CN103981135B - 一株沙氏芽孢杆菌及其在降解黄曲霉毒素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株沙氏芽孢杆菌及其在降解黄曲霉毒素中的应用。本发明公开的一株沙氏芽孢杆菌(Bacillus?shackletonii),其保藏编号为CGMCC?No.8868。作为黄曲霉毒素降解的生物材料,无论开发新的生物降解菌剂或者生物降解无菌制剂,该菌都具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一株沙氏芽孢杆菌及其在降解黄曲霉毒素中的应用。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是一类主要由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)真菌产生的有毒次级代谢产物,具有致癌、致畸、致细胞突变的作用,仅0.294mg/kg剂量就能引起敏感动物的急性中毒死亡(BondyandPestka,2000;Wangetal.,2002;Rawal,etal.,2010),其主要的作用靶标是肝脏,是诱发恶性肿瘤原发性肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)的主要因素之一,此外还可以引起肾脏和肾上腺的急性病变(Poirieretal.,2000;Kensleretal.,2011)。
黄曲霉毒素的基本结构是二呋喃环和氧杂萘邻酮(香豆素),前者为基本毒性结构,后者有加强毒性及致癌作用。目前已发现的黄曲霉毒素约有20种,在紫外光下发蓝色光(Blue)的为B族(黄曲霉毒素B1和B2),发绿光(Green)的为G族(黄曲霉毒素G1和G2)。黄曲霉毒素M1是AFB1的羟基化衍生物。其中AFB1分布最广、含量最高、毒性最强,其毒性是氰化钾的10倍、砒霜的68倍。
传统的黄曲霉毒素去毒方法有物理和化学方法,包括氨化法、碱法、高温法、射线辐照法及超滤-渗滤法等,这些方法存在效果不稳定、营养成分损失大、降解产物复杂、降解产物毒性难以确定,以及难以规模化生产等缺点;此外,还有吸附法,吸附法在吸附毒素的同时也会吸附营养成分。生物法,是利用微生物及其分泌的酶等代谢产物降解黄曲霉毒素的方法。生物法具有效率高、特异性强以及对食品、饲料和环境没有污染的特点,是黄曲霉毒素降解的方向。
发明内容
本发明的目的是提供一株沙氏芽孢杆菌。
本发明提供的一株沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)L7,其保藏编号为CGMCCNo.8868。
上述的沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)L7和/或其培养液和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在降解黄曲霉毒素中的应用也是本发明保护的范围。
上述的沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)L7和/或其培养液和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在制备降解黄曲霉毒素的产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中,所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2或黄曲霉毒素M1。
本发明的另一个目的是提供一种降解黄曲霉毒素的方法。
本发明提供的方法,包括如下步骤:用上述的沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)L7对黄曲霉毒素进行降解处理。
上述方法中,所述降解处理的方式为将上述的沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)L7的培养液和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物与含有黄曲霉毒素的样品和/或产品混合。
上述方法中,所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2或黄曲霉毒素M1。
所述黄曲霉毒素可以为B族黄曲霉毒素、B族黄曲霉毒素的衍生物和/或G族黄曲霉毒素,其中,所述B族黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1或黄曲霉毒素B2;所述G族黄曲霉毒素为黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2。所述B族黄曲霉毒素的衍生物为黄曲霉毒素M1。
所述含有黄曲霉毒素的样品和/或产品具体为含有黄曲霉毒素的农产品加工原料、饲料、食品及环境样品和/或产品。
在本发明的实施例中,所述降解处理为沙氏芽孢杆菌L7的培养液与黄曲霉毒素溶液混合;黄曲霉毒素溶液由黄曲霉毒素和色谱纯甲醇组成,且黄曲霉毒素在黄曲霉毒素溶液中的终浓度为100ppb。
沙氏芽孢杆菌L7的培养液为将沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)L7CGMCCNo.8868接种于液体NB培养基中,在温度为37℃和转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养24h,培养容器内的所有物质记作L7培养液。
所述混合为混匀后37℃静置72h。
菌株L7已于2014年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏号为CGMCCNo.8868,分类命名为沙氏芽孢杆菌Bacillusshackletonii。
本发明的实验证明,本发明发现了一株沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)L7,经过研究本发明提供的沙氏芽孢杆菌L7可高效降解黄曲霉毒素,该菌作为黄曲霉毒素降解的生物材料,无论在开发新的生物降解菌剂还是生物降解无菌制剂方面都具有很好的应用前景。
附图说明
图1为黄曲霉毒素B1降解效果液相色谱图
图2为黄曲霉毒素B2降解效果液相色谱图
图3为黄曲霉毒素G1降解效果液相色谱图
图4为黄曲霉毒素G2降解效果液相色谱图
图5为黄曲霉毒素M1降解效果液相色谱图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
NB液体培养基:由溶剂和溶质组成;溶质为蛋白胨、牛肉膏和NaCl,溶剂为水;蛋白胨在NB液体培养基中的浓度为1%,牛肉膏在NB液体培养基中的浓度为0.3%,NaCl在NB液体培养基中的浓度为0.5%,所述%均为质量体积百分比(g/100ml)。
NA固体培养基:在NB液体培养基中加入琼脂(琼脂与液体培养基的比例为1.5g:100ml),得到NA固体培养基。
实施例1、菌的分离与鉴定
一、菌的分离
(一)2013年6月,在超净工作台中,将采集自北京郊区的土壤样品放在无菌蒸馏水中震荡15分钟制备菌悬液,摇床转速为180rpm。
(二)将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在NA培养基平板上,30℃条件下培养24小时,菌落布满整个平板,用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化,点接纯化后的菌株应用于黄曲霉毒素降解实验。得到的一株黄曲霉毒素降解能力强的菌株命名为L7。
二、鉴定
(一)按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌系统鉴定手册”(东秀珠,蔡妙英等编著,北京:科学出版社,2001.2)中描述的方法,对菌株L7进行形态特征和生理生化特性鉴定,具体结果如下:
菌体的形态:
在NA培养基,28℃培养1天,菌体杆状,直径约为1.0-2.0μm×2.5-6.5μm;菌落奶白色,圆形,微凸,边缘不整齐。
生理生化特性:氧化酶:-;精氨酸双水解酶:-;明胶水解:-;淀粉水解:-;过氧化氢酶:+;三丁酸甘油脂水解:-;硝酸盐还原:-;七叶灵水解:+;酪素水解:+;Tween80水解:-;吲哚实验:-;脲酶:-;柠檬酸利用:+;H2S生成:-;VP实验:-;5%NaCl:+;厌氧生长:-;50℃:+;55℃:+;pH9.0:+。
(二)16SrDNA试验
提取L7的总DNA,以其为模板,利用细菌16SrDNA通用引物(27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;1492r:GGTTACCTTGTTACGACTT)进行PCR扩增,得到长度约为1.4kb的扩增产物,将扩增产物回收并进行测序,测得的序列如序列1所示。
根据Gen-Bank序列同源性比较,菌株L7与BacillusshackletoniibE58(2011)(GenBank登录号JF772506.1)同源性为100%,初步判定该菌为沙氏芽孢杆菌属细菌(Bacillusshackletonii)。
基于以上特征,将菌株L7鉴定为沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)。该菌株已于2014年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏号为CGMCCNo.8868,分类命名为沙氏芽孢杆菌Bacillusshackletonii。
实施例2、沙氏芽孢杆菌L7在降解黄曲霉毒素中的应用
一、沙氏芽孢杆菌L7的培养
将沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)L7CGMCCNo.8868接种于液体NB培养基中,在温度为37℃和转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养24h,培养容器内的所有物质记作L7培养液,用于后续的黄曲霉毒素降解实验。
二、沙氏芽孢杆菌L7对黄曲霉毒素B1降解作用
1、黄曲霉毒素B1的配制:
将1mg黄曲霉毒素B1标准品(货号A6636)溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素B1溶液。
2、降解实验
处理组:取0.4ml上述一得到的L7培养液置于1.5ml离心管中,加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素B1至其终浓度为100ppb,充分混匀37℃静置72h后,10000g离心10min去除细胞。
对照组:以0.4ml不接菌的NB培养基加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素B1至其终浓度为100ppb作为对照组。
3、黄曲霉毒素B1的检测
首先使用甲醇:水(6:4)溶液对其进行萃取,然后使用免疫亲和柱对样品残留毒素进行净化提取(方法参照免疫亲和柱使用说明书);最后用HPLC(柱后光化学衍生)对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇:水=1:1;流速1ml/min;色谱柱C18150mm×4.6mm,0.5μm;激发波长350nm,检测波长450nm;柱温30℃;进样量20μl。
AFB1降解率(%)=(对照组残留AFB1含量-处理组残留AFB1含量)/对照组残留AFB1含量×100。
结果如图1和表1所示,图1中,A:黄曲霉毒素标准品(黄曲霉毒素B1的保留时间为11.412min);B:对照组(黄曲霉毒素B1的保留时间为11.962min);C:L7组(黄曲霉毒素B1的保留时间为11.892min);
对照组残留AFB1含量为97.25±1.56;
处理组残留AFB1含量27.45±2.88;
结果表明,L7对黄曲霉毒素B1有较好的降解效果,降解率为71.77%。
表1沙氏芽孢杆菌L7对黄曲霉毒素的降解效果
三、沙氏芽孢杆菌L7对黄曲霉毒素B2降解作用
1、黄曲霉毒素B2的配制:
将1mg黄曲霉毒素B2标准品(货号A9887)溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素B2溶液。
2、降解实验
处理组:取0.4ml上述一得到的L7培养液置于1.5ml离心管中,加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素B2至其终浓度为100ppb,充分混匀37℃静置72h后,10000g离心10min去除细胞。
对照组:以0.4ml不接菌的NB培养基加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素B2至其终浓度为100ppb作为对照组。
3、黄曲霉毒素B2的检测:
首先使用甲醇:水(6:4)溶液对其进行萃取,然后使用免疫亲和柱对样品残留毒素进行净化提取(方法参照免疫亲和柱使用说明书);最后用HPLC(柱后光化学衍生)对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇:水=1:1;流速1ml/min;色谱柱C18150mm×4.6mm,0.5μm;激发波长350nm,检测波长450nm;柱温30℃;进样量20μl。
AFB2降解率(%)=(对照组残留AFB2含量-处理组残留AFB2含量)/对照组残留AFB2含量×100。
结果如图2和表1所示。
图2中,A:黄曲霉毒素标准品(黄曲霉毒素B2的保留时间为10.047min);B:对照组(黄曲霉毒素B2的保留时间为10.129min);C:L7组(黄曲霉毒素B2的保留时间为10.173min);
对照组残留AFB2含量为106.56±3.25;
处理组残留AFB2含量65.21±3.80;
结果表明,L7对黄曲霉毒素B2有一定的降解效果,降解率为38.80%。
四、沙氏芽孢杆菌L7对黄曲霉毒素G1降解作用
1、黄曲霉毒素G1的配制:
将1mg黄曲霉毒素G1标准品(货号32756)溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素G1溶液
2、降解实验
处理组:取0.4ml上述一得到的L7培养液置于1.5ml离心管中,加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素G1至其终浓度为100ppb,充分混匀37℃静置72h后,10000g离心10min去除细胞。
对照组:以0.4ml不接菌的NB培养基加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素G1作为对照组。
3、黄曲霉毒素G1的检测:
首先使用甲醇:水(6:4)溶液对其进行萃取,然后使用免疫亲和柱对样品残留毒素进行净化提取(方法参照免疫亲和柱使用说明书);最后用HPLC(柱后光化学衍生)对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇:水=1:1;流速1ml/min;色谱柱C18150mm×4.6mm,0.5μm;激发波长350nm,检测波长450nm;柱温30℃;进样量20μl。
AFG1降解率(%)=(对照组残留AFG1含量-处理组残留AFG1含量)/对照组残留AFG1含量×100。
结果如图3和表1所示,图3中,A:黄曲霉毒素标准品(黄曲霉毒素G1的保留时间为8.588min);B:对照组(黄曲霉毒素G1的保留时间为8.297min);C:L7组(黄曲霉毒素G1的保留时间为8.317min);
对照组残留AFG1含量为98.63±1.96;
处理组残留AFG1含量1.82±1.22;
结果表明,L7对黄曲霉毒素G1有很好的降解效果,降解率为98.15%。
五、沙氏芽孢杆菌L7对黄曲霉毒素G2降解作用
1、黄曲霉毒素G2的配制:
将1mg黄曲霉毒素G2标准品(货号34031)溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素G2溶液
2、降解实验
处理组:取0.4ml上述一得到的L7培养液置于1.5ml离心管中,加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素G2至其终浓度为100ppb,充分混匀37℃静置72h后,10000g离心10min去除细胞。
对照组:以0.4ml不接菌的NB培养基加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素G2作为对照组。
3、黄曲霉毒素G2的检测:
首先使用甲醇:水(6:4)溶液对其进行萃取,然后使用免疫亲和柱对样品残留毒素进行净化提取(方法参照免疫亲和柱使用说明书);最后用HPLC(柱后光化学衍生)对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇:水=1:1;流速1ml/min;色谱柱C18150mm×4.6mm,0.5μm;激发波长350nm,检测波长450nm;柱温30℃;进样量20μl。
AFG2降解率(%)=(对照组残留AFG2含量-处理组残留AFG2含量)/对照组残留AFG2含量×100。
结果如图4和表1所示。
图4中,A:黄曲霉毒素标准品(黄曲霉毒素G2的保留时间为7.713min);B:对照组(黄曲霉毒素G2的保留时间为7.657min);C:L7组(黄曲霉毒素G2的保留时间为7.537min);
对照组残留AFG2含量为95.53±2.07;
处理组残留AFG2含量3.53±0.46;
结果表明,L7对黄曲霉毒素G2有很好的降解效果,降解率为96.30%。
六、沙氏芽孢杆菌L7对黄曲霉毒素M1降解作用
1、黄曲霉毒素M1的配制:
将1mg黄曲霉毒素M1标准品(货号34031)溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素M1溶液。
2、降解实验
处理组:与上述二的方法基本相同,不同的是替换为黄曲霉毒素M1溶液。
对照组:与上述二的方法相同。
3、黄曲霉毒素M1的检测:
与上述二的方法相同。
AFM1降解率(%)=(对照组残留AFM1含量-处理组残留AFM1含量)/对照组AFM1含量×100。
结果如图5和表1所示,A:黄曲霉毒素标准品(黄曲霉毒素M1的保留时间为7.847min);B:对照组(黄曲霉毒素M1的保留时间为7.622min);C:处理组(黄曲霉毒素M1的保留时间为7.918min);
对照组残留AFM1含量为97.71±2.75;
处理组残留AFM1含量68.77±1.96;
结果表明,L7对黄曲霉毒素M1有很好的降解效果,降解率为29.62%。
Claims (7)
1.一株沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)L7,其保藏编号为CGMCCNo.8868。
2.权利要求1所述的沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)L7和/或其培养液和/或其菌悬液和/或其发酵液在降解黄曲霉毒素中的应用。
3.权利要求1所述的沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)L7和/或其培养液和/或其菌悬液和/或其发酵液在制备降解黄曲霉毒素的产品中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于:所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2或黄曲霉毒素M1。
5.一种降解黄曲霉毒素的方法,包括如下步骤:用权利要求1所述的沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)L7对黄曲霉毒素进行降解处理。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述降解处理的方式为将权利要求1所述的沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)L7的培养液和/或其菌悬液和/或其发酵液与含有黄曲霉毒素的样品和/或产品混合。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其特征在于:
所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2或黄曲霉毒素M1。
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