CN103695343B - 一株利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌BBER23（Tetragenococcushalophilus）BBER23，属于微生物领域。所述嗜盐四联球菌已于2013年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2013480。这株嗜盐四联球菌BBER23能够利用精氨酸，并且不积累瓜氨酸。

Description

一株利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌
技术领域
本发明涉及一株利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌，属于微生物领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯（Ethylcarbamate,EC）是一种致癌物质，主要会引发肺癌、肝癌等严重性肿瘤疾病，并且对人体的免疫系统造成伤害。研究发现，不仅酒类中含有氨基甲酸乙酯，而且在大豆发酵制品如酱油中同样不同程度的含有此类物质。
酿造酱油中氨基甲酸乙酯的主要前体物质是瓜氨酸与乙醇。因此降低酱油中瓜氨酸的含量是我们降低酱油中氨基甲酸乙酯有效措施之一。
在酱油生产中，酵母产生乙醇，一大类厌氧或兼性厌氧的乳酸菌可以把精氨酸通过精氨酸脱亚氨基途径（ADI途径）转化成瓜氨酸。ADI途径主要由三个基因控制：arcA基因，arcB基因，arcC基因，具体反应如下面的反应式所示。
酱醪中的主要微生物有乳酸足球菌，嗜盐四联球菌，魏斯氏菌，链球菌，葡萄球菌，乳酸菌。乳酸菌是酱油生产过程中的优势菌株，也是香味物质产生菌，但也是瓜氨酸积累量很高的菌株。
本发明目的在于提供一株能利用瓜氨酸或者是不积累瓜氨酸的乳酸菌，从而降低酱油中氨基甲酸乙酯的含量。
发明内容
本发明提供了一株嗜盐四联球菌，是在高盐环境下能够利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌BBER23（Tetragenococcushalophilus）BBER23，该菌已于2013年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2013480。
所述嗜盐四联球菌分离自日式工艺的酱醪，其保藏条件如下：从生长良好的平板上挑取单菌落转接入含100g/lNacl的MRS培养基中，在30℃静置培养四天，取500μL培养液移入含有500μL30%甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。
嗜盐四联球菌分离培养基为改良MRS：100g/lNaCl,溴甲酚紫0.06g/l，50u/ml制霉菌素，100g/l生酱油；30℃培养5-7天。
氨基酸检测培养基：酵母膏5g/l，牛肉膏5g/l，胰蛋白胨5g/l，NaCl180g/l，葡萄糖0.5g/l，Tween-801g/l，MgSO4·7H2O0.2g/l，MnSO4·H2O0.05g/l，FeSO40.4g/l，柠檬酸三胺2g/l，CaCO30.1g/l，吡哆醛-5-磷酸0.05g/l，K2HPO42g/l，pH6.0。根据检测需要添加相应氨基酸。
将保藏的所述嗜盐四联球菌在含100g/lNaCl的MRS固体培养基上划线，于30℃静置培养4天，挑取单菌落接入含100g/lNaCl的MRS液体培养基，30℃静置培养四天，离心10min（6000rpm，4℃）后去上清获得菌体，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）悬浮菌体。向5mL离心管中加入4mL含5g/l的精氨酸的氨基酸检测培养基，接种400μL的悬浮菌液，接种后OD600为7.8；30℃静置培养5天，精氨酸含量降到0，瓜氨酸积累量为0，鸟氨酸大量积累。
向5mL离心管中加入4mL含3g/l的瓜氨酸的氨基酸检测培养基，接种400μL的悬浮菌液，接种后OD600为7.8；30℃静置培养5天后，瓜氨酸大量降低，鸟氨酸大量积累。
向5mL离心管中加入4mL含3g/l的瓜氨酸及5g/l的精氨酸的氨基酸检测培养基，接种400μL悬浮菌液，接种后的OD600为7.8。30℃静置培养5天后用HPLC的方法检测培养基中精氨酸，瓜氨酸和鸟氨酸含量，观测到精氨酸瓜氨酸含量降低，鸟氨酸大量积累，但精氨酸利用量大于瓜氨酸利用量。因此，在高盐条件下这所述嗜盐四联球菌利用精氨酸并不积累瓜氨酸。
本发明提供了一株能利用环境中的精氨酸和瓜氨酸的嗜盐四联球菌，耐盐，能消耗掉氨基甲酸乙酯的前体物，从而降低环境中的氨基甲酸乙酯的含量，在降低发酵食品瓜氨酸、氨基甲酸乙酯含量方面有潜在应用价值。
生物材料保藏
嗜盐四联球菌BBER23（Tetragenococcushalophilus）BBER23，该菌已于2013年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2013480。
具体实施方式
分离平板：改良MRS（100g/lNaCl,溴甲酚紫0.06g/l，50u/ml制霉菌素，100g/l生酱油，琼脂20g/l）。MRS培养基为培养乳酸杆菌专用，购于OXIOD公司。培养条件：30℃，5-7天。
基因组提取试剂盒：e.Z.N.ABacterialDNAKitD3350-01。
嗜盐四联球菌分离培养基：改良MRS(100g/lNaCl,溴甲酚紫0.06g/l，50u/ml制霉菌素，100g/l生酱油)，30℃，5-7天。
氨基酸检测培养基：酵母膏5g/l，牛肉膏5g/l，胰蛋白胨5g/l，NaCl180g/l，葡萄糖0.5g/l，Tween-801g/l，MgSO4·7H2O0.2g/l，MnSO4·H2O0.05g/l，FeSO40.4g/l，柠檬酸三胺2g/l，CaCO30.1g/l，吡哆醛-5-磷酸0.05g/l，K2HPO42g/l，pH6.0。根据检测需要添加相应氨基酸。
嗜盐四联球菌的培养条件为：将保藏的乳酸菌在含100g/lNaCl的MRS固体培养基上划线，于30℃静置培养4天，挑取单菌落接入含100g/lNaCl的MRS液体培养基，30℃静置培养四天，离心10min（6000rpm，4℃）后去上清获得菌体，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）悬浮菌体。
实施例1嗜盐四联球菌筛选方法
从180天的日式酱油工艺酱醪中取样稀释涂板到嗜盐四联球菌分离培养基平板上，30℃富集培养5天。挑选表面光滑、不透明、乳白色的小单菌落接种到含有100g/lNaCl的MRS固体培养基上，划线分离作纯培养。四天后，将纯培养物接种到100g/lNaCl的MRS液体培养基中培养四天富集菌体，提取基因组，通过PCR筛选得到有groEL基因的菌株。
正向引物：5'-CGTCGTTCAATGCTTAATGG-3'；
反向引物：5'-TGCTGCCAGAAGAAACTTCA-3'；通过16SrDNA测序结果与数据库比对后确定是嗜盐四联球菌。该菌已于2013年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2013480，其16SrDNA核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
实施例2嗜盐四联球菌利用精氨酸能力分析
挑取平板上活化好的嗜盐四联球菌单菌落接种于100g/lNaCl的MRS液体培养基中，30℃静置培养四天，离心10min（4000rpm，4℃）取菌体，加入1mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）悬浮菌体。
向5mL离心管中加入4mL含5g/l的精氨酸的氨基酸检测培养基，接种400uL的悬浮菌液，接种后OD600为7.8。30℃静置培养5天后用HPLC的方法检测培养基中精氨酸和瓜氨酸以及鸟氨酸含量，结果表明精氨酸含量降到0，瓜氨酸积累量为0，鸟氨酸大量积累。因此，在高盐条件下这株嗜盐四联球菌利用精氨酸转化成瓜氨酸，瓜氨酸又转化成鸟氨酸，不积累瓜氨酸。具体数值如下：
表1不同盐浓度下精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸代谢变化
ΔArg(g/l）：精氨酸的消耗量     ΔCit(g/l)：瓜氨酸的生成量     ΔOrn(g/l)：鸟氨酸的生成量
实施例3嗜盐四联球菌利用瓜氨酸能力分析
挑取平板上活化好的嗜盐四联球菌单菌落接种于100g/lNaCl的MRS液体培养基中，30℃静置培养四天，离心10min（4000rpm，4℃）取菌体，加入1mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）悬浮菌体。
向5mL离心管中加入4mL含3g/l的瓜氨酸的氨基酸检测培养基，接种400uL的菌液，接种后OD600为7.8。30℃静置培养5天后用HPLC的方法检测培养基中瓜氨酸和鸟氨酸含量，观测到瓜氨酸大量降低，鸟氨酸大量积累。因此，在高盐条件下这株嗜盐四联球菌能利用瓜氨酸转化成鸟氨酸，这样即可减少环境中的瓜氨酸含量，从而降低氨基甲酸乙酯的产生。具体数值如下：
表2不同盐浓度下瓜氨酸、鸟氨酸代谢变化
ΔCit(g/l)：瓜氨酸的消耗量    ΔOrn(g/l)：鸟氨酸的生成量
实施例4嗜盐四联球菌利用精氨酸加瓜氨酸混合能力分析
挑取平板上活化好的嗜盐四联球菌单菌落接种于100g/lNaCl的MRS液体培养基中，30℃静置培养四天，离心10min（4000rpm，4℃）取菌体，加入1mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）悬浮菌体。
向5mL离心管中加入4mL含3g/l的瓜氨酸及5g/l的精氨酸的氨基酸检测培养基，接种400uL菌液，接种后的OD600为7.8。30℃静置培养5天后用HPLC的方法检测培养基中精氨酸，瓜氨酸和鸟氨酸含量，观测到精氨酸瓜氨酸含量降低，鸟氨酸大量积累，但精氨酸利用量大于瓜氨酸利用量。因此，在高盐条件下这株嗜盐四联球菌优先利用精氨酸。具体数值如下：
表3不同盐浓度下精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸代谢变化
ΔArg(g/l）：精氨酸的消耗量     ΔCit(g/l)：瓜氨酸的消耗量       ΔOrn(g/l)：鸟氨酸的生成量
实施例5嗜盐四联球菌的arcA、arcB、arcC基因验证
挑取-80℃甘油管保藏的嗜盐四联球菌在100g/lNaCl的MRS固体培养基上划线，30℃培养四天后，提取基因组后PCR，验证是否有arcA、arcB、arcC基因。
arcA引物如下：
正向引物：5'-GTGTTCCAATGTGTCCTCTTCT-3'；
反向引物：5'-GGTATTCGTAGTCATGCGGTAA-3'；验证结果表明这株嗜盐四联球菌有arcA基因。
arcB引物如下：
正向引物：5'-TTACACACGTGGGATAAATAAA-3'；
反向引物：5'-ATGACATCAGTATTTCAAGGACG-3'；验证结果表明这株嗜盐四联球菌有arcB基因。
arcC引物如下：
正向引物：5'-CTATTTTTTTATTATAGTTCCAGTTTTACC-3'；
反向引物：5'-ATGGCTAAAATTGTAATTGCACTC-3'；验证结果表明嗜盐四联球菌有arcC基因。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (2)

1.一株利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)BBER23，于2013年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2013480。
2.权利要求1所述嗜盐四联球菌应用于降低发酵食品中瓜氨酸的含量。
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