CN104152419A - 一种控制产黄曲霉毒素B1降解酶菌株发酵液pH的方法 - Google Patents

一种控制产黄曲霉毒素B1降解酶菌株发酵液pH的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产黄曲霉毒素解毒酶的细菌Sinomonasatrocyanea在发酵过程中控制发酵液pH的方法，属于微生物技术领域。在发酵培养基的基础上添加0.4%（w/v）葡萄糖、0.25%（w/v）磷酸二氢钾混合物，使发酵上清液的pH值控制在7.0左右，有效解决了pH影响酶活检测的问题。

Description

一种控制产黄曲霉毒素B1降解酶菌株发酵液pH的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体而言，涉及一种产黄曲霉毒素解毒酶的细菌Sinomonas sp.HSD8在发酵过程中控制发酵液pH的方法。
技术背景
黄曲霉毒素（aflatoxin）是一种有强烈生物毒性的化合物，常由黄曲霉及另外几种霉菌在霉变的谷物中产生，如大米、豆类、花生等，是目前为止最强的致癌物质，而且其毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性。当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。黄曲霉毒素主要有B1、B2、G1与G2等4种，又以B1的毒性最强。一般在中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解在pH9-10的强碱溶液中分解迅速。其纯品为无色结晶、耐高温，黄曲霉毒素B1的分解温度为268℃，所以一般的加热不易破坏其结构。另外紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。粮食储存不当，极容易发霉变黄，产生黄曲霉毒素。中国是一个农业大国，预防和消除黄曲霉毒素对粮食及农副产品的污染至关重要，对我国的经济发展和人民健康将会起到重要作用。警惕黄曲霉毒素的危害，对我国而言已迫在眉睫。
随着人们对于黄曲霉毒素对人类及动物健康造的巨大危害的逐步认识，人们越来越大力的寻找可以解除黄曲霉毒素毒性或减少其在食品和饲料中的污染的方法。作物收割前的污染可以通过好的收割作业等加以预防，而收获后的污染情况可以通过正确的处理、干燥、分类和改善储存条件，如降低温度和减少湿度来加以控制。然而，与农产品相关的许多污染是很难避免的，这就需要一个合适的去除黄曲霉毒素的方法。除了将黄曲霉毒素降低到安全极限以下，同时也需要满足下列基本准则：
(1)不能造成其它毒性物质的产生或者留有会对食品安全性造成威胁的有毒残基。
(2)产品的营养成分不能被严重的破坏。
(3)不能改变产品的物理和感官状态成分。
(4)必须是经济和技术可行的。
(5)必须能够破坏黄曲霉毒素产毒菌株的孢子和菌丝体，因为如果它们还残存在产品中，在合适的条件下，可能会造成毒素的再生。
由于黄曲霉毒素在中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在pH9-10的强碱溶液中分解迅速。因此，在微生物发酵产黄曲霉毒素解毒酶的过程中要控制发酵液的pH值，以防在检测发酵液中黄曲霉毒素B1降解酶酶活时，向黄曲霉毒素B1样品中加入发酵液后反应体系的pH偏离中性，会导致黄曲霉毒素B1因pH偏离而降解，而非酶促反应结果，造成酶活升高的假象。这对产酶微生物的筛选和黄曲霉毒素降解酶酶活的检测至关重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是细菌Sinomonas sp.HSD8在发酵产酶过程中控制发酵液pH的方法，有效解决在检测黄曲霉毒素降解酶活力时pH值的影响，保证酶活检测结果的可靠性和准确性。该细菌Sinomonas sp.HSD8，已于2014年3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014109。
为了实现本发明，发明人通过大量试验反复进行培养基调整，最终将发酵液pH控制在7.0左右，很好的解决了pH对酶活检测的影响。
1、黄曲霉毒素B1在不同pH值溶液中稳定性的探究：
用0.2mol/L Na2HPO4﹒12H2O和0.2mol/L NaH2PO4﹒2H2O溶液配制不同pH值的缓冲溶液，分别取950μl不同pH值的缓冲溶液于1.5ml离心管中，然后取100μg/ml黄曲霉毒素B1溶液50μl于该离心管，封口膜封口混合均匀后置于37℃恒温培养箱中反应24h。每组3个平行。反应结束后过0.45μm水系滤膜HPLC法（色谱条件：液相色谱：岛津LC20AD，色谱柱：C18（ODS-3，150mm×4.6mm，5mm），流动相：甲醇：乙腈：水=1：3：6，流速：1ml/min，检测器：紫外检测器，进样量：20μl，柱温：35℃，检测波长：370nm）检测残余黄曲霉毒素B1含量。由色谱结果可知：黄曲霉毒素B1在中性和偏酸性条件下比较稳定，在强酸性条件下有微弱分解，在碱性条件下分解较快。在pH 7.5的条件下黄曲霉毒素B1分解率为3.1%，在pH 8.0的条件下黄曲霉毒素B1分解率为15.25%，在pH 9的条件下黄曲霉毒素B1分解率为80.73%，在pH 10的条件下黄曲霉毒素B1分解率为99.28%。由检测数据可知，当发酵上清液pH值过高时，黄曲霉毒素B1会被分解而影响到黄曲霉毒素B1解毒酶酶活的测定，然而当pH值小于7.5时对酶活的测定影响不大，因此要控制发酵液的pH值不大于7.5，以此明确黄曲霉毒素B1的降解是因为酶的作用，从而筛选到真正高产黄曲霉毒素B1解毒酶的菌株。
2、发酵液pH控制方法：
（1）添加不同量的葡萄糖对发酵液pH控制
 在培养基（培养基配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 8.5，KH2PO4 1，K2HPO4·3H2O 1， MgSO4 1，香豆素 1)的基础上添加0%（W/V）、0.2%（W/V）、0.4%（W/V）、0.6%（W/V）、0.8%（W/V）的葡萄糖作为调控pH的培养基，菌种Sinomonas sp.HSD8活化后制备种子液，接种（接种量10%（V:V））后，在37℃、160rpm/min摇床振荡培养3天。培养结束后取30mL发酵液于50mL离心管，8000rpm/min离心10min后取上清液测量pH值。
（2）添加不同量的KH2PO4对发酵液pH控制
在培养基（培养基配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 8.5，葡萄糖4，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4 1，香豆素 1)的基础上添加0%（W/V）、0.1%（W/V）、0.15%（W/V）、0.2%（W/V）、0.25%（W/V）、0.3%（W/V）的KH2PO4作为调控pH的培养基，菌种Sinomonas sp.HSD8活化后制备种子液，接种（接种量10%（V:V））后，在37℃、160rpm/min摇床振荡培养3天。培养结束后取30mL发酵液于50mL离心管，8000rpm/min离心10min后取上清液测量pH值。
（3）添加0.4%葡萄糖和0.25%KH2PO4的发酵培养基对菌株Sinomonas sp.HSD8发酵pH控制
 菌株Sinomonas sp.HSD8活化（斜面培养基配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，琼脂 20，121℃灭菌20min）后制备种子液（种子培养基配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，121℃灭菌20min），接种至发酵培养基（发酵培养基配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，葡萄糖 4，NaCl 8.5g，KH2PO4 2.5g，K2HPO4·3H2O 1g， MgSO4 1g，香豆素 1g）接种量为10%（V:V），37℃、160rpm/min摇床振荡培养3天。培养结束后取30mL发酵液于50mL离心管，8000rpm/min离心10min后取上清液测量pH值。
（4）添加葡萄糖和KH2PO4 在50L发酵罐上发酵对发酵液pH控制
菌株Sinomonas sp.HSD8活化（活化培养基配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，琼脂 20，121℃灭菌20min）后制备一级种子液和二级种子液（种子培养基配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，121℃灭菌20min），将二级种子液接种至发酵培养基（发酵培养基配方（g/L）：玉米浆 13，葡萄糖 2g，NaCl 8.5，KH2PO4 2.5，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4 1，香豆素 1，所述发酵培养基pH 4.5-5.0），接种量为5-10%（V:V），温度为37℃、搅拌转速150-200rmp，通气量10-20L/min 的50L发酵罐上发酵3天。培养结束后取30mL发酵液于50mL离心管，8000rpm/min离心10min后取上清液测量pH值。
本发明具有以下优点：
1、.发酵pH调控方便，葡萄糖和磷酸二氢钾等调控物料价廉易得且用量较小。
2、发酵pH调控后排除了pH对黄曲霉毒素B1分解的影响，明确了黄曲霉毒素B1的分解是因为酶的作用。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：添加葡萄糖摇瓶发酵对发酵pH控制
（1）菌株
细菌Sinomonas sp.HSD8，CCTCC NO：M2014109。
（2）培养基
每1 L所述斜面培养基含有：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂 20g，所述斜面培养基pH自然；
每1 L所述种子培养基含有：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，所述种子培养基pH自然；
每1 L所述摇瓶上发酵培养基（基本培养基）含有：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 8.5g，KH2PO4 1g，K2HPO4·3H2O 1g， MgSO4 1g，香豆素 1g，所述发酵培养基pH 5.0-5.5；
（3）实验中所用到的溶液
PBS缓冲液（pH 7.0），由0.2mol/L Na2HPO4﹒12H2O溶液和0.2mol/L NaH2PO4﹒2H2O溶液配制而成。
（4）添加不同量的葡萄糖对发酵液pH控制
在培养基（培养基配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 8.5，KH2PO4 1，K2HPO4·3H2O 1， MgSO4 1，香豆素 1)的基础上添加0%（W/V）、0.2%（W/V）、0.4%（W/V）、0.6%（W/V）、0.8%（W/V）的葡萄糖作为调控pH的培养基，初筛菌种活化后制备种子液，接种（接种量10%（V/V））后37℃、160rpm/min摇床振荡培养3天。培养结束后取30mL发酵液于50mL离心管，8000rpm/min离心10min后取上清液测量pH值并测定酶活。当葡萄糖添加量为0.4%时发酵液的pH控制最好，为7.62，但还没有在7.5以内。
（5）发酵上清液与黄曲霉毒素B1反应
     取发酵液30mL于大离心管，8000rpm/min离心10min。离心完后取上清液950uL和AFB1工作液50μL（PBS毒素溶液浓度20μg/mL）于灭菌的5mL离心管中，使AFB1终浓度为1μg /mL，然后在恒温培养箱中37℃培养24h。以灭菌发酵培养基加等量PBS毒素溶液做空白对照。做3次平行。
（6）高压液相色谱（HPLC）法测定残留黄曲霉毒素B1含量
反应混合液用等体积（1mL）的二氯甲烷旋涡振荡萃取3次每次30秒，取下层二氯甲烷于另一5mL离心管中，真空干燥箱65℃除去二氯甲烷层，用1mL甲醇（色谱纯）溶解残余物，有机相滤膜（0.22μm）过滤，混匀进样。高压液相色谱检测残余黄曲霉毒素B1含量。
（7）黄曲霉毒素B1解毒酶酶活计算
根据酶活定义：在温度为37℃，pH 7.0的条件下，反应24h降解1ng黄曲霉毒素B1的酶量为一个酶活单位U。计算酶活。
（8）结果：
     当葡萄糖添加量为0.4%时，发酵72小时，发酵液pH：7.62，酶活：323 U/mL。
实施例2：添加KH 2 PO 4 摇瓶发酵对发酵pH控制
（1）菌株 
与实施例1相同。
（2）培养基
每1 L所述斜面培养基与实施例1相同。
每1 L所述种子培养基与实施例1相同。
每1 L所述摇瓶上发酵培养基（基本培养基）含有：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，葡萄糖 4g，NaCl 8.5g，K2HPO4·3H2O 1g， MgSO4 1g，香豆素 1g，所述发酵培养基pH 5.0-5.5；
（3）实验中所用到的溶液
与实施例1相同。
（4）添加不同量的KH2PO4对发酵液pH控制
     在发酵培养基（基本培养基）（基本培养基配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 8.5，葡萄糖4g，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4 1，香豆素 1)的基础上添加0%（W/V）、0.1%（W/V）、0.15%（W/V）、0.2%（W/V）、0.25%（W/V）、0.3%（W/V）的KH2PO4作为调控pH的培养基，初筛菌种活化后制备种子液，接种（接种量10%（V/V））后37℃、160rpm/min摇床振荡培养3天。培养结束后取30mL发酵液于50mL离心管，8000rpm/min离心10min后取上清液测量pH值及酶活。当KH2PO4添加量为0.25%时生物量相对较大且pH控制在7.5以内对酶活检测影响不大，故KH2PO4添加量为0.25%最好，发酵液pH为7.22。
（5）发酵上清液与黄曲霉毒素B1反应
     参照实施例1方法测定。
（6）HPLC法测定残留黄曲霉毒素B1含量
    参照实施例1方法测定。
（7）黄曲霉毒素B1解毒酶酶活计算
    参照实施例1方法测定。
（8）结果
  当KH2PO4添加量为0.25%时，发酵72小时，发酵液pH：7.22，酶活：483.5 U/mL。
实施例3：添加葡萄糖和KH 2 PO 4 50L发酵罐发酵对发酵液pH控制
（1）菌株
    与实施例1相同。
（2）培养基
每1 L所述斜面培养基同实施例1；
每1 L所述种子培养基同实施例1；
每1 L所述发酵罐水平上发酵培养基含有：玉米浆 13g，葡萄糖 2g，NaCl 8.5g，KH2PO4 2.5g，K2HPO4·3H2O 1g，MgSO4 1g，香豆素 1g，所述发酵培养基pH 4.5-5.0；
（3）种子培养
斜面种子活化24-36小时后，接入装入50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中培养12-14小时即得一级种子；之后再按10%（10%为体积比）的接种量将一级种子接入相同发酵培养基培养12-14小时制备二级种子，培养温度37-40 ℃，恒温振荡培养，转速160rpm/min；
（4）发酵培养
将二级种子按5-10%的接种量接入发酵罐中，发酵温度37℃，搅拌转速150-200rmp，通气量10-20L/min，在生物量达到一定时，调节转速和通气量，实时监测发酵液pH变化，分阶段控制发酵罐的溶氧水平。继续发酵至60h-72h放罐，并且测定发酵液pH值。
（5）发酵上清液与黄曲霉毒素B1反应
参照实施例1方法测定。
（6）HPLC法测定残留黄曲霉毒素B1含量
参照实施例1方法测定。
（7）黄曲霉毒素B1解毒酶酶活计算
参照实施例1方法测定。
（8）结果
  当葡萄糖添加0.2%，KH2PO4添加量为0.25%时，发酵60-72小时，发酵液pH：6.92，酶活：562.6U/mL。

Claims (4)

1.一种控制产黄曲霉毒素B1降解酶菌株发酵液pH的方法，其特征在于：在发酵培养基中添加葡萄糖和磷酸二氢钾，调控发酵液的pH至7.0左右。
2.根据权利要求1所述的一种控制产黄曲霉毒素B1降解酶菌株发酵液pH的方法，其特征在于：在发酵培养基的基础上添加0.4%（W/V）葡萄糖，0.25%（W/V）磷酸二氢钾。
3.根据权利要求1所述的一种控制产黄曲霉毒素B1降解酶菌株发酵液pH的方法，其特征在于：所述产黄曲霉毒素B1降解酶的菌株为细菌Sinomonas sp.HSD8，保藏编号CCTCC NO：M 2014109。
4.根据权利要求1所述的一种控制产黄曲霉毒素B1降解酶菌株发酵液pH的方法，其特征在于：发酵培养基配方（g/L）为牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 8.5g，KH2PO4 1g，K2HPO4·3H2O 1g， MgSO4 1g，香豆素1g。
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