CN100582234C - 克列维醇在制备抗氧化剂的应用 - Google Patents
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Abstract
克列维醇在制备抗氧化剂的应用，涉及一种克列维醇。提供一种来源于红树林内生真菌次级代谢产物克列维醇的制备方法及其在制备抗氧化剂中的应用。制备方法为：矮棒曲霉BYY-1种子培养；液体深层发酵；发酵液过滤除菌体；滤液减压浓缩后用有机溶剂多次萃取，收集有机相并减压浓缩获得粗提物；粗提物经硅胶柱色谱及重结晶精制后制得克列维醇。经药理实验证实该化合物具有显著的抗氧化作用，可用于制备抗氧化剂，并应用于医药品、化妆品及食品的制备中。由于本发明所述的来源于红树林内生真菌次级代谢产物克列维醇不仅可通过发酵制得，无原材料之忧，而且提取精制方法简单，适合规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种克列维醇，尤其是涉及一种来源于红树林内生真菌一矮棒曲霉BYY-1(A.clavatonanicus)真菌代谢产物克列维醇作为抗氧化剂在医药品、化妆品及食品领域的用途。
背景技术
生物体内会不断产生具有很高反应活性的自由基，在正常条件下，这些自由基会不断地被抗氧化系统清除，使机体内的自由基处于动态平衡之中。但是，当机体的抗氧化防御体系受到损伤，或在内源性和/或外源性的刺激而使机体代谢异常时，会导致自由基的大量产生。它们可对机体产生毒害，破坏生物大分子，影响细胞活性，主要损害细胞膜包括血管内皮细胞膜及亚微结构，并引起一系列氧化性的损伤疾病。现已明确人体内的自由基与许多病理生理现象都有密切的关系，如衰老、肿瘤、炎症、糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏症、帕金森病等(1、Ono K，Hamaguchi T，Naiki H，Yamada M.Anti-amyloidogenic effects ofantioxidants：implications for the prevention and therapeutics of Alzheimer′s disease.Biochim.Biophys.Acta，2006，1762(6)：575-586；2、赵先英，张涛.天然药物中抗氧化剂的研究进展.中国医院药学杂志，2006，26(4)：466-467；3、晏马成，郭澄.氧化损伤性疾病和中药的抗氧化治疗.时珍国医国药，2000，11(8)：765-766)。自由基还与食品变质密切相关，是食品氧化的主要原因。
鉴于自由基与人体健康疾病的关系十分密切，而且又是影响食品质量的主要原因，因此寻找具有抗氧化的活性化合物已成为制药、食品及化妆品等不同领域的研究开发热点。
目前，已有不少来源于化学合成和天然产物的抗氧化剂作为药品、化妆品或食品添加剂使用。已普遍应用的抗氧化剂(非酶类)主要有维生素E、维生素C、β-胡萝卜素、茶多酚、异黄酮、迷迭香酚和阿魏酸等。但现有的抗氧化剂在活性、稳定性或安全性等多方面存在着不同程度的缺陷。例如：天然抗氧化剂茶多酚自身容易被氧化，性质不够稳定。因此，继续寻找活性高、安全性好、性质稳定的抗氧化剂仍然具有十分重要的意义。
海洋真菌种类多，分布广，既可生活在水体和底泥中，又可栖息在红树植物、海绵、珊瑚、海鞘、海藻等不同的海洋动植物体上。国内外对海洋真菌的系统研究起步较迟，对其代谢产物化学及生物活性的研究水平远不及陆生真菌，但近几年来研究进展较快，目前已从这类真菌中分离并鉴定了许多活性化合物，其中有些具有很强的抗氧化活性(1、Bugni T S，Ireland C M.Marine-derived fungi：a chemically and biologically diverse group ofmicroorganisms.Nat.Prod.Rep.，2004，21：143-163；2、Imada C，Sugimoto Y，Makimura T，kobayashi T，Hamada N，Watanabe E.Isolation and characterization of tyrosinaseinhibitorproducing microorganisms from marine environment.Fisheries science.2001，67：1151-1156.)。已有的研究结果表明海洋真菌代谢产物中蕴藏着许多具有生物活性的新化合物，是开发活性物质的宝贵资源。
红树植物内生真菌是海洋真菌的重要成员，这类微生物能产生许多与宿主植物相同或不同的活性代谢产物，包括一些在陆栖微生物中未曾发现过的生物活性物质，是发掘天然的及抗氧化剂的重要资源，但目前鲜见从这类真菌中寻找抗氧化剂乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究开发报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于红树林内生真菌次级代谢产物克列维醇的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种来源于红树林内生真菌次级代谢产物克列维醇在制备抗氧化剂的应用。
本发明所用的红树林内生真菌为矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)，已于2006年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC中国 武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NO：M206063。
本发明所述的克列维醇(clavatol)为2，4-Dihydroxy-3，5-dimethylacetophenone，其化学结构式如下：
所述的克列维醇的制备方法为：
1)矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)的种子培养
A.配制斜面培养基：马铃薯去皮切块，放入海水中，煮后过滤，滤液用海水定容，得马铃薯汁，然后添加葡萄糖或蔗糖及琼脂，分装试管，灭菌后制成斜面培养基。将矮棒曲霉BYY-1转接至斜面培养基上培养。
B.配制种子液：在马铃薯汁中添加葡萄糖或蔗糖，分装后灭菌，得种子培养基。将上述培养的斜面菌种接入到分装后的种子培养基中，摇瓶培养，得种子液。
C.种子罐种子培养：先配制种子培养基(配方同上)，将种子培养基装入种子罐，将上述培养的种子液接入种子罐中，培养后得培养后的种子液。
2、克列维醇的发酵
配制发酵培养基(配方同种子培养基)，将发酵培养基装入发酵罐，将上述培养后的种子液接入发酵罐中，发酵后得发酵液。
3、克列维醇的提取
将发酵液过滤除菌体，滤液减压浓缩后用有机溶剂萃取，收集有机相并减压浓缩成浸膏。
4、克列维醇的精制
浸膏用甲醇溶解得克列维醇甲醇溶液，在克列维醇甲醇溶液中加入硅胶拌样，上硅胶柱进行分离，以石油醚/乙酸乙酯(石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100)为洗脱剂梯度洗脱，收集当石油醚/乙酸乙酯的体积比例为(50～3)∶1时的洗脱液，合并洗脱液并减压浓缩至干，得微黄色晶体，加溶剂溶解后重结晶至少2次，得目标产物，即克列维醇。
在步骤1)中，配制斜面培养基的马铃薯去皮切成小块，取150～300g放入1L 20％～100％海水(海水与自来水按体积比混合)中，煮后过滤，滤液用20％～100％海水定容至1000ml，得马铃薯汁，然后添加葡萄糖或蔗糖10～30g，琼脂1.5～3.0g，分装试管，121℃灭菌30min后制成斜面培养基，将矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)转接至斜面培养基上后25～32℃下培养3～7d；配制种子液时，在每升马铃薯汁(制备方法同上)中添加葡萄糖或蔗糖10～30g，分装后灭菌(121℃，30min)，得种子培养基，将上述培养的斜面菌种接入到分装后的种子培养基中，25～32℃下，120～250r/min摇瓶培养2～5d，得种子液；种子罐种子培养时，将种子培养基装入种子罐的装罐量为种子罐容积的60％～70％，将上述培养的种子液按接种量2％～10％接入种子罐中，在温度25～32℃、搅拌转速120～220r/min和通气量0.3～1.2vvm的条件下培养2～4d，得培养后的种子液。
在步骤2)中，配制发酵培养基时，将发酵培养基装入发酵罐的装罐量为发酵罐容积的60％～70％，将上述培养后的种子液按接种量5％～10％接入发酵罐中，在温度25～32℃、搅拌转速120～200r/min和通气量0.3～1.5vvm的条件下发酵4～7d，得发酵液。
在步骤3)中，将发酵液过滤除菌体，滤液减压浓缩至发酵液体积的35％～20％后用有机溶剂萃取至少2次，收集有机相并减压浓缩成浸膏，有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳、甲苯中的一种。
在步骤4)中，在克列维醇甲醇溶液中加入质量为浸膏5～10倍的硅胶拌样，收集当石油醚/乙酸乙酯的体积比例为(50～3)/1时的洗脱液。溶剂选自甲醇、乙酸乙酯和丙酮中的一种。
所得的化合物无色针状晶体，mp：180～182℃，ESIMS：m/z(rel.int.)：179.0[M-H]-；1H-NMR和13C-NMR(500MHz，DMSO，ppm)数据见表1。经谱图综合解析结果证实该化合物为克列维醇。
表1.克列维醇的NMR数据
| Position. | 1H-NMR | Position. | 13C |
| 1’ | 2.00(s，3H) | 1 | 110.3s |
| 2’ | 2.12(s，3H) | 2 | 160.5s |
| 6 | 7.51(s，1H) | 3 | 112.1s |
| 8 | 2.51(s，3H) | 1’ | 8.1q |
| 4 | 160.6s | ||
| 5 | 115.9s | ||
| 2’ | 16.2q | ||
| 6 | 130.3d | ||
| 7 | 203.1s | ||
| 8 | 26.2q |
经药理实验证实该化合物具有显著的抗氧化作用，可用于制备抗氧化剂，并应用于医药品、化妆品及食品的制备中。由于本发明所述的来源于红树林内生真菌次级代谢产物克列维醇不仅可通过发酵制得，无原材料之忧，而且提取精制方法简单，适合规模化生产。
附图说明
图1为本发明所述的来源于红树林内生真菌次级代谢产物克列维醇对H2O2的清除活性。在图1中，横坐标为Clavstol(μg/ml)，纵坐标为Inhibitror(％)。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步阐述本发明。
实施例1
A.培养基配方：斜面培养基配方：每升马铃薯汁(马铃薯去皮切成小块，取200g放入1L 50％海水中，煮30min，过滤，滤液用50％海水(海水与自来水按体积比混合)定容至1000ml)中添加葡萄糖20g，琼脂2.0g。种子培养基配方：每升马铃薯汁(制法同上)中添加葡萄糖20g。发酵培养基配方：同种子培养基。
B.发酵工艺：斜面培养：按上述斜面培养基配方配制培养基，分装试管，121℃灭菌30min后制斜面。将保存的红树植物内生真菌一矮棒曲霉CCTCC NO：M206063菌种转接至斜面培养基上，25℃下培养7d。摇瓶培养：按种子培养基配方配制培养基，分装500锥型瓶(80ml/瓶)，灭菌(121℃，30min)后将培养的斜面菌种接入，28℃下，140r/min摇瓶培养3d。种子罐培养：按种子培养基配方配制培养基，20L种子罐培养基装量为12L，121℃灭菌30min，冷却后将培养的摇瓶种子按接种量2％接入种子罐中，在温度28℃、搅拌转速120r/min和通气量0.5vvm的条件下培养3d。发酵罐培养：按发酵培养基配方配制培养基，200L发酵罐培养基装量为120L，121℃灭菌30min，待冷却至28℃后将上述种子罐已培养好的种子按接种量10％接入罐中，在温度28℃、搅拌转速120r/min和通气量0.3vvm的条件下培养7d。
C.克列维醇的提取：发酵结束后，发酵液过滤除菌体，滤液减压浓缩至原液体积的25％后用乙酸乙酯萃取3次，收集有机相并减压浓缩成浸膏。
D.克列维醇的精制：浸膏用少量的甲醇溶解后加入适量硅胶拌样，上硅胶柱进行分离，以石油醚-乙酸乙酯＝50∶1(v/v)为洗脱剂洗脱，收集洗脱液并减压浓缩至干，得微黄色晶体，加适量的乙酸乙酯溶解，于室温下重结晶，同法再重结晶4次。
实施例2
A.培养基配方：斜面培养基配方：每升马铃薯汁(马铃薯去皮切成小块，取300g放入1L 100％海水中，煮30min，过滤，滤液用100％海水定容至1000ml)中添加葡萄糖30g，琼脂3.0g。种子培养基配方：每升马铃薯汁(制法同上)中添加蔗糖30g。发酵培养基配方：同种子培养基。
B.发酵工艺：斜面培养：按上述斜面培养基配方配制培养基，分装试管，121℃灭菌30min后制斜面。将保存的红树植物内生真菌一矮棒曲霉CCTCC NO：M206063菌种转接至斜面培养基上，28℃下培养5d。摇瓶培养：按上述种子培养基配方配制培养基，分装锥型瓶(100ml/瓶)，灭菌(121℃，30min)后将上述培养的斜面菌种接入，28℃下，220r/min摇瓶培养3d。种子罐培养：按上述种子培养基配方配制培养基，20L种子罐培养基装量为12L，121℃灭菌30min，冷却后将上述培养的摇瓶种子按接种量5％接入种子罐中，在温度25℃、搅拌转速220r/min和通气量0.5vvm的条件下培养3d。发酵罐培养：按上述发酵培养基配方配制培养基，200L发酵罐培养基装量为120L，121℃灭菌30min，待冷却至25℃后将上述种子罐已培养好的种子按接种量5％接入罐中，在温度25℃、搅拌转速220r/min和通气量0.5vvm的条件下培养3d。
C.克列维醇的提取：发酵结束后，发酵液过滤除菌体，滤液减压浓缩至原液体积的20％后用乙酸乙酯萃取5次，收集有机相并减压浓缩成浸膏。
D.克列维醇的精制：浸膏用少量的甲醇溶解后加入适量硅胶拌样，上硅胶柱进行分离，以石油醚-乙酸乙酯＝20∶1(v/v)为洗脱剂洗脱，收集洗脱液并减压浓缩至干，得微黄色晶体，加适量的甲醇溶解，于室温下重结晶，同法再重结晶2次。
实施例3
A.培养基配方：斜面培养基配方：每升马铃薯汁(马铃薯去皮切成小块，取150g放入1L 20％海水中，煮30min，过滤，滤液用20％海水(海水与自来水按体积比混合)定容至1000ml)中添加葡萄糖15g，琼脂1.5g。种子培养基配方：每升马铃薯汁(制法同上)中添加葡萄糖15g。发酵培养基配方：同种子培养基。
B.发酵工艺：斜面培养：按上述斜面培养基配方配制培养基，分装试管，121℃灭菌30min后制斜面。将保存的红树植物内生真菌一矮棒曲霉CCTCC NO：M206063菌种转接至斜面培养基上，32℃下培养5d。摇瓶培养：按上述种子培养基配方配制培养基，分装500锥型瓶(120ml/瓶)，灭菌(121℃，30min)后将上述培养的斜面菌种接入，32℃下，180r/min摇瓶培养5d。种子罐培养：按上述种子培养基配方配制培养基，50L种子罐培养基装量为30L，121℃灭菌30min，冷却后将上述培养的摇瓶种子按接种量5％接入种子罐中，在温度32℃、搅拌转速180r/min和通气量1.2vvm的条件下培养5d。发酵罐培养：按上述发酵培养基配方配制培养基，500L发酵罐培养基装量为120L，121℃灭菌30min，待冷却至32℃后将上述种子罐已培养好的种子按接种量10％接入罐中，在温度32℃、搅拌转速180r/min和通气量1.2vvm的条件下培养5d。
C.克列维醇的提取：发酵结束后，发酵液过滤除菌体，滤液减压浓缩至原液体积的35％后用乙酸乙酯萃取3次，收集有机相并减压浓缩成浸膏。
D.克列维醇的精制：浸膏用少量的甲醇溶解后加入适量硅胶拌样，上硅胶柱进行分离，以石油醚-乙酸乙酯＝10∶1(v/v)为洗脱剂洗脱，收集洗脱液并减压浓缩至干，得微黄色晶体，加适量的丙酮溶解，于室温下重结晶，同法再重结晶3次。
实施例4
采用鲁米诺化学发光法测定克列维醇对H2O2的清除能力。
在96孔板孔内依次分别加入pH7.4的PBS缓冲液90μl，不同浓度(5％DMSO配制)的待测样品50μL(以5％DMSO作空白对照)，30mmol/L的H2O2 20μl，25℃放置5min，冰浴3min，随后加入2.5×10-5 mol/L Luminol 40μL启动化学发光反应，记录2min内发光强度的峰值(CL)。按下式计算抑制率：
发光抑制率(％)＝[(空白对照CL-样品CL)/空白对照CL]×100％
用发光抑制率大小来衡量样品对H2O2清除能力。
测定结果(参见图1)表明，克列维醇清除H2O2的IC50(抑制发光50％时所需的清除剂浓度)为6.25μg/ml，显示该化合物对H2O2具有较强的清除能力。
实施例5
采用DPPH(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)法测定克列维醇清除有机自由基能力。
在96孔板孔内依次分别加入不同浓度的待测样品溶液(甲醇配制)或甲醇(空白)50μL，50μmol/L的DPPH(甲醇配制)150μl，25℃下静置20min后用分光光度计测定吸光度(OD517)。按下式计算样品对DPPH自由基的清除率：
清除率＝1-[(A-A0)/(B-B0)]×100％
式中：A0，A为加样反应前后的吸光度，B0，B为空白孔反应前后的吸光度。
测定结果表明，当克列维醇的浓度为6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml时，对DPPH自由基的清除率分别可达到44.65％、89.82％、93.33％。
Claims (1)
1.克列维醇在制备抗氧化剂中的应用，所述的克列维醇来源于红树林内生真菌次级代谢产物，红树林内生真菌为矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)，已于2006年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M206063，所述的克列维醇为2，4-Dihydroxy-3，5-dimethylacetophenone，其化学结构式如下：
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100120 Termination date: 20130429 |