CN113016984B - 蒙氏假单胞菌的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蒙氏假单胞菌A3‑1的应用，属于微生物应用技术领域。蒙氏假单胞菌A3‑1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14485，能够适应在100℃的处理下降解黄曲霉毒素，降解率高，可将其制备成菌剂或者无菌制剂，应用于黄曲霉毒素的降解过程中，具有广阔的经济和应用价值。

Description

蒙氏假单胞菌的应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及蒙氏假单胞菌A3-1在降解黄曲霉毒素中的应用。
背景技术
黄曲霉毒素（Aflatoxin）是一类由黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（A.parasiticus）和集蜂曲霉（A.nomious）等曲霉菌产生的有毒二次代谢产物，具有很强的毒性和致癌性，其毒性远高于氰化物、砷化物和农药，是导致人体肝癌、鼻咽癌的主要病原之一。在食品和饲料中，黄曲霉毒素污染现象非常普遍，对食品业和畜牧业造成了严重经济损失，对人类和动物的健康造成巨大威胁。1960年含有黄曲霉毒素的巴西花生粕导致英国10万多只火鸡死亡；该毒素每年对亚洲养猪业造成高达11亿的经济损失。
黄曲霉毒素的基本结构是二呋喃环和氧杂奈邻酮，前者为基本毒性结构，后者有加强毒性和致畸作用。目前已经发现的黄曲霉毒素约有20种，主要分为B族（黄曲霉毒素B1和B2），G族（黄曲霉毒素G1和G2）。其中黄曲霉毒素B1分布最广、含量最高、毒性最强。
黄曲霉毒素性质稳定，一般加工方法不能去除其毒性。国内外去除黄曲霉素素的方法主要有紫外线照射、热处理、吸附剂脱毒等物理法，强酸、强碱、抗氧化剂处理等化学法，但是这些理化方法不仅成本高、营养成分损失大、效率低，有的方法还伴有毒性物质产生，以及难以规模化处理等缺点，难以同时满足高效、安全和成本低廉的实际应用需求。生物法是利用细菌和真菌等微生物及其代谢产物降解饲料、食品中污染的黄曲霉毒素的方法。生物去毒法对原料无污染、具有高度专一性、同时避免毒素重新产生，因而是一种绿色、安全和高效的去毒方法，成为近年来的研究热点。赵月菊等人发明的《一株铜绿假单胞菌及其在降解黄曲霉毒素方面的应用》（授权公告号CN103710292B），报道了一株在37℃条件下能降解82.84％的黄曲霉毒素B1、降解46.77％的黄曲霉毒素B2的铜绿假单胞菌。可以看出，虽然这株菌可以降解黄曲霉毒素，但是，它的降解温度要求严苛，只在37℃条件下能降解黄曲霉毒素，而在超过40-80℃的温度条件下没有降解效果的报道。在实际的食品和饲料加工应用中会有升温的加工过程问题。我们分离发现了一株明显不同于铜绿假单胞菌的菌株，经表型特征和16S rRNA基因分析发现该菌为蒙氏假单胞菌。本发明中可耐热降解黄曲霉毒素的蒙氏假单胞菌，37℃条件下能降解高达91.5％的黄曲霉毒素B1；30℃条件下降解79.2％的黄曲霉毒素B2；80℃条件下能降解83.6％的黄曲霉毒素B1，降解61.1％的黄曲霉毒素B2；100℃处理20min后降至37℃，能降解78.9％的黄曲霉毒素B1，降解50.5％黄曲霉毒素B2。相比铜绿假单胞菌，蒙氏假单胞菌具有更高效的降解黄曲霉毒素能力，尤其是在较高温度下仍能高效降解多种黄曲霉毒素。蒙氏假单胞菌悬液和/或发酵液和/或发酵上清液和/或代谢产物能耐受高温处理，更适合降解去除需要高温处理的农产品原料、饲料、食品及环境样品和/或产品中污染的黄曲霉毒素。
发明内容
本发明的目的是提供一株可耐热、降解黄曲霉毒素的蒙氏假单胞菌（Pseudomonasmonteilii），以便克服已有的降解黄曲霉毒素菌株的降解能力低、降解温度只限于小于40℃的温度条件的缺陷。本发明的一株蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii），其菌悬液和/或发酵液和/或发酵上清液和/或代谢产物能耐受高温处理，降解效率高，更适合降解去除需要高温处理的农产品原料、饲料、食品及环境样品和/或产品中污染的黄曲霉毒素。
本发明提供的一株蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii），其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.14485。
一株蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii），其表型为革兰氏阴性、杆状、极性鞭毛；其生化特性为能利用吐温40，吐温80，L-阿拉伯糖，α-D-葡萄糖，D-甘露糖，丙酮酸甲酯，顺乌头酸，柠檬酸，D-葡萄糖酸，β-羟基丁酸，α-酮戊二酸，D, L-乳酸、丙酸、奎宁酸、D-葡萄糖二酸、琥珀酸、D-丙氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天门冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-羟基脯氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、左旋肉碱、γ-氨基丁酸、肌苷、氨基乙基苯胺、腐胺、丙三醇；其16S rRNA基因序列特征为SEQ ID No.1。
一株蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）降解黄曲霉毒素的方法包括常温下蒙氏假单胞菌对黄曲霉毒素进行降解处理和较高温度下蒙氏假单胞菌仍具有较强的降解处理能力。
优选地，一株蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）降解黄曲霉毒素的方法为将所述的蒙氏假单胞菌的菌悬液和/或发酵液和/或发酵上清液和/或代谢产物与含有黄曲霉毒素的样品和/或产品在30-80℃混合。进一步，可以在37-80℃条件下进行黄曲霉毒素的降解，混合时间是40-72h。
优选地，一株蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）降解黄曲霉毒素的方法，所述含有黄曲霉毒素的样品和/或产品具体为被黄曲霉毒素污染的花生、玉米等农产品原料、饲料、食品及环境样品和/或产品。
优选地，一株蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）降解黄曲霉毒素的方法，所述的黄曲霉毒素为B族黄曲霉毒素中的黄曲霉毒素B1或黄曲霉毒素B2，和/或G族黄曲霉毒素中的黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2。
优选地，一株蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）的菌悬液和/或发酵液和/或发酵上清液和/或代谢产物可在制备降解黄曲霉毒素产品中的应用。
进一步，一株蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）的菌悬液和/或发酵液和/或发酵上清液和/或代谢产物可在制备耐热的降解黄曲霉毒素产品中的应用。
优选地，一株蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）的菌悬液和/或发酵液和/或发酵上清液和/或代谢产物可在降解黄曲霉毒素中应用。
进一步，一株蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）的菌悬液和/或发酵上清液和/或代谢产物可在耐热地降解黄曲霉毒素中应用。
优选地，一株蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）的菌悬液和/或发酵液和/或发酵上清液和/或代谢产物在制备降解黄曲霉毒素产品、制备耐热的降解黄曲霉毒素产品、降解黄曲霉毒素、耐热地降解黄曲霉毒素的应用中，所述的黄曲霉毒素为B族黄曲霉毒素中的黄曲霉毒素B1或黄曲霉毒素B2，和/或G族黄曲霉毒素中的黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2。
本发明有益效果包括：
1、本发明首次报道蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）能降解多种黄曲霉毒素，包括B族黄曲霉毒素中的黄曲霉毒素B1或黄曲霉毒素B2，和/或G族黄曲霉毒素中的黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2，在此之前没有关于蒙氏假单胞菌能降解多种黄曲霉毒素的任何研究，且本发明中蒙氏假单胞菌降解黄曲霉毒素的降解效率显著高于其他报道的假单胞菌。
2、本发明蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）可耐热地降解多种黄曲霉毒素，包括B族黄曲霉毒素中的黄曲霉毒素B1或黄曲霉毒素B2，和/或G族黄曲霉毒素中的黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2，在80℃条件下对AFB1降解效率为83.6％。
3、本发明蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）在开发新的生物降解菌剂和生物降解无菌制剂方面，尤其是耐热生物降解菌剂和生物降解无菌制剂方面都有很好的应用前景。
附图说明
图1：在37℃条件下黄曲霉毒素B1降解效果液相色谱图。
图2：在80℃条件下黄曲霉毒素B1降解效果液相色谱图。
图3：在100℃沸水处理20min后降至37℃条件下，黄曲霉毒素B1降解效果液相色谱图。
图4：在30℃条件下黄曲霉毒素B2降解效果液相色谱图。
图5：在80℃条件下黄曲霉毒素B2降解效果液相色谱图。
图6：在100℃沸水处理20min后降至37℃条件下，黄曲霉毒素B2降解效果液相色谱图。
图7：在37℃条件下黄曲霉毒素G1降解效果液相色谱图。
图8：在80℃条件下黄曲霉毒素G1降解效果液相色谱图。
图9：在100℃沸水处理20min后降至37℃条件下，黄曲霉毒素G1降解效果液相色谱图。
图10：在37℃条件下黄曲霉毒素G2降解效果液相色谱图。
图11：在80℃条件下黄曲霉毒素G2降解效果液相色谱图。
图12：在100℃沸水处理20min后降至37℃条件下，黄曲霉毒素G2降解效果液相色谱图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下列实施例中所用的试剂等材料，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下列实施例中的定量试验均重复三次，结果取平均值。
PNG液体培养基：溶剂为水，溶质为蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钾；每升PNG培养基中有10g蛋白胨、5g牛肉膏、3g葡萄糖、10g氯化钠和1g磷酸二氢钾。
PNG固体培养基：在PNG液体培养基中加入2％的琼脂，即每升PNG培养基中加入20g琼脂，制备得到PNG固体培养基。
实施例1
菌的分离、纯化与鉴定
一、菌的分离
（一）2016年4月从青岛莱西花生地中采集土壤样品，在超净台中将1g土壤放在10mL无菌蒸馏水中震荡稀释制备土壤悬浊液，然后用无菌蒸馏水稀释100倍、1000倍和10000倍的梯度。
（二）将不同浓度稀释的土壤悬浊液涂布在PNG培养基固体平板上，37℃条件下培养36小时，菌落长满平板，挑取平板上形态特征、颜色、大小不同的菌株进行平板划线纯化，经过3次传代纯化，接纯化后的菌株进行黄曲霉毒素降解试验，分析得到降解效率最高的一株菌，该菌编号为A3-1。
二、鉴定
（一）按照“伯杰细菌鉴定手册”（第八版）中描述的方法，对菌株A3-1进行形态特征和生理生化特征鉴定，具体结果如下：
菌体的形态和生理生化特性：革兰氏阴性；呈杆状；具有极性鞭毛；好氧菌；生长的盐度范围是0-5％（w/v）NaCl，在固体平板是圆形和光滑克隆。
Biolog GN2生长实验表明，菌株A3-1可以利用吐温40，吐温80，L-阿拉伯糖，α-D-葡萄糖，D-甘露糖，丙酮酸甲酯，顺乌头酸，柠檬酸，D-葡萄糖酸，β-羟基丁酸，α-酮戊二酸，D, L-乳酸、丙酸、奎宁酸、D-葡萄糖二酸、琥珀酸、D-丙氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天门冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-羟基脯氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、左旋肉碱、γ-氨基丁酸、肌苷、氨基乙基苯胺、腐胺、丙三醇。
革兰氏阴性、杆状、根极性鞭毛、能利用吐温40和吐温80等表型和生化特性符合假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的特征。
（二）16S rRNA基因分析
提取A3-1的总DNA，利用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1486bp的扩增产物，连接到pMD19-T载体，转化重组质粒到大肠杆菌，测序得到的序列如SEQID No.1所示。根据EzTaxon-e server数据库标准菌株序列同源性比较，菌株A3-1的16SrRNA基因与标准菌株Pseudomonas monteilii NBRC 103158T的16S rRNA基因同源性为100％，基因分析表明该菌为蒙氏假单胞菌属细菌（Pseudomonas monteilii）。
基于形态特征、生理生化特征和基因序列特征，将菌株A3-1鉴定为蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）。该菌已于2017年8月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC No.14485。
实施例2
蒙氏假单胞菌A3-1的培养
将蒙氏假单胞菌A3-1（Pseudomonas monteilii）接种于液体PNG培养基中，在温度为37℃、转速150rpm的条件下震荡培养70h，得到菌液，用于黄曲霉毒素降解实验。
实施例3
蒙氏假单胞菌A3-1在37℃条件下对黄曲霉毒素B1的降解作用
一、黄曲霉毒素B1的配置
将5mg黄曲霉毒素B1（AFB1）标准品溶解于100mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFB1贮存溶液。取1mL 50ppm的AFB1，加入9mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFB1工作母液。
二、蒙氏假单胞菌A3-1对AFB1的降解
取1.96mL实施例2得到的菌液置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFB1工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育72h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作实验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL 5000ppb的AFB1工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
三、37℃条件下A3-1对AFB1的降解能力分析
首先加入甲醇到实验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1（体积比）；流速0.8mL/min；色谱柱C18（150mm×4.6mm，0.5μm）；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFB1降解率（％）＝（对照组AFB1含量–实验组AFB1含量）/对照组AFB1含量×100％。
结果如图1和表1所示。图1中，A：对照组；B：实验组。结果表明，37℃条件下A3-1对AFB1降解效果较好，降解率为91.5％。
实施例4
蒙氏假单胞菌A3-1在80℃条件下对AFB1的降解作用
一、AFB1的配置
将5mg AFB1标准品溶解于100mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFB1贮存溶液。取1mL 50ppm的AFB1，加入9mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFB1工作母液。
二、蒙氏假单胞菌A3-1对AFB1的降解
取1.96mL实施例2得到的菌液置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFB1工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后80℃孵育50h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作实验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL 5000ppb的AFB1工作母液在80℃孵育作为对照组，记作对照组溶液。
三、80℃条件下A3-1对AFB1降解能力分析
首先加入甲醇到实验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1（体积比）；流速0.8mL/min；色谱柱C18（150mm×4.6mm，0.5μm）；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFB1降解率（％）＝（对照组AFB1含量–实验组AFB1含量）/对照组AFB1含量×100％。
结果如图2和表1所示。图2中，A：对照组；B：实验组。结果表明，80℃条件下A3-1对AFB1降解效果较好，降解率为83.6％。
实施例5
蒙氏假单胞菌A3-1在100℃下处理20min后，降至37℃下对AFB1的降解作用
一、AFB1的配置
将5mg AFB1标准品溶解于100mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFB1贮存溶液。取1mL 50ppm的AFB1，加入9mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFB1工作母液。
二、蒙氏假单胞菌A3-1对AFB1的降解
取1.96mL实施例2得到的菌液置于10mL样品管中，在100℃沸水浴中加热20min，降温至37℃后加入40μL 5000ppb的AFB1工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育72h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作实验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL5000ppb的AFB1工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
三、100℃沸水浴中加热20min处理后降温至37℃条件下，A3-1对AFB1的降解能力分析
首先加入甲醇到实验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1（体积比）；流速0.8mL/min；色谱柱C18（150mm×4.6mm，0.5μm）；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFB1降解率（％）＝（对照组AFB1含量–实验组AFB1含量）/对照组AFB1含量×100％。
结果如图3和表1所示。图3中，A：对照组；B：实验组。结果表明，100℃沸水浴中加热20min处理后降温至37℃下，A3-1对AFB1降解率为78.9％。
实施例6
蒙氏假单胞菌A3-1在30℃下对黄曲霉毒素B2的降解作用
一、黄曲霉毒素B2配制
将1mg黄曲霉毒素B2（AFB2）标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFB2贮存溶液。取1mL 50ppm的AFB2，加入9mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFB2工作母液。
二、蒙氏假单胞菌A3-1对AFB2的降解
取1.96mL实施例2得到的菌液置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFB2工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后30℃孵育72h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作实验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL 5000ppb的AFB2工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
三、30℃条件下A3-1对AFB2降解能力分析
首先加入甲醇到实验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1（体积比）；流速0.8mL/min；色谱柱C18（150mm×4.6mm，0.5μm）；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFB2降解率（％）＝（对照组AFB2含量–实验组AFB2含量）/对照组AFB2含量×100％。
结果如图4和表1所示。图4中，A：对照组；B：实验组。结果表明，30℃条件下A3-1对AFB2降解率为79.2％。
实施例7
蒙氏假单胞菌A3-1在80℃条件下对AFB2的降解作用
一、AFB2的配置
将1mg AFB2标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFB2贮存溶液。取1mL 50ppm的AFB2，加入9mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFB2工作母液。
二、蒙氏假单胞菌A3-1对AFB2的降解
取1.96mL实施例2得到的菌液置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFB2工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后80℃孵育60h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作实验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL 5000ppb的AFB2工作母液在80℃孵育作为对照组，记作对照组溶液。
三、80℃条件下A3-1在对AFB2降解能力分析
首先加入甲醇到实验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1（体积比）；流速0.8mL/min；色谱柱C18（150mm×4.6mm，0.5μm）；激发波长350nm，检测波长450nm；柱温30℃；进样量20μL。
AFB2降解率（％）＝（对照组AFB2含量–实验组AFB2含量）/对照组AFB2含量×100％。
结果如图5和表1所示。图5中，A：对照组；B：实验组。结果表明，80℃条件下A3-1对AFB2的降解率为61.1％。
实施例8
蒙氏假单胞菌A3-1在100℃下处理20min后，降至37℃下对AFB2的降解作用
一、AFB2的配置
将1mg AFB2标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFB2贮存溶液。取1mL 50ppm的AFB2，加入9mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFB2工作母液。
二、蒙氏假单胞菌A3-1对AFB2的降解
取1.96mL实施例2得到的菌液置于10mL样品管中，在100℃沸水浴中加热20min，降温至37℃后加入40μL 5000ppb的AFB2工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育72h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作实验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL5000ppb的AFB2工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
三、100℃沸水浴中加热20min处理后降温至37℃条件下，A3-1对AFB2的降解能力分析
首先加入甲醇到实验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1（体积比）；流速0.8mL/min；色谱柱C18（150mm×4.6mm，0.5μm）；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFB2降解率（％）＝（对照组AFB2含量–实验组AFB2含量）/对照组AFB2含量×100％。
结果如图6和表1所示。图6中，A：对照组；B：实验组。结果表明，100℃沸水浴中加热20min处理后降温至37℃下，A3-1对AFB2降解率为50.5％。
实施例9
蒙氏假单胞菌A3-1在37℃下对黄曲霉毒素G1的降解作用
一、黄曲霉毒素G1的配置
将1mg黄曲霉毒素G1（AFG1）标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFG1贮存溶液。取1mL 50ppm的AFG1，加入9mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFG1工作母液。
二、蒙氏假单胞菌A3-1对AFG1的降解
取1.96mL实施例2得到的菌液置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFG1工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育72h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作实验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL 5000ppb的AFG1工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
三、37℃条件下，A3-1对AFG1降解能力分析
首先加入甲醇到实验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1（体积比）；流速0.8mL/min；色谱柱C18（150mm×4.6mm，0.5μm）；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFG1降解率（％）＝（对照组AFG1含量–实验组AFG1含量）/对照组AFG1含量×100％。
结果如图7和表1所示。图7中，A：对照组；B：实验组。结果表明，37℃条件下A3-1对AFG1有较好的降解效果，降解率为98.4％。
实施例10
蒙氏假单胞菌A3-1在80℃对AFG1的降解作用
一、AFG1的配置
将1mg AFG1标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的黄曲霉毒素B2贮存溶液。取1mL 50ppm的AFG1，加入9mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFG1工作母液。
二、蒙氏假单胞菌A3-1对AFG1的降解
取1.96mL实施例2得到的菌液置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFG1工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后80℃孵育60h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作实验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL 5000ppb的AFG1工作母液在80℃孵育作为对照组，记作对照组溶液。
三、80℃条件下，A3-1对AFG1降解能力分析
首先加入甲醇到实验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1（体积比）；流速0.8mL/min；色谱柱C18（150mm×4.6mm，0.5μm）；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFG1降解率（％）＝（对照组AFG1含量–实验组AFG1含量）/对照组AFG1含量×100％。
结果如图8和表1所示。图8中，A：对照组；B：实验组。结果表明，80℃条件下A3-1对AFG1有较好的降解效果，降解率为93.5％。
实施例11
蒙氏假单胞菌A3-1在100℃下处理20min后，降至37℃下对AFG1的降解作用
一、AFG1的配置
将1mg AFG1标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的黄曲霉毒素B2贮存溶液。取1mL 50ppm的AFG1，加入9mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFG1工作母液。
二、蒙氏假单胞菌A3-1对AFG1的降解
取1.96mL实施例2得到的菌液置于10mL样品管中，在100℃沸水浴中加热20min，降温至37℃后加入40μL 5000ppb的AFG1工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育72h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作实验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL5000ppb的AFG1工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
三、100℃沸水浴中加热20min处理后降温至37℃条件下，A3-1对AFG1的降解能力分析
首先加入甲醇到实验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1（体积比）；流速0.8mL/min；色谱柱C18（150mm×4.6mm，0.5μm）；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFG1降解率（％）＝（对照组AFG1含量–实验组AFB1含量）/对照组AFG1含量×100％。
结果如图9和表1所示。图9中，A：对照组；B：实验组。结果表明，100℃沸水浴中加热20min处理后降温至37℃下，A3-1对AFG1降解率为73.6％。
实施例12
蒙氏假单胞菌A3-1在37℃条件下对黄曲霉毒素G2的降解作用
一、黄曲霉毒素G2的配置
将1mg黄曲霉毒素G2（AFG2）标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFG2贮存溶液。取1mL 50ppm的AFG2，加入9mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFG2工作母液。
二、蒙氏假单胞菌A3-1对AFG2的降解
取1.96mL实施例2得到的菌液置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFG2工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育72h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作实验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL 5000ppb的AFG2工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
三、37℃条件下A3-1对AFG2降解能力分析
首先加入甲醇到实验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1（体积比）；流速0.8mL/min；色谱柱C18（150mm×4.6mm，0.5μm）；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFG2降解率（％）＝（对照组AFG2含量–实验组AFG2含量）/对照组AFG2含量×100％。
结果如图10和表1所示。图10中，A：对照组；B：实验组。结果表明，37℃条件下A3-1对AFG2有较好的降解效果，降解率为99.2％。
实施例13
蒙氏假单胞菌A3-1在80℃条件下对AFG2的降解作用
一、AFG2的配置
将1mg AFG2标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFG2贮存溶液。取1mL 50ppm的AFG2，加入9mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFG2工作母液。
二、蒙氏假单胞菌A3-1对AFG2的降解
取1.96mL实施例2得到的菌液置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFG2工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后80℃孵育72h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作实验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL 5000ppb的AFG2工作母液在80℃孵育作为对照组，记作对照组溶液。
三、80℃条件下，A3-1对AFG2降解能力分析
首先加入甲醇到实验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1（体积比）；流速0.8mL/min；色谱柱C18（150mm×4.6mm，0.5μm）；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFG2降解率（％）＝（对照组AFG2含量–实验组AFG2含量）/对照组AFG2含量×100％。
结果如图11和表1所示。图11中，A：对照组；B实验组。结果表明，80℃条件下A3-1对AFG2有较好的降解效果，降解率为93.3％。
实施例14
蒙氏假单胞菌A3-1在100℃下处理20min后，降至37℃下对AFG2的降解作用
一、AFG2的配置
将1mg AFG2标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFG2贮存溶液。取1mL 50ppm的AFG2，加入9mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFG2工作母液。
二、蒙氏假单胞菌A3-1对AFG2的降解
取1.96mL实施例2得到的菌液置于10mL样品管中，在100℃沸水浴中加热20min，降温至37℃后加入40μL 5000ppb的AFG2工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育72h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作实验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL5000ppb的AFG2工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
三、100℃沸水浴中加热20min处理后降温至37℃条件下，A3-1对AFG2的降解能力分析
首先加入甲醇到实验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1（体积比）；流速0.8mL/min；色谱柱C18（150mm×4.6mm，0.5μm）；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFG2降解率（％）＝（对照组AFG2含量–实验组AFG2含量）/对照组AFG2含量×100％。
结果如图12和表1所示。图12中，A：对照组；B：实验组。结果表明，100℃沸水浴中加热20min处理后降温至37℃下，A3-1对AFG2降解率为70.7％。
表1蒙氏假单胞菌A3-1对黄曲霉毒素的降解效果
Figure 35946DEST_PATH_IMAGE001
※在30℃条件下假单胞菌A3-1对AFB2的降解率。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 山东省花生研究所
<120> 蒙氏假单胞菌A3-1的应用
<150> 201810075511.8
<151> 2018-01-26
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1486
<212> DNA
<213> 蒙氏假单胞菌A3-1(Pseudomonas monteilii)
<400> 1
atcctggctc agattgaacg ctgcggcagg cctaacacat gcaagtcgag cggatgacgg 60
gagcttgctc cttgattcag cggcggacgg gtgagtaatg cctaggaatc tgcctggtag 120
tgggggacaa cgtttcgaaa ggaacgctaa taccgcatac gtcctacggg agaaagcagg 180
ggaccttcgg gccttgcgct atcagatgag cctaggtcgg attagctagt tggtggggta 240
atggctcacc aaggcgacga tccgtaactg gtctgagagg atgatcagtc acactggaac 300
tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggcgaa 360
agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggtcttc ggattgtaaa gcactttaag 420
ttgggaggaa gggcagtaag ttaatacctt gctgttttga cgttaccgac agaataagca 480
ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg tgcaagcgtt aatcggaatt 540
actgggcgta aagcgcgcgt aggtggttcg ttaagttgga tgtgaaagcc ccgggctcaa 600
cctgggaact gcatccaaaa ctggcgagct agagtacggt agagggtggt ggaatttcct 660
gtgtagcggt gaaatgcgta gatataggaa ggaacaccag tggcgaaggc gaccacctgg 720
actgatactg acactgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta 780
gtccacgccg taaacgatgt caactagccg ttggaatcct tgagatttta gtggcgcagc 840
taacgcatta agttgaccgc ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg 900
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 960
accaggcctt gacatgcaga gaactttcca gagatggatt ggtgccttcg ggaactctga 1020
cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgtaa 1080
cgagcgcaac ccttgtcctt agttaccagc acgtaatggt gggcactcta aggagactgc 1140
cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacggcctgg 1200
gctacacacg tgctacaatg gtcggtacag agggttgcca agccgcgagg tggagctaat 1260
ctcacaaaac cgatcgtagt ccggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagtcggaat 1320
cgctagtaat cgcgaatcag aatgtcgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1380
cccgtcacac catgggagtg ggttgcacca gaagtagcta gtctaacctt cgggaggacg 1440
gttaccacgg tgtgattcat gactggggtg aagtcgtaac aaggta 1486

Claims (2)

1.蒙氏假单胞菌用于降解黄曲霉毒素的用途，所述蒙氏假单胞菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.14485。
2.根据权利要求1所述的用途，所述黄曲霉毒素是黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1以及黄曲霉毒素G2中的一种或多种。
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