CN105255739B - 一种产黄曲霉毒素b1降解酶微生物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能降解黄曲霉毒素B1（AFB1）的微生物夏孢生枝孢Cladosporium uredinicolaHSK8。该微生物已于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2015181。不仅如此，该株菌还能利用工农副产物或废弃物糖蜜、玉米芯粉和橙皮粉发酵产黄曲霉毒素B1降解酶，因此也大大节约了。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，内容为一株能有效降解黄曲霉毒素B1(AFB1)的菌株夏孢生枝孢(Cladosporium uredinicola)HSK8及其应用。
技术背景
黄曲霉毒素B1于1960年被发现。当时，在英国就是因为喂食了含黄曲霉毒素的花生粕，导致了大批火鸡暴毙。自那以后已有20多种黄曲霉毒素被分离，目前已经有18 种被鉴定，其中最为常见的几种常见的是B1、B2、G1、G2、M1和M2。B类黄曲霉毒素的命名源于其在紫外光下可发出蓝色(blue)荧光，类似的，G类黄曲霉毒素则能在紫外光下发出绿色(green)荧光，黄曲霉毒素M1、M2因其最先发现于牛奶(milk)中所以被这样命名。在各黄曲霉毒素中，数黄曲霉毒素B1(AFB1)毒性最强。AFB1每年造成大量的粮食污染，并且对人畜的健康。黄曲霉毒素(aflatoxin，AF)是寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和黄曲霉(Aspergillus flavus)的典型次级代谢产物，具有极强的毒性、致癌性和致畸性。除上述两种曲霉外，A.nominus，A.tamarii和A.pseudotamarii也报道具有合成黄曲霉毒素的能力，但以寄生曲霉和黄曲霉为主。食米储存不当，极容易发霉变黄，产生黄曲霉毒素。
生物法去除AFB1使得去除食品、饲料中的AFB1可在温和的条件下进行，而同时又不影响食品和饲料中的营养，与化学法和物理法相比，这是生物法的优点。化学法和物理法的主要缺点在于要么反应条件过于激烈、脱毒效果不理想，要么耗资大、破坏营养成分及适口性，因为这些原因，这两类方法难以得到广泛应用。
用生物法来去除AFB1自AFB1被发现初就有研究。生物法基于微生物对真菌毒素或产毒真菌的作用，这些微生物包括酵母、丝状真菌、细菌、藻类等，作用机制包括营养和空间竞争、反应、抗生等。国内报道的降解AFB1的微生物有：假蜜环菌(Armillariellatabescens)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas sp.) 等；国外报道的有Dactylium dendroides NRRL2575、Corynebacterium rubrum、Aspergillus niger、Trichoderma viride、Mucor ambiguus、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、红蹿红球菌(Rhodococcus erythropolis)、橙色黄杆菌(Flavobacterium aurantiacum)等。除此之外，近年来还出现了有关药用植物降解黄曲霉毒素的文献报道，比如：Adhatoda vasica Nees，zimmu，Trachyspermum ammi(L.)Sprague ex Turrill。关于生物降解AFB1的文献报道越来越多，这说明生物法降解AFB的研究正蓬勃发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种产黄曲霉毒素解毒酶的菌株及其应用，有效解决黄曲霉毒素污染的问题。不仅如此，该株菌还能利用工农副产物或废弃物糖蜜、玉米芯粉和橙皮粉发酵产黄曲霉毒素B1降解酶，因此也大大节约了成本。
为了实现本发明，发明人通过大量试验反复进行菌种筛选研究，终于获得了一株合成黄曲霉毒素解毒酶能力较强的霉菌：夏孢生枝孢(Cladosporium uredinicola)HSK8，已于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2015181，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山。
形态学特征：菌落粉状，反面黑绿色；分生孢子顶生或侧生，形成分枝的孢子链，椭圆形，淡橄榄绿色。
代谢特性：代谢过程能产生黄曲霉毒素解毒酶；较强的纤维素、半纤维素利用能力。
本发明涉及的高产黄曲霉毒素解毒酶的夏孢生枝孢(Cladosporiumuredinicola)HSK8 是按照如下方法获得的：
(1)产黄曲霉毒素降解酶菌株的筛选
取5g采集的花生壳样品置于50ml灭菌生理盐水中，37℃、160r/min条件下振荡2h。然后取5ml菌液接种于富集培养基(富集培养基配方(g/L)：香豆素1，(NH4)2SO4 5， NaCl8.5，0.1MPa灭菌20min)中，37℃、160r/min条件下培养24h。连续富集培养3 次。取富集培养液稀释成不同不同稀释倍数的菌液，然后涂布于初筛平板(初筛平板培养基配方(g/L)：香豆素1，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 2.5，MgSO4 1，NaH2PO4﹒12H2O 0.5， FeSO4﹒7H2O 0.1，CaCl2 0.1，琼脂20，0.1MPa灭菌20min)上，30℃恒温培养7d。取稀释涂布平板上长势较好的三株霉菌保存于试管斜面(斜面培养基(g/L):马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，115℃灭菌30min)，保藏备用。
通过摇瓶发酵(发酵培养基(g/L)：蔗糖30，NaNO3 2.0，K2HPO4·3H2O 1.0，KCl0.5， MgSO4 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，0.1MPa灭菌20min)，培养48h后取样品进行AFB1降解率测定。
通过计算，初筛得到的三株霉菌中，夏孢生枝孢(Cladosporium uredinicola)HSK8对 AFB1的降解能力最强40.68％，该菌在中国典型微生物保藏中心的专利保藏编号为CCTCC NO:M 2015181。故选用CCTCC NO:M 2015181作为下一步实验菌株。
(2)CCTCC NO:M 2015181发酵条件的优化
采用单因素试验考察CCTCC NO:M 2015181的发酵温度、初始pH、发酵周期、接种量、装液量对木聚糖酶产量的影响。
发酵培养基为初始培养基(蔗糖30g/L，NaNO3 2.0g/L，K2HPO4·3H2O 1.0g/L，KCl0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，0.1MPa灭菌20min)。初始发酵条件为：自然pH，接种量10％，装液量50ml/250ml，28℃，180r/min摇瓶发酵48h。
a.发酵温度对AFB1降解率的影响
以10％的接种量将Cladosporium uredinicola HSK8种子液转接于发酵培养基中，分别于25，28，31，34，37，40℃进行培养48h。转速180r/min，装液量50mL/250mL。以此研究发酵温度对AFB1降解率的影响。
b.装液量对AFB1降解率的影响
以10％的接种量将种子转接于发酵培养基中28℃、180r/min条件下培养48h，发酵培养基的装液量梯度为(mL/250mL)：25，50，75，100，125。以此研究装液量对AFB1 降解率的影响。
c.接种量对AFB1降解率的影响
接种量(v/v)梯度分别为：1％，3％，6％，9％，12％，15％。通过此接种量的不同来研究接种量对AFB1降解率的影响。发酵温度28℃，转180r/min，装液75mL/250mL，培养时间48h。
d.发酵周期对AFB1降解率的影响
在最优发酵条件下，分别发酵24、48、72、96、120、144h。以此考察发酵周期对 AFB1降解率的影响。
e.初始发酵液pH对AFB1降解率的影响
在上面最优的条件下，研究初始pH对AFB1降解率的影响。初始pH梯度设为： 5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0。
(3)CCTCC NO:M 2015181发酵培养基优化
a.碳源的优化
为了研究碳源对AFB1降解率的影响，使用了下列碳源：蔗糖，葡萄糖，α-乳糖，糖蜜，可溶性淀粉，D-甘露醇，羧甲基纤维素钠，玉米芯粉，玉米粉，橙皮粉，D-山梨醇。
b.碳源添加量的优化
根据上面实验选择糖蜜作为碳源，然后对其添加量进行研究，添加量梯度如下：
0.5％，1％，1.5％，2.0％，2.5％，3.0％，3.5％。
(4)AFB1降解率的测定
发酵液经10000r/min、4℃离心10min，取上清液(950uL)与AFB1(50uL，终浓度1ug/mL)混合，37℃下暗处反应24h。反应混合液用等体积(1mL)的二氯甲烷旋涡振荡萃取3次，萃取液于50℃下真空干燥。之后用1mL色谱甲醇溶解残余物，并用有机相滤膜(0.22μm)过滤，混匀进样。以灭菌发酵培养基作为对照。色谱条件如下：液相色谱：岛津LC-20AD；色谱柱：C18(ODS-3，150mm×4.6mm,5mm)；流动相：甲醇：乙腈：水＝1：3：6，流速：1mL/min；进样量：20μL；柱温：30℃；检测波长：370nm。
附图说明
图1是夏孢生枝孢Cladosporium uredinicola HSK8发酵温度优选的试验图。
图2是装液量对Cladosporium uredinicola HSK8降解AFB1的影响图。
图3是Cladosporium uredinicola HSK8接种量对AFB1降解率的影响图。
图4是Cladosporium uredinicola HSK8发酵周期对AFB1降解率的影响图。
图5是Cladosporium uredinicola HSK8发酵36h时对AFB1降解效果图。
图6是初始pH对AFB1降解率的影响图。
图7是Cladosporium uredinicola HSK8的发酵培养基碳源优化图。
图8是Cladosporium uredinicola HSK8碳源添加量的优化图
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：菌种的筛选
(1)筛选样本
腐烂花生壳
(2)培养基
每1L所述富集培养基含有：香豆素1g，(NH4)2SO4 5g，NaCl 8.5g，所述富集培养基pH自然；
每1L所述初筛培养基含有：香豆素1g，(NH4)2SO4 5g，KH2PO4 2.5g,MgSO4 1g,NaH2PO4﹒12H2O 0.5g,FeSO4﹒7H2O 0.1g,CaCl2 0.1g,琼脂20g，所述初筛培养基 pH6.0-6.5；
每1L所述斜面培养基含有：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，所述斜面培养基pH自然；
每1L所述种子培养基含有：马铃薯200g，葡萄糖20g，Tween 80 1.0mL，所述种子培养基pH自然；
每1L所述复筛培养基含有：蔗糖30g，NaNO3 2.0g，K2HPO4·3H2O 1.0g，KCl 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，pH自然；
(3)试验中所用到的溶液
①黄曲霉毒素B1贮备液
5mg黄曲霉毒素B1溶于甲醇(色谱纯)，50ml容量瓶定容，得黄曲霉毒素B1浓度100ug/ml溶液，密封后避光-20℃保存。
②黄曲霉毒素B1工作液
取一定量的黄曲霉毒素B1贮备液，然后加入一定比例的甲醇稀释至20ug/mL。
(4)种子培养
斜面种子活化5天后，接入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中培养34h，即得种子液。培养温度28℃，转速180r/min。
(5)发酵培养
将种子液接入50mL/250mL摇瓶中，接种量10％(V:V)，在28℃、转速180r/min 的条件下培养48h。
(6)发酵上清液与黄曲霉毒素B1反应
发酵48h后取发酵液于离心管，10000r/min离心10min。离心完后取上清液950μL和AFB1工作液50μLAFB1甲醇溶液(毒素溶液浓度20ug/mL)于灭菌的7ml离心管中，使AFB1终浓度为1ug/mL，封口膜封住管口，然后在恒温培养箱中37℃反应24h。以灭菌发酵培养基加等量AFB1甲醇溶液做空白对照。做3次平行。
(7)HPLC法测定残留黄曲霉毒素B1含量
反应混合液用等体积(1ml)的二氯甲烷旋涡振荡萃取3次每次30秒，取下层二氯甲烷于另一7ml离心管中，真空干燥箱50℃除去二氯甲烷层，用1ml甲醇(色谱纯) 溶解残余物，经有机相滤膜(0.22um)过滤，混匀进样。岛津LCsolution计算残余黄曲霉毒素B1含量。
(8)黄曲霉毒素B1降解率计算
分别测算初筛菌株的酶活，Cladosporium uredinicola HSK8菌株的酶活最高为443U。经鉴定，该株菌为夏孢生枝孢(Cladosporium uredinicola)HSK8，专利保藏编号：CCTCC NO:M 2015181。将该菌株作为以后的试验菌株。
实例2：CCTCC NO:M 2015181的的培养条件优化
(1)菌株：CCTCC NO:M 2015181
(2)方法步骤
发酵培养基为初始培养基(g/L)：蔗糖30，NaNO3 2.0，K2HPO4·3H2O 1.0，KCl0.5， MgSO4 0.5，FeSO4·7H2O 0.01。初始发酵条件为：自然pH，接种量10％，装液量50ml/250 ml，28℃，摇床转速180r/min，发酵周期48h。
采用单因素试验考察CCTCC NO:M 2015181的发酵温度、初始pH、发酵周期、接种量、装液量对AFB1降解率的影响。
a.发酵温度的优选试验
依图1可知，25-34℃条件下AFB1降解率变化并不大，只是对生物量影响较大， 37℃和40℃条件下微生物不能生长。在不严重影响微生物生长的情况下，选择降解率最高(40.68％)的28℃作为发酵培养温度。
b.装液量对HSK8降解AFB1的影响
由图2可知，装液量25mL/250mL对应的AFB1降解率最高(44.36％)，但经过3天的发酵，菌体都黏在瓶底，剩余可流动的液体很少，这不利于以后活性物质的提取。 75mL/250mL时所对应的降解率与25mL/250mL的相差不多，综合考虑，把75mL/250mL 作为发酵装液量。其中125mL/250mL装液量所对应的发酵液粘稠，严重影响萃取过程，也阻碍了对降解AFB1的活性物质的进一步分析，所以该组数据不作考虑。
c.接种量对AFB1降解率的影响
如图3所示接种量对AFB1降解率的影响是很明显的，6％、12％和15％相对较高，且相差不多。其中以15％的接种量对应的降解率最高，为43.14％，故将15％选为发酵的接种量。
d.发酵周期对AFB1降解率的影响
如图4所示，发酵周期对AFB1的降解率影响并不大，且在3-6天的时候发酵液变得特别粘稠，萃取时出现轻微的乳化现象。为了考虑到乳化现象对AFB1萃取的影响，对3天后的实验结果不予考虑，同时对发酵周期进行更细化的优化。其结果如图5，结果显示发酵36h时对AFB1降解效果最好，达到70.31％。
e.初始pH对AFB1降解率的影响
如图6所示，在不同初始pH条件下，当pH＝8.0(不调节pH)时AFB1降解率达到最高69％，与上文结果类似。依图还可以看出，无论初始pH高低，发酵液完毕的发酵液 pH都约为7.5，可见微生物对环境有很强的适应性。
实例3：CCTCC NO:M 2015181培养基优化
a.碳源的优化
CCTCC NO:M 2015181发酵培养基碳源优化结果如图7所示。可见大部分碳源所对应的AFB1降解率都是很可观的，达到80％以上，其中糖蜜、玉米芯粉、玉米粉对应的 AFB1降解率接近100％，只是玉米芯粉组在萃取阶段有一定的乳化现象，为了实验的严谨性，暂且对该组数据不做考虑。降解率最低的为橙皮粉组50％。
CCTCC NO:M 2015181在糖蜜、羧甲基纤维素钠、玉米芯粉、橙皮粉组发酵培养基中都能很好地生长，这一方面说明CCTCC NO:M 2015181能利用这些工农副产品或废弃物，另一方面说明CCTCC NO:M 2015181能利用这些廉价的碳源产AFB1降解酶，一举两得。
b.碳源添加量的优化
上述试验的到最优碳源糖蜜，培养基中其添加量的优化结果见图8，结果显示在添加量在≥2.5％的条件下，AFB1的降解率都是接近100％的，为了进一步节省成本，选择2.5％作为碳源的添加量。
Claims (8)
1.一种产黄曲霉毒素B1降解酶微生物为夏孢生枝孢(Cladosporium uredinicola ) HSK8，其保藏编号为CCTCC NO: M 2015181。
2.根据权利要求1所述的一种产黄曲霉毒素B1降解酶微生物，其特征在于，夏孢生枝孢发酵培养的初始培养基为蔗糖30g/L，NaNO3 2.0g/L，K2HPO4·3H2O 1.0g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
3.根据权利要求1所述的一种产黄曲霉毒素B1降解酶微生物，其特征在于，夏孢生枝孢的发酵条件为：发酵温度25-34 ℃、180r/min发酵24-144h、接种量为与培养基1-15%的体积比接种、装液量25-125ml/250ml、pH5.0-9.0。
4.根据权利要求3所述的一种产黄曲霉毒素B1降解酶微生物，其特征在于，夏孢生枝孢的发酵条件为：发酵温度为28 ℃、180r/min发酵36h、接种量15%、装液量75ml/250ml、pH7.5。
5.根据权利要求1所述的一种产黄曲霉毒素B1降解酶微生物，其特征在于，夏孢生枝孢的发酵培养基的碳源为蔗糖，葡萄糖，α-乳糖，糖蜜，可溶性淀粉，D-甘露醇，羧甲基纤维素钠，玉米芯粉，玉米粉，橙皮粉，D-山梨醇的一种。
6.根据权利要求1所述的一种产黄曲霉毒素B1降解酶微生物，其特征在于，夏孢生枝孢的发酵培养基的碳源添加量为0.5-3.5%。
7.根据权利要求5所述的一种产黄曲霉毒素B1降解酶微生物，其特征在于，夏孢生枝孢的发酵培养基的碳源添加量为2.5%。
8.根据权利要求1所述的一种产黄曲霉毒素B1降解酶微生物的应用，其特征在于，夏孢生枝孢在利用糖蜜、玉米芯、橙皮粉生产黄曲霉毒素降解酶的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |