CN107201377A - 一种生产肝脏解毒酶的工程菌的构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生产肝脏解毒酶的工程菌的构建及其应用，所述的构建包括获取目的基因、获取表达载体、重组、转化感受态大肠杆菌DH5α、重组子鉴定、重组质粒线性化、抽提线性化质粒、制备毕赤酵母受体菌X‑33感受态细胞、电转化；构建工程菌的宿主为巴斯德毕赤酵母菌X‑33。所述的应用：诱导表达72小时后，肝脏解毒酶的含量为410mg/L～600mg/L。构建生产肝脏解毒酶的工程菌株，大大提高菌株表达肝脏解毒酶的能力。

Description

一种生产肝脏解毒酶的工程菌的构建及其应用

技术领域

本发明涉及一种高效生产肝脏解毒酶的重组毕赤酵母菌的构建及其应用。

背景技术

霉菌毒素是霉菌的次级代谢产物，目前已鉴定出 300 多种霉菌毒素对人和动物有毒害作用，其中常见的毒素有黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲毒素、T2 毒素、呕吐毒素等，污染范围极广，作用危害巨大。

据联合国粮农组织报道，全球约有四分之一的农作物被霉菌毒素污染，其中 2%的农作物因严重污染而失去饲用价值，霉菌毒素污染每年给全球畜牧业造成数百亿美元的直接和间接经济损失。我国饲料和食品中霉菌感染率极高，其中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和烟曲霉毒素污染极为严重，每年因饲料原料霉变造成的经济损失都高达数百亿元以上。近期通过对饲料原料进行检验发现，所验原料均有霉菌毒素检出。

因此在养殖过程中使用脱霉产品势在必行，目前全球处理霉菌毒素大多数选用蒙脱石、酵母细胞壁等脱霉类产品，而脱霉类产品虽能吸附一定量毒素，但是存在着很大缺点：缺点一：吸附能力会随着 PH 值下降而下降，出现被吸附的霉菌毒素重新释放出来的情况，引发中毒。缺点二：吸附是不定向的，它不光吸附霉菌毒素，也会吸附营养物质，造成大量营养物质的流失。缺点三，过多使用脱霉类产品，会造成免疫过度增强而产生紊乱，缺少多维，造成畜禽抗应激能力下降。

肝脏解毒酶可以直接降解霉菌毒素，将有毒基团转化为无毒基团，无二次污染问题，并且作为蛋白类酶制剂，不会造成营养流失的问题。但是在自然界存在的菌株中，没有可以高效表达肝脏解毒酶的菌株。因此，从自然界存在的菌株中提取肝脏解毒酶，效率非常低，无法进行大规模生产，为了解决这个问题，我们构建了肝脏解毒酶毕赤酵母重组菌，以便大规模生产。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供一种生产肝脏解毒酶的工程菌的构建及其应用，实现以下发明目的：

构建生产肝脏解毒酶的工程菌株，大大提高菌株表达肝脏解毒酶的能力，提高菌株表达肝脏解毒酶的酶活，提高工程菌发酵液中肝脏解毒酶的含量，实现生产工业化。

为解决现有的技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种生产肝脏解毒酶的工程菌的构建，包括获取目的基因、获取表达载体、重组、转化感受态大肠杆菌DH5α、重组子鉴定、重组质粒线性化、抽提线性化质粒、制备毕赤酵母受体菌X-33感受态细胞、电转化；构建工程菌的宿主为巴斯德毕赤酵母菌X-33；导入的基因序列如附图1所示。

所述的转化感受态大肠杆菌DH5α：将重组子加入到感受态的大肠杆菌DH5α中，冰浴30min，再用42℃水浴热激90s，再冰浴2min，再加入LLB液体培养基，于37℃、200-250rpm条件下振荡培养45min；取上述培养后的液体培养基涂布于含有25µg/mL博来霉素的LLB平板培养基上，在37℃培养12-16h，得到转化后的大肠杆菌DH5α菌落。

所述重组质粒线性化：采用BamHⅠ单酶切进行质粒线性化。

所述的抽提线性化质粒：先用苯酚抽提一次，再用苯酚：氯仿质量比1：1的混合液抽提一次，再用苯酚抽提一次，每次抽提充分混匀后12000rpm离心5 min，保留上清；

抽提得到的线性化质粒浓度为500ng/µL。

所述的制备毕赤酵母受体菌X-33感受态细胞：使感受态细胞浓度达到OD600为1。

所述的电转化：

将线性化质粒加入酵母感受态细胞中，所述线性化质粒：酵母感受态细胞的体积比为1:8；混匀后，加入到预冷5 min的石英电转化杯中，控制在1.5kV、25µF、200Ω、0℃的条件下电击，转化后立即加入4℃预冷30min的D-山梨醇；将电转化杯放于30℃恒温箱中温育1-2h。

一种生产肝脏解毒酶的工程菌的应用，构建的工程菌经过诱导可表达肝脏解毒酶；诱导表达过程包括：将构建的工程菌接种于含100µg /mL 博来霉素的YPD液体培养基中，在30℃，250rpm培养过夜，得到YPD培养液。

所述的诱导表达过程还包括：将YPD培养液按1：50的体积比转接于BMGY培养基，在30℃，250rpm培养至培养液的OD600达到6.0，离心收集菌体。

所述的诱导表达过程还包括：将离心收集的菌体在BMMY液体培养基中，28℃、250rpm条件下培养，每24h补加0.5%的甲醇；10000rpm，10min离心收集上清，得到肝脏解毒酶溶液。

所述的应用：诱导表达72小时后，肝脏解毒酶的含量为410mg/L～600mg/L。

由于采用了上述技术方案，本发明达到的技术效果是：

1、 本发明基因工程菌株表达肝脏解毒酶的酶活可达到6000U/mL。

2、 本发明基因工程菌可高效表达肝脏解毒酶，大大提高发酵液中肝脏解毒酶的含量，经检测肝脏解毒酶的含量为410-600mg/L。

3、 肝脏解毒酶的生产成本降低。

附图说明

附图1为目的基因；

附图2为肝脏解毒酶的氨基酸序列；

附图3为表达载体pPICZαA质粒图谱；

附图4为重组子的PCR鉴定结果图；

附图5为双酶切鉴定结果图，泳道1#和2#是经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切后的重组质粒pPICZαA-det，泳道3#是未经酶切的pPICZαA-det作为对照，泳道M是5000bp Marker；

附图6为重组质粒pPICZαA-det单酶切线性化鉴定结果图。泳道1#是经BamHⅠ酶切后的pPICZαA-det质粒，泳道2#是未经酶切的pPICZαA-det作为对照，泳道M是5000bpMarker；

附图7为SDS-PAGE电泳图，其中泳道1#作为对照，是转入空表达载体的毕赤酵母菌诱导后提取的蛋白质，泳道2#、3#、4#为三个重复组的重组毕赤酵母菌诱导72h后提取的蛋白质，泳道M为蛋白Marker。

具体实施方式

实施例1一种生产肝脏解毒酶的工程菌的构建

步骤1、获取目的基因

将肝脏解毒酶的DNA序列和选用的密码子，送到生工生物股份有限公司合成含肝脏解毒酶基因及限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ的质粒pUC57，即目的基因的克隆载体。

用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切处理pUC57质粒，酶切产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA 纯化回收试剂盒回收2088bp的目的片段，得到目的基因，具体的cDNA序列如附图1所示。

步骤2、获取表达载体

用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切处理表达载体pPICZαA质粒，酶切产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA 纯化回收试剂盒回收3.6kp的片段，得到线性化的质粒片段。

所述的表达载体pPICZαA质粒图谱如附图3所示。

步骤3、重组

将步骤2得到的目的基因片段与线性化的质粒片段按1pmol:10pmol的比例混合均匀，加入5μLT4-DNA连接酶，在25℃条件下连接15min，连接产物即重组子，用于转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

所述T4-DNA连接酶购自Invitrogen公司。

步骤4、转化感受态大肠杆菌DH5α

从Invitrogen公司购买感受态大肠杆菌DH5α；

将0.2-1.5μL步骤3得到的连接产物加入到100μL感受态的大肠杆菌DH5α中；冰浴30min，再用42℃水浴热激90s，再冰浴2min，再加入800µL的LLB(低盐LB)液体培养基，于37℃、200-250rpm条件下振荡培养45min；

最后取上述培养后的液体培养基100μL涂布于含有25µg/mL博来霉素(Zeocin)的LLB(低盐LB) 平板培养基上，在37℃培养12-16h，得到转化后的大肠杆菌DH5α菌落。

步骤5、重组子鉴定

从转化后的大肠杆菌DH5α菌落中，挑取单菌落转移至加有25µg/mL博来霉素的LLB液体培养基中，采用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒。

将提取出的质粒进行重组子PCR鉴定和缺失酶切位点鉴定(双酶切鉴定)，

上述重组子PCR鉴定和缺失酶切位点鉴定的方法：

重组子PCR鉴定反应体系如下：

P1：CTCGAGATGGCTACTACTACTGTTC；

P2：TCTAGATCACAATCTTCTTTCGATG；

PCR反应程序为：

(1) 94℃3min预变性；

(2) 94℃30s，57℃30s，72℃30s，30个循环；

(3) 72℃ 10 min，结束后取10µL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶呈相系统中观察并拍照记录，在2088bp处有明显条带，证明重组子含有目的基因。

上述重组子的PCR鉴定结果图如附图4所示。

缺失酶切位点反应体系如下：

反应体系混匀后于37℃反应15min，取20µL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶呈相系统中观察并拍照记录，反应产物在3600bp和2000bp附近均有条带，证明重组子构建成功。

上述酶切鉴定结果如附图5所示。

鉴定结果为阳性的质粒送Invitrogen上海分公司测序；序列（肝脏解毒酶的DNA序列）正确的阳性表达质粒（阳性重组子）命名为pPICZαA-det。

步骤6、重组质粒线性化

大量提取重组质粒pPICZαA-det置于EP管中，并用BamHⅠ单酶切将其线性化；

采用的线性化反应200µL体系为：145µL 双蒸水（ddH₂O），120µL 10×M Buffer，30µLpPICZαA-det质粒（约15mg），5µL BamHⅠ；

将线性化反应体系充分混匀后，37℃酶切5h；得到的酶切产物，即为线性化质粒；

取2µL酶切产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，鉴定确认完全线性化。

上述重组质粒pPICZαA-det单酶切线性化鉴定结果如附图6所示。

步骤7、抽提线性化质粒

（1）在进行线性化反应的EP管中补加无菌去离子水至总体积500µL。

（2）向EP管中加入500µL的苯酚进行抽提一次，再加入500µL苯酚：氯仿质量比1：1的混合液抽提一次，再加入500µ0的苯酚抽提一次，每次抽提充分混匀后12000rpm离心5min，保留上清。

（3）将上清移至新的EP管中，加入1/10体积的3mol/L pH 5.2 的NaAC和2.5倍体积的4℃预冷30min的无水乙醇，充分混匀后，-20℃放置1小时，12000 rpm离心5 min，收集固体相；

用4℃预冷30min的70%乙醇洗涤2次，干燥后用10 µL灭菌双蒸水溶解，得到线性化质粒，质粒浓度为：500ng/µL，-20℃保存备用。

步骤8、制备毕赤酵母受体菌X-33感受态细胞

具体步骤如下：

①准备好冻存于-20℃的巴斯德毕赤酵母菌X-33，巴斯德毕赤酵母菌X-33的保藏号为CICC1958；

②无菌条件下进行以下操作：用接种环迅速蘸取巴斯德毕赤酵母菌X-33菌，并划线接种于不含博来霉素的固体YPD平板培养基上；将培养皿倒置于培养箱中，30℃培养72h，期间观察；

所述的固体YPD平板培养基：含1% 酵母膏(yeast extract)，2% 蛋白胨(peptone)，2%葡萄糖（dextrose），2%琼脂（agar）。

③待平板上长出单个菌落，挑取形态均一的单菌落，接种于含5 mL液体YPD的试管中，在30℃，250 rpm振摇培养过夜，得到菌液A。

④取0.5 mL上述菌液A接种于含50 mL YPD液体培养基的锥形瓶中，在30℃振摇培养20-24 h，得到菌液B。

⑤取菌液B于50mL的离心管中，以2500 rpm的转速，在4℃条件下离心5 min后收集菌体。

⑥ 用50 mL灭菌的4℃预冷30min的双蒸水轻轻重悬菌体细胞，再用1500rpm，4℃离心5 min，收集菌体。

再用10mL灭菌的4℃预冷30min的1mol/L D-山梨醇轻轻重悬上述步骤收集的菌体细胞，再用1500rpm，4℃离心5 min，收集菌体。

用灭菌的4℃预冷30min的1mol/L D-山梨糖醇轻轻重悬上述步骤收集的菌体细胞，并使细胞终浓度达到OD600=1，即得到感受态细胞。

将该感受态细胞于4℃条件下储存，于5h内使用。

步骤9、电转化

将步骤7提取的的线性化质粒点击转化步骤8 得到的感受态细胞，具体操作步骤如下：

①经步骤7制备的质粒10 µL转入80 µL步骤8制备好的酵母感受态细胞中，轻轻混匀充分，加入到置于冰上预冷5 min的0.2cm的石英电转化杯中。电转化杯使用前预先用70%乙醇清洗浸泡，并置于紫外灯下消毒半小时。

②将石英电转化杯擦干外壁的水分，放入BioRad GenePulse电转化仪的槽中以1.5kV、25µF、200Ω、0℃的条件下电击，转化后立即加入1 mL4℃预冷30min的D-山梨醇，混匀。

③将电转化杯放于30℃恒温箱中温育1-2h，得到电转化产物。

取150µL电转化产物均匀涂布于含100µg/mL博来霉素的YPD选择平板培养基上，观察转化子的生长，30℃培养3-5天，得到一种生产肝脏解毒酶的工程菌。

实施例2一种生产肝脏解毒酶的工程菌的鉴定

实施例1得到的工程菌，可通过以下步骤进行鉴定：

①将得到的工程菌单菌落接种于3mLYPD液体培养基中，编号标记后置于30℃，250rpm振摇培养过夜；

所述的YPD液体培养基：含100µg/mL博来霉素。

②取上述培养好的新鲜菌液，提取酵母基因组作为PCR鉴定反应的模板。提取方法参照Invitrogen公司提供的酵母表达手册用“煮-冻-煮法”进行，具体过程如下：将1mL菌液5000rpm离心5min弃上清；用500µLPBS重悬洗涤沉淀两次，5000rpm离心5min，倒弃上清；沉淀溶于100µLpH8.0的TE中，沸水煮10min，-20℃冷冻，待PCR前重新取出煮沸10min，12000rpm离心5min，最后取上清得到酵母基因组。

③ PCR检测目的基因的整合

具体反应体系如下：

P1：CTCGAGATGGCTACTACTACTGTTC；

P2：TCTAGATCACAATCTTCTTTCGATG

PCR反应程序为：

(1) 94℃3min预变性；

(2) 94℃30s，57℃30s，72℃30s，30个循环；

(3) 72℃ 10 min，结束后取10µL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶呈相系统中观察并拍照记录，在2088bp处有明显条带，证明构建的工程菌含有目的基因。

实施例3酵母重组解毒酶的诱导表达

构建的工程菌诱导表达过程如下：

将制备得到的含目的基因的工程菌接种于3mL含100µg /mL Zeocin的YPD液体培养基中；在30℃，250rpm培养过夜。

次日按1：50的体积比例转接于100mLBMGY培养基，在30℃，250rpm培养至OD600达到6.0，离心收集菌体；

将上述菌体重悬于500 mL BMMY液体培养基中，28℃250rpm培养，每24h补加0.5%的甲醇，72h后，10000rpm，10min离心收集培养上清；

得到酵母重组解毒酶发酵液。

所述的YPD选择平板培养基：含1% 酵母膏(yeast extract)，2% 蛋白胨(peptone)，2%葡萄糖（dextrose），2%琼脂（agar）；

所述的BMGY培养基：含2%peptone-Y、1%yeast、1.34%YNB、0.4mg/L生物素、1%甘油、100mmol/L磷酸盐缓冲液；

所述的BMMY液体培养基：2%peptone-Y、1%酵母膏(yeast extract)、1.34%YNB、0.4mg/L生物素、0.5%甲醇、100mmol/L磷酸盐缓冲液。

酵母重组解毒酶的鉴定：

对制备的酵母重组解毒酶，通过SDS-PAGE电泳进行鉴定是否是肝脏解毒酶；

肝脏解毒酶的分子量约为75kDa～77kDa；

鉴定时，如果有75kDa～77kDa的条带，则证明重组酵母工程菌表达的是肝脏解毒酶。

上述SDS-PAGE电泳图如附图7所示。

通过DNA/RNA微量定量仪测定肝脏解毒酶含量，测得肝脏解毒酶发酵液中的肝脏解毒酶含量为410mg/L～600mg/L。

本发明所述的肝脏解毒酶的氨基酸序列如附图2所示。

本发明所述的肝脏解毒酶，也可称为黄曲霉毒素解毒酶。

除非特殊说明和本领域常用单位，本发明所述比例，均为质量比例，所述百分比，均为质量百分比。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>山东仙普爱瑞科技股份有限公司

<120>一种生产肝脏解毒酶的工程菌的构建及其应用

<160>2

<210>1

<211>2088

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atggctacta ctactgttca cagagaaaga ttcttggctg acaagtctgc tccattgtgt 60

ggtatggaca tcagaaagtc tttcgaccaa ttgtcttcta aggaaaagtt gtacactcac 120

tacgttactg aagcttcttg ggctggtgct agaatcatcc aagctcaatg gactccacaa 180

gctactgact tgtacgactt gttgatcttg actttctctg ttaacggtaa gttggctgac 240

ttgaacgctt tgaagacttc ttctggtttg tctgaagacg actgggaagc tttgatccaa 300

tacactgttc aagttttgtc taacttggtt aactacaaga ctttcggttt cactaagatc 360

atcccaagag ttgacgctga aaagttcgaa tctgttgtta aggcttcttc taacgctgac 420

caaggttctg ctttgttcac taagttgaag caacacatct acgctttgtc tccagaatct 480

gctttgttca tcggtaagag aaaggacggt cacgtttcta actactactt gggtgaacca 540

gttggtgacg ctgaagttga cgctatccaa aacgttgctg aaaagttggg tgttgacatc 600

ttgaacacta gagttaagaa gaacggtgct ggtgactaca ctttgttggt tgcttctgct 660

aagacttctc caccatctgt tcacgacttc caaatcgact ctactccagc taagttgact 720

atcgaatacg gtgactacgc ttcttctttg actaaggttg ttgctgcttt gcaagaagct 780

aagcaataca ctgctaacga ccaccaatct gctatgatcg aaggttacgt taagtctttc 840

aactctggtt ctatcccaga acacaaggct gcttctactg aatgggttaa ggacatcggt 900

ccagttgttg aatcttacat cggtttcgtt gaaacttacg ttgacccata cggtggtaga 960

gctgaatggg aaggtttcac tgctatcgtt gacaagcaat tgtctgctaa gtacgaagct 1020

ttggttaacg gtgctccaaa gttgatcaag tctttgccat ggggtactga cttcgaagtt 1080

gacgttttca gaaagccaga cttcactgct ttggaagttg tttctttcgc tactggtggt 1140

atcccagctg gtatcaacat cccaaactac tacgaagtta gagaatctac tggtttcaag 1200

aacgtttctt tggctaacat cttggctgct aaggttccaa acgaagaatt gactttcatc 1260

cacccagacg acgttgaatt gtacaacgct tgggactctc gtgctttcga attgcaagtt 1320

gctaaccacg aattgttggg tcacggttct ggtaagttgt tccaagaagg tgctgacggt 1380

aagttgaact tcgacccaga aaaggttatc aacccattga ctggtaagcc aatcacttct 1440

tggtacaagc caggtcaaac tccagactct gttttgggtg aagtttcttc ttctatggaa 1500

gaatgtagag ctgaaactgt tgctttgtac ttggtttcta acttggacat cttgaagatc 1560

ttcaactacg ttgacaagca agacatcgaa gacatccaat acatcacttt cttgttgatg 1620

gctagagctg gtttgagagc tttggaattc tacgacccag ctactaagaa gcacggtcaa 1680

gctcacatgc aagctagaat gggtatcact caatacttga tccaagctgg tatcgctaga 1740

ttggaattga tccaagacgc taacggtgaa ttggaaaact tgtacgttag agttgacaga 1800

gaaaaggttt tgtctaaggg taaggaagtt gttggtcaat tgttgatcga attgcaagtt 1860

agaaagtcta ctgctgacgg tactggttct cgtgacttct acactacttt gactgaacca 1920

atctctggtt gggaaggtaa gatcagagac atcgttttga agaagaagtt gccaagaaag 1980

atcttcgttc aaccaaacac tttcgttgtt aacggtgaag ttcaattgaa ggaataccca 2040

ttgactgctg ctggtgttat cgaatctttc atcgaaagaa gattgtaa 2088

<210>2

<211>695

<212>PRT

<213>肝脏解毒酶

<400>2

Met Ala Thr Thr Thr Val His Arg Glu Arg Phe Leu Ala Asp Lys Ser

1 5 10 15

Ala Pro Leu Cys Gly Met Asp Ile Arg Lys Ser Phe Asp Gln Leu Ser

20 25 30

Ser Lys Glu Lys Leu Tyr Thr His Tyr Val Thr Glu Ala Ser Trp Ala

35 40 45

Gly Ala Arg Ile Ile Gln Ala Gln Trp Thr Pro Gln Ala Thr Asp Leu

50 55 60

Tyr Asp Leu Leu Ile Leu Thr Phe Ser Val Asn Gly Lys Leu Ala Asp

65 70 75 80

Leu Asn Ala Leu Lys Thr Ser Ser Gly Leu Ser Glu Asp Asp Trp Glu

85 90 95

Ala Leu Ile Gln Tyr Thr Val Gln Val Leu Ser Asn Leu Val Asn Tyr

100 105 110

Lys Thr Phe Gly Phe Thr Lys Ile Ile Pro Arg Val Asp Ala Glu Lys

115 120 125

Phe Glu Ser Val Val Lys Ala Ser Ser Asn Ala Asp Gln Gly Ser Ala

130 135 140

Leu Phe Thr Lys Leu Lys Gln His Ile Tyr Ala Leu Ser Pro Glu Ser

145 150 155 160

Ala Leu Phe Ile Gly Lys Arg Lys Asp Gly His Val Ser Asn Tyr Tyr

165 170 175

Leu Gly Glu Pro Val Gly Asp Ala Glu Val Asp Ala Ile Gln Asn Val

180 185 190

Ala Glu Lys Leu Gly Val Asp Ile Leu Asn Thr Arg Val Lys Lys Asn

195 200 205

Gly Ala Gly Asp Tyr Thr Leu Leu Val Ala Ser Ala Lys Thr Ser Pro

210 215 220

Pro Ser Val His Asp Phe Gln Ile Asp Ser Thr Pro Ala Lys Leu Thr

225 230 235 240

Ile Glu Tyr Gly Asp Tyr Ala Ser Ser Leu Thr Lys Val Val Ala Ala

245 250 255

Leu Gln Glu Ala Lys Gln Tyr Thr Ala Asn Asp His Gln Ser Ala Met

260 265 270

Ile Glu Gly Tyr Val Lys Ser Phe Asn Ser Gly Ser Ile Pro Glu His

275 280 285

Lys Ala Ala Ser Thr Glu Trp Val Lys Asp Ile Gly Pro Val Val Glu

290 295 300

Ser Tyr Ile Gly Phe Val Glu Thr Tyr Val Asp Pro Tyr Gly Gly Arg

305 310 315 320

Ala Glu Trp Glu Gly Phe Thr Ala Ile Val Asp Lys Gln Leu Ser Ala

325 330 335

Lys Tyr Glu Ala Leu Val Asn Gly Ala Pro Lys Leu Ile Lys Ser Leu

340 345 350

Pro Trp Gly Thr Asp Phe Glu Val Asp Val Phe Arg Lys Pro Asp Phe

355 360 365

Thr Ala Leu Glu Val Val Ser Phe Ala Thr Gly Gly Ile Pro Ala Gly

370 375 380

Ile Asn Ile Pro Asn Tyr Tyr Glu Val Arg Glu Ser Thr Gly Phe Lys

385 390 395 400

Asn Val Ser Leu Ala Asn Ile Leu Ala Ala Lys Val Pro Asn Glu Glu

405 410 415

Leu Thr Phe Ile His Pro Asp Asp Val Glu Leu Tyr Asn Ala Trp Asp

420 425 430

Ser Arg Ala Phe Glu Leu Gln Val Ala Asn His Glu Leu Leu Gly His

435 440 445

Gly Ser Gly Lys Leu Phe Gln Glu Gly Ala Asp Gly Lys Leu Asn Phe

450 455 460

Asp Pro Glu Lys Val Ile Asn Pro Leu Thr Gly Lys Pro Ile Thr Ser

465 470 475 480

Trp Tyr Lys Pro Gly Gln Thr Pro Asp Ser Val Leu Gly Glu Val Ser

485 490 495

Ser Ser Met Glu Glu Cys Arg Ala Glu Thr Val Ala Leu Tyr Leu Val

500 505 510

Ser Asn Leu Asp Ile Leu Lys Ile Phe Asn Tyr Val Asp Lys Gln Asp

515 520 525

Ile Glu Asp Ile Gln Tyr Ile Thr Phe Leu Leu Met Ala Arg Ala Gly

530 535 540

Leu Arg Ala Leu Glu Phe Tyr Asp Pro Ala Thr Lys Lys His Gly Gln

545 550 555 560

Ala His Met Gln Ala Arg Met Gly Ile Thr Gln Tyr Leu Ile Gln Ala

565 570 575

Gly Ile Ala Arg Leu Glu Leu Ile Gln Asp Ala Asn Gly Glu Leu Glu

580 585 590

Asn Leu Tyr Val Arg Val Asp Arg Glu Lys Val Leu Ser Lys Gly Lys

595 600 605

Glu Val Val Gly Gln Leu Leu Ile Glu Leu Gln Val Arg Lys Ser Thr

610 615 620

Ala Asp Gly Thr Gly Ser Arg Asp Phe Tyr Thr Thr Leu Thr Glu Pro

625 630 635 640

Ile Ser Gly Trp Glu Gly Lys Ile Arg Asp Ile Val Leu Lys Lys Lys

645 650 655

Leu Pro Arg Lys Ile Phe Val Gln Pro Asn Thr Phe Val Val Asn Gly

660 665 670

Glu Val Gln Leu Lys Glu Tyr Pro Leu Thr Ala Ala Gly Val Ile Glu

675 680 685

Ser Phe Ile Glu Arg Arg Leu

690 695

Claims (10)

1.一种生产肝脏解毒酶的工程菌的构建，其特征在于：包括获取目的基因、获取表达载体、重组、转化感受态大肠杆菌DH5α、重组子鉴定、重组质粒线性化、抽提线性化质粒、制备毕赤酵母受体菌X-33感受态细胞、电转化；构建工程菌的宿主为巴斯德毕赤酵母菌X-33；导入的基因序列如附图1所示。

2.根据权利要求1所述的一种生产肝脏解毒酶的工程菌的构建，其特征在于：所述的转化感受态大肠杆菌DH5α：将重组子加入到感受态的大肠杆菌DH5α中，冰浴30min，再用42℃水浴热激90s，再冰浴2min，再加入LLB液体培养基，于37℃、200-250rpm条件下振荡培养45min；取上述培养后的液体培养基涂布于含有25µg/mL博来霉素的LLB平板培养基上，在37℃培养12-16h，得到转化后的大肠杆菌DH5α菌落。

3.根据权利要求1所述的一种生产肝脏解毒酶的工程菌的构建，其特征在于：所述重组质粒线性化：采用BamHⅠ单酶切进行质粒线性化。

4.根据权利要求1所述的一种生产肝脏解毒酶的工程菌的构建，其特征在于：所述的抽提线性化质粒：先用苯酚抽提一次，再用苯酚：氯仿质量比1：1的混合液抽提一次，再用苯酚抽提一次，每次抽提充分混匀后12000rpm离心5 min，保留上清；

抽提得到的线性化质粒浓度为500ng/µL。

5.根据权利要求1所述的一种生产肝脏解毒酶的工程菌的构建，其特征在于：

所述的制备毕赤酵母受体菌X-33感受态细胞：使感受态细胞浓度达到OD600为1。

6.根据权利要求1所述的一种生产肝脏解毒酶的工程菌的构建，其特征在于：

所述的电转化：

将线性化质粒加入酵母感受态细胞中，所述线性化质粒：酵母感受态细胞的体积比为1:8；混匀后，加入到预冷5 min的石英电转化杯中，控制在1.5kV、25µF、200Ω、0℃的条件下电击，转化后立即加入4℃预冷30min的D-山梨醇；将电转化杯放于30℃恒温箱中温育1-2h。

7.一种生产肝脏解毒酶的工程菌的应用，其特征在于：构建的工程菌经过诱导可表达肝脏解毒酶；诱导表达过程包括：将构建的工程菌接种于含100µg /mL 博来霉素的YPD液体培养基中，在30℃，250rpm培养过夜，得到YPD培养液。

8.根据权利要求7所述的一种生产肝脏解毒酶的工程菌的应用，其特征在于：所述的诱导表达过程还包括：将YPD培养液按1：50的体积比转接于BMGY培养基，在30℃，250rpm培养至培养液的OD600达到6.0，离心收集菌体。

9.根据权利要求7所述的一种生产肝脏解毒酶的工程菌的应用，其特征在于：所述的诱导表达过程还包括：将离心收集的菌体在BMMY液体培养基中，28℃、250rpm条件下培养，每24h补加0.5%的甲醇；10000rpm，10min离心收集上清，得到肝脏解毒酶溶液。

10.根据权利要求7所述的一种生产肝脏解毒酶的工程菌的应用，其特征在于：所述的应用：诱导表达72小时后，肝脏解毒酶的含量为410mg/L～600mg/L。