゲノフィラス サーモルテオラス組み換え株が有するプラスミドを表1に示す。
2-ケト酸 デカルボキシラーゼの活性測定
上記のようにして得た各2-ケト酸 デカルボキシラーゼ遺伝子導入株をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入し、50℃にて20時間、振盪培養を行った。
このようにして培養増殖された菌体を、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 1分間) により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 5分間)により得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法により2-ケト酸 でカルボキシラーゼ活性を測定した。粗酵素液、50 mM Tris-HCl (pH 6.8)、 2.5 mM MgSO4、0.2 mM thiamine pyrophosphate (TPP)、3.0 mM NADH、30 mM 2-ケトイソ吉草酸(2-ketoisovalerate)、0.5 U/ml ウマ由来アルコール デヒドロゲナーゼ(シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社)を混合し、50℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク質濃度から比活性を算出した。1分間あたり、1μmolのイソブチルアルデヒドを産生せしめる酵素量を1 U(Unit)と定義した。
一方、ラクトコッカス ラクティスの天然型のkivDを導入したKDC02株、バチルス サブチリスのalsSを導入したKDC03株、ジオバチルス サーモグルコシダシウスのGeoth_3495を導入したKDC04株、ジオバチルス サーモデニトリフィカンスのGtng_0348を導入したKDC05株、及びクレブシェラ ニューモニエのipdCを導入したKDC06株では、2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性は認められなかった。
また、同様の実験を空ベクター(pCYK21)を導入したヒドロゲノフィラス サーモルテオラス TH-1株に対して行った結果、2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性は認められなかった。
上記のようにして得た各ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスのアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子導入株をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入し、50℃にて20時間、振とう培養を行った。
このようにして培養増殖された各菌体を、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 1分間) により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 5分間)により得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりアルコール デヒドロゲナーゼ活性を測定した。粗酵素液、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.2 mM NADH、100 mM イソブチルアルデヒドを混合し、50℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク質濃度から比活性を算出した。1分間あたり、1μmolのイソブタノールを産生せしめる酵素量を1 U(Unit)と定義した。
クレブシェラ ニューモニエのアルコール デヒドロゲナーゼをコードするadhP遺伝子を含む DNA断片を、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いたPCRにより、常法により増幅した。鋳型DNAとしてプラスミドpC-Kpn-adhPを用い、下記一対のプライマーを用いた。
クレブシェラ ニューモニエadhP遺伝子増幅用プライマー
(a-15) 5’-CGCGGTACCGGATCTGGAGGAGAAACGCATATGAA-3’(配列番号70)
(b-15) 5’-CGCGGTACCTTAACGGTTGACACCGATGGTTAAAA-3’(配列番号71)
なお、プライマー(a-15)及び(b-15)には、KpnI制限酵素部位が付加されている。
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、クレブシェラ ニューモニエadhP遺伝子の約1.0-kbのDNA断片が検出された。
得られたライゲーション液で、電気パルス法により、ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスTH-1(NBRC 14978)を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
A固体培地上の生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、このプラスミドを制限酵素KpnIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpC-opt-kivDの約12.3-kbのDNA断片に加え、クレブシェラ ニューモニエadhP遺伝子の約1.0-kbの挿入断片が認められた。
コドン最適化ラクトコッカス ラクティスkivD遺伝子の下流にクレブシェラ ニューモニエadhP遺伝子を含むプラスミドを、pC-opt-kivD&Kpn-adhPと命名した。
また、この株をヒドロゲノフィラス サーモルテオラスIBU-1株と命名した。
(3-5)の項目で得たヒドロゲノフィラス サーモルテオラスのイソブタノール生成遺伝子導入株(IBU-1)をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを培養に伴い供給し、50℃にて30時間、振盪培養した。
培養後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、1分間) により得た培養上清のイソブタノールを定量した結果、培地上清中に4mMのイソブタノールの生成が確認された。
(4-1) ピルビン酸 デカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング
グルコノバクター オキシダンスNBRC 3292、ザイモモナス モビリスNBRC 13756、ザイモバクター パルマエNBRC 102412、アセトバクター パスツリアヌスNBRC 105184から、常法に従い、ゲノムDNAを抽出した。
(a-16) 5’- GCACATATGACTTATACTGTCGGACATTATCTTGC -3’(配列番号72)
(b-16) 5’- GCAGGATCCTTAGACGCTCTGGGGCTTGCGGGAGT -3’(配列番号73)
なお、プライマー(a-16)にはNdeI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-16)にはBamHI制限酵素部位が付加されている。
ザイモモナス モビリスpdc遺伝子増幅用プライマー
(a-17) 5’-CGAGTCCATATGAAGGCAGCTGTTGTTACCCACGA-3’(配列番号74)
(b-17) 5’-CGCGTCGACTTAGCTACGCAGATCGATAACCATAC-3’(配列番号75)
なお、プライマー(a-17)には、NdeI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-17)には、SalI制限酵素部位が付加されている。
ザイモバクター パルマエpdc遺伝子増幅用プライマー
(a-18) 5’-GCACATATGTATACCGTTGGTATGTACTTGGCAGA-3’(配列番号76)
(b-18) 5’-GCAGTCGACTTACGCTTGTGGTTTGCGAGAGTTGG-3’(配列番号77)
なお、プライマー(a-18)には、NdeI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-18)には、SalI制限酵素部位が付加されている。
アセトバクター パスツリアヌスpdc遺伝子増幅用プライマー
(a-19) 5’-GCACATATGACATATACAGTCGGCATGTATCTTGC-3’(配列番号78)
(b-19) 5’-GCAGTCGACTCAGGATACCTGCGGTTTTCTGGAAT-3’(配列番号79)
なお、プライマー(a-19)には、NdeI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-19)には、SalI制限酵素部位が付加されている。
上記PCRにより増幅したザイモモナス モビリス、ザイモバクター パルマエ、及びアセトバクター パスツリアヌスのpdc遺伝子それぞれを含む約1.7-kbのDNA断片及び上述のクローニングベクターpCYK21の約10.6-kbのDNA断片を、各々制限酵素NdeI及びSalIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
A固体培地上の各生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出した。
グルコノバクター オキシダンス由来pdc遺伝子を含むプラスミドを制限酵素NdeI及びBamHIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、グルコノバクター オキシダンス由来pdc遺伝子の長さ約1.7-kbの挿入断片が認められた。
また、ザイモモナス モビリス、ザイモバクター パルマエ、及びアセトバクター パスツリアヌスの各pdc遺伝子を含むプラスミドを制限酵素NdeI及びSalIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、ザイモモナス モビリス、ザイモバクター パルマエ、及びアセトバクター パスツリアヌスのpdc遺伝子それぞれの長さ約1.7-kbの挿入断片が認められた。
「(3)イソブタノール生成能を有する形質転換体」の(3-3)の項目で説明した通りである。
エシェリヒア コリK12 MG1655から、常法によりゲノムDNAを抽出した。また、クロストリジウム サーモセラムATCC 27405のゲノムDNAを、独立行政法人 製品評価技術基盤機構(NBRC)より入手した。
これらのゲノムDNAをそれぞれ鋳型として用いて、アルデヒド-アルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子adhEを含むDNA断片をPCR法により増幅した。PCRには、以下のプライマーを用いた。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。
エシェリヒア コリadhE遺伝子増幅用プライマー
(a-20) 5’-GCACATATGGCTGTTACTAATGTCGCTGAACTTAA-3’(配列番号80)
(b-20) 5’-GCAGGATCCTTAAGCGGATTTTTTCGCTTTTTTCT-3’(配列番号81)
なお、プライマー(a-20)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-20)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。
クロストリジウム サーモセラムadhE遺伝子増幅用プライマー
(a-21) 5’-GCACATATGACGAAAATAGCGAATAAATACGAAGT-3’(配列番号82)
(b-21) 5’-GCACTGCAGTTATTTCTTCGCACCTCCGTAATAAG-3’(配列番号83)
なお、プライマー(a-21)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-21)には、PstI制限酵素部位が付加されている。
また、上記PCRにより増幅したクロストリジウム サーモセラム由来adhE遺伝子の約2.7-kbのDNA断片及び上述のクローニングベクターpCYK21の約10.6-kbのDNA断片を各々制限酵素NdeI及びPstIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
A固体培地上の各生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、このプラスミドを制限酵素NdeI及びBamHI、又はNdeI及びPstIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、エシェリヒア コリ由来adhE遺伝子、又はクロストリジウム サーモセラム由来adhE遺伝子の長さ約2.7-kbの挿入断片が認められた。
エシェリヒア コリ由来adhE遺伝子を含むプラスミドをpC-Eco-adhE、クロストリジウム サーモセラム由来adhE遺伝子を含むプラスミドをpC-Cth-adhEと命名した。
ピルビン酸 デカルボキシラーゼの活性測定
ピルビン酸 デカルボキシラーゼ遺伝子(pdc遺伝子)導入PDC01株、PDC02株、PDC03株、及びPDC04株をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入し、50℃にて20時間、振盪培養した。
培養により増殖した菌体を、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 1分間) により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 5分間)により得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりピルビン酸 デカルボキシラーゼ活性を測定した。粗酵素液、250 mM sodium phosphate (pH 6.2)、 1 mM MgCl2、1 mM thiamine pyrophosphate (TPP)、0.4 mM NADH、100 mM ピルビン酸、0.02 mg/ml 酵母アルコール デヒドロゲナーゼ(シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社)を混合し、50℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク質濃度から比活性を算出した。1分間あたり、1μmolのアセトアルデヒドを産生せしめる酵素量を1 U(Unit)と定義した。
一方、ザイモモナス モビリスpdc遺伝子を導入したPDC02株、ザイモバクター パルマエpdc遺伝子を導入したPDC03株、アセトバクター パスツリアヌスpdc遺伝子を導入したPDC04株では、ピルビン酸 デカルボキシラーゼ活性が検出されなかった。
また、同様の実験をヒドロゲノフィラス サーモルテオラス野生株(空ベクター(pCYK21)のみを有するTH-1株)に対して行ったところ、ピルビン酸 デカルボキシラーゼ活性は認められなかった。
ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスのアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子導入ADH01株、ADH02株、ADH03株、及びADH04株をそれぞれカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地5mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入し、50℃にて20時間、振盪培養した。
培養により増殖した各菌体を、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 1分間) により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、5分間)により得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりアセトアルデヒドを基質とするアルコール デヒドロゲナーゼ活性を測定した。粗酵素液、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.2 mM NADH、90 mM アセトアルデヒドを混合し、50℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク質濃度から比活性を算出した。1分間あたり、1μmolのエタノールを産生せしめる酵素量を1 U(Unit)と定義した。
この結果、表4に示す通り、ADH01〜ADH04株について、目的とするアルコール デヒドロゲナーゼ活性が検出された。特に高い活性を示したのは、クレブシェラ ニューモニエ由来adhP遺伝子、ジオバチルス サーモグルコシダシウス由来adhP遺伝子であった。また、ジオバチルス サーモカテニュラタス由来adhP遺伝子、ジオバチルス サーモグルコシダシウス由来adhA遺伝子についてもアルコール デヒドロゲナーゼ活性が検出された。ここで、同様の実験を空ベクター(pCYK21)を導入したヒドロゲノフィラス サーモルテオラス TH-1株に対して行ったところ、アルコール デヒドロゲナーゼ活性は認められなかった。
部位特異的変異導入プラスミドの構築
adhEにコードされるアルデヒド-アルコール デヒドロゲナーゼは好気条件下では活性が阻害される。好気条件下でも高い活性を示すよう、上記プラスミドpC-Eco-adhEを用いて、568番目のグルタミン酸(E568)部位をリジン(K)に置換したエシェリヒア コリ由来adhEの変異体(adhE(E568K))を、インバースPCR(inverse PCR)によって作成し、部位特異的変異が導入されたプラスミドを取得し、pC-Eco-E568Kと命名した。
また、クロストリジウム サーモセラム由来adhEについては、上記プラスミドpC-Cth-adhEを用いて、575番目のアスパラギン酸(D575)部位をアスパラギン(N)に置換したクロストリジウム サーモセラム由来adhEの変異体(adhE(D575N))を、インバースPCRによって作成し、部位特異的変異が導入されたプラスミドを取得し、pC-Cth-D575Nと命名した。
エシェリヒア コリadhE遺伝子E568K変異導入用プライマー
(a-22) 5’-GAAGCTGGCGCTGCGCTTTATGGATATCCGTAAAC-3’(配列番号84)
(b-22) 5’-TCGAAGTGAGTTTCCGGATGTTCGTACATAACCCA-3’(配列番号85)
クロストリジウム サーモセラムadhE遺伝子D575N変異導入用プライマー
(a-23) 5’-ATGGCAATGAGATTTATGGATATAAGAAAGAGAGT-3’(配列番号86)
(b-23) 5’-GTTCATAAAGTCAACTTCCGGATGTTCATACATCA-3’(配列番号87)
生成した反応液を1%アガロースゲルにより電気泳動に供し、エシェリヒア コリ由来adhEのE568K変異体及びクロストリジウム サーモセラム由来adhEのD575N変異体のそれぞれについて、約13-kbのDNA断片が検出された。
得られたライゲーション液で、電気パルス法により、ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスNBRC 14978を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
A固体培地上の各生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出した。このプラスミドを、エシェリヒア コリ由来adhEのE568K変異遺伝子の場合は制限酵素NdeI及びBamHI、クロストリジウム サーモセラム由来adhEのD575N変異遺伝子の場合は制限酵素NdeI及びPstIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、それぞれプラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、長さ約2.7-kbの挿入断片が認められた。
(4-3)の項目で作成したヒドロゲノフィラス サーモルテオラスのアルデヒド−アルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子導入株(ADH05、ADH06)、及び(4-5)の項目で作成したヒドロゲノフィラス サーモルテオラスの変異アルデヒド−アルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子導入株(ADH07、ADH08)を、カナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地5mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入し、50℃にて20時間、振盪培養した。
培養により増殖した各菌体を、遠心分離(4℃、15,000 rpm、1分間) により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、5分間)により得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりアセトアルデヒドを基質とするアルコール デヒドロゲナーゼ活性を測定した。粗酵素液、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.2 mM NADH、90 mM アセトアルデヒドを混合し、50℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク質濃度から比活性を算出した。1分間あたり、1μmolのエタノールを産生せしめる酵素量を1 U(Unit)と定義した。
クレブシェラ ニューモニエのアルコール デヒドロゲナーゼをコードするadhP遺伝子を含む DNA断片を、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いたPCRにより、常法により増幅した。鋳型DNAとしてプラスミドpC-Kpn-adhPを用い、下記一対のプライマーを用いた。
ジオバチルス サーモグルコシダシウスadhP遺伝子増幅用プライマー
(a-24) 5’-CGCGGTACCGGATCTGGAGGAGAAACGCATATGAA-3’(配列番号88)
(b-24) 5’-CGCGGTACCTTAACGGTTGACACCGATGGTTAAAA-3’(配列番号89)
なお、プライマー(a-24)及び(b-24)には、KpnI制限酵素部位が付加されている。
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、ジオバチルス サーモグルコシダシウス由来adhP遺伝子に相当する、約1.0-kbのDNA断片が検出された。
A固体培地上の生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、このプラスミドを制限酵素KpnIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpC-Gox-pdcの約12.3-kbのDNA断片に加え、クレブシェラ ニューモニエadhP遺伝子の約1.0-kbの挿入断片が認められた。
グルコノバクター オキシダンスpdc遺伝子の下流にジオバチルス サーモグルコシダシウスadhP遺伝子を含むプラスミドを、pC-Gox-pdc&Kpn-adhPと命名した。
また、このプラスミドを有する菌株をヒドロゲノフィラス サーモルテオラスETH-1株と命名した。
(4-7)の項目で得たヒドロゲノフィラス サーモルテオラスのエタノール生成遺伝子導入株(ETH-1株)をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを培養に伴い供給し、50℃にて30時間、振盪培養した。
培養後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、1分間) により得た培養上清のエタノールの定量を行ったところ、培地上清中に10mMのエタノールが生成されていた。
(5-1)ゲノムDNAの調製
ジオバチルス ステアロサーモフィラス ATCC 12980から常法によりゲノムDNAを抽出した。また、サーマス サーモフィラス HB8株(ATCC 27634)のゲノムDNAをタカラバイオ株式会社から購入した。
アラニン デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むDNA断片を、ジオバチルス ステアロサーモフィラス ATCC 12980のゲノムDNA、及びサーマス サーモフィラス HB8株(ATCC 27634)のゲノムDNAをそれぞれ鋳型として用い、下記一対のプライマーを用いて、PCRにより増幅した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて常法により行った。
ジオバチルス ステアロサーモフィラスalaD1遺伝子増幅用プライマー
(a-25) 5’-TCCGGCGGGCATATGAAGATCGGCATTCCAAAAGA-3’(配列番号90)
(b-25) 5’-AAGAATTCCAGCGGCTCATATACGATACCGTTCGG-3’(配列番号91)
なお、プライマー(a-25)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-25)には、EcoRI制限酵素部位が付加されている。
ジオバチルス ステアロサーモフィラスalaD2遺伝子増幅用プライマー
(a-26) 5’-TCCGGCGGGCATATGATTATTGGAGTGCCAAAGGA-3’(配列番号92)
(b-26) 5’-AAGAATTCTTAGTTGGCAGCCAACGTTTTCCCGAG-3’(配列番号93)
なお、プライマー(a-26)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-26)には、EcoRI制限酵素部位が付加されている。
サーマス サーモフィラスalaD1遺伝子増幅用プライマー
(a-27) 5’-CCGGCGGGCATATGGTGATCGGCGTGCCGAAGGAG-3’(配列番号94)
(b-27) 5’-AAGAATTCTCACCCCCTCAAGGCCTCCTCGGGAGG-3’(配列番号95)
なお、プライマー(a-27)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-27)には、EcoRI制限酵素部位が付加されている。
サーマス サーモフィラスalaD2遺伝子増幅用プライマー
(a-28) 5’-CGGCGGGCATATGgagttcggcgtgcccagagaac-3’(配列番号96)
(b-28) 5’-AAGAATTCtcattctaggtggcctcctttctcgcc-3’(配列番号97)
なお、プライマー(a-28)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-28)には、EcoRI制限酵素部位が付加されている。
生成した反応液を1%アガロースゲルにより電気泳動に供し、ジオバチルス ステアロサーモフィラスalaD1遺伝子の場合は約1.6kbのDNA断片が、ジオバチルス ステアロサーモフィラスalaD2遺伝子、サーマス サーモフィラスalaD1遺伝子、サーマス サーモフィラスalaD2遺伝子の場合はそれぞれ約1.1kbのDNA断片が検出された。
A固体培地上の各生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、これらのプラスミドを制限酵素NdeI及びEcoRIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、ジオバチルス ステアロサーモフィラスalaD1遺伝子の場合は長さ約1.6-kbの挿入断片が、ジオバチルス ステアロサーモフィラスalaD2遺伝子、サーマス サーモフィラスalaD1遺伝子、及びサーマス サーモフィラスalaD2遺伝子の場合はそれぞれ約1.1-kbのDNA断片が認められた。
ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスのアラニン デヒドロゲナーゼ遺伝子導入ALA01株、ALA02株、ALA03株、及びALA04株を、それぞれカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地5mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入し、50℃にて20時間、振盪培養した。
培養により増殖した各菌体を、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 1分間) により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、5分間)により得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりアラニン デヒドロゲナーゼ活性を測定した。粗酵素液、100 mM Tris-HCl (pH 8.5)、100 mM NH4Cl、0.1 mM NADH、60 mM ピルビン酸を混合し、50℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク質濃度から比活性を算出した。1分間あたり、1μmolのアラニンを産生せしめる酵素量を1 U(unit)と定義した。
ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスのalaD遺伝子導入株が産生したアラニン デヒドロゲナーゼの活性を表8に示す。
付加するポリペプチドをコードするDNA断片の調製
付加するポリペプチドをコードするDNA断片を調製するため、下記の各一対ずつのオリゴヌクレオチドを合成した。各一対のオリゴヌクレオチドは互いに相補的な配列である。
MKIEEGKLVIHの配列(配列番号37)のポリペプチド(マルトース結合タンパク質のN末端配列)
(a-29) 5’-TATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCCA-3’(配列番号98)
(b-29) 5’-TATGGATTACCAGTTTACCTTCTTCGATTTTCA-3’(配列番号99)
MSKIKHの配列(配列番号100)のポリペプチド〔Journal of Bioscience and Bioengineering, 123, 540-546 (2017)〕
(a-30) 5’-TATGAGCAAGATCAAACA-3’(配列番号101)
(b-30) 5’-TATGTTTGATCTTGCTCA-3’(配列番号102)
MDFPVAEDRRHの配列(配列番号103)のポリペプチド(グルタチオン S-トランスフェラーゼのN末端配列)
(a-31) 5’-TATGTCGCCGATCCTCGGCTACTGGAAAATCCA-3’(配列番号104)
(b-31) 5’-TATGGATTTTCCAGTAGCCGAGGATCGGCGACA-3’(配列番号105)
MTENAEKFLWHの配列(配列番号106)のポリペプチド(β-グルコシダーゼのN末端配列)
(a-32) 5’-TATGACCGAGAACGCCGAAAAATTCCTTTGGCA-3’(配列番号107)
(b-32) 5’-TATGCCAAAGGAATTTTTCGGCGTTCTCGGTCA-3’(配列番号108)
(a-29)と(b-29)、(a-30)と(b-30)、(a-31)と(b-31)、(a-32)と(b-32)のオリゴヌクレオチドをそれぞれ等モル(mol)ずつ混合し、混合液を98℃から20℃まで緩やかに冷却し、オリゴヌクレオチドがアニーリングすることで、ポリペプチド配列をコードする二本鎖DNA断片を調製した。なお、このDNA断片の両端は制限酵素NdeI切断による突出末端と同等である。
HAT配列調製用プライマー
(a-33) 5’-CGCATATGGGCAAGGATCATCTCATCCACAATGTCCACAAAGAGG-3’(配列番号110)
(b-33) 5’-CGCATATGCTTGTTGTGGGCATGAGCGTGCTCCTCTTTGTGGACA-3’(配列番号111)
プライマー(a-33)及び(b-33)の3’側の塩基配列は互いに相補的になっている。なお、プライマー(a-33)及び(b-33)には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
生成した反応液を1%アガロースゲルにより電気泳動した結果、HAT配列に相当する、約0.1-kbのDNA断片が検出された。増幅したHAT配列の約0.1-kbのDNA断片を制限酵素NdeIで切断した。
ジオバチルス ステアロサーモフィラスalaD2遺伝子を含有するプラスミドpC-Gst-alaD2を制限酵素NdeIで切断した。このプラスミドと、両末端に制限酵素NdeI切断突出を有する上記各DNA断片(「付加するポリペプチドをコードするDNA断片の調製」の項目で調製した5種の二本鎖DNA断片)のそれぞれとを混合し、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
A固体培地上の各生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養した。培養液よりプラスミドDNAを抽出、これらのプラスミドを制限酵素NdeIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。
(5-4)の項目で作製した、ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスのポリペプチド融合アラニン デヒドロゲナーゼ遺伝子導入株を、カナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地5mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを封入し、50℃にて20時間、振盪培養した。
培養により増殖した各菌体を、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 1分間) により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、5分間)により得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりアラニン デヒドロゲナーゼ活性を測定した。粗酵素液、100 mM Tris-HCl (pH 8.5)、100 mM NH4Cl、0.1 mM NADH、60 mM ピルビン酸を混合し、50℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク質濃度から比活性を算出した。1分間あたり、1μmolのアラニンを産生せしめる酵素量を1 U(unit)と定義した。
ヒドロゲノフィラス サーモルテオラスのアラニン デヒドロゲナーゼ遺伝子導入株ALA05をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2=7.5:1:1.5の混合ガスを培養に伴い供給し、50℃にて30時間、振盪培養した。
培養後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、1分間) により得た培養上清のアラニンの定量を行ったところ、培地上清中5mMのアラニンが生成していた。
下記表11に示す各菌株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8(郵便番号292-0818)に寄託した。受託日、受託番号を表11に示す。従って、これらの菌株は公に利用可能である。
Claims (8)
- ヒドロゲノフィラス属細菌に、(e)アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体。
- (e)アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記(e1)、(e2)、(e3)、(e4)、(e5)、(e6)、(e7)、(e8)、(e9)、(e10)、(e11)、又は(e12)のDNAである請求項1に記載の形質転換体。
(e1)配列番号29、30、31、又は32の塩基配列からなるDNA
(e2)配列番号29、30、31、又は32と90%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e3)配列番号29、30、31、又は32と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e4)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(e5)配列番号33、34、35、又は36と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e6)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e7)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列のN末端に配列番号37のアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(e8)配列番号33、34、35、又は36と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列のN末端に配列番号37のアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e9)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列のN末端に配列番号37のアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e10)配列番号29、30、31、又は32の塩基配列の5’末端に配列番号38の塩基配列を付加した塩基配列からなるDNA
(e11)配列番号29、30、31、又は32と90%以上の同一性を有する塩基配列の5’末端に配列番号38の塩基配列を付加した塩基配列からなるDNAであり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e12)配列番号29、30、31、又は32と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAの塩基配列の5’末端に配列番号38の塩基配列を付加した塩基配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA - ヒドロゲノフィラス属細菌がヒドロゲノフィラス サーモルテオラスである請求項1又は2に記載の形質転換体。
- 請求項1〜3の何れかに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むアラニンの製造方法。
- アラニンデヒドロゲナーゼのN末端に配列番号37のアミノ酸配列からなるポリペプチドを付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼ。
- 配列番号39のアミノ酸配列からなる請求項5に記載の修飾アラニンデヒドロゲナーゼ。
- アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’末端に配列番号38の塩基配列からなるポリヌクレオチドを付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子。
- 配列番号40の塩基配列からなる請求項7に記載の修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子。
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