CN103981134B - 一株铜绿假单胞菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用 - Google Patents

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本发明公开了一株铜绿假单胞菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用。本发明公开的一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，其保藏编号为CGMCC No.8727。作为玉米赤霉烯酮降解的生物材料，无论开发新的生物降解菌剂或者生物降解无菌制剂，该菌都具有很好的应用前景。

Description

一株铜绿假单胞菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株铜绿假单胞菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
背景技术
玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)由镰刀菌在次生代谢的过程中产生的一种雌激素类真菌毒素。ZEN污染谷物的种类非常广泛，如小麦、大麦、玉米、燕麦、高粱、黑麦、小米及这些谷物的相关产品，是世界上污染范围最广泛的镰刀霉毒素之一。ZEN对动物、人类都会产生毒害，主要影响动物繁殖机能，降低怀孕动物的胚胎成活率及新生胎儿的出生重，导致动物繁殖机能紊乱。人们食用被其污染的食物会导致肝癌、睾丸癌、食道癌及青春期早熟等疾病。此外，ZEN还具有免疫毒性、肝毒性、遗传毒性，对肿瘤发生也有一定的影响。
ZEN去毒方法可分为物理、化学和生物三大类，其中生物法因具有效率高、特异性强以及对食品、饲料和环境没有污染的特点，利用生物手段进行ZEN的降解则成为近年来ZEN毒素降解研究的热点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NS7。
本发明提供的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NS7，其保藏编号为CGMCCNo.8727。
上述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NS7或其培养液或其发酵产物或其代谢产物或其菌悬液在降解玉米赤霉烯酮中的应用也是本发明保护的范围。
上述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NS7或其培养液或其发酵产物或其代谢产物或其菌悬液在制备降解玉米赤霉烯酮产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种降解玉米赤霉烯酮的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述的铜绿假单胞菌NS7对玉米赤霉烯酮进行降解处理。
上述方法中，所述降解处理为将上述的铜绿假单胞菌NS7的培养液和/或发酵产物和/或代谢产物和/或菌悬液与含有玉米赤霉烯酮的样品和/或产品混合。
其中，含有玉米赤霉烯酮的样品和/或产品具体为含有玉米赤霉烯酮的农产品加工原料、饲料、食品及环境样品和/或产品。
在本发明的实施例中，所述降解处理为将铜绿假单胞菌NS7的培养液与玉米赤霉烯酮溶液混合；
所述玉米赤霉烯酮溶液的浓度为5ppm，该溶液由溶质玉米赤霉烯酮和溶剂色谱纯甲醇组成，且溶质的终浓度为2ppm。
所述混合为混匀后28℃转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养72h。
铜绿假单胞菌NS7的培养液为将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NS7(CGMCC No.8727)接种于液体NB培养基中，在温度为37℃和转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养24h后，收集培养产物为NS7培养液。
菌株NS7鉴定已于2014年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.8727，分类命名为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。
本发明的实验证明，本发明发现了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NS7，经过研究本发明提供的铜绿假单胞菌NS7可高效降解玉米赤霉烯酮，该菌作为玉米赤霉烯酮降解的生物材料，无论在开发新的生物降解菌剂还是生物降解无菌制剂方面都具有很好的应用前景。
附图说明
图1为玉米赤霉烯酮降解效果的高效液相色谱串联质谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
NB液体培养基：由溶剂和溶质组成；溶质为蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶剂为水；蛋白胨在NB液体培养基中的浓度为1％，牛肉膏在NB液体培养基中的浓度为0.3％，NaCl在NB液体培养基中的浓度为0.5％，所述％均为质量体积百分比(g/100ml)。
NA固体培养基：在NB液体培养基中加入琼脂(琼脂与液体培养基的比例为1.5g：100ml)，得到NA固体培养基。
MM液体培养基：由溶剂和溶质组成；溶质为Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaNO3、(NH4)2SO4、CaCl2·2H2O，溶剂为水；Na2HPO4浓度为0.16％,，KH2PO4浓度为0.1％，MgSO4·7H2O浓度为0.05％，NaNO3浓度为0.05％,(NH4)2SO4浓度为0.05％,CaCl2·2H2O浓度为0.0025％，所述％均为质量体积百分比(g/100ml)。
实施例1、菌的分离与鉴定
一、菌的分离
(一)2013年6月，在超净工作台中，将采集自北京郊区的土壤样品放在无菌蒸馏水中震荡15分钟制备菌悬液，摇床转速为180rpm。
(二)将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在NA培养基平板上，30℃条件下培养24小时，菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株应用于玉米赤霉烯酮降解实验。得到的一株玉米赤霉烯酮降解能力强的菌株命名为NS7。
二、鉴定
(一)按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌系统鉴定手册”(东秀珠，蔡妙英等编著，北京：科学出版社，2001.2)中描述的方法，对菌株NS7进行形态特征和生理生化特性鉴定，具体结果如下：
呈杆状；革兰氏阴性；硝酸还原：+；接触酶：+；酪素水解：+；氧化酶：+；淀粉水解：-；4％NaCl生长：+；柠檬酸利用：+；精氨酸双水解酶：+；吲哚产生：-；色氨酸脱氢酶：-；H2S产生：-；脲酶：+；VP实验：-；赖氨酸脱酸酶：-。
Biolog GEN III生长实验表明，菌株NS7可以利用β-羟基-D，L-丁酸、甘氨酸-L-脯氨酸、N-乙酰-D-葡糖胺、α-D-葡萄糖、D-果糖、D-岩藻糖、肌苷、D-甘露醇、D-阿糖醇、甘油、D-果糖-6-磷酸、明胶、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-焦谷氨酸、D-葡糖酸、D-葡萄糖醛酸、葡糖醛酰胺、奎宁酸、p-羟基苯乙酸、丙酮酸甲酯、L-乳酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、L-苹果酸、吐温40、γ-氨基丁酸、丙酸和乙酸。
Biolog GEN III化学敏感实验表明，菌株NS7对pH6.0、pH5.0、4％NaCl、二甲胺四环素、1％乳酸钠、夫西地酸、D-丝氨酸、醋竹桃霉素、利福霉素SV、林可霉素、盐酸胍、十四烷基硫酸钠、万古霉素、四唑紫、萘啶酸、亚碲酸钾、氨曲南、丁酸钠、四唑蓝等所测定条件不敏感。
(二)16S rDNA试验
提取NS7的总DNA，以其为模板，利用细菌16S rDNA通用引物(27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492r：GGTTACCTTGTTACGACTT)进行PCR扩增，得到长度约为1.4kb的扩增产物，将扩增产物回收并进行测序，测得的序列如序列表序列1所示。
根据Gen-Bank序列同源性比较，菌株NS7与Pseudomonas aeruginosa strainfwzb12(GenBank登录号KF208493.1)同源性为99％，初步判定该菌为假单胞菌属细菌(Pseudomonas sp.)。
基于以上特征，将菌株NS7鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。该菌株已于2014年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.8727，分类命名为铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa。
实施例2、铜绿假单胞菌NS7在降解玉米赤霉烯酮中的应用
一、铜绿假单胞菌NS7培养活化
将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NS7(CGMCC No.8727)接种于液体NB培养基中，在温度为37℃和转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养24h后，收集培养产物为NS7培养液，用于后续的玉米赤霉烯酮降解实验。
二、铜绿假单胞菌NS7对玉米赤霉烯酮降解作用
1、玉米赤霉烯酮的配制：
将5mg玉米赤霉烯酮标准品(Sigma-，货号Z2125)溶解于25ml色谱纯甲醇中获得浓度为200ppm的玉米赤霉烯酮溶液。
2、降解玉米赤霉烯酮
实验组：取10μl浓度为200ppm的玉米赤霉烯酮溶液置于10ml离心管中，加入975μl新鲜MM培养基，使其终浓度为2ppm。加入10μl上述二得到的NS7培养液，充分混匀在28℃转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养72h，10000g离心10min去除细胞，收集上清液。
对照组：取10μl不接菌的NB培养基加入体积为1ml的含2ppm玉米赤霉烯酮的MM培养基作为对照组。
3、玉米赤霉烯酮的检测
首先使用甲醇：水(6：4)溶液对上清液进行萃取，然后使用免疫亲和净化柱对样品残留毒素进行净化提取(方法参照免疫亲和柱使用说明书)；最后用HPLC-TOF-MS对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相乙腈：水＝50：50；流速0.2ml/min；色谱柱C18150mm×4.6mm，0.5μm；激发波长274nm，检测波长316nm；柱温30℃；进样量20μl。
玉米赤霉烯酮降解率(％)＝(对照组残留玉米赤霉烯酮含量-处理组残留玉米赤霉烯酮含量)/对照组玉米赤霉烯酮含量×100。
结果如图1所示，A：玉米赤霉烯酮标准品；B：对照组；C：实验组；
对照组残留玉米赤霉烯含量为1.92±0.08ppm；
实验组残留玉米赤霉烯含量0.14±0ppm；
结果表明，NS7对玉米赤霉烯酮有较好的降解效果，降解率92.75±0.33％。

Claims (5)

1.一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）NS7，其保藏编号为CGMCC No.8727。
2.权利要求1所述的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）NS7或其培养液或其菌悬液在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
3.权利要求1所述的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）NS7或其培养液或其菌悬液在制备降解玉米赤霉烯酮的产品中的应用。
4.一种降解玉米赤霉烯酮的方法，包括如下步骤：用权利要求1 所述的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）NS7对玉米赤霉烯酮进行降解处理。
5.根据权利要求4所述的方法，其特性在于：所述降解处理为将权利要求1 所述的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）NS7的培养液和/或菌悬液与含有玉米赤霉烯酮的样品和/或产品混合。
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