CN107574219B - 一种利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水处理技术领域，具体涉及一种利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，复配菌剂为海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2，两种菌株均从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离纯化而得，将两种菌株分别扩大培养后复配发酵，两种菌株在发酵培养过程中相互协同强化，菌株活力强，产生的胞外多糖产量高，将发酵后的发酵菌液透析去除部分培养基成份后经离心、两次乙醇沉降分离出胞外多糖，然后经琼脂、淀粉固化制成重金属高效吸附剂，吸附效果好，吸附效率高，性能稳定，可以直接添加到饮用水中安全无害。
Description
技术领域
本发明涉及水处理技术领域，具体涉及一种利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法。
背景技术
人们在生产生活中使用的水大多为自来水，主要是通过自来水厂将从地下水或河水等水源抽取的水进行处理获得。由于部分水源受到工业或生活污水排放影响而导致重金属含量超标，虽然在供人畜饮用前经过自来水厂的处理，但是部分重金属的含量依然处于较高的指标，部分甚至超标；另外城市自来水输水管路老旧也会导致重金属如铅等渗入水体中造成重金属含量超标；市场上虽然出售具有重金属脱除功能的净水器，净水器主要靠内部的滤芯对金属离子进行吸附脱除，长期使用后滤芯的吸附能力达到饱和，脱除重金属离子的能力下降，而部分重金属离子还有可能从滤芯上脱附重新进入水体被人引饮用，带来健康风险，而普通市民缺少净水器的维护保养知识和意识，不能对滤芯进行及时科学的更换。除以上原因外不排除其它潜在原因都会导致饮用水存在饮用健康隐患，因此需要对饮用水进行饮用前的重金属终端脱除。
生物吸附法是新兴的水处理方法，具有成本低、可处理低浓度重金属水体、适用的pH值与温度范围宽等优点。生物吸附法包括微生物体吸附法，微生物体吸附主要是利用细胞壁表面具有的络合、配位基团与金属离子形成离子键达到吸附目的，但是微生物体在水中生存条件要求较为严苛限制了微生物体吸附的应用。而微生物体分泌物主要是微生物体分泌的细菌胞外多糖、荚膜多糖等。胞外多糖具有较大的比表面积、丰富的表面羧基、氨基等和强负电性，对重金属具有较强的吸附能力。目前的多数研究肯定了胞外多糖在微生物体吸附过程中的吸附作用，但是专门将胞外多糖分离进行吸附重金属的研究还较少，尤其是用于饮用水饮用前的重金属处理，而且从部分微生物体上分离胞外多糖制备的吸附剂的吸附效率低，吸附剂性能不稳定。
发明内容
针对现阶段微生物分泌胞外多糖制备的重金属吸附剂的吸附效率低的问题，本发明的目的在于提供一种利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，复配菌剂为海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2，两种菌株均从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离纯化而得，两种菌株复配使用在发酵培养过程中相互协同强化，产生的胞外多糖产量高、吸附效果好，所得吸附剂的吸附效率高，性能稳定。
本发明提供如下的技术方案：
本发明的复配菌剂包括海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2，其中：海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年8月9日；保藏编号CGMCC No.：14510，建议的分类命名为大安盐单胞菌，拉丁文学名为Halomonas taeanensis；海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年8月9日；保藏编号CGMCC No.：14509，建议的分类命名为海水嗜冷杆菌，拉丁文学名为Psychrobacter aquimaris。
海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobactersp.GHF2均从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离纯化而得，经实验发现，这两种海洋菌株的分泌物，主要是胞外多糖具有吸附重金属的能力，两种菌株复配发酵培养有协同效果，胞外多糖产量高。
上述海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11的16S rDNA全序列(1281bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702265，全序列如下：
上述海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的16S rDNA全序列(1280bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702255，全序列如下：
一种利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，包括以下步骤：
(1)将海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobactersp.GHF2的菌种分别接种到固体培养基上培养，加入无菌水制成GHF11菌种液与GHF2菌种液；
(2)两种菌种液混合得到混合菌液，然后接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；
(3)将发酵菌液透析去除部分培养基成份后离心得上清液，再加入乙醇静置沉降、离心分离得粗提产物；
(4)将粗提产物溶于水中得到粗产品溶液，加入乙醇静置沉降，然后离心分离沉降物并干燥得到精提产物；
(5)将精提产物溶于琼脂与淀粉的混合水溶液中，再冷却凝固制成重金属高效吸附剂。
首先将两种菌株分别扩大培养制成菌种液，然后将两种菌种液混合复配培养，使两种菌株协同强化发酵过程，菌株活力强，胞外多糖的产量高，将发酵菌液离心分离得到含胞外多糖的上清液，然后经两次乙醇沉降得到胞外多糖的精提产物，将得到的胞外多糖精提产物与琼脂、淀粉混合制成重金属吸附剂，可直接添加到饮用水中，吸附高效，安全无害。
作为本发明方法的一种改进，所述的液体培养基经以下过程制成：
a.将贝类海鲜产品用水清洗干净，按质量比贝类海鲜产品:水＝1:2～4加水在120～122℃高压蒸煮100～120分钟得到蒸煮肉汤；
b.蒸煮肉汤降温至50～60℃，加入枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶酶解8～12小时，两种蛋白酶添加后的质量浓度为4‰～8‰，然后经400～500目筛网过滤得到酶解液；
c.在95～100℃下持续加热酶解液使体积浓缩30％～50％得到浓缩液；
d.向100mL浓缩液中加入磷酸氢二钾0.8～1.4g、葡萄糖25～45g溶解均匀，然后加入陈化海水定容到1L，经高压灭菌制成液体培养基；
固体培养基为向1L液体培养基中加入15～20g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
由上述方法制成的液体培养基可满足海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2与海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11发酵培养所需的营养成分，促进两种菌株的协同发酵，提高胞外多糖的产量。
作为本发明方法的一种改进，贝类海鲜产品为蛤仔、蛏子、蚬子、海虹、扇贝与贻贝中的一种或几种。所选用的贝类海鲜产品可以提供两种菌株适宜的营养成分。
作为本发明方法的一种改进，步骤(1)中海洋盐单胞菌菌株的培养温度为25～30℃，海洋冷杆菌菌株的培养温度为18～23℃，培养时间为36～48小时，无菌水与固体培养基的体积比为1.0～1.5:1。合适的培养温度促进菌种的扩大培养的效果，并满足菌种液的浓度要求。
作为本发明方法的一种改进，步骤(2)中GHF11菌种液与GHF2菌种液体积比为0.5～2:1，混合菌液接种浓度为1.5～2.5mL混合菌液/100mL液体培养基，培养温度23～27℃、时间3～5天，摇床转速100～160r/min。菌种在液体培养基中充分振荡发酵培养，促进胞外多糖的分泌，胞外多糖的产率高。
作为本发明方法的一种改进，步骤(3)中发酵菌液透析去除部分培养基成份的过程如下：将发酵菌液置于旋转蒸发仪上，在60～65℃下减压浓缩至原体积的10％～15％，然后装入截留分子量为8000道尔顿的透析袋中用去离子水透析，至透析袋外侧的去离子水无色无味。经透析袋充分透析后大部分的培养基成份从发酵菌液中分离，提高胞外多糖的清洁程度。
作为本发明方法的一种改进，步骤(3)中乙醇与上清液的体积比2～4:1，1～5℃静置10～15小时，离心速率6000～8000r/min。通过加入乙醇沉降得到胞外多糖的粗产品，粗产品中还含有蛋白质等成份。
作为本发明方法的一种改进，步骤(4)中的乙醇与粗产品溶液体积比2～4:1，在1～5℃静置6～9小时，离心速率6000～8000r/min，干燥温度为90～105℃、时间为1～2小时。经乙醇进一步沉降纯化提高胞外多糖的纯度，提高重金属吸附剂的吸附效果。
作为本发明方法的一种改进，步骤(5)中向琼脂与淀粉的混合物中加入水并加热溶解，琼脂的质量百分浓度为2％～5％，琼脂与淀粉的重量比为1.2～2:1，然后加入精提产物溶解均匀，将混合液降温凝固，在60～80℃干燥90～120分钟得到重金属吸附剂，琼脂与精提产物的重量比为1:1.5～2.5。将胞外多糖经琼脂、淀粉固定成块制成的重金属吸附剂的性能稳定，能吸附多种重金属，吸附率高，可直接添加到水体使用，安全无害。
本发明的有益效果如下：
本发明筛选的海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2与海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11复配发酵，可协同强化发酵过程，菌种活力强，胞外多糖的产量高，通过乙醇两次沉降纯化得到胞外多糖的精提产物，然后经琼脂、淀粉固化制成重金属吸附剂，吸附效率高，性能稳定，而且安全无害。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
陈化海水为取新鲜海水在23℃静置沉降7天后所得的海水的上层清液。
本发明的复配菌剂包括海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2。
海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年8月9日，保藏编号CGMCC No.：14510，建议的分类命名为大安盐单胞菌，拉丁文学名为Halomonastaeanensis。
海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年8月9日，保藏编号CGMCC No.：14509，建议的分类命名为海水嗜冷杆菌，拉丁文学名为Psychrobacter aquimaris。
实施例1
一种利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，包括以下步骤：
(1)将海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobactersp.GHF2的菌种分别接种到固体培养基上培养36小时，海洋盐单胞菌菌株的培养温度为25℃，海洋冷杆菌菌株的培养温度为18℃，然后分别加入无菌水制成GHF11菌种液与GHF2菌种液，无菌水与固体培养基的体积比为1:1；
(2)将GHF11菌种液与GHF2菌种液按体积比为0.5:1混合得到混合均匀，然后接种到液体培养基中，混合菌液接种浓度为1.5mL混合菌液/100mL液体培养基，在23℃发酵培养3天，摇床转速100r/min，制成发酵菌液；
(3)将发酵菌液透析去除部分培养基成份后离心得上清液，具体过程为：将发酵菌液置于旋转蒸发仪上，在60℃下减压浓缩至原体积的10％，然后装入截留分子量为8000道尔顿的透析袋中加用去离子水透析，至透析袋外侧的去离子水无色无味，再将透析袋中的液体离心处理得到上清液；然后加入2倍上清液体积的乙醇，在1℃静置沉降10小时，以6000r/min离心分离得粗提产物；
(4)将粗提产物溶于水中得到粗产品溶液，然后加入2倍粗产品溶液体积的乙醇，在1℃静置沉降6小时，然后6000r/min离心分离沉降物，在90℃干燥2小时得到精提产物；
(5)向琼脂与淀粉的混合物中加入水并加热溶解，琼脂的质量百分浓度为2％，琼脂与淀粉的重量比为1.2:1，然后加入精提产物溶解均匀，将混合液降温至25℃凝固，在60℃干燥120分钟得到重金属吸附剂，琼脂与精提产物的重量比为1:1.5。
其中，液体培养基经以下过程制成：
a.将贝类海鲜产品用水清洗干净，按质量比贝类海鲜产品:水＝1:2加水在120℃高压蒸煮120分钟得到蒸煮肉汤；
b.蒸煮肉汤降温至50℃，加入枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶酶解8小时，两种蛋白酶添加后的质量浓度均为4‰，然后经400目筛网过滤得到酶解液；
c.在95℃下持续加热酶解液使体积浓缩30％得到浓缩液；
d.向100mL浓缩液中加入磷酸氢二钾0.8g、葡萄糖25g溶解均匀，然后加入陈化海水定容到1L，经高压灭菌制成液体培养基。
固体培养基为向1L液体培养基中加入15g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
实施例2
一种利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，包括以下步骤：
(1)将海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobactersp.GHF2的菌种分别接种到固体培养基上培养42小时，海洋盐单胞菌菌株的培养温度为28℃，海洋冷杆菌菌株的培养温度为20℃，然后分别加入无菌水制成GHF11菌种液与GHF2菌种液，无菌水与固体培养基的体积比为1.25:1；
(2)将GHF11菌种液与GHF2菌种液按体积比为1:1混合得到混合均匀，然后接种到液体培养基中，混合菌液接种浓度为2mL混合菌液/100mL液体培养基，在25℃发酵培养4天，摇床转速130r/min，制成发酵菌液；
(3)将发酵菌液透析去除部分培养基成份后离心得上清液，具体过程为：将发酵菌液置于旋转蒸发仪上，在62℃下减压浓缩至原体积的12％，然后装入截留分子量为8000道尔顿的透析袋中用去离子水水透析，至透析袋外侧的去离子水无色无味，再将透析袋中的液体离心处理得到上清液；然后加入3倍上清液体积的乙醇，在4℃静置沉降12小时，以7000r/min离心分离得粗提产物；
(4)将粗提产物溶于水中得到粗产品溶液，然后加入3倍粗产品溶液体积的乙醇，在4℃静置沉降7小时，然后7000r/min离心分离沉降物，在100℃干燥1.5小时得到精提产物；
(5)向琼脂与淀粉的混合物中加入水并加热溶解，琼脂的质量百分浓度为3％，琼脂与淀粉的重量比为1.6:1，然后加入精提产物溶解均匀，将混合液降温至23℃凝固，在70℃干燥100分钟得到重金属吸附剂，琼脂与精提产物的重量比为1:2。
其中，液体培养基经以下过程制成：
a.将贝类海鲜产品用水清洗干净，按质量比贝类海鲜产品:水＝1:3加水在121℃高压蒸煮110分钟得到蒸煮肉汤；
b.蒸煮肉汤降温至55℃，加入枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶酶解10小时，两种蛋白酶添加后的质量浓度均为6‰，然后经450目筛网过滤得到酶解液；
c.在98℃下持续加热酶解液使体积浓缩40％得到浓缩液；
d.向100mL浓缩液中加入磷酸氢二钾1.1g、葡萄糖35g溶解均匀，然后加入陈化海水定容到1L，经高压灭菌制成液体培养基。
固体培养基为向1L液体培养基中加入17g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
实施例3
一种利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，包括以下步骤：
(1)将海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobactersp.GHF2的菌种分别接种到固体培养基上培养48小时，海洋盐单胞菌菌株的培养温度为30℃，海洋冷杆菌菌株的培养温度为23℃，然后加入无菌水制成GHF11菌种液与GHF2菌种液，无菌水与固体培养基的体积比为1.5:1；
(2)将GHF11菌种液与GHF2菌种液按体积比为2:1混合得到混合均匀，然后接种到液体培养基中，混合菌液接种浓度为2.5mL混合菌液/100mL液体培养基，在27℃发酵培养5天，摇床转速160r/min，制成发酵菌液；
(3)将发酵菌液透析去除部分培养基成份后离心得上清液，具体过程为：将发酵菌液置于旋转蒸发仪上，在65℃下减压浓缩至原体积的15％，然后装入截留分子量为8000道尔顿的透析袋中用去离子水水透析，至透析袋外侧的去离子水无色无味，再将透析袋中的液体离心处理得到上清液；然后加入4倍上清液体积的乙醇，在5℃静置沉降15小时，以8000r/min离心分离得粗提产物；
(4)将粗提产物溶于水中得到粗产品溶液，然后加入4倍粗产品溶液体积的乙醇，在5℃静置沉降9小时，然后8000r/min离心分离沉降物，在105℃干燥1小时得到精提产物；
(5)向琼脂与淀粉的混合物中加入水并加热溶解，琼脂的质量百分浓度为5％，琼脂与淀粉的重量比为2:1，然后加入精提产物溶解均匀，将混合液降温至18℃凝固，在80℃干燥90～120分钟得到重金属吸附剂，琼脂与精提产物的重量比为1:2.5。
其中，液体培养基经以下过程制成：
a.将贝类海鲜产品用水清洗干净，按质量比贝类海鲜产品:水＝1:4加水在122℃高压蒸煮100分钟得到蒸煮肉汤；
b.蒸煮肉汤降温至60℃，加入枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶酶解12小时，两种蛋白酶添加后的质量浓度为8‰，然后经500目筛网过滤得到酶解液；
c.在100℃下持续加热酶解液使体积浓缩50％得到浓缩液；
d.向100mL浓缩液中加入磷酸氢二钾1.4g、葡萄糖45g溶解均匀，然后加入陈化海水定容到1L，经高压灭菌制成液体培养基。
固体培养基为向1L液体培养基中加入20g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
需要说明的是，采用蛏子、蚬子、海虹、扇贝与贻贝中的一种或者蛏子、蚬子、海虹、扇贝与贻贝中的任意两种或多种的组合代替蛤仔制备的液体培养基可提供相近的营养效果。
重金属高效吸附剂除去饮用水中重金属的应用方法
取10g重金属高效吸附剂加入茶杯中，冲入300～500mL的热开水，温度为95～100℃，浸泡5～10分钟后将水杯摇晃5～10次即可饮用。水中的重金属被吸附剂吸附，饮用水的安全系数提高，而吸附剂被茶杯的滤网隔离，且由于热开水短时间内即发生降温，琼脂在热开水中无法溶解，因此吸附剂不会进入体内，安全无害，使用后可直接丢弃自然降解，使用方便。
实验测试
1.发酵菌液中胞外多糖的含量测定
取100mL的步骤(2)中的发酵菌液测定其中胞外多糖的质量含量，测定方法参考期刊“光谱实验室”2006年5月第23卷第3期中“雷蘑深层发酵胞外多糖含量测定方法的确定”，测定结果如表1所示。
表1发酵菌液中胞外多糖的质量含量
| 项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 胞外多糖含量/‰ | 4.8 | 5.4 | 5.3 |
2.重金属高效吸附剂的吸附性能
测试液配制：用蒸馏水配制锰液(Mn2+)、铬液(Cr6+)、镉液(Cd2+)、铜液(Cu2+)、铅液(Pb2+)五种测试液，浓度依次为：0.5mg/L、0.25mg/L、0.025mg/L、2mg/L、0.05mg/L；吸附重金属离子：每种测试液取3份成为1组，每份50mL，取实施例1、实施例2、实施例3中的重金属高效吸附剂各10g加入每组的3份测试液内，1份测试液只加入1个实施例所得的重金属高效吸附剂，摇晃10分钟后通过原子火焰吸收法测量各测试液中所含金属离子的浓度，从而计算吸附率，吸附率为金属离子的浓度的前后差值与吸附前的浓度值的百分比，结果见表2。
表2吸附率
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法
<130> JWE173056
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1281
<212> DNA
<213> 大安盐单胞菌的16S rDNA基因全序列(Halomonas taeanensis 16S ribosomalDNA gene)
<400> 1
cataggaatc tgcccggtag tgggggataa cgtggggaaa ctcacgctaa taccgcatac 60
gccccaaggg ggaaagcagg ggatcttcgg accttgcgct atcggatgag cctatgtcgg 120
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atgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 240
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gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 840
gatgcaacgc gaagaacctt acctactctt gacatcgtgc gaactttcca gagatggatt 900
ggtgccttcg ggagcgcaca gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa 960
tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccctatcctt atttgccagc gagtaatgtc 1020
gggaactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca 1080
tcatggccct tacgagtagg gctacacacg tgctacaatg gcaggtacaa agggtcgcaa 1140
gacggcgacg tggagctaat cccagaaagc ctgcctcagt ccggatcgga gtctgcaact 1200
cgactccgtg aagtcggaat cgctagtaat cgtgaatcag aatgtcacgg tgaatacgtt 1260
cccgggcctt gtacacaccg c 1281
<210> 2
<211> 1280
<212> DNA
<213> 海水冷杆菌的16S rDNA基因全序列(Psychrobacter aquimaris 16S ribosomalDNA gene)
<400> 2
acttaggaat ctacctagta gtgggggata gcacggggaa actcgtatta ataccgcata 60
cgacctacgg gagaaagggg gcagtttact gctctcgcta ttagatgagc ctaagtcgga 120
ttagctagat ggtggggtaa aggcctacca tggcgacgat ctgtagctgg tctgagagga 180
tgatcagcca caccgggact gagacacggc ccggactcct acgggaggca gcagtgggga 240
atattggaca atgggggaaa ccctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggcctttt 300
ggttgtaaag cactttaagc agtgaagaag actccgtggt taatacccac ggacgatgac 360
attagctgca gaataagcac cggctaactc tgtgccagca gccgcggtaa tacagagggt 420
gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgagcgta ggtggcttga taagtcagat 480
gtgaaatccc cgggcttaac ctgggaactg catctgaaac tgttaggcta gagtaggtga 540
gagggaagta gaatttcagg tgtagcggtg aaatgcgtag agatctgaag gaataccgat 600
ggcgaaggca gcttcctggc atcatactga cactgaggct cgaaagcgtg ggtagcaaac 660
aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc tactagtcgt tgggtccctt 720
gaggacttag tgacgcagct aacgcaataa gtagaccgcc tggggagtac ggccgcaagg 780
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catggccctt acgaccaggg ctacacacgt gctacaatgg taggtacaga gggcagctac 1140
acagcgatgt gatgcgaatc tcaaaaagcc tatcgtagtc cagattggag tctgcaactc 1200
gactccatga agtaggaatc gctagtaatc gcggatcaga atgccgcggt gaatacgttc 1260
ccgggccttg tacacaccgc 1280
Claims (9)
1.一种利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，所述的复配菌剂包括海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2，包括以下步骤：
(1)将海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的菌种分别接种到固体培养基上培养，加入无菌水制成GHF11菌种液与GHF2菌种液；
(2)两种菌种液混合得到混合菌液，然后接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；
(3)将发酵菌液透析去除部分培养基成份后离心得上清液，再加入乙醇静置沉降、离心分离得粗提产物；
(4)将粗提产物溶于水中得到粗产品溶液，加入乙醇静置沉降，然后离心分离沉降物并干燥得到精提产物；
(5)将精提产物溶于琼脂与淀粉的混合水溶液中，再冷却凝固制成重金属高效吸附剂；
所述海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年8月9日，保藏编号CGMCC No.：14510；建议的分类命名为大安盐单胞菌，拉丁文学名为Halomonas taeanensis；
所述的海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年8月9日，保藏编号CGMCC No.：14509；建议的分类命名为海水嗜冷杆菌，拉丁文学名为Psychrobacter aquimaris。
2.根据权利要求1所述的利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，其特征在于，所述的液体培养基经以下过程制成：
a.将贝类海鲜产品用水清洗干净，按质量比贝类海鲜产品:水＝1:2～4加水在120～122℃高压蒸煮100～120分钟得到蒸煮肉汤；
b.蒸煮肉汤降温至50～60℃，加入枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶酶解8～12小时，两种蛋白酶添加后的质量浓度为4‰～8‰，然后经400～500目筛网过滤得到酶解液；
c.在95～100℃下持续加热酶解液使体积浓缩30％～50％得到浓缩液；
d.向100mL浓缩液中加入磷酸氢二钾0.8～1.4g、葡萄糖25～45g溶解均匀，然后加入陈化海水定容到1L，经高压灭菌制成液体培养基；
固体培养基为向1L液体培养基中加入15～20g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
3.根据权利要求2所述的利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，其特征在于，贝类海鲜产品为蛤仔、蛏子、蚬子、海虹、扇贝与贻贝中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，其特征在于，步骤(1)中海洋盐单胞菌菌株的培养温度为25～30℃，海洋冷杆菌菌株的培养温度为18～23℃，培养时间为36～48小时，无菌水与固体培养基的体积比为1.0～1.5:1。
5.根据权利要求1所述的利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，其特征在于，步骤(2)中GHF11菌种液与GHF2菌种液体积比为0.5～2:1，混合菌液接种浓度为1.5～2.5mL混合菌液/100mL液体培养基，培养温度23～27℃、时间3～5天，摇床转速100～160r/min。
6.根据权利要求1所述的利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，其特征在于，步骤(3)中发酵菌液透析去除部分培养基成份的过程如下：将发酵菌液置于旋转蒸发仪上，在60～65℃下减压浓缩至原体积的10％～15％，然后装入截留分子量为8000道尔顿的透析袋中用去离子水透析，至透析袋外侧的去离子水无色无味。
7.根据权利要求1或6所述的利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，其特征在于，步骤(3)中乙醇与上清液的体积比为2～4:1，在1～5℃静置10～15小时，离心速率为6000～8000r/min。
8.根据权利要求1所述的利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，其特征在于，步骤(4)中的乙醇与粗产品溶液体积比2～4:1，在1～5℃静置6～9小时，离心速率6000～8000r/min，干燥温度为90～105℃、时间为1～2小时。
9.根据权利要求1所述的利用复配菌剂制备重金属高效吸附剂的方法，其特征在于，步骤(5)中向琼脂与淀粉的混合物中加入水并加热溶解，琼脂的质量百分浓度为2％～5％，琼脂与淀粉的重量比为1.2～2:1，然后加入精提产物溶解均匀，将混合液降温凝固，在60～80℃干燥90～120分钟得到重金属吸附剂，琼脂与精提产物的重量比为1:1.5～2.5。
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