CN103555745A - 编码黄曲霉毒素降解酶的基因及获得高效黄曲霉毒素降解酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了编码黄曲霉毒素降解酶的基因及获得高效黄曲霉毒素降解酶的方法。编码黄曲霉毒素降解酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。获得高效黄曲霉毒素降解酶的方法包括如下步骤：将如SEQ ID NO.1所示的基因克隆至载体pCold-II中，再转化到大肠杆菌BL21-PG-Tf2中得到黄曲霉毒素降解酶的表达菌；将该表达菌用四环素及IPTG诱导表达，收集菌体，破碎后利用pCold-II上的融合蛋白表达标签纯化得到高效的黄曲霉毒素降解酶。本发明通过优化表达载体和表达条件，获得的黄曲霉毒素降解酶纯度达到95%以上，降解黄曲霉毒素B1的效率达到161.7nmol/min/mg.pr。

Description

编码黄曲霉毒素降解酶的基因及获得高效黄曲霉毒素降解酶的方法

 

技术领域

本发明涉及生物技术应用或农业、食品、饲料等领域，具体涉及编码黄曲霉毒素降解酶的基因及获得高效黄曲霉毒素降解酶的方法。

背景技术

黄曲霉毒素（aflatoxin, AFT）为黄曲霉和寄生曲霉等霉菌的代谢产物，被认为是自然界中发现的毒性最大、影响最广泛、理化性质最稳定的一类霉菌毒素，是农作物常见的霉菌毒素污染物，广泛污染饲料、粮油、动植物食品等，给农业生产带来巨大的损失，给食品安全带来极大的隐患，同时也严重威胁着公众的健康，被称为新的“万病之源”。近年来，由于全球异常气候逐年增加、原料全球贸易化、能源危机及原料短缺等原因使得AFT污染变得日益严重，AFT解毒去毒研究显得尤为迫切重要。

AFT是一群结构类似物，含有一个双呋喃环（bifuran）和一个氧杂萘邻酮（coumarin，又称香豆素）。现已确定的AFT有18种，其中B1、B2、G1、G2、M1、M2 具有强毒性，其结构如图1。在这六种强毒性黄曲霉毒素中AFB1是发生最为频繁、毒性最大、也是目前研究工作中最为关注的一种黄曲霉毒素。目前关于AFT解毒、去毒的传统方法主要有氨化法、NaOH法、氧化处理法、混合溶剂萃取法、吸附剂脱毒及高温法等，但这些方法由于对饲料、食品等原料的营养物质破坏严重、后处理成本很高、使用存在不同程度的局限性等成为现代饲料、食品中AFT降解或去毒所面临的非常重要的问题，而探索新的AFT降解或去毒方法是解决这一重要问题的有效途径之一。一般而言，有效的AFT降解和去除的方法应该满足以下几点要求：毒素应该被破坏或者被转化成无毒化合物；饲料或食品等原料应该保持它原有的营养水平和风味；原料的物理性状不应被明显改变，去毒加工应该经济可行。

研究发现，AFT可以通过生物酶降解作用得以去除，同时由于生物酶解毒具有对饲料、食品等原料无污染、有高度专一性、不影响原料的营养价值，而且能够避免毒素的重新产生等优点，受到人们越来越多的关注，降解黄曲霉毒素的生物酶的研究已经有了很大的进展。例如，Neal and Colley（Neal G. E. and Colley P.J. Some high-performance liquid chromatographic studies of the metabolism of aflatoxins by rat liver microsomal preparations. Biochem. J. 1978, 174, 839-851）、Yoshizawa（Yoshizawa H., Uchimaru R. and Ueno Y. Metabolism of aflatoxin B1 in the isolated in the rat liver. J.Biochem. 1981,89(2), 443-452）等研究发现用肝微粒体、核微粒体可以降解黄曲霉毒素；Lotliker（Lotlikar P. D., Raj H. G., Bohm L. S., HO L. L., Eun  C.J., Tsuji K. and Gopalan P. Mechanism of Inhibition of Aflatoxin B1 DNA binding in the liver by phenobarbital pretreatment of Rats. Cancer Res. 1989, 49, 951-957.）、Hayers（Hayes J. D., Judah D. J., Mc Lellan L. I., Kerr L. A. and Peacock S. D. Ethoxyquin induced resistance to Aflatoxin B1 in the rat is associated with the expression of a novel Alpha–class glutathione S-transferase submit YC2, which processes high catalytic activity for aflatoxin B1 8, 9 - epoxide. Biochem. J.  1991,279, 385-398.）、Ellis（Ellis W. O., Smith J. P., Simpson B. K. and Oldham J. H.Aflatoxins in food: occurance, biosynthesis, effects on organisms, detection and methods of control. Crit. Rev. Food Sci. Nutr.  1991, 3, 403-439.）等分别发现谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathoine-S-transferase, GST）、细胞色素P-450同功酶（Cytochrome P-450 isozymes）、乙醛还原酶（Aldehyde reductase, AFB1-AR）对黄曲霉毒素有一定的降解作用；2003年吴肖等发现花生粕酶可以降解黄曲霉毒素（吴肖，刘通讯，林勉. 花生粕酶水解液中黄曲霉毒素脱毒定性研究. 粮油食品科技. 2003, 11（1）, 32-33）；1995年liu等发现从真菌E20中获得的粗提液可以降解黄曲霉毒素，并且在1998年、2001年从Armillariella tabescens 中分离得到一种可以降解黄曲霉毒素的酶（ADTZ）（Liu D.L., Yao D.S. and Chen M. F. Study on detoxification of aflatoxin B1 by the crude extract of fungi E20. Academic Journal of Guangdong College of Pharmacy 1995, 11（2）, 92–94；Liu D.L., Yao D.S., Liang R., Ma L., Chen W.Q. and Gu L.Q.  Detoxification of aflatoxin B1 by enzymes isolated from Armillariella tabescens. Food and Chemical Toxicology 1998, 36, 363–574；Liu D.L., Yao D.S. and Liang R. Production, purification and characterization of an intracellar aflatoxin-detoxifizyme from Armil (E-20). Food and Chemical Toxicology 2001, 39, 461-466）；2003年Motomura 从Pleurotus ostreatus 中也分离到一种降解黄曲霉毒素的天然酶并对其进行了相关性质研究（Motomura M., Toyomasu T., Mizuno K. and Shinozawa T.  Purification and characterization of an aflatoxin degradation enzyme from Pleurotus ostreatus. Microbiol. Res. 2003, 158, 237-242）；2006年Alberts 发现Rhodococcus erythropolis 培养液可以降解黄曲霉毒素（Alberts J.F., Engelbrecht Y., Steyn P.S., Holzapfel W.H. and Van Zyl W.H. Biological degradation of aflatoxin B1 by Rhodococcus erythropolis cultures. International Journal of Food Microbiology. 2006, 109, 121-126）。虽然以上这些通过分离提取方式获得的天然酶具有一定的解毒作用，但是由于提取程序繁琐，酶产量低，ADTZ降解AFT的活性比较低，在高温和极端pH条件下稳定性差，易丧失酶活性，限制了实际应用。为了解决获得的天然酶活性低、稳定性差的问题。鉴于此，Liu研究组尝试对ADTZ酶进行了固定化研究，ADTZ酶的酸碱稳定性、热稳定性等有了一定提高，但酶活性没有得到提高（刘大岭，姚冬生，黄炳贺，谢春芳，梁郁强，马林. 黄曲霉毒素解毒酶的固定化及其性质的研究. 生物工程学报  2003, 19(5), 603-607）。为了解决获得的天然酶产量和活性低的问题，Liu研究组尝试在原核和真核表达系统中表达该解毒酶，但这些酶依然存在降解效率不高、稳定性较差、使用条件比较苛刻等问题，影响了ADTZ的进一步广泛应用（胡熔，刘大岭，谢春芳，姚冬生. 黄曲霉毒素解毒酶在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及其圆二色谱分析. 中国生物工程杂志. 2011, 31（4）, 71-76）。

因此如何获得高效的黄曲霉毒素降解酶（ADTZ），是我们应用生物酶有效、安全解除黄曲霉毒素对环境、食品、农业等危害的一个重要前提和首要问题。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种编码黄曲霉毒素降解酶的基因。

本发明的另一目的在于提供一种获得高效的黄曲霉毒素降解酶的生物合成方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种编码黄曲霉毒素降解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因序列是在NCBI搜索获得ADTZ序列（GeneBank No. AY941095.1）基础上优化得到，与原始序列相似度为78%。

一种获得高效的黄曲霉毒素降解酶的生物合成方法，包含如下步骤：

（1）将上述编码黄曲霉毒素降解酶的基因克隆至原核表达载体pCold-II中得到表达黄曲霉毒素降解酶的载体pCold-II-Opt-ADTZ。

（2）将pCold-II-Opt-ADTZ转化到大肠杆菌BL21-PG-Tf2中得到黄曲霉毒素降解酶的表达菌。

（3）将黄曲霉毒素降解酶的表达菌用四环素及IPTG诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎后利用pCold-II上的融合蛋白表达标签（组氨酸标签）纯化得到高效的黄曲霉毒素降解酶（Opt-ADTZ）。

步骤（1）中所述的载体pCold-II-Opt-ADTZ优选通过包含如下步骤的方法制备得到：编码黄曲霉毒素降解酶的基因通过合成获得，将其克隆至pUC19 克隆载体上，获得pUC19-Opt-ADTZ；再以pUC19-Opt-ADTZ为模板，用Opt-ADTZ上游引物和Opt-ADTZ下游引物扩增编码黄曲霉毒素降解酶的基因；通过上下游引物上的酶切位点Nde I和Hind III将其构建到pCold-II载体上，得到载体pCold-II-Opt-ADTZ；

其中，Opt-ADTZ上游引物为5’-CGCATATGCATGGCGACCACCACC-3’，Opt-ADTZ下游引物为5’-ATCGAACGTCGTCTGTGAAAGCTTGG-3’。

步骤（3）中所述的诱导的条件优选为：诱导前菌液OD600为0.4～0.8，四环素浓度50μg/mL，IPTG浓度0.5mM，诱导表达温度为22℃，诱导时间为7小时。

步骤（3）中所述的纯化的方法优选包括如下步骤：清洗并再生的HisTrap FF Ni-柱装到蛋白纯化仪（AKTA purifier 10）上，用柱平衡缓冲液进行柱平衡，流速为2.5mL/min；平衡完毕后，将收集的诱导表达后的菌体用柱平衡缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清以0.5mL/min的流速进行上样结合；上样完毕后，用80%（v/v）柱平衡缓冲液和20%（v/v）洗脱缓冲液配比成50mM咪唑将柱上的非特异性杂质洗去，直至UV280基线不再变化时，用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，流速2.5mL/min，用自动收样器收集目的蛋白；再用洗脱缓冲液洗脱，收集目的蛋白；将收集的目的蛋白放在蛋白浓缩管（Milli-Q）中，离心（2700rpm，4℃，10min）；加入脱盐缓冲液洗涤蛋白（每次加入1mL左右的脱盐溶液）三次，然后收集目的蛋白得到纯化的黄曲霉毒素降解酶Opt-ADTZ。其中，

柱平衡缓冲液组分为：50mM Tris-base，300mM NaCl，pH=8.0；

洗脱缓冲液组分为：50mM Tris-HCl，300mM 氯化钠，250mM咪唑，pH=8.0；

脱盐缓冲液组分为：50mM Tris-HCl，50mM 氯化钠，pH=8.0。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：通过优化基因序列、表达载体和表达条件，获得的黄曲霉毒素降解酶Opt-ADTZ纯度达到95%以上，降解黄曲霉毒素B1的效率是161.7nmol/min/mg.pr，酶比活力为 161.7U/mg，1L LB培养基可获得黄曲霉毒素降解酶的总活力是388.0U，而目前文献报道的1L LB培养基获得黄曲霉毒素降解酶ADTZ的总活力是在3～50U范围（1U酶单位定义为：1nmol AFB1在合适条件下1min内转化为产物所需的酶量）。

附图说明

图1是具有强毒性的6种黄曲霉毒素的化学结构图。

图2是PCR筛选pCold-II-Opt-ADTZ阳性单克隆琼脂糖凝胶电泳图；M为DL2000，2为水样阴性对照，4和6为阳性单克隆，13为pUC19-Opt-ADTZ阳性对照。

图3是优化条件下表达并纯化黄曲霉毒素降解酶Opt-ADTZ的SDS-PAGE图；1：Marker，2：未诱导菌液，3：诱导菌液，4：破碎细胞后离心得到的上清，5：流穿液（蛋白混合液经过结合柱没有结合部分），6：洗脱未结合蛋白，7：纯化后的黄曲霉毒素降解酶Opt-ADTZ。    

    图4是黄曲霉毒素AFB1标准曲线图，I（A.U）为荧光强度相对单位（arbitrary unit, au）。

图5是黄曲霉毒素降解酶作用3分钟扫描获得的荧光检测光谱图；其中，Opt-ADTZ：0.095mg/mL，反应体系中AFB1初始浓度为0.5μg/mL；I（CPS.）是荧光强度，即 CPS 是Counts Per Second，X射线强度I的计数率，即每秒进入探测器的有效X射线光子数目。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 优化的黄曲霉毒素降解酶基因（Opt-ADTZ）

在NCBI上搜索黄曲霉毒素降解酶基因（GeneBank No. AY941095.1），对其进行密码子优化得到优化的黄曲霉毒素降解酶基因（Opt-ADTZ），其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，优化的基因与原始基因的序列相似度为78%。将Opt-ADTZ进行合成后克隆到pUC19载体上得到pUC19-Opt-ADTZ。

实施例2 黄曲霉毒素降解酶表达载体pCold-II-Opt-ADTZ的构建

（1）质粒的提取

取2个装有20mL LB（胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、氨苄青霉素30mg/L）培养基的锥形瓶，将含有pUC19-Opt-ADTZ、pCold-II质粒的单菌落分别加入培养基中，在37℃、220rpm下过夜培养，按照SDS裂解法提取质粒。质粒提取完成后将其做好标记放入4℃冰箱等待下一步使用。

（2）PCR扩增Opt-ADTZ、Opt-ADTZ和pCold-II的双酶切

PCR扩增反应体系：质粒（pUC19-Opt-ADTZ）1μL、10×buffer 5μL、dNTPs 4μL、Opt-ADTZ上游引物1μL、Opt-ADTZ下游引物1μL、Taq DNA聚合酶1μL、加ddH₂O至50μL。

Opt-ADTZ上游引物为5’-CGCATATGCATGGCGACCACCACC-3’， 

Opt-ADTZ下游引物为5’-ATCGAACGTCGTCTGTGAAAGCTTGG-3’，

下划线分别是酶切位点Nde I和Hind III。 

PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，25个循环；最后延伸72℃ 5min。

将PCR产物Opt-ADTZ通过琼脂糖凝胶电泳检测正确后，进行胶回收并用Nde I和Hind III进行双酶切。pCold-II载体（该载体的融合蛋白表达标签为六个组氨酸His）也用Nde I和Hind III进行双酶切。酶切产物进行胶回收用于连接。

（3）连接及转化

在EP管中分别加入酶切后的载体pCold-II 2μL、10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL、T4 DNA连接酶1μL、H₂O 5μL、酶切后的目的基因Opt-ADTZ 1μL混匀，载体和目的基因的量可变化，将EP管放入16℃的恒温水浴箱中，水浴16h。这一步可将载体与目的基因连在一起。

将制得的感受态DH5α从冰箱中拿出放于冰上冻融，加入10μL连接产物，将EP管重置于冰中30min，然后放入到42℃的水浴中，放置90s，再放入冰中，静置5min。每管加入600 μL LB培养基，在摇床中37℃、180rpm培养60～90min；然后4000rpm离心，取600μL上清，将沉淀轻轻混匀，涂在含氨苄青霉素30mg/L的LB平板上，在37℃恒温箱中培养13～16h。

（4）单克隆检测

将上步平板上长出的单菌落，活化于含氨苄青霉素30mg/L20mL LB培养基的烧瓶中37℃、220rpm培养16h。取菌液3μL进行PCR验证（图2），分别取质粒（pUC19-Opt-ADTZ）3μL和水3μL进行PCR做阳性和阴性对照，将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，若菌液扩增出的条带与质粒pUC19-Opt-ADTZ扩增出的条带分子量相同，则初步证明连接成功。

将正确条带所对应的菌液重新活化，保菌送去测序，测序序列结果显示载入的Opt-ADTZ片段长度为2104bp，与Opt-ADTZ比对，比对一致表明载体pCold-II-Opt-ADTZ构建成功。

实施例3 黄曲霉毒素降解酶的表达纯化

（1）诱导条件的优化

对诱导前菌液浓度、诱导剂四环素及IPTG浓度、诱导表达温度、诱导时间进行了优化

提取大肠杆菌DH5α中的pCold-II-Opt-ADTZ质粒，将提取的质粒转入BL21-PG-Tf2感受态中。将含有目的基因的表达菌活化于含氨苄青霉素30mg/L的20mL LB培养基的烧瓶中37℃、220rpm培养16h，取活化后的菌液按2.5%的接种量接种于500mL LB培养基中，选择不同的诱导条件进行诱导表达。诱导表达后收集菌体，通过SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况，以确定最优的诱导条件。最后确定最优的诱导条件为：诱导前菌液OD600为0.4～0.8，四环素浓度50μg/mL，IPTG浓度0.5mM，诱导表达温度为22℃，诱导时间为7小时。

（2）诱导菌株的准备

将含有目的基因的表达菌活化于含氨苄青霉素30mg/L的20mL LB培养基的烧瓶中37℃、220rpm培养16h，取活化后的菌液按2.5%的接种量接种于500mL LB培养基中，培养到OD600 0.4～0.8的时候，加入四环素浓度50μg/mL，半小时后加入IPTG至终浓度0.5mM，22℃、220rpm诱导7小时，用高速冷冻离心机（J-26XP，Beckman）12000rpm、4℃离心收集诱导后的菌。

（3）HisTrap FF Ni-柱的再生

首先用二次蒸馏水洗5个柱体积，后用0.5M的NaOH溶液洗涤3个柱体积，注满NaOH浸泡30min，再用0.5M的NaOH溶液洗涤1～2个柱体积，再用二次蒸馏水洗涤10个柱体积，直至柱子里不再有NaOH溶液，然后用柱平衡缓冲液 （50mM Tris-base，300mM NaCl，pH 8.0）洗涤5个柱体积，平衡纯化柱。

（4）蛋白纯化

纯化蛋白所用缓冲液：                                                                                             

柱平衡缓冲液组分为：50mM Tris-base，300mM NaCl，pH = 8.0；

洗脱缓冲液组分为：50 mM Tris-HCl，300 mM 氯化钠，250mM 咪唑，pH = 8.0；

脱盐缓冲液组分为：50 mM Tris-HCl，50 mM 氯化钠，pH = 8.0。

将诱导后的细菌沉淀放在冰上冻融，用30mL柱平衡缓冲液悬浮细菌，超声破碎（运行3秒，停3秒，180个循环）至溶液变为半透明状态为止，然后用高速冷冻离心机（J-26XP，Beckman）12000rpm 4℃离心40min，取上清用0.45μm的滤膜过滤。

将清洗并再生的HisTrap FF Ni-柱装到蛋白纯化仪（AKTA purifier 10）上，用柱平衡缓冲液进行柱平衡，流速为2.5mL/min。平衡完毕后，将收集的诱导表达后的菌体用柱平衡缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清以0.5mL/min的流速进行上样结合。上样完毕后，用80%（v/v）柱平衡缓冲液和20%（v/v）洗脱缓冲液配比成50mM咪唑将柱上的非特异性杂质洗去，直至UV280基线不再变化时，用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，流速2.5mL/min，用自动收样器收集目的蛋白。将收集的目的蛋白放在蛋白浓缩管（Milli-Q）中，离心（2700rpm，4℃，10min）；加入脱盐缓冲液洗涤蛋白（每次加入1mL左右的脱盐溶液）三次，然后收集目的蛋白得到纯化的黄曲霉毒素降解酶Opt-ADTZ。

获得纯化的Opt-ADTZ蛋白的SDS-PAGE结果如图3所示，目的蛋白Opt-ADTZ纯度在95%以上，通过与蛋白Marker的对照可以看出，蛋白的单体分子量为77KDa左右，与根据优化的黄曲霉毒素降解酶核酸系列推导的氨基酸序列计算得到的基本符合。1L LB培养基可获得黄曲霉毒素降解酶 2.4mg。

实施例3 黄曲霉毒素降解酶的活性检测

（1）黄曲霉毒素标准曲线的建立

将黄曲霉毒素AFB1加入反应缓冲液中，配制一系列的浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1μg/mL），然后在多功能微孔板检测系统 SpectraMax M5上测定荧光值，其中激发波长是365nm，发射波长是435nm，黄曲霉毒素AFB1标准曲线见图4。 

反应缓冲液组分是：0.2 M Na₂HPO₄-0.1 M 柠檬酸，pH为6.0。

（2）酶活性的测试

首先将黄曲霉毒素AFB1按一定浓度加入反应缓冲液中，测定荧光值，然后加入一定体积的酶液，反应一定时间后测定荧光值，根据反应前后荧光值的减少及所用的时间来计算确定酶的催化效率。结果如图5所示，扫描获得的荧光检测光谱图，其中，Opt-ADTZ：0.095mg/mL；反应体系中初始AFB1浓度为0.5μg/mL。

上述结果表明：本发明制备得到的黄曲霉毒素降解酶降解黄曲霉毒素B1的效率是161.7 nmol/min/mg.pr，酶比活力为 161.7U/mg，1L LB培养基可获得黄曲霉毒素降解酶2.4mg，总活力是388.0 U。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华中师范大学

 

<120>  编码黄曲霉毒素降解酶的基因及获得高效黄曲霉毒素降解酶的方法

 

<130>  1

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  2104

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  优化的黄曲霉毒素降解酶基因序列

 

<400>  1

cgggatccat ggcgaccacc accgttcacc gtgaacgttt cctggcggac aaatctgcgc       60

 

cgctgtgcgg tatggacatc cgtaaatctt tcgaccagct gtcttctaaa gaaaaactgt      120

 

acacccacta cgttaccgaa gcgtcttggg cgggtgcgcg tatcatccag gcgcagtgga      180

 

ccccgcaggc gaccgacctg tacgacctgc tgatcctgac cttctctgtt aacggtaaac      240

 

tggcggacct gaacgcgctg aaaacctctt ctggtctgtc tgaagacgac tgggaagcgc      300

 

tgatccagta caccgttcag gttctgtcta acctggttaa ctacaaaacc ttcggtttca      360

 

ccaaaatcat cccgcgtgtt gacgcggaaa aattcgaatc tgttgttaaa gcgtcttcta      420

 

acgcggacca gggttctgcg ctgttcacca aactgaaaca gcacatctac gcgctgtctc      480

 

cggaatctgc gctgttcatc ggtaaacgta aagacggtca cgtttctaac tactacctgg      540

 

gtgaaccggt tggtgacgcg gaagttgacg cgatccagaa cgttgcggaa aaactgggtg      600

 

ttgacatcct gaacacccgt gttaaaaaaa acggtgcggg tgactacacc ctgctggttg      660

 

cgtctgcgaa aacctctccg ccgtctgttc acgacttcca gatcgactct accccggcga      720

 

aactgaccat cgaatacggt gactacgcgt cttctctgac caaagttgtt gcggcgctgc      780

 

aggaagcgaa acagtacacc gcgaacgacc accagtctgc gatgatcgaa ggttacgtta      840

 

aatctttcaa ctctggttct atcccggaac acaaagcggc gtctaccgaa tgggttaaag      900

 

acatcggtcc ggttgttgaa tcttacatcg gtttcgttga aacctacgtt gacccgtacg      960

 

gtggtcgtgc ggaatgggaa ggtttcaccg cgatcgttga caaacagctg tctgcgaaat     1020

 

acgaagcgct ggttaacggt gcgccgaaac tgatcaaatc tctgccgtgg ggtaccgact     1080

 

tcgaagttga cgttttccgt aaaccggact tcaccgcgct ggaagttgtt tctttcgcga     1140

 

ccggtggtat cccggcgggt atcaacatcc cgaactacta cgaagttcgt gaatctaccg     1200

 

gtttcaaaaa cgtttctctg gcgaacatcc tggcggcgaa agttccgaac gaagaactga     1260

 

ccttcatcca cccggacgac gttgaactgt acaacgcgtg ggactctcgt gcgttcgaac     1320

 

tgcaggttgc gaaccacgaa ctgctgggtc acggttctgg taaactgttc caggaaggtg     1380

 

cggacggtaa actgaacttc gacccggaaa aagttatcaa cccgctgacc ggtaaaccga     1440

 

tcacctcttg gtacaaaccg ggtcagaccc cggactctgt tctgggtgaa gtttcttctt     1500

 

ctatggaaga atgccgtgcg gaaaccgttg cgctgtacct ggtttctaac ctggacatcc     1560

 

tgaaaatctt caactacgtt gacaaacagg acatcgaaga catccagtac atcaccttcc     1620

 

tgctgatggc gcgtgcgggt ctgcgtgcgc tggaattcta cgacccggcg accaaaaaac     1680

 

acggtcaggc gcacatgcag gcgcgtatgg gtatcaccca gtacctgatc caggcgggta     1740

 

tcgcgcgtct ggaactgatc caggacgcga acggtgaact ggaaaacctg tacgttcgtg     1800

 

ttgaccgtga aaaagttctg tctaaaggta aagaagttgt tggtcagctg ctgatcgaac     1860

 

tgcaggttcg taaatctacc gcggacggta ccggttctcg tgacttctac accaccctga     1920

 

ccgaaccgat ctctggttgg gaaggtaaaa tccgtgacat cgttctgaaa aaaaaactgc     1980

 

cgcgtaaaat cttcgttcag ccgaacacct tcgttgttaa cggtgaagtt cagctgaaag     2040

 

aatacccgct gaccgcggcg ggtgttatcg aatctttcat cgaacgtcgt ctgtgaaagc     2100

 

ttgg                                                                  2104

 

 

<210>  2

<211>  24

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  Opt-ADTZ上游引物

 

<400>  2

cgcatatgca tggcgaccac cacc                                              24

 

 

<210>  3

<211>  26

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  Opt-ADTZ下游引物

 

<400>  3

atcgaacgtc gtctgtgaaa gcttgg                                            26

 

Claims (5)

1.一种编码黄曲霉毒素降解酶的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种获得高效的黄曲霉毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）将权利要求1所述的基因克隆至原核表达载体pCold-II中得到表达黄曲霉毒素降解酶的载体pCold-II-Opt-ADTZ；

（2）将pCold-II-Opt-ADTZ转化到大肠杆菌BL21-PG-Tf2中得到黄曲霉毒素降解酶的表达菌；

（3）将黄曲霉毒素降解酶的表达菌用四环素及IPTG诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎后利用pCold-II上的融合蛋白表达标签纯化得到高效的黄曲霉毒素降解酶。

3.根据权利要求2所述的获得高效的黄曲霉毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于：步骤（1）中所述的载体pCold-II-Opt-ADTZ通过包含如下步骤的方法制备得到：权利要求1所述的基因通过合成获得，将其克隆至pUC19 克隆载体上，获得pUC19-Opt-ADTZ；再以pUC19-Opt-ADTZ为模板，用Opt-ADTZ上游引物和Opt-ADTZ下游引物扩增编码黄曲霉毒素降解酶的基因；通过上下游引物上的酶切位点Nde I和Hind III将其构建到pCold-II载体上，得到载体pCold-II-Opt-ADTZ；其中，Opt-ADTZ上游引物为5’-CGCATATGCATGGCGACCAC

CACC-3’，Opt-ADTZ下游引物为5’-ATCGAACGTCGTCTGTGAAAGCTTGG-3’。

4.根据权利要求2所述的获得高效的黄曲霉毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于：步骤（3）中所述的诱导的条件为：诱导前菌液OD600为0.4～0.8，四环素浓度50μg/mL，IPTG浓度0.5mM，诱导表达温度为22℃，诱导时间为7小时。

5.根据权利要求2所述的获得高效的黄曲霉毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于：步骤（3）中所述的纯化的方法包括如下步骤：清洗并再生的HisTrap FF Ni-柱装到蛋白纯化仪上，用柱平衡缓冲液进行柱平衡，流速为2.5mL/min；平衡完毕后，将收集的诱导表达后的菌体用柱平衡缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清以0.5mL/min的流速进行上样结合；上样完毕后，用80%柱平衡缓冲液和20%洗脱缓冲液配比成50mM咪唑将柱上的非特异性杂质洗去，直至UV280基线不再变化时，用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，流速2.5mL/min，用自动收样器收集目的蛋白；再用洗脱缓冲液洗脱，收集目的蛋白；将收集的目的蛋白放在蛋白浓缩管中，离心；加入脱盐缓冲液洗涤蛋白三次，然后收集目的蛋白得到纯化的黄曲霉毒素降解酶；其中，柱平衡缓冲液组分为：50mM Tris-base，300mM NaCl，pH = 8.0；洗脱缓冲液组分为：50mM Tris-HCl，300mM 氯化钠，250mM咪唑，pH=8.0；脱盐缓冲液组分为：50mM Tris-HCl，50mM 氯化钠，pH=8.0。

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