CN104195125B - 一种α-酮酸脱羧酶KIVD-LL及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种α‑酮酸脱羧酶KIVD‑LL及其编码基因和应用。α‑酮酸脱羧酶KIVD‑LL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。α‑酮酸脱羧酶编码基因kivd‑LL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过基因工程的方法，获得了对α‑酮异戊酸与α‑酮异已酸均具有较高脱羧活力的α‑酮酸脱羧酶KIVD‑LL，该酶在生物合成异戊醇工业中具有较大的应用潜力。

Description

一种α-酮酸脱羧酶KIVD-LL及其编码基因和应用
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种α-酮酸脱羧酶KIVD-LL及其编码基因和应用。
背景技术：
长链醇类不仅是一种重要的化工原料，用于有机合成，同时也被认为一类新兴的能源替代品。3-甲基-1-丁酮(异戊醇)，是酒精发酵副产物“杂醇油”的主要成分，其在化学制药、溶剂、香精、有机合成等行业有着非常广泛的用途。异戊醇是我国规定允许使用的香精，也可以用合成镇静催眠药，还是应用广泛的有机溶剂和化学分析试剂。此外，作为新兴燃料，异戊醇比乙醇、丙醇、丁醇和正异醇具有更良好的燃料特性。
长链醇的合成主要有生物合成法和化学合成法，由于生物合成的安全性和环保性而倍受人们关注。长链醇的生物合成主要依赖于微生物中的Ehrlich途径，该途径包括转氨作用、脱羧反应、还原反应等三个步骤。合成长链醇的转氨作用是将氨基酸的氨基基团转移后生成代谢过程中间产物—各类α-酮酸。这些α-酮酸成为不同酮酸脱羧酶作用的底物，生成相应的醛类物质，接着通过氧化或还原反应进一步生成终产物酸或者醇，酮酸脱羧酶的脱羧反应是Ehrlich途径中的关键反应步骤。
目前已知的酮酸脱羧酶多数存在于酵母、真菌等微生物中，在细菌中也有发现。近年来，对酵母中各类酮酸脱羧酶已经有了初步的了解，这些酶的功能也陆续得到验证。目前，已经鉴定出一系列来源于不同微生物的酮酸脱羧酶，根据其功能与作用特点进行了分类，初步分为丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.1)，苯丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.43)，支链-2-酮基脱羧酶(EC4.1.1.72)，2-氧戊二酸脱酶(酮戊二酸)(EC4.1.1.71)，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.74)等。由于其底物作用的高度特异性，支链-2-酮基脱羧酶成为支链醇生物合成的限速酶。
除了对这些酮酸脱羧酶进行分类与定性研究，对某些特定酶的酶学特性也做了深入细致的分析。目前已有的α-酮酸脱羧酶酶学特性的研究主要有丙酮酸脱羧酶、α-酮异戊酸脱羧酶和苯丙酮酸脱羧酶。其中关于α-酮异戊酸脱羧酶的专利与文献有：de la Plaza M等报道的来源于Lactococcus lactis IFPL730α-酮异戊酸脱羧酶，该酶对3-甲基-2-酮基-丁酸(酮异戊酸)具有最大酶活力为80.7U/mg蛋白，其次为4-甲基-2-酮基-戊酸(酮异已酸)(18.3U/mg蛋白)和3-甲基-2-酮基戊酸(异亮氨酸酮酸)(13.5U/mg蛋白)，约为其最大酶活力的22％和16％；Smit BA等报道了来源于Lactococcus lactis B1157的α-酮酸脱羧酶KdcA，该酶也对酮异戊酸表现出最大酶活力，酮异已酸和异亮氨酸酮酸的酶活力仅为其最高活力的30％左右。由上可见，已有的α-酮异戊酸脱羧酶均对酮异戊酸具有较高的底物专一作用性，目前并没有发现对酮异已酸(产物为异戊醇)具有较高脱羧活力的α-酮酸脱羧酶。
基于Ehrlich途径和氨基酸代谢途径的综合应用，对包括大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸菌等不同微生物进行基因重组改造来生产长链醇的专利和文献报道非常之多。然而，由于已知的α-酮酸脱羧酶的最佳作用底物均为酮异戊酸，从而导致重组菌株更倾向于异丁醇的生物合成。基于酶的催化专一性，获得对酮异已酸具有高度特异性的酮酸脱羧酶，对高效生物合成异戊醇至关重要。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种能高效脱羧应用的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL。
本发明的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种编码上述α-酮酸脱羧酶KIVD-LL的基因(α-酮酸脱羧酶编码基因kivd-LL)，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种包含上述编码上述α-酮酸脱羧酶KIVD-LL的基因的重组载体。
一种包含上述重组载体的重组菌株。
本发明的第三个目的是提供α-酮酸脱羧酶KIVD-LL在α-酮酸脱羧中的应用。
优选，α-酮酸脱羧酶KIVD-LL在α-酮异已酸脱羧中的应用。
本发明提供的α-酮酸脱羧酶编码基因kivd-LL，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该α-酮酸脱羧酶编码基因kivd-LL含有1647bp核苷酸，编码的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL理论分子量为61.1kDa。
将本发明的α-酮酸脱羧酶编码基因kivd-LL插入到表达载体pET28a(+)合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的α-酮酸脱羧酶编码基因kivd-LL插入到质粒pET28a(+)上的BamHI和SalI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组表达质粒pET28a-kivd-LL。
本发明还提供了包含上述α-酮酸脱羧酶基因kivd-LL的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、棒状杆菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，进一步优选为重组菌株BL21/kivd-LL。
将α-酮酸脱羧酶基因kivd-LL序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Lactococcus lactis IFPL730的α-酮酸脱羧酶Kivd氨基酸序列一致性为98％。虽然二者的同源性较高，然而本发明提出的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL的功能与Kivd有很大区别。含有本发明提出的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL的重组E.coli菌株能在LB发酵培养基中特异性高产异戊醇，在37℃发酵2h逐渐产生异戊醇，24h浓度达到104mg/L，而异丁醇产量只有24mg/L。即使在M9发酵培养基中，该重组菌株产生的异戊醇产量也与异丁醇相当，发酵12h后异丁醇和异戊醇浓度可分别达到210和199mg/L，是已报道的只含有酮酸脱羧酶的重组菌株异戊醇浓度(19h发酵后得到的异戊醇浓度为56mg/L)的3.75倍。
用0.6mM IPTG对本发明的重组E.coli BL21/kivd-LL菌株进行诱导产酶，用Ni-NTA亲和纯化柱诱导得到的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL粗酶液进行纯化，得到纯度达到90％以上的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL。测定α-酮酸脱羧酶KIVD-LL对α-酮异戊酸与α-酮异已酸的酶活力，结果显示KIVD-LL对二者的酶活力分别为26.77和21.24μmol min-1mg-1。可以看出本发明的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL降解α-酮异已酸的脱羧能力可达到酮异戊酸的80％。目前，已报道的α-酮酸脱羧酶Kivd均对酮异戊酸表现出最大酶活力，对酮异已酸的脱羧活性只有酮异戊酸的30％左右，由于本发明提出α-酮酸脱羧酶KIVD-LL表现出对α-酮异已酸独特的高效脱羧能力，使得重组菌株BL21/kivd-LL在生物合成异戊醇中具有重要的应用价值。
本发明通过基因工程的方法，获得了对α-酮异戊酸与α-酮异已酸均具有较高脱羧活力的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL，该酶在生物合成异戊醇工业中具有较大的应用潜力。
附图说明：
图1是本发明实施例中的α-酮酸脱羧酶基因重组质粒pET28a-kivd-LL的构建模式图。
图2是本发明的α-酮酸脱羧酶基因kivd-LL的凝胶电泳图，M：marker；1,2,3：kivd-LL目的片段。
图3是本发明的α-酮酸脱羧酶重组质粒pET28a-kivd-LL的BamHI，Sal I双酶切电泳图，M：DL5000DNA marker；K：重组质粒pET28a-kivd-LL的BamH I,Sal I双酶切产物。
图4是本发明的E.coli BL21(DE3)表达α-酮酸脱羧酶、及酶纯化的SDS-PAGE电泳图，M：marker；1：含pET28a-kivd-LL质粒的E.coli胞内总蛋白；2-5，Ni-NTA纯化过程洗脱液。
图5是本发明含重组质粒pET28a-kivd-LL的E.coli BL21(DE3)重组菌株LB培养基发酵产物分析。
图6是本发明的含重组质粒pET28a-kivd-LL的E.coli BL21(DE3)重组菌株M9培养基发酵产物分析。
图7是本发明的重组α-酮酸脱羧酶的底物特异性。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实验材料和试剂
1、菌株及载体：本发明从乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)(保存于中国工业微生物菌种保藏中心，其保藏号为CICC6246，可以从该保藏中心购买)中克隆得到一种α-酮酸脱羧酶kivd-LL基因。大肠杆菌表达载体pET28a(+)购自于Novagen公司，菌株E.coli trans1-T1和E.coli BL21(DE3)购自于北京全式金生物技术有限公司。
2、酶类及其它生化试剂：Taq酶、内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自Tiangen公司，3-甲基-2-酮基-丁酸(α-酮异戊酸)、4-甲基-2-酮基-戊酸(α-酮异已酸)购自Sigma公司，其它均为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)Lactococcus lactis subsp.lactis培养基为MRS培养基：1％酪蛋白，1％牛肉膏，0.5％酵母提取物，0.5％乙酸钠，0.2％柠檬酸二钠，0.1％吐温80，0.2％K2HPO4，0.02％MgSO4·7H2O，0.005％MnSO4·H2O，pH6.8，121℃灭菌20min；固体培养基为液体培养基加入2％的琼脂粉。
(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)，121℃灭菌20min。
(3)M9发酵培养基：
5×M9盐溶液：Na2HPO4·7H2O12.8g；KH2PO43.0g；NaCl0.5g，NH4Cl1.0g，加双蒸水200mL溶解，121℃灭菌15min；
1M MgSO4与1M CaCl2，分别配制并高压灭菌备用；20％葡萄糖溶液用0.22μm滤器过滤除菌备用。
M9工作液：5×M9盐溶液200mL；1M MgSO42mL；20％的葡萄糖溶液500mL；1M的CaCl20.1mL；加灭菌双蒸水至1000mL。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1 乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.Lactis基因组的提取：
乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.lactis的培养：
将菌种划线接种至MRS固体平板，37℃培养48h，挑单菌落于2.5mL MRS液体培养基中，37℃200rpm过夜培养。
乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.Lactis基因组的提取：
(1)取菌体培养基于10000rpm离心1min收集菌体，加入180μL溶菌酶，37℃消化2h。
(2)加入4μL核酸内切酶A(100mg/mL)溶液，振荡15s，室温放置5min，向管中加入20μL蛋白酶K溶液，均匀混合。
(3)加入220μL缓冲液GB，颠倒混匀后置金属浴中70℃、10min，原混浊液变澄清，短暂离心去除管壁上的液滴；
(4)向EP管中加入220μL无水乙醇，涡旋振荡30s，溶液中可能出现白色絮状沉淀；
(5)将EP管中的溶液(包括絮状沉淀)转移至一个干净的滤柱(spin column)中，12000rpm离心30s，弃去吸附膜下的液体，再将滤柱放回收集管中；
(6)向滤柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃去吸附膜下的液体，再将滤柱放回收集管中；
(7)向滤柱中加入700μL Washing Buffer，12000rpm离心30s，弃去吸附膜下的液体，再将滤柱放回收集管中；
(8)向滤柱中加入500μL Washing Buffer，12000rpm离心30s，弃去吸附膜下的液体，再将滤柱放回收集管中；
(9)将滤柱12000rpm离心2min，弃去收集管，将滤柱转移至干净的1.5mL EP管中，常温下静置2～3min；
(10)待吸附膜上残余的Washing Buffer完全挥发，滴加50μL60℃预热的TE缓冲液至吸附膜中央，室温静置3min后，12000rpm离心2min，用移液枪将EP管中的液体吸回至吸附膜中央，重复离心后，弃去滤柱，收集基因组DNA的TE缓冲液保存于-20℃备用，由此得到乳酸乳球菌的基因组DNA。
实施例2 乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.Lactisα-酮酸脱羧酶编码基因kivd-LL的克隆
根据乳酸乳球菌α-酮酸脱羧酶基因kivd在NCBI数据库中的信息，设计引物Kivd-BF和Kivd-SR，以乳酸乳球菌的基因组DNA为模板扩增kivd-LL序列。
Kivd-BF：CGGGATCCGATGTATACAGTAGGAGATTACC
Kivd-SR：GCGTCGACTTATGATTTATTTTGTTCAGC
PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸2min，共30个循环，72℃保温10min。得到一个约1700bp片段(其凝胶电泳图如图2所示)，将该片段回收后与pEASY-blunt zero载体相连得到克隆载体pEASY-kivd-LL送华大基因测序。通过BLAST比对，结果确认获得的片段为α-酮酸脱羧酶基因kivd-LL，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示，该α-酮酸脱羧酶基因kivd-LL含有1647bp，编码的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，理论分子量为61.1kDa。该α-酮酸脱羧酶基因kivd-LL在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Lactococcus lactis IFPL730的α-酮酸脱羧酶Kivd氨基酸序列一致性为98％。
实施例3 重组α-酮酸脱羧酶的制备与纯化
用BamHI和SalI对含α-酮酸脱羧酶基因kvid-LL的克隆载体pEASY-kivd-LL进行酶切，并与同样酶切后的表达载体pET28a(+)用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化E.coliTrans1-T1感受态细胞，转化得到的阳性克隆子转入液体培养基培养过夜，提取得到重组表达质粒pET28a-kivd-LL(质粒构建模式图如图1所示，其BamHI,Sal I双酶切电泳图如图3所示)。
将重组表达质粒pET28a-kivd-LL转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在抗性培养基上筛选阳性克隆子。取含有重组质粒pET28a-kivd-LL的BL21(DE3)菌株，接种于100mL LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养2-3h，OD600达到约0.6-1后，加入终浓度0.6mM IPTG，于30℃、200rpm诱导培养8-10h。
将诱导后的培养基离心收集菌体，用适量的pH6.0磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎仪对菌体进行破碎，离心去除细胞碎片，得到的可溶总蛋白液用SDS-PAGE检测α-酮酸脱羧酶KIVD-LL的表达，蛋白电泳结果表明，在约61kDa位置(图4)能看到比对照有明显更粗的条带，说明α-酮酸脱羧酶KIVD-LL在大肠杆菌中得到表达。
由于表达载体pET28a(+)含有6个His标签，通过Ni-NTA亲和层析柱纯化即可以得到纯度较高的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL酶液。具体步骤如下：
所需缓冲液：
NPI-10:50mM NaH2PO4,300mM NaCl,10mM咪唑，pH8.0；
NPI-250:50mM NaH2PO4,300mM NaCl,250mM咪唑，pH8.0。
1)IPTG诱导后得到的E.coli BL21/kivd-LL菌体12000rpm离心2min，去除上清；
2)菌体用适量的NPI-10重悬菌体，用超声波破碎菌体；
3)破碎后的液体12000rpm离心10min，取上清，即得到粗酶液；
4)取2mL粗酶液，上柱至Ni-NTA亲和层析柱，收集穿透峰；
5)用2mL NPI-10至NPI-250洗脱液进行梯度上柱将蛋白洗脱，分段收集各洗脱液；
6)用SDS-PAGE检测洗脱液中蛋白纯度。
实施例4 α-酮酸脱羧酶KIVD-LL大肠杆菌重组菌株的LB发酵液产物分析
将含有重组质粒pET28a-kivd-LL的E.coli BL21(DE3)重组菌株接种到10mL液体LB发酵培养基中37℃、200rpm过夜活化培养。新鲜的种子液按0.5％接种量转接至100mL液体LB发酵培养基，于37℃、200rpm摇瓶培养2-3h，OD600约为0.6-1.0，加入终浓度为0.6mMIPTG进行产酶发酵诱导，然后37℃、200rpm下摇床培养，隔一定时间取样，用气相色谱法测定发酵产物浓度。
发酵产物测定方法：发酵液12000rpm离心10min去除蛋白以及不溶性杂质，上清用0.22μm滤器过滤后进样。发酵产物测定采用岛津GC2014气相色谱仪，程序为：分流比1:50，上样量1μL，柱温60℃平衡3min，30℃/min升温至200℃并保持3min，载气为氩气。
结果如图5所示，含有本发明的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL的重组E.coli菌株能在LB发酵培养基中特异性高产异戊醇，在37℃发酵2h逐渐产生异戊醇，24h浓度达到104mg/L，而异丁醇产量只有24mg/L。
实施例5 α-酮酸脱羧酶KIVD-LL大肠杆菌重组菌株的M9发酵产物分析
将含有重组质粒pET28a-kivd-LL的E.coli BL21(DE3)重组菌株接种到10mL液体LB发酵培养基中37℃、200rpm过夜活化培养。将新鲜的种子液按0.5％接种量转接至100mL液体M9发酵培养基，于37℃、200rpm摇瓶培养2-3h，OD600约为0.6-1.0，加入终浓度为0.6mM IPTG进行产酶发酵诱导，然后37℃、200rpm下摇床培养，隔一定时间取样，用气相色谱法测定发酵产物的浓度。
发酵产物测定方法同实施例4。
结果如图6所示，在M9发酵培养基中，含有重组质粒pET28a-kivd-LL的E.coli BL21(DE3)重组菌株产生的异戊醇产量也与异丁醇相当，发酵12h后异丁醇和异戊醇浓度可分别达到210和199mg/L，是已报道的只含有酮酸脱羧酶的重组菌株异戊醇浓度(19h发酵后得到的异戊醇浓度为56mg/L)的3.75倍。
实施例6 重组α-酮酸脱羧酶KIVD-LL的活性分析
1mL标准反应体系：含有50mM磷酸缓冲液(pH6.0)，10mMα-酮异戊酸，5mM MgCl2，1.5mM硫胺素焦磷酸，适量α-酮酸脱羧酶KIVD-LL酶液，37℃反应20min，加入适量体积6N HCl至pH约为3.0-2.0终止反应，于液相色谱测定异丁醛的生成量。1个酶活单位(U)定义为在给定条件下，每分钟每mg蛋白转化α-酮异戊酸生成的异丁醛的量(μmol)。
测的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL的酶活力为26.77μmol min-1mg-1。
实施例7 重组α-酮酸脱羧酶KIVD-LL的底物特异性分析
按实施例6中1mL标准反应进行，底物分别为10mmol/Lα-酮异戊酸和α-酮异已酸，pH6.0，37℃反应20min，液相色谱测定产物异丁醛和异戊醛的生成量。
结果如图7所示。测定α-酮酸脱羧酶KIVD-LL对α-酮异戊酸与α-酮异已酸的酶活力，结果显示α-酮酸脱羧酶KIVD-LL对二者的酶活力分别为26.77和21.24μmol min-1mg-1。可以看出本发明的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL降解α-酮异已酸的脱羧能力可达到α-酮异戊酸的80％。目前，已报道的α-酮酸脱羧酶Kivd均对α-酮异戊酸表现出最大酶活力，对酮异已酸的脱羧活性只有酮异戊酸的30％左右，由于本发明提出α-酮酸脱羧酶KIVD-LL表现出对酮异已酸独特的高效脱羧能力，使得重组菌株BL21/kivd-LL在生物合成异戊醇中具有重要的应用价值。

Claims (8)

1.一种α-酮酸脱羧酶KIVD-LL，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种编码权利要求1所示的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL的α-酮酸脱羧酶编码基因kivd-LL，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种包含权利要求2所述的α-酮酸脱羧酶编码基因kivd-LL的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体中的表达载体为pET28a(+)。
5.一种包含权利要求3所述的重组载体的重组菌株。
6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株的宿主菌株为大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
7.权利要求1所述的α-酮酸脱羧酶KIVD-LL在α-酮酸脱羧中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，α-酮酸脱羧酶KIVD-LL在α-酮异已酸脱羧中的应用。
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