CN106282137B - 一种类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的制备方法及其应用 - Google Patents
一种类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物工程领域，涉及一种类胡萝卜素9,10’双加氧酶的制备方法及其应用。制备步骤如下，培养霍氏肠杆菌并提取全基因组序列；构建类胡萝卜素9,10’双加氧酶基因的重组质粒；类胡萝卜素9,10’双加氧酶基因的诱导表达及酶蛋白的纯化；类胡萝卜素9,10’双加氧酶酶学性质的分析鉴定。本发明所制备的类胡萝卜素9,10’双加氧酶基因，可高效催化合成β‑紫罗兰酮，催化专一性高，反应产物少，反应时间短。本发明获得了一种不同于已发现类胡萝卜素9,10’双加氧酶的新型酶资源。该类胡萝卜素9,10’双加氧酶具有不同的氨基酸序列和酶学特性。并优化了反应条件，经优化后β‑紫罗兰酮产率达到79.4%。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的制备方法及其应用。
背景技术
β-紫罗兰酮是一种天然香料和重要的中间体，广泛应用于食品、化妆品和医药工业中。β-紫罗兰酮作为环化的类异戊二烯的代表，具有广泛的生物活性，尤其表现出较好的抗肿瘤活性。β-紫罗兰酮作为植物次级代谢产物，从植物精油中提取的方法得到的量微且昂贵，目前主要通过化学法合成。化学法对反应条件和分离设备要求高，产品不易分离，产生的废液污染环境。此外，随着生活水平的提高和健康意识的增强，化学合成β-紫罗兰酮的安全性也受到人们越来越多质疑。
微生物酶法制备β-紫罗兰酮是近年来发展起来的新方法，该方法具有生产成本低、专一性强、操作方便和环境友好等优势。微生物酶法制备的香精香料被认为是“天然”香料，具有更为可靠的食品安全性，因此具有广阔的应用前景。郑坚强等（中国食品添加剂，2016，4: 133-138）利用西方许旺酵母发酵液转化β-胡萝卜素生成β-紫罗兰酮，发酵时间8天，产物中β-紫罗兰酮的含量只有22.36%；Nack等人（Journal of IndustrialMicrobiology & Biotechnology, 2012, 39: 1771-1778）利用类胡萝卜素裂解双加氧酶大肠杆菌工程菌的细胞破碎液催化β-胡萝卜素转化为β-紫罗兰酮，产率达到60%。目前微生物酶法制备β-紫罗兰酮存在主要问题是：催化专一性不高，反应产物较多，反应时间较长及β-紫罗兰酮产率不高等问题。
发明内容
本发明提供了一种类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的制备方法，解决了工业生产β-紫罗兰酮反应时间长，产率不高，反应条件要求高等问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方法：
一种类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的制备方法，制备步骤如下：
（1）培养霍氏肠杆菌并提取全基因组序列；
（2）构建类胡萝卜素9, 10’双加氧酶基因的重组质粒；
（3）类胡萝卜素9, 10’双加氧酶基因的诱导表达及酶蛋白的纯化，制得类胡萝卜素9, 10’双加氧酶。
所述步骤（1）中霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei），来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No：1.10608。
所述步骤（2）中构建重组质粒的操作为：根据类胡萝卜素9, 10’双加氧酶保守氨基酸序列，设计含有NdeI酶切位点的上游引物如SEQ ID NO：1所示及含有SalI酶切位点下游引物如SEQ ID NO：2所示，利用NdeI酶、SalI酶双酶切，将类胡萝卜素9, 10’双加氧酶基因插入pET15b-SM中间载体上，转化到大肠杆菌DH5α上，筛选并进行验证。
所述步骤（3）中诱导表达指将重组质粒转化到E. coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL中；酶蛋白的纯化指将收集的菌体，经超声破碎后进一步采用镍柱亲和层析和分子筛进行纯化。
所述步骤（4）中经分析鉴定得到类胡萝卜素9, 10’双加氧酶基因的序列，如SEQID NO：3所示；类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
所述pET15b-SM中间载体是在Novogen原核表达载体pET15b的多克隆位点上，添加了SalI和NsiI酶切位点。
一种类胡萝卜素9, 10’双加氧酶，作为催化β-胡萝卜素产生β-紫罗兰酮的应用。
本发明的有益效果在于：
1.本发明所制备的类胡萝卜素9, 10’双加氧酶基因，可高效催化合成β-紫罗兰酮，催化专一性高，反应产物少，反应时间短。
2.本发明得到了一种肠杆菌类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的基因序列和氨基酸序列，该酶是在霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）中发现并制备获得的第一个类胡萝卜素9, 10’双加氧酶。
3.本发明获得了一种不同于已发现类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的新型酶资源。该类胡萝卜素9, 10’双加氧酶具有不同的氨基酸序列和酶学特性。
4.本发明建立了肠杆菌类胡萝卜素9, 10’双加氧酶制备β-紫罗兰酮的方法，并优化了反应条件，经优化后β-紫罗兰酮产率达到79.4%。
附图说明
图1为重组载体的双酶切图。
图2为纯化后肠杆菌类胡萝卜素9, 10’双加氧酶SDS-PAGE电泳图。
图3 为肠杆菌类胡萝卜素9, 10’双加氧酶催化反应产物β-紫罗兰酮的HPLC图谱（a为反应底物β-胡萝卜素；b为反应产物β-紫罗兰酮和阿扑-10’-β-胡萝卜醛）。
图4为类胡萝卜素9, 10’双加氧酶催化β-胡萝卜素制备β-紫罗兰酮反应式。
图5为类胡萝卜素9, 10’双加氧酶最适反应温度。
图6为类胡萝卜素9, 10’双加氧酶最适反应pH。
图7为酶浓度对β-紫罗兰酮产量的影响。
图8为底物浓度对β-紫罗兰酮产量的影响。
图9为在最佳反应条件下β-紫罗兰酮产量。
具体实施方式
1、肠杆菌类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的制备
肠杆菌类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，引物设计，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化。具体步骤如下：
（1）菌株、质粒、酶与培养基：
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、限制性内切酶NdeI和SalI、Pyrobest DNA聚合酶、DNA连接试剂盒kit ver.2.1、细菌基因组DNA提取试剂盒kit ver.3.0购自TAKARA公司；大肠杆菌Escherichia coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL购自Novagen公司LB培养基：每升含Tryptone 10 g, Yeast extract 5 g, NaCl 10 g； 氨苄青霉素浓度为100 mg/L， 氯霉素浓度为34 mg/L；霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1.10608；克隆与表达质粒载体pET15b-SM本实验室构建与保存。
（2）霍氏肠杆菌菌株培养：
霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）培养基成分：K2HPO4（0.2 %）、MgSO4·7H2O（0.1 %）、NaNO3（0.2 %）、FeSO4·7H2O（0.005 %）、KCl（0.1%）、蔗糖（5%）、酵母浸粉（0.5%）。
培养条件：37℃、转速150 r/min震荡培养36 h至OD600nm为1.0左右。将菌液转至灭菌的50 mL离心管，4℃下4,000 g离心10 min，弃上清，收集菌体。
（3）PCR扩增及重组质粒的构建：
利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取霍氏肠杆菌基因组DNA（提取方法见试剂盒说明书）。按照目前已经报道类胡萝卜素9, 10’ 双加氧酶保守氨基酸序列，设计一对引物:上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示，其中，CATATG为上游引物NdeI酶切位点，GTCGAC为下游引物SalI酶切位点。以霍氏肠杆菌全基因组序列为模板进行PCR扩增，PCR反应体系（50 μL）如下：模板1 μL（25 ng）, dNTP (25 mmol/L) 1 μL，引物（100 μmol/L）各0.5 μL，10×缓冲液 5 μL，ProbestTMDNA 聚合酶 (5U/μL) 1μL，超纯水41μL。PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 45s，51℃ 60s，72℃ 2 min，30个循环。
PCR产物经NdeI酶和SalI酶双酶切后，连接到经同样内切酶酶切的pET15b-SM上，双酶切反应体系（20 μL）如下：PCR产物/pET15b-SM 16μL（400 ng），NdeI 内切酶（15 U/μL）1μL，SalI 内切酶（15 U/μL）1μL，10×缓冲液 2 μL。双酶切反应混合液37℃反应4h。
连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切（如图1所示）及测序验证，经测序分析鉴定得到类胡萝卜素9, 10’双加氧酶基因的序列，如SEQ ID NO：3所示；类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。pET15b-SM是在Novogen原核表达载体pET15b基础上改造而成，在原多克隆位点添加了SalI和NsiI酶切位点，便于基因克隆以及提高蛋白表达量。
（4）基因的诱导表达与蛋白质的纯化
将重组质粒转化E. coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL。带有重组质粒的表达菌在5mL含100 mg/L氨苄青霉素和34 mg/L氯霉素的LB液体培养基中过夜培养，然后按1% 接种量接到300 mL含氨苄青霉素的 LB 液体培养基培养2h，使OD600nm在0.5；加入终浓度0.5 mmol/L IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）于37℃继续培养4h，4℃ 12,000g离心15min。使用破壁buffer（50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 50 mmol/L NaCl）悬浮收集菌体，超声波破碎菌体，12,000g离心15min，得到粗酶液。进一步采用镍柱亲和层析（洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole）和分子筛Sephacryl TM S-200 HRcolumn（洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl；洗脱速度为：1 mL/min）纯化后，得到纯化的酶蛋白，并利用SDS-PAGE凝胶电泳来检测纯化效果（如图2所示）。
2、肠杆菌类胡萝卜素9, 10’双加氧酶酶学性质的分析鉴定
肠杆菌类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的酶活标准反应体系如下：0.5 mg/mL β-胡萝卜素、10 mmol/L三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP）、5%（w/v）辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷（OTG）、10 mmol/L FeSO4·7H2O、0.5% （w/v）Tween 80、1 mmol/L DTT、100 mmol/L NaCl、80mmol/L Tricine/KOH缓冲液（pH 8.5）和0.4 U/mL双加氧酶酶液。以不含有酶液的上述反应体系作对照组，40℃酶解60min，加入37%的甲醛终止反应。酶活力单位定义为：在一定条件下，每分钟生成1 微摩尔的β-紫罗兰酮所需要的酶量为一个活力单位(U)。高效液相色谱HPLC检测反应产物，所用色谱柱为Alltech Prevail C18柱 (美国奥泰公司，25 cm × 4.6cm)，采用日本岛津SPD-M10A二极管阵列检测器，流动相为正己烷：甲基叔丁基醚 （95:5,v/v），洗脱速度为1.0 mL/min，在波长460 nm检测。
通过对肠杆菌类胡萝卜素9, 10’双加氧酶进行分析鉴定，得到该酶的主要以下酶学性质如下：
（1）该酶能够催化转化β-胡萝卜素生成β-紫罗兰酮和阿扑-10’-β-胡萝卜醛（如图3和4所示）。
（2）该酶最适反应温度为40℃（如图5所示）。
（3）该酶最适反应pH为8.5（如图6所示）。
3、肠杆菌类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的应用
在水溶液反应体系中高效催化降解β-胡萝卜素，制备高纯度的β-紫罗兰酮，在食品、化妆品和医药工业领域具有重要的应用价值。由于微生物酶法制备β-紫罗兰酮具有降解效率高、专一性强、催化条件温和、产物中目标化合物含量高等特点，可以避免化学合成方法中转化率不高以及环境污染等问题。此外，微生物酶法制备的β-紫罗兰酮被认为是“天然”香料，具有更为可靠的食品安全性。
利用肠杆菌类胡萝卜素9, 10’双加氧酶催化降解β-胡萝卜素，制备β-紫罗兰酮。在标准反应体系中，该酶浓度为0.4 U/mL，β-紫罗兰酮的相对产量最高（如图7所示）。在标准反应体系中，底物β-胡萝卜素浓度为500 mg/L，该酶催化合成β-紫罗兰酮的相对产量最高（如图8所示）。经优化最佳反应条件：底物β-胡萝卜素浓度500 mg/L，类胡萝卜素9, 10’双加氧酶酶0.4 U/mL，反应温度40℃，水解反应12 h，10 mmol/L三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP）、5%（w/v）辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷（OTG）、10 mmol/L FeSO4·7H2O、0.5% （w/v）Tween 80、1 mmol/L DTT、100 mmol/L NaCl和80 mmol/L Tricine/KOH缓冲液（pH 8.5）。在此条件下，生成142.3 mg/L β-紫罗兰酮，产率达到79.4%（如图9所示）。
β-紫罗兰酮不仅可作为食品、化妆品、果酒的香料添加剂，而且还具有一定的对人体有益的生物活性功能，如β-紫罗兰酮可抑制癌细胞、调控癌细胞的增殖，并具有降血脂等功能，因此β-胡萝卜素氧化裂解生成β-紫罗兰酮受到越来越多的关注。本发明的肠杆菌类胡萝卜素9, 10’双加氧酶高效催化β-胡萝卜素，得到β-紫罗兰酮，在食品、化妆品和医药工业领域具有重要的工业应用价值。
本发明在霍氏肠杆菌中发现了一个能够高效催化降解β-胡萝卜素的类胡萝卜素9, 10’双加氧酶，该菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No：1.10608。采用基因工程方法在大肠杆菌Escherichia coli中克隆表达该双加氧酶基因，经亲和层析和分子筛等方法制备了该酶蛋白，分子量为57 KD。该酯酶最适反应温度和反应pH分别为40℃和8.5。该酶可以催化降解β-胡萝卜素，制备β-紫罗兰酮。经优化最佳反应条件：底物β-胡萝卜素浓度500 mg/L，类胡萝卜素9, 10’双加氧酶酶0.4 U/mL，反应温度40℃，水解反应12 h，10 mmol/L三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP）、5%（w/v）辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷（OTG）、10 mmol/L FeSO4·7H2O、0.5% （w/v）Tween 80、1 mmol/L DTT、100 mmol/LNaCl和80 mmol/L Tricine/KOH缓冲液（pH 8.5）。在此条件下，生成142.3 mg/L β-紫罗兰酮，产率达到79.4%。在目前微生物酶法制备β-紫罗兰酮方法中，大多采用微生物发酵液或粗酶催化合成β-紫罗兰酮，还未见利用纯酶催化β-胡萝卜素制备β-紫罗兰酮的方法。综上所述，肠杆菌类胡萝卜素9, 10’双加氧酶具有良好的催化活性，可以高效催化降解β-胡萝卜素，制备高纯度的β-紫罗兰酮，适用于β-紫罗兰酮生物酶法制备，具有较好的工业应用前景。
Claims (5)
1.一种类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的制备方法，其特征在于：制备步骤如下：
（1）培养霍氏肠杆菌并提取全基因组序列；
（2）构建类胡萝卜素9, 10’双加氧酶基因的重组质粒；
（3）类胡萝卜素9, 10’双加氧酶基因的诱导表达及酶蛋白的纯化，制得类胡萝卜素9,10’双加氧酶；
所述步骤（2）中经分析鉴定得到类胡萝卜素9, 10’双加氧酶基因的序列，如SEQ IDNO：3所示；类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.如权利要求1所述的类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中构建重组质粒的操作为：根据类胡萝卜素9, 10’双加氧酶保守氨基酸序列，设计含有NdeI酶切位点的上游引物如SEQ ID NO：1所示及含有SalI酶切位点下游引物如SEQ ID NO：2所示，利用NdeI酶、SalI酶双酶切，将类胡萝卜素9, 10’双加氧酶基因插入pET15b-SM中间载体上，转化到大肠杆菌DH5α上，筛选并进行验证。
3.如权利要求1所述的类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中诱导表达指将重组质粒转化到E. coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL中；酶蛋白的纯化指将收集的菌体，经超声破碎后进一步采用镍柱亲和层析和分子筛进行纯化。
4.如权利要求2所述的类胡萝卜素9, 10’双加氧酶的制备方法，其特征在于：所述pET15b-SM中间载体是在Novogen原核表达载体pET15b的多克隆位点上，添加了SalI和NsiI酶切位点。
5.权利要求1-4任一项所制备的类胡萝卜素9, 10’双加氧酶，作为催化β-胡萝卜素产生β-紫罗兰酮的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |