CN104498378A - 一种产黄曲霉毒素b1降解酶的菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细菌 Sinomonas sp.HSD8及其应用，该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2014109，经发酵培养后发酵液中的黄曲霉毒素B1降解酶活力高，能有效解决饲料和食品中黄曲霉毒素污染问题，保障了动物饲料和食品的安全性。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体而言，涉及一株产黄曲霉毒素解毒酶能力较强的细菌Sinomonas sp.HSD8及其应用。
技术背景
黄曲霉毒素（aflatoxin）是一种有强烈生物毒性的化合物，常由黄曲霉及另外几种霉菌在霉变的谷物中产生，如大米、豆类、花生等，是目前为止最强的致癌物质，而且其毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性。当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。黄曲霉毒素主要有B1、B2、G1与G2等4种，又以B1的毒性最强。一般在中性溶液中较稳定，在强酸性溶液中稍有分解，在pH9-10的强碱溶液中分解迅速。其纯品为无色结晶、耐高温，黄曲霉毒素B1的分解温度为268℃，所以一般的加热不易破坏其结构。另外紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。粮食储存不当，极容易发霉变黄，产生黄曲霉毒素。中国是一个农业大国，预防和消除黄曲霉毒素对粮食及农副产品的污染至关重要，对我国的经济发展和人民健康将会起到重要作用。警惕黄曲霉毒素的危害，对我国而言已迫在眉睫。
随着人们对于黄曲霉毒素对人类及动物健康造的巨大危害的逐步认识，人们越来越大力寻找可以解除黄曲霉毒素毒性或减少其在食品和饲料中的污染的方法。作物收割前的污染可以通过好的收割作业等加以预防，而收获后的污染情况可以通过正确的处理、干燥、分类和改善储存条件，如降低温度和减少湿度来加以控制。然而，与农产品相关的许多污染是很难避免的，这就需要一个合适的去除黄曲霉毒素的方法。除了将黄曲霉毒素降低到安全极限以下，同时也需要满足下列基本准则：
(1)不能造成其它毒性物质的产生或者留有仍然会对食品安全性造成威胁有毒的残基。
(2)产品的营养成分不能被严重的破坏。
(3)不能改变产品的物理和感官状态成分。
(4)必须是经济和技术可行的。
(5)必须能够破坏黄曲霉毒素产毒菌株的孢子和菌丝体，因为如果它们还残存在产品中，在合适的条件下，可能会造成毒素的再生。
目前，通常使用的解毒方法都在于从食物中去除黄曲霉毒素或者在食品中将其破坏掉，主要可以分为物理、化学，生物学方法。其中生物法中的酶解法是最具潜力的方法。物理方法主要包括溶剂萃取、吸附、加热，辐射、太阳照射等。化学方法去毒主要是使用化学试剂除去毒素。使用的化学试剂有次氯酸钠、臭氧、过氧化氢、氢氧化钠、氨水以及氯气等。生物学方法主要包括生物化学、生物医学和微生物发酵产酶来进行解毒。由于物理和化学方法对产品的色，香，味以及营养成分，如维生素、蛋白质等均有不同程度的破坏和不良影响，降低了产品品质，同时易产生副产物和处理剂残留，且易被二次污染，对人和动物产生危害。此外，有些方法不适合大规模的生产，有些只适合一定物性的物料，去毒率不高、费时、费力且造成浪费。由于这些问题的存在，人们一直在寻找一种高效，无危害的去除毒素的方法，于是生物脱毒的方法应运而生。黄曲霉毒素的生物脱毒主要是采用微生物或其产生的酶来进行脱毒，生物脱毒的处理条件相对温和，不会破坏产品的品质，而且有些还能增加产品的营养价值，此外生物酶具有作用专一性。应用专门分解黄曲霉毒素而对所降解产品的其他成份没有作用的酶，这无疑是一种最理想的方式。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种产黄曲霉毒素降解酶能力较强的菌株及其应用，该酶可有效解决黄曲霉毒素污染的问题。
为了实现本发明，发明人通过大量试验反复进行菌种筛选研究，并终于获得了一株合成黄曲霉毒素降解酶能力较强的细菌Sinomonas sp.HSD8已于2014年3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014109。
本发明涉及的产黄曲霉毒素B1降解酶的细菌Sinomonas sp.HSD8具有如下生物学特征：
形态学特征：菌落黄色，有光泽，扁平，呈圆形，表面及边缘光滑，边缘整齐，湿润粘腻，容易挑起；正反面，边缘与中央部位颜色一致。
生理特性：不仅可利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜等碳源，还可利用玉米浆作为氮源。
代谢特性：代谢过程能积累产生黄曲霉毒素解毒酶。
本发明涉及的高产黄曲霉毒素解毒酶的细菌Sinomonas sp.HSD8是按照如下方法获得的：
产黄曲霉毒素降解酶菌株的初筛：
（1）富集培养：取5g筛选样本于50ml灭菌生理盐水中，37℃下160r/min摇床振荡2h后取5ml菌液接种于富集培养基（富集培养基配方（g/L）：香豆素 1，(NH4)2SO4 5，NaCl 8.5，121℃灭菌20min）中，37℃、160r/min摇床振荡培养24h。富集培养3次。
（2）稀释涂布：取富集培养液0.5ml于灭菌后的小试管内，然后加入4.5ml无菌水，依次稀释，分别得到10-1到10-8等8个稀释梯度。分别取10-4到10-8等5个梯度的稀释菌液200μl于初筛平板（初筛平板培养基配方（g/L）：香豆素 1 ，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 2.5，MgSO4 1，NaH2PO4﹒12H2O 0.5，FeSO4﹒7H2O 0.1，CaCl2 0.1，琼脂 20，121℃灭菌20min）上，用灭菌的涂布玻棒涂布均匀，每个梯度做3次平行。30℃恒温培养箱中培养7d。
（3）平板划线分纯：取稀释涂布平板上菌落直径较大，长势较好的菌落分别编号并在琼脂平板（初筛平板培养基配方（g/L）：香豆素 1，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 2.5，MgSO4 1，NaH2PO4﹒12H2O 0.5，FeSO4﹒7H2O 0.1，CaCl2 0.1，琼脂 20，121℃灭菌20min）上划线分纯，于37℃恒温培养箱中培养7d。划线分纯后挑选菌落直径较大，生长较快的菌株转接于琼脂斜面（斜面培养基配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，琼脂 20，121℃灭菌20min）37℃恒温培养箱中培养36h后4℃冰箱保藏。初筛共计筛选到27株细菌。
产黄曲霉毒素降解酶菌株的复筛：
（1）初筛菌种活化：斜面培养基（斜面培养基配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，琼脂 20，121℃灭菌20min）配制好后灭菌摆试管斜面备用，在超净台中用接种针挑取初筛菌株转接于试管斜面，37℃培养36h。
（2）种子液制备：种子培养基（种子培养基配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，121℃灭菌20min）配制好后分装（50mL/250mL摇瓶）灭菌备用，在超净台中用接种针挑取活化后的菌种转接于种子培养基中。37℃、160rpm/min摇床培养14h。
（3）接种发酵培养基发酵：发酵培养基(发酵培养基配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，葡萄糖 4，NaCl 8.5，KH2PO4 2.5，K2HPO4·3H2O 1， MgSO4 1，香豆素 1)配制好后分装（50mL/250mL摇瓶）灭菌备用，在超净台中用5mL移液枪吸取5ml种子液（接种量10%(V/V)）加入发酵培养基中，37℃、160rpm/min摇床培养3天。
（4）发酵上清液与黄曲霉毒素B1反应：发酵3天后取发酵液30mL于大离心管，8000rpm/min离心10min。离心完后取上清液（离心后检测pH值，控制pH值不大于7.5）950μL+AFB1工作液50μL（PBS毒素溶液浓度20μg/mL）于灭菌的5mL离心管中，使AFB1终浓度为1μg/mL，然后在恒温培养箱中37℃培养24h。以灭菌发酵培养基加等量PBS毒素溶液做空白对照。做3次平行。
（5）HPLC法测定残留黄曲霉毒素B1含量：（色谱条件：液相色谱：岛津LC20AD，色谱柱：C18（ODS-3，150mm×4.6mm,5mm），流动相：甲醇：乙腈：水=1：3：6，流速：1mL/min，检测器：紫外检测器，进样量：20μL，柱温：35℃，检测波长：370nm）反应混合液用等体积（1mL）的二氯甲烷旋涡振荡萃取3次每次30秒，取下层二氯甲烷于另一5mL离心管中，真空干燥箱65℃除去二氯甲烷层，用1mL甲醇（色谱纯）溶解残余物，有机相滤膜（0.22μm）过滤，混匀进样。岛津LCsolution计算残余黄曲霉毒素B1含量。
（6）黄曲霉毒素B1解毒酶酶活计算：根据酶活定义：在温度为37℃，pH 7.0的条件下，反应24h降解1ng黄曲霉毒素B1的酶量为一个酶活单位U。分别测算初筛菌株的酶活，酶活最高的即为降解黄曲霉毒素B1的最优菌株。
经过初筛和复筛，编号为HSD8的菌株产黄曲霉毒素解毒酶能力最高，经鉴定，该菌株为Sinomonas sp.HSD8，在中国典型培养物保藏中心的专利保藏编号为CCTCC NO：M2014109。
利用本发明的菌株可以产黄曲霉毒素B1降解酶，广泛应用于饲料及食品。例如，利用本发明的菌株制备黄曲霉毒素解毒酶的方法如下：
（1）将该菌株Sinomonas sp.HSD8，CCTCC NO：M2014109接种到种子培养基中，37-40℃培养12-14小时，摇床转速160-180 rmp/min。
（2）2L摇瓶水平上发酵：将步骤1）的菌液接种至发酵培养基中，接种量8%-10%（V/V），37℃培养60-72小时，培养结束后，酶活为483.5U/mL。
（3）放大到50L发酵罐：将步骤1）的菌液接种至发酵培养基中，接种量8%-10%（V/V），发酵温度37℃，搅拌转速150-200 rmp/min，通气量10-20 L/min，在生物量达到一定时，调节转速和通气量，分阶段控制发酵罐的溶氧水平。继续发酵至60h-72h放罐。
（4）富含黄曲霉毒素解毒酶添加剂的生产：将3）中得到的发酵液，在5000 rmp/min条件下，离心10min，得到发酵上清液，在发酵上清液中添加10%麦芽糊精拌匀，在喷雾干燥塔中，控制进风温度130-150℃，得到干物质含量在90%-95%、酶活在2000-3000U/g的添加剂。
具体地，本领域技术人员可参考以下具体发酵过程进行发酵培养：
（1） 菌株：
细菌Sinomonas sp.HSD8，CCTCC NO：M2014109。
（2） 培养基：
每1 L所述斜面培养基含有：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂 20g，pH自然；
每1 L所述种子培养基含有：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，pH自然；
每1 L所述摇瓶水平上发酵培养基含有：玉米浆 13g，葡萄糖 2g，NaCl 8.5g，KH2PO4 2.5g，K2HPO4·3H2O 1g，MgSO4 1g，香豆素 1g，所述发酵培养基pH 4.5-5.0；
每1 L所述发酵罐水平上发酵培养基含有：玉米浆 13g，葡萄糖 2g，NaCl 8.5g，KH2PO4 2.5g，K2HPO4·3H2O 1g，MgSO4 1g，香豆素 1g，所述发酵培养基pH 4.5-5.0；
（3） 种子扩大培养：
斜面种子活化24-36小时后接入到装液量50 mL/250mL种子培养基的三角瓶中培养12-14小时即得一级种子；之后再按5-10%（V:V）的接种量将一级种子接入到装液量500mL/2L相同种子培养基的三角瓶中培养12-14小时制备二级种子，培养温度37-40℃，转速160-180rpm/min；
（4） 发酵具体包括以下步骤：
将二级种子按5-10%（V:V）的接种量接入50L发酵罐中，发酵温度37℃，搅拌转速150-200rmp，通气量10-20L/min，调节转速和通气量，分阶段控制发酵罐的溶氧水平。继续发酵至60h-72h放罐，发酵液酶活为562.6U/mL。
本发明涉及的细菌Sinomonas sp.HSD8，CCTCC NO：M2014109具有如下优点和显著的进步：
（1）筛选到了一株产黄曲霉毒素B1降解酶的高产菌株。
（2）发酵液中黄曲霉毒素B1降解酶酶活为483.5-562.6U/mL，可有效解决饲料及食品中黄曲霉毒素污染的问题。
（3）在摇瓶水平上发酵培养后的黄曲霉毒素B1降解酶酶活483.5 U/mL，在50 L发酵罐上发酵培养后的黄曲霉毒素B1解毒酶酶活为562.6U/mL。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例一: 在摇瓶水平上发酵培养
（1）菌株
细菌Sinomonas sp.HSD8，CCTCC NO：M2014109。
（2）培养基
每1 L所述斜面培养基含有：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂 20g，pH自然；
每1 L所述种子培养基含有：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，pH自然；
每1 L所述摇瓶水平上发酵培养基含有：玉米浆 13g，葡萄糖 2g，NaCl 8.5g，KH2PO4 2.5g，K2HPO4·3H2O 1g，MgSO4 1g，香豆素 1g，所述发酵培养基pH 4.5-5.0。
（3）种子培养
斜面种子活化24-36小时后，接入装入50mL种子培养基的250mL三角瓶中培养12-14小时，转速160rpm即得一级种子。
（4）发酵培养
将一级种子接入50mL/250mL摇瓶中，在37℃、转速160rmp的条件下培养72h。
（5）发酵上清液与黄曲霉毒素B1反应
取发酵液30mL于大离心管，8000rpm/min离心10min。离心完后取上清液950ul和AFB1工作液50μL（PBS毒素溶液浓度20μg/mL）于灭菌的5mL离心管中，使AFB1终浓度为1μg/mL，然后在恒温培养箱中37℃培养24h。以灭菌发酵培养基加等量PBS毒素溶液做空白对照。做3次平行。
（6）HPLC法测定残留黄曲霉毒素B1含量
反应混合液用等体积（1mL）的二氯甲烷旋涡振荡萃取3次每次30秒，取下层二氯甲烷于另一5mL离心管中，真空干燥箱65℃除去二氯甲烷层，用1mL甲醇（色谱纯）溶解残余物，有机相滤膜（0.22μm）过滤，混匀进样。采用高效液相色谱检测残余黄曲霉毒素B1含量。
（7）黄曲霉毒素B1解毒酶酶活计算
根据酶活定义：在温度为37℃，pH 7.0的条件下，反应24h降解1ng黄曲霉毒素B1的酶量为一个酶活单位U。计算酶活。
（8）结果：
发酵时间：72小时；酶活：483.5 U/mL；
实施例二: 在50 L发酵罐上发酵培养
（1）菌株
细菌Sinomonas sp.HSD8，CCTCC NO：M2014109。
（2）培养基
每1 L所述斜面培养基含有：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂 20g，pH自然；
每1 L所述种子培养基含有：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，pH自然；
每1 L所述发酵罐水平上发酵培养基含有：玉米浆 13g，葡萄糖 2g，NaCl 8.5g，KH2PO4 2.5g，K2HPO4·3H2O 1g，MgSO4 1g，香豆素 1g，所述发酵培养基pH 4.5-5.0；
（3）种子培养
斜面种子活化24-36小时后，接入装入50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中培养12-14小时即得一级种子；之后再按10%（V/V）的接种量将一级种子接入相同发酵培养基培养12-14小时制备二级种子，培养温度37-40 ℃，恒温振荡培养，转速160rpm/min；
（4）发酵培养
将二级种子按5-10%（V/V）的接种量接入发酵罐中，发酵温度37℃，搅拌转速150-200rmp，通气量10-20L/min，在生物量达到一定时，调节转速和通气量，分阶段控制发酵罐的溶氧水平。继续发酵至60h-72h放罐。
（5）发酵上清液与黄曲霉毒素B1反应
取发酵液30mL于大离心管，8000rpm/min离心10min。离心完后取上清液950ul和AFB1工作液50μL（PBS毒素溶液浓度20μg/mL）于灭菌的5mL离心管中，使AFB1终浓度为1μg/mL，然后在恒温培养箱中37℃培养24h。以灭菌发酵培养基加等量PBS毒素溶液做空白对照。做3次平行。
（6）HPLC法测定残留黄曲霉毒素B1含量
反应混合液用等体积（1mL）的二氯甲烷旋涡振荡萃取3次每次30秒，取下层二氯甲烷于另一5mL离心管中，真空干燥箱65℃除去二氯甲烷层，用1mL甲醇（色谱纯）溶解残余物，有机相滤膜（0.22μm）过滤，混匀进样。采用高效液相色谱检测残余黄曲霉毒素B1含量。
（7）黄曲霉毒素B1解毒酶酶活计算
根据酶活定义：在温度为37℃，pH 7.0的条件下，反应24h降解1ng黄曲霉毒素B1的酶量为一个酶活单位U。计算酶活。
（8）结果：
发酵时间：60-72小时；酶活：562.6U/mL。
Claims (3)
1.一种产黄曲霉毒素B1降解酶的细菌Sinomonas sp.HSD8，它的保藏编号为CCTCC NO：M2014109。
2.利用权利要求1所述的细菌Sinomonas sp.HSD8发酵生产黄曲霉毒素B1降解酶的方法。
3.权利要求1所述的细菌Sinomonas sp.HSD8在发酵生产黄曲霉毒素B1降解酶的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150408 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |