CN112159774A

CN112159774A - 一株高效降解硒化卡拉胶的深海芽孢杆菌n1-1及其应用

Info

Publication number: CN112159774A
Application number: CN202011007110.2A
Authority: CN
Inventors: 曲长凤; 缪锦来; 王凯; 王西西
Original assignee: First Institute of Oceanography MNR
Current assignee: First Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2021-01-01
Anticipated expiration: 2040-09-22
Also published as: CN112159774B

Abstract

本发明提供了一株高效降解硒化卡拉胶的深海芽孢杆菌N1‑1及其应用。所述的深海芽孢杆菌N1‑1的分类命名为Bacillus sp.，保藏编号为CGMCC No.20357，其为革兰氏阳性菌，其菌落呈黄色，近圆形，边缘光滑，表面粗糙不透明，直径2‑3mm。深海芽孢杆菌N1‑1可以硒化卡拉胶为底物，发酵得到的硒化卡拉胶酶可以将硒化卡拉胶降解为小分子的硒化卡拉胶二糖。本发明利用深海微生物菌株发酵降解获得硒化卡拉胶二糖，不仅生产安全高效，并且硒化卡拉胶二糖更可以用于肿瘤治疗辅助药品、海洋特医食品、食品添加剂和饲料添加剂的制备。

Description

一株高效降解硒化卡拉胶的深海芽孢杆菌N1-1及其应用

技术领域

本发明属于微生物应用领域，具体涉及一株高效降解硒化卡拉胶的深海芽孢杆菌N1-1及其应用。

背景技术

很多生物体内包含必要的硒蛋白(谷胱甘肽过氧化物酶、甲酸脱氢酶、硒磷酸合成酶等)，因此它们需要微量元素硒才能发挥正常的细胞学功能。硒具有抗氧化、抗衰老、抗癌、防治心脑血管疾病等多方面的生物学功效，硒也是人体谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心，其对人类健康十分重要，因此近年来硒成为人们关注的焦点。世界上的很多地区都缺硒，硒缺乏会导致甲状腺功能减退、免疫系统减弱以及诱发多种疾病，比如癌症、心脑血管病、肝病和克山病、大骨节病等。

我国是一个缺硒大国，据《中华人民共和国地方疾病与环境因素图集》揭示，我国存在一条低硒地带，占我国土地面积的72％，其中30％为严重缺硒地区，而约七亿人生活在这片低硒地区。据统计，我国成人每日的平均摄硒量仅为26-32μg，远低于中国营养学会推荐的硒安全和适宜摄入量(50μg/d-250μg/d)下限。全世界也有四十多个国家和地区属于缺硒地区。早在1973年，世界卫生组织(WHO)就宣布硒是人体及动物生命中不可缺少的微量元素，过去十年的研究也表明，硒除了满足基本营养要求外，还具有许多潜在的健康益处，中国营养学会也已将硒列入到十五种每日膳食营养素中。因此，开发富硒食品作为补硒营养源受到国内外的广泛关注。

硒是人体和动物必需的微量元素，同时又具有较大毒性。硒的毒性大小依化合物种类不同而异，在各种硒化物中，亚硒酸盐的毒性相对较大，硒半胱氨酸与之相近，硒蛋氨酸相对较小，无机硒(主要是亚硒酸钠和硒酸钠)半致死量(LD₅₀)为12.7mg/kg，其生理需要量和中毒量之间的范围很窄。无机硒具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制，且环境污染大。而有机硒与无机硒相比，具有较高生物活性(比无机硒高约100倍)和较低毒性。有机硒的生物利用率远高于无机硒，且毒性较小、适应性好，所以有机硒具有生物利用度高、安全性高等优势，已渐渐成为补硒产品的主流。在许多发达国家，无机硒已被明令禁止直接添加到动物饲料中，但在我国一些严重缺硒地区，由于有机硒价格太高，人体补硒仍在使用亚硒酸钠等无机硒，许多保健品、硒营养强化食品，甚至包括一些药品中也在添加无机硒盐，更不用说使用量巨大的养殖业。因此，寻找高效、低毒和价格低廉的有机硒化合物具有十分重要的意义。

多糖具有多种生理功能，比如抗衰老、防治癌症等；有机硒毒性低，副作用小，能更好的激发免疫反应，因此，将无机硒与多糖有机结合使之成为有机硒化合物-硒多糖，将会使硒和多糖的生理和药理功能得到优化，不仅保持了多糖的基本构型和活性，还很大程度提高了硒的生物可利用度，降低了其毒性和副作用，并且还具有生物活性强、环境污染小等特点。硒多糖主要分为天然硒多糖和合成硒多糖。合成硒多糖主要由化学手段制备，生物合成硒多糖的相关研究尚浅。我国沿海海域幅员辽阔，生长多种的海洋藻类，利用海洋生物技术和组合化学技术将硒元素和海藻多糖结合，形成的海藻硒多糖是一种新型分子结构的海洋生物活性物质，这种有机硒化合物既消除了硒的毒副作用，又具有很高的生理活性，大大提高了硒营养素使用的安全性和功效。因此，海藻硒多糖是急待推广应用的海洋生物制品。但未降解的硒多糖粘度大、分子量大、水溶性差、不易扩散，会导致其在生物体内吸收较差，因此，现在急需寻找一种安全可靠且高效的降解海洋硒多糖，进一步提升其性能的方法。

发明内容

为了解决现有技术中的不足与缺陷，本发明提供了一株高效降解硒化卡拉胶的深海芽孢杆菌N1-1及其应用，该菌株可以产生酶活高的硒化卡拉胶酶并高效的降解硒化卡拉胶，并制得稳定性优良的硒化卡拉胶二糖。

为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：

本发明提供了一株深海芽孢杆菌N1-1，其分类命名为Bacillus sp.，保藏编号为CGMCC No.20357。

进一步的，所述深海芽孢杆菌N1-1为革兰氏阳性菌，菌落呈呈黄色，近圆形，边缘光滑，表面粗糙不透明，直径2-3mm。

进一步的，所述深海芽孢杆菌N1-1的适合生长温度为25-37℃。

进一步的，所述深海芽孢杆菌N1-1的最适生长温度为30℃。

进一步的，所述深海芽孢杆菌N1-1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了所述的深海芽孢杆菌N1-1在用于制备硒化卡拉胶二糖的制剂中的应用。

进一步的，所述硒化卡拉胶固体酶制剂的制备步骤为：

(1)将所述深海芽孢杆菌N1-1接种到发酵培养基上发酵培养，然后收集发酵液于4℃、7500r/min离心15min后，再收集沉淀菌体并用pH 7.0的磷酸缓冲液进行重悬，超声破碎20min，取破碎液于4℃、12000r/min离心15min，取上清液得到硒化卡拉胶酶粗酶液；

(2)将硒化卡拉胶酶粗酶液静置过夜后10000r/min离心20min，收集沉淀物用pH8.0的10mM Tris-HCl缓冲液透析，经透析后的溶液使用Tris-HCl缓冲液预平衡的洗脱柱洗脱后，收集活性组分超滤浓缩，收集浓缩液使用含有0.15M NaCl的10mM Tris-HCl预平衡的洗脱柱进行洗脱(流速为1mL/min)，收集液体为纯化的硒化卡拉胶酶液；

(3)使用0.22μm孔径的水相膜对纯化的硒化卡拉胶酶液进行除菌过滤后，利用改良的真空冷冻干燥法进行干燥，得到硒化卡拉胶固体酶制剂；

(4)称取5g硒化卡拉胶固体酶制剂并溶解，使其终浓度为5mg/ml，与0.2％硒化卡拉胶溶液以1∶9的体积比混合，在40℃、pH为8.0条件下反应12h，然后加热煮沸15min停止反应，冷却至室温，7500r/min离心15min，去除未酶解的不溶性片段；然后将的得到的反应液置于透析袋中进行透析；将透析外液60℃进行旋转蒸发并浓缩，干燥后得到硒化卡拉胶二糖粉末。

进一步的，所述步骤(1)中的发酵培养基包括碳源、氮源、金属离子和海水。

进一步的，所述碳源为0.2％κ-卡拉胶、蔗糖或乙酸钠；所述氮源为酵母粉、蛋白胨或硫酸铵；所述金属离子为Ca²⁺、Cu²⁺或Na⁺；所述海水为经0.22μm膜过滤的海水。

进一步的，最佳碳源为0.2％κ-卡拉胶，最适氮源为酵母粉，最佳金属离子为Ca²⁺。

进一步的，所述步骤(1)中的发酵培养基的配方为：2g κ-卡拉胶、1g酵母粉、5g蛋白胨、0.1g氯化钙，1000mL经0.22μm膜过滤的海水，pH为7.0。

进一步的，所述步骤(1)中的发酵培养条件为发酵温度为25-45℃；发酵pH为6.0-8.0；适宜摇瓶转速为100-150r/min；所述深海芽孢杆菌N1-1的接种量为2.0-3.5％。

进一步的，最佳发酵温度为35℃，最佳发酵pH值为7.0，最佳摇瓶转速为150r/min，所述深海芽孢杆菌N1-1的最佳接种量为2.5％。

进一步的，所述步骤(2)中的第一次洗脱时使用150mL线性梯度的0.1-1.0M NaCl洗脱，流速为5mL/min。

进一步的，所述硒化卡拉胶酶液的酶促反应适合温度为30-45℃，且热稳定性良好；反应适合pH为5.5-9.0，对碱性环境具有良好的耐受性。

进一步的，所述硒化卡拉胶酶液的酶促反应最适温度为35℃，最适pH为7.5。

进一步的，金属离子Cu²⁺、K⁺、Mg²⁺、Na⁺、Ca²⁺、Tween-80能够促进所述硒化卡拉胶酶酶活；Ba⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、SDS、DTT、EDTA、β-巯基乙醇能够抑制所述硒化卡拉胶酶酶活。

进一步的，Ca²⁺促进所述硒化卡拉胶酶酶活的作用最明显；Mn²⁺抑制所述硒化卡拉胶酶酶活的作用最明显。

进一步的，所述步骤(3)中的改良的真空冷冻干燥法的条件为预冻温度为-40℃、预冻时间为10h、冻干保护剂海藻糖浓度为2.0％、酶液厚度为5mm，干燥时间为5h。

进一步的，制得的硒化卡拉胶固体酶制剂的最佳保存条件为：-20℃、避光、干燥。

本发明还提供了由所述的深海芽孢杆菌N1-1制备得到的硒化卡拉胶二糖在用于制备食品添加剂、饲料添加剂或海洋食品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

本发明从深海冷泉泥样分离得到一株深海芽孢杆菌N1-1，该菌株可以发酵生产出能够显著降解硒化卡拉胶的硒化卡拉胶酶，该硒化卡拉胶酶酶活力达到8.416U/mL，有效地水解硒化卡拉胶。本发明还对深海芽孢杆菌N1-1的产酶性能和条件进行了优化，得到了最佳的发酵生产硒化卡拉胶酶的发酵培养基和培养条件；并且还将纯化的硒化卡拉胶酶利用本发明改良的真空冷冻干燥法制得到备硒化卡拉胶固体酶制剂，并进一步生产出硒化卡拉胶二糖。由于深海微生物长期生活在海洋低温环境中，其产生的硒化卡拉胶酶可以在较低的温度下也具有较好的催化效果，且制备硒化卡拉胶二糖的过程易于控制，能有效降低经济成本，绿色环保和专一高效，建立了环保的生物酶解新工艺技术。另外，硒化卡拉胶二糖不仅安全高效，更可以用于制备肿瘤治疗辅助药品、海洋特医食品、食品添加剂和饲料添加剂。

附图说明

图1：深海芽孢杆菌N1-1的菌落形态特征；

图2：深海芽孢杆菌N1-1在不同温度下的生长情况；

图3：温度、pH、碳源、氮源、接种量及转速对深海芽孢杆菌N1-1产酶活力的影响；

图4：温度、pH、金属离子与变性剂对硒化卡拉胶酶活力的影响；

图5：预冻温度与预冻时间对硒化卡拉胶酶活力的影响；

图6：干燥时间对硒化卡拉胶酶活力的影响；

图7：海藻糖浓度对硒化卡拉胶酶活力的影响；

图8：温度、温度空气复合作用、温度空气光照复合作用、湿度、紫外线照射对固体酶制剂贮藏稳定性的影响；

图9：硒化卡拉胶二糖的冻干粉末。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则使用试剂和仪器均为市售产品。

实施例1：深海芽孢杆菌N1-1的筛选和鉴定

1、深海芽孢杆菌N1-1的筛选和活化

称取深海冷泉海泥沉积物1g，加入9mL无菌海水，取0.1mL逐级稀释为10^-2～10^-6浓度涂布于平板培养基(5g蛋白胨、1g酵母粉、0.1g磷酸铁、15g琼脂粉、1000mL经0.22μm膜过滤的海水，pH为7.6)，在25℃恒温培养箱里培养。据菌落形态、大小等特征挑取单菌落，划线分离纯化3次后，直至获得多种纯细菌培养物；然后，配置2216E发酵培养基(5g蛋白胨、1g酵母粉、0.1g磷酸铁、1000mL经0.22μm膜过滤的海水，pH为7.6)，高温灭菌后恢复常温，用接种环将纯化好的菌株接入发酵培养基中，置于恒温振荡培养箱，25℃，150rpm活化培养。

将活化后的不同菌株使用固体选择培养基(5g蛋白胨、1g酵母粉、15g硒化卡拉胶、15g琼脂粉，1000mL经0.22μm膜过滤的海水)进行点板测试，25℃培养16h后，用卢戈氏碘液染色，观察平板是否出现透明圈；对出现透明圈的平板上的菌株复筛三次，以此避免偶然出现透明圈现象。最终，筛选得到一株能够降解硒化卡拉胶的菌株，将该菌株命名为N1-1。

如图1所示，所述菌株N1-1为革兰氏阳性菌，其菌落呈黄色，近圆形，边缘光滑，表面粗糙不透明，直径2-3mm。

2、深海芽孢杆菌N1-1的鉴定

对菌株N1-1进行16SrRNA扩增测序，然后将菌株N1-1的测序结果(SEQ ID No.1)在NCBI-BLAST进行比对，结果显示菌株N1-1与芽孢杆菌属的菌株的亲缘关系最近，因此确定该菌株N1-1为芽孢杆菌Bacillus sp.。

将菌株N1-1进行菌种保藏，所述芽孢杆菌Bacillus sp.的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年07月14日；芽孢杆菌Bacillus sp.的保藏编号为CGMCC No.20357。

将芽孢杆菌N1-1接种到发酵培养基中，在不同温度下恒温摇床培养，每4h取样一次，在波长600nm(OD₆₀₀)下测定吸光值，并绘制生长曲线图。结果如图2所示，芽孢杆菌N1-1的适合生长温度为25-37℃，最适生长温度为30℃。

实施例2：深海芽孢杆菌N1-1的最适产酶条件的测定

将芽孢杆菌N1-1接种到2216E发酵培养基中，25℃，150r/min培养过夜，收集发酵液并于4℃、7500rpm/min离心15min，收集的菌体沉淀用pH 7.0的磷酸缓冲液进行重悬，超声破碎20min，取破碎液于4℃、12000rpm/min离心15min，取上清即为芽孢杆菌N1-1所产硒化卡拉胶酶的粗酶液。采用DNS(3，5-二硝基水杨酸)法对菌株N1-1所产硒化卡拉胶酶的活性进行测定。

采用DNS(3，5-二硝基水杨酸)法测定菌株N1-1所产硒化卡拉胶酶的活性。具体地，1mL酶液与1mL 0.2％硒化卡拉胶底物(pH＝7.0)混合，在40℃的温度下，置于恒温水浴锅中反应3.0h，以100℃灭活的酶液作为对照组。取1ml反应液、1.5ml DNS溶液于25ml比色管中，沸水中加热反应15min，冷却至室温(冰浴)后，定容至25ml并摇匀，在波长600nm(OD₆₀₀)下采用分光光度计测定其吸光度值。根据吸光值的差值计算还原糖的产量。一个酶活力单位(U)定义为在37℃的条件下，1min产生1μg还原糖(以葡萄糖或半乳糖计算)所需要的酶量。

在上述发酵培养基的基础上，分别将芽孢杆菌N1-1于不同培养温度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、45℃)、pH(5.0、6.0、7.0、7.5、8.0)、碳源(0.2％κ-卡拉胶、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、淀粉、甘油、乙酸钠)，氮源(蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、牛肉膏、硝酸铵、硝酸钾、氯化铵、硝酸钠)或者接种量(1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、5％)、摇瓶转速(50r/min、100r/min、150r/min、200r/min)下培养，经收集分离得到酶液，对其活性进行测定，以此来确定芽孢杆菌N1-1产酶的最适发酵条件。

结果如图3所示，深海芽孢杆菌N1-1的适宜产酶温度为25-45℃；适宜产酶pH值为6.0-8.0；适宜产酶碳源为0.2％κ-卡拉胶、蔗糖和乙酸钠；适宜氮源为酵母粉、蛋白胨和硫酸铵；适宜接种量为2.0-3.5％；适宜摇瓶转速为100-150r/min。而深海芽孢杆菌N1-1的最佳产酶温度为35℃，最佳产酶pH值为7.0，最佳产酶碳源为0.2％κ-卡拉胶，最适氮源为酵母粉，最佳接种量为2.5％，最佳产酶发酵摇瓶转速为150r/min。

本发明同时也根据深海芽孢杆菌N1-1的最佳产酶条件配制了最适合深海芽孢杆菌N1-1的最佳发酵培养基，该培养基的配方为：2g κ-卡拉胶、1g酵母粉、5g蛋白胨、0.1g氯化钙，1000mL经0.22μm膜过滤的海水，pH为7.0。

实施例3：硒化卡拉胶酶的提取、纯化与最适反应条件

1、硒化卡拉胶酶的提取和纯化

将深海芽孢杆菌N1-1以2.5％的接种量接种到最佳发酵培养基上，35℃、150r/min恒温培养过夜。将发酵液于4℃、7500r/min离心15min后，收集沉淀菌体并用pH 7.0的磷酸缓冲液进行重悬，超声破碎20min，取破碎液于4℃、12000r/min离心15min，取上清液即为芽孢杆菌N1-1所产硒化卡拉胶酶粗酶液，并用硫酸铵将其调节至80％饱和度。

将粗酶液静置过夜，10000r/min离心20min，将收集的沉淀物溶于10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，并用含有10mM Tris-HCl(pH8.0)的缓冲液A(100mM NaCl)透析过夜。将透析之后的溶液应用于使用缓冲液A预平衡的HiTrap^TMQ HP柱上；结合的蛋白在10mM Tris-HCl(pH8.0)中用150mL线性梯度的0.1-1.0M NaCl洗脱，流速为5mL/min；收集活性组分并通过超滤(MWCO为10kDa)浓缩。将浓缩液应用于含有0.15M NaCl的10mM Tris-HCl(pH8.0)预平衡的Hiload^TM 16/600superdex^TM 200柱，并用等效缓冲液以1mL/min的流速(每管2ml)洗脱结合的蛋白质，收集得到的液体即为深海芽孢杆菌N1-1所产硒化卡拉胶酶纯化酶液。所有纯化均使用AKTA系统在4℃条件下进行。

将纯化后的酶液按照实施例2的方法测定酶活力。经检测，深海芽孢杆菌N1-1所产硒化卡拉胶酶的酶活力达到8.416U/mL。

2、硒化卡拉胶酶的最适反应条件

确定硒化卡拉胶酶的pH与最适温度，以及金属离子、变性剂对硒化卡拉胶酶活的影响。

(1)分别用不同pH的Tris-HCl缓冲液(3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)配制0.2％硒化卡拉胶溶液，与硒化卡拉胶酶液混合，在40℃下按照实施例2中的方法测定硒化卡拉胶酶的活力。

(2)将硒化卡拉胶酶液与0.2％硒化卡拉胶溶液混合，分别在20、25、30、35、40、45、60、70℃温度下按照实施例2中的方法测定硒化卡拉胶酶的活力。

(3)在硒化卡拉胶酶液中分别加入Ba⁺、Na⁺、K⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺的离子溶液，使其在酶液中的终浓度为5.0mmol/mL后，与0.2％硒化卡拉胶溶液混合，在40℃下按照实施例2中的方法测定硒化卡拉胶酶的活力。

(4)在硒化卡拉胶酶液中分别加入蛋白抑制剂(EDTA、β-巯基乙醇、DTT和PMSF)、变性剂(SDS)及表面活性剂(Tween-80)，使其在酶液中的终浓度为1.0mmol/L后，与0.2％硒化卡拉胶溶液混合，在40℃下按照实施例2中的方法测定硒化卡拉胶酶的活力。

结果如图4所示，硒化卡拉胶酶的酶促反应适合温度为30-45℃，最适温度为35℃，且热稳定性良好；酶促反应适合pH为5.5-9.0，酶促反应最适pH为7.5，其对碱性环境具有良好的耐受性；金属离子Cu²⁺、K⁺、Mg²⁺、Na⁺、Ca²⁺对硒化卡拉胶酶起促进作用且依次增强，Ba⁺、Zn²⁺、Mn²⁺对硒化卡拉胶酶起抑制作用，其中Ca²⁺和Mn²⁺的作用最明显，Ca²⁺能够提高约70％的硒化卡拉胶酶酶活，Mn²⁺能降低约40％的酶活；表面活性剂Tween-80通过与酶分子的氢键和疏水作用，对酶的活性起到了明显的促进作用，而SDS、DTT、EDTA、β-巯基乙醇导致酶的空间构象变化，产生不同程度的抑制作用，另外，PMSF具有促进酶活的作用。

实施例4：硒化卡拉胶固体酶制剂的制备

1、硒化卡拉胶固体酶制剂制备条件的优化

使用0.22μm孔径的水相膜对纯化好的硒化卡拉胶酶液进行除菌过滤，经除菌过滤后硒化卡拉胶酶的剩余酶活为97.5％。

在利用真空冷冻干燥法制备硒化卡拉胶固体酶制剂前，先初步在不同预冻温度(-20℃、-80℃、液氮)、预冻时间(6h、12h、18h、24h)、干燥时间(0、5、10、15、20、25、30h)及冻干保护剂海藻糖的浓度(0.5％、1％、2％、3％、4％、5％)条件下对硒化卡拉胶固体酶活力的影响进行检测，结果如图5-7所示，预冻会对酶活造成一定的影响，但预冻温度在-80℃对酶活力影响最小，并且预冻时间对酶活力的影响呈现先上升后下降的趋势，在预冻10h时对酶活力影响最小。干燥时间对酶活的影响较小，并且在干燥55h后，酶活力趋近于稳定，但失水率逐渐上升。较低的海藻糖浓度对酶活的影响较大，随着海藻糖浓度的增加，酶活先上升后下降，在2％时，对酶活影响最小。

利用真空冷冻干燥机(冷阱温度达到-40℃以下，真空度为1.0pa)制备硒化卡拉胶固体酶制剂，采用四因素三水平的正交试验表L₉(3⁴)进行正交试验，优化制备固体酶制剂的条件，结果如表1(其中1代表预冻温度-40℃，预冻时间10h，酶液厚度4.5mm，海藻糖浓度1.5％；2代表预冻温度-60℃，预冻时间12h，酶液厚度5.0mm，海藻糖浓度2.0％；3代表预冻温度-80℃，预冻时间14h，酶液厚度5.5mm，海藻糖浓度2.5％)。根据表1、表2的试验结果表明：通过分析可知，各因素对酶活力的影响的先后顺序为D＞B＞C＞A，得到最优条件组合为A₁B₁C₂D₂，即预冻温度为-40℃、海藻糖浓度为2.0％、酶液厚度为5mm、预冻时间为10h。

表1正交试验结果

表2正交试验方差分析表

2、硒化卡拉胶固体酶制剂的保存性能

将纯化好的硒化卡拉胶酶按照最佳制备条件(预冻温度为-40℃、海藻糖浓度为2.0％、酶液厚度为5mm、预冻时间为10h、干燥时间5h)制备成硒化卡拉胶固体酶制剂后，并对其保存性能进行检测：

(1)将硒化卡拉胶固体酶制剂样品真空包装，0.5g/袋，分别保存于-20℃、4℃、28℃以及37℃，避光保存，每隔10天取出进行酶活力测定，检测温度对硒化卡拉胶固体酶制剂保存稳定性的影响。

(2)将硒化卡拉胶固体酶制剂样品，敞口，0.5g/袋，分别保存于-20℃、4℃下避光保存，每隔10天取出进行酶活力测定，检测温度和空气对硒化卡拉胶固体酶制剂保存稳定性的影响。

(3)将硒化卡拉胶固体酶制剂样品，敞口，0.5g/袋，分别保存于-20℃、4℃下见光保存，每隔10天取出进行酶活力测定，检测温度、空气和光照对硒化卡拉胶固体酶制剂保存稳定性的影响。

(4)将硒化卡拉胶固体酶制剂样品，0.5g/袋，分别保存在干燥和潮湿的环境中，检测湿度对硒化卡拉胶固体酶制剂保存稳定性的影响。

(5)将硒化卡拉胶固体酶制剂样品密封于玻璃平板内，使用紫外灯照射，分别在10、20、30、40、50、70、90min取出进行酶活力测定，检测紫外线对硒化卡拉胶固体酶制剂保存稳定性的影响。

结果如图8所示，随着保存时间的推移，不同温度均会对硒化卡拉胶固体酶制剂的酶活力产生影响，而-20℃对酶活的影响最小；避光保存和见光保存相比，避光保存对酶活的影响更小，并且干燥环境对酶活的影响更小，且紫外线会对硒化卡拉胶酶的酶活的产生较大的影响。因此，制备的硒化卡拉胶固体酶制剂的最佳保存条件为：-20℃、避光、干燥的条件下保存。

实施例5：应用硒化卡拉胶固体酶制剂制备硒化卡拉胶二糖的方法

1、硒化卡拉胶二糖的制备

称取5g硒化卡拉胶固体酶制剂，溶解使其终浓度为5mg/ml，用蒸馏水配制0.2％的硒化卡拉胶底物，取500mL溶解后的酶制剂与4.5L硒化卡拉胶底物混合，于40℃反应12h，然后加热煮沸15min停止反应，冷却至室温，酶解液于7500r/min离心15min以去除未酶解的不溶性片段；将上清液置于透析袋(8-14KD)中进行透析，而小分子的糖(小于8000Da)则存在于透析外液内，将透析外液进行60℃旋转蒸发并浓缩，冷冻干燥(冷阱温度达到-40℃以下，真空度为1.0pa)后即得到小于8000Da的硒化卡拉胶二糖，得到的硒化卡拉胶二糖粉末为淡黄色(如图9所示)。

2、硒化卡拉胶二糖的性能检测

精密称量1.0g硒化卡拉胶二糖，放置于盛有15mL消化液的锥形瓶中(消化液的配比为浓硝酸∶浓硫酸∶高氯酸＝4∶1∶1)静置消化24h后，把锥形瓶放在水浴锅上加热，此时会有黄色的浓烟冒出，加热至溶液澄清透明后，转移至容量瓶中定容(15mL)，过滤后使用，测定的总硒含量为48.69±0.95μg/g。

将硒化卡拉胶二糖溶解后，选取100-500D的透析袋透析后，将透析外液旋转蒸发进行浓缩，或者采用乙醇沉淀多糖的原理，测定上清液中无机硒含量，并计算其有机硒比率。有机硒比率＝(总硒含量-无机硒含量)/总硒含量。最终计算得到的有机硒比率为0.66。

硒化卡拉胶二糖在25℃的条件下配成1.0％的蒸馏水溶液，采用旋转粘度计，读出黏度值。在不同温度下将硒化卡拉胶二糖在水、乙醇、丙酮等溶剂中至饱和，测定其在不同溶剂中的溶解性。结果如表3所示，通过硒化卡拉胶固体酶制剂所产的硒化卡拉胶二糖在丙酮、氯仿中完全不溶，在乙醇中几乎不溶，在高温的水中溶解性较低。

表3不同溶剂中硒化卡拉胶二糖的溶解性

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 自然资源部第一海洋研究所

<120> 一株高效降解硒化卡拉胶的深海芽孢杆菌N1-1及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1444

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌(Bacillus sp.)

<400> 1

agcctatcct gcagtcgagc gaagagatgg gagcttgctc cctgatctta gcggcggacg 60

ggtgagtaac acgtgggcaa cctgccctgc agactgggat aactccggga aaccggagct 120

aataccgggt aatacatcgc accgcatggt gcaatgttga aagttggctt tctgagctaa 180

cactgcagga tgggcccgcg gcgcattagc tagttggtaa ggtaatggct taccaaggcg 240

acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaaa 300

ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac 360

gccgcgtgag tgacgaaggc cttcgggtcg taaagctctg ttgttaggga agaacaagta 420

ccgttcgaat agggcggtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg 480

ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg 540

cgcgcaggcg gtcttttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg gagggtcatt 600

ggaaactgga ggacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat 660

gcgtagatat gtggaggaac accagtggcg aaggcggctc tctggtctgt aactgacgct 720

gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 780

gatgagtgct aggtgttggg gggttccacc ctcagtgctg aagttaacac attaagcact 840

ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 900

gcagtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc 960

ctctgacaat cctggagaca ggacgttccc cttcggggga cagagtgaca ggtggtgcat 1020

ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080

gatcttagtt gccagcattt agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag 1140

gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1200

aatggacggt acaaagggca gcaacaccgc gaggtgaagc aaatcccata aagccgttct 1260

cagttcggat tgcaggctgc aactcgcctg catgaagccg gaattgctag taatcgcgga 1320

tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag 1380

agtttgtaac acccgaagtc ggtggggtaa cctttatgga gccagccgcc gaaaggggac 1440

catc 1444

Claims

1.一株高效降解硒化卡拉胶的深海芽孢杆菌N1-1，其特征在于，其分类命名为Bacillus sp.，保藏编号为CGMCC No.20357。

2.根据权利要求1所述的深海芽孢杆菌N1-1，其特征在于，所述深海芽孢杆菌N1-1为革兰氏阳性菌，菌落呈黄色，近圆形，边缘光滑，表面粗糙不透明，直径2-3mm。

3.权利要求1所述的深海芽孢杆菌N1-1在用于制备硒化卡拉胶二糖的制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述深海芽孢杆菌N1-1制备硒化卡拉胶二糖的步骤为：

(1)将所述深海芽孢杆菌N1-1接种到发酵培养基上发酵培养，然后收集发酵液离心后，收集沉淀菌体重悬，超声破碎取破碎后，离心取上清，得到硒化卡拉胶酶粗酶液；

(2)将硒化卡拉胶酶粗酶液静置过夜后离心，收集沉淀物用缓冲液透析，经透析后的溶液经洗脱柱洗脱后，收集活性组分超滤浓缩，收集浓缩液再一次进行洗脱，收集液体为纯化的硒化卡拉胶酶液；

(3)使用水相膜对纯化的硒化卡拉胶酶液进行除菌过滤后，利用改良的真空冷冻干燥法进行干燥，得到硒化卡拉胶固体酶制剂；

(4)称取硒化卡拉胶固体酶制剂并溶解，使其终浓度为5mg/ml，与硒化卡拉胶溶液混合反应，离心去除未酶解的不溶性片段；然后将得到的反应液置于透析袋中透析；将透析外液进行旋转蒸发并浓缩，干燥后得到硒化卡拉胶二糖粉末。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的发酵培养基包括碳源、氮源、金属离子和海水。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述碳源为0.2％κ-卡拉胶、蔗糖或乙酸钠；所述氮源为酵母粉、蛋白胨或硫酸铵；所述金属离子为Ca²⁺、Cu²⁺或Na⁺；所述海水为经0.22μm膜过滤的海水。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的发酵培养条件为发酵温度为25-45℃；发酵pH为6.0-8.0；适宜摇瓶转速为100-150r/min；所述深海芽孢杆菌N1-1的接种量为2.0-3.5％。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述硒化卡拉胶酶液的酶促反应适合温度为30-45℃，反应适合pH为5.5-9.0。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中的改良的真空冷冻干燥法的条件为预冻温度为-40℃、预冻时间为10h、冻干保护剂海藻糖浓度为2.0％、酶液厚度为5mm、干燥时间为5h。

10.由权利要求1所述的深海芽孢杆菌N1-1制备得到的硒化卡拉胶二糖在用于制备食品添加剂、饲料添加剂或海洋食品中的应用。