KR20130103943A

KR20130103943A - 한천 및 카라기난 분해능을 가지는 신규 미생물

Info

Publication number: KR20130103943A
Application number: KR1020120024992A
Authority: KR
Inventors: 김중균; 강소연
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2012-03-12
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2013-09-25
Also published as: KR101316086B1

Abstract

본 발명은 한천 및 카라기난 분해능을 가지는 신규 미생물에 관한 것으로 더욱 자세하게는, 한천 및 카라기난을 분해하는 능력을 가진 바실러스 알칼로필러스에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 홍조류 가공공정에서 발생되거나 홍조류 추출 공정 중에 발생되는 처리하기 어려운 부산물인 한천 및 카라기난으로부터 갈락토오스, 글루코오스 등의 환원당을 생산할 수 있어 환경보호 효과가 있으며, 생리활성물질이나 바이오에탄올 생산 등으로 재활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

한천 및 카라기난 분해능을 가지는 신규 미생물{Novel Microorganism Degrading agar and carrageenan}

본 발명은 한천 및 카라기난 분해능을 가지는 신규 미생물에 관한 것으로 더욱 자세하게는, 한천 및 카라기난을 분해하는 능력을 가진 바실러스 알칼로필러스에 관한 것이다.

현재 세계적으로 기후변화협약과 환경규제 강화에 의해서 석유 및 석탄을 대체할 수 있고 안정적이며 환경 친화적인 에너지를 개발하기 위한 바이오, 수소, 태양 등의 신재생에너지의 연구가 활발히 진행되고 있다. 바이오 에너지 생산의 원료로는 주로 사탕수수, 옥수수 등의 곡물류와 임업 및 농업 부산물인 목질계 자원들을 이용하여, 미국, 브라질, 독일과 같은 신재생에너지 생산의 선도국가에서 이에 관한 연구 및 생산이 진행되고 있으나, 식량난 문제와 작물 종류에 따른 지배 면적 한정성 및 영양분 공급의 어려움 그리고 셀룰로오스 이외의 헤미셀룰로오스, 리그닌 등의 추가 전처리 공정에 의한 경제성과 같은 문제로 곡물류와 목질계 자원을 이용한 바이오 연료 생산의 한계가 드러나고 있다.

이러한 문제점들을 해결하기 위하여, 최근에는 많은 섬유질 및 다양한 다당류에 의해 세포벽이 구성되어 있는 해양조류가 새로운 바이오 에너지 원료로서 주목을 받고 있다. 해조류를 주로 생산하는 나라는 한국, 일본, 중국, 인도네시아 등의 아시아 국가들이며 육상보다 재배 가능한 바다 면적이 넓다. 또한, 해조류는 목재와 식물계 셀룰로오스보다 빠른 속도로 성장하며 광합성 반응으로 공기 중 이산화탄소를 흡수하므로 온실 가스를 줄일 수 있는 효과가 있고, 해조류 내 리그닌의 함량이 적어 전처리 공정을 간소화 할 수 있을 뿐만 아니라 이러한 대형 해조류에는 60~95 % 정도가 수분이며 나머지 성분들 가운데 50 % 이상이 탄수화물로 이루어져 있어서 바이오 연료 원료로서의 많은 잠재성을 내포하고 있다. 한편 우리나라와 일본에서는 홍조류 중 김(주로 Porphyra yezoensis)양식이 활발하게 이루어지고 있으며, 홍조류는 우리나라에서 자생하는 해조류의 절반 이상을 차지하고 있다. 또한, 갈조류나 녹조류보다 서식 범위가 넓고 얕은 수심에서부터 광선이 닿는 깊은 수심에 이르기까지 자생하고 있어 다른 조류보다 종의 수효가 많아 원료 수급 측면에서 매우 우수하며, 타 해조류에 비해 탄수화물, 즉, 미생물이 에탄올로 전환할 수 있는 단당 전환물질을 많이 함유하고 있어 에너지 전환 측면에서도 장점을 지니고 있다. 대형 해조류는 종에 따라 구성하고 있는 다당류의 종류 및 결합 형태가 다양한데, 그 중에서 홍조류는 세포벽 내층의 구조 다당류인 셀룰로오스와 외층 및 세포 사이에 황산기를 가지는 점질성 다당류인 한천, 카라기난, 그리고 그 밖에 자일란, 만난 등으로 구성되어 있다. 특히 한천과 카라기난이 각각 28%, 24%로 대표적이며 셀룰로오스는 3~16%로 그다지 많지 않다.

홍조류 가공 공정 및 추출에서 발생되는 대표적 부산물인 한천은 단일당으로 형성된 다당류가 아니고 중성 다당류인 아가로오즈(60~80%)와 산성 다당류인 아가로펙틴(20~40%)의 혼합물로서, 아가로오즈는 D-갈락토오즈와 3,6-안하이드로-L-갈락토오즈(AG)가 β-1,4 결합을 하고 있는 이당류인 아가로바이오즈들 간에 α-1,3 결합을 반복하는 고분자 구조(또는 D-갈락토오즈와 3,6-안하이드로-L-갈락토오즈(AG)가 α-1,3 결합을 하고 있는 이당류인 네오아가로바이오즈들 간에 β-1,4 결합을 반복하는 고분자 구조)이고, 아가로펙틴은 아가로오즈와 마찬가지로 같은 기본구조로 되어 있으나 황산기 등의 산성기를 포함하고 있어 아가로오즈와 달리 겔화력이 약하다. 카라기난은 D-갈락토오즈와 3,6-안하이드로-D-갈락토오즈(AG)로 결합된 고분자 다당류에 황산기가 일부 결합한 산성 다당류로서, 구성당이 한천과 비슷하나, 한천과 다른 점은 한천은 3,6-안하이드로-L-갈락토오즈(AG)인데 비하여 카라기난은 3,6-안하이드로-D-갈락토오즈(AG)이고, 황산기의 함량이 한천은 3~6% 정도로 적은데 비하여 카라기난은 20~25%로 극히 많이 존재한다. 또한 한천은 응고력이 강한데 비하여 카라기난은 응고력이 약하고 점성이 강한 점이라고 할 수 있다. 따라서, 토양, 갯벌, 해저 동물의 내장 등에서 순수 분리한 한천 및 카라기난을 분해하는 미생물을 이용하면, 분해 결과로 에탄올 생산에 필요한 갈락토오스나 글루코오스 생산뿐만 아니라, 분해 반응 시 생성 되는 이탄당, 삼탕당, 올리고당 등과 같은 분해 대사산물들이 유용한 생리활성물질이 될 수 있다. 현재까지 홍조류로부터 알칼리, 산 또는 효소 처리 등의 가공 방법을 통해 해조다당류인 한천, 카라기난을 추출하여 식품 및 화장품 첨가제, 건강 식량 자원으로서 산업적으로 많이 유용하게 이용되고 있다. 그러나 홍조류 자체의 분해하기 어려운 복잡한 구조로 인해 바이오 연료 생산용 기질로서 사용하기에 어려움이 있으며, 현재 이용되고 있는 물질 이외에 발생되는 부산물 및 폐기물들의 처리가 문제점으로 남아 있다. 우리나라는 OECD 가입 회원국으로서 폐기물 해양투기를 규제하는 런던협약이 채택한 ‘96 의정서’를 의무적으로 따라야 할 입장이어서, 2012년 이후에는 폐기되는 해조류 처리문제로 인한 대란이 발생될 가능성을 배제할 수 없다.

지금까지 한천 또는 카라기난을 효소적 방법을 이용하여 분해한다고 알려진 미생물로는 한천 분해능을 가지는 미생물로서, 높은 온도의 졸상 상태에서 한천 올리고당을 생산하기 위한 내열성 베타 아가라제를 가지는 Agarivorans albus(Agarivorans sp. JA-1, KCCM10645P)(한국특허등록 제736,889호), 한천 올리고당을 생산하기 위한 베타 아가라제를 가지는 Thalassomonas agarivorans(Thalassomonas sp. SL-5, KCCM 10790P)(한국특허등록 제794,593호), 갈락토오스를 생산하기 위한 알파 아가라제와 베타 아가라제를 모두 가지는 Saccharophagus degradans 2-40(Saccharophagus sp. AG21, KFCC 11416P)(한국특허출원 제2008-0038244호), 그리고 40 ℃ 이상에서도 우수한 한천 분해능을 유지할 수 있고, 한천을 원료로 하여 고부가가치 상품인 다양한 한천올리고당을 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 산업적으로 부가가치가 높은 네오아가로올리고당를 생산할 수 있는 베타 아가라제를 가지는 Glaciecola mesophila AJ548479(Glaciecola sp. SL-12, KCCM 10945P)(한국특허등록 제1,072,503호) 등이 보고되고 있다.

카라기난 분해능을 가지는 미생물로서, Pseudomonas sp.(MTCC 5261)을 이용하여 카라기나제 생산을 최대화하기 위한 신규 배지 개발에 관한 특허(한국특허출원 제2008-7026331호)와 카라기나제 생산과 카라기난 분해에 관련된 보고(JP1006656, JP 2000116376) 등이 보고되고 있지만, 아직까지 카라기난을 분해하는 미생물 개발은 미비한 상태이다.

그 외에도 한천을 분해하는 효소, 아가라제를 생산하는 미생물에는 Acinetobacter sp., Agarivorans sp., Alteromonas sp., Bacillus sp., Cytophaga sp., Flavobacterium flevense, Microbulbifer sp., Microbulbifer thermotolerans, Microsilla, Pseudoalteromonas sp., Pseudoalteromonas antarctica, Pseudoalteromonas atlantica, Pseudomonas sp., Streptomyces coelicolor, Vibrio sp., Vibrio harveyi, Zobellia galactanivorans 등이 있고, 카라기난을 분해하는 효소, 카라기나제를 생산하는 미생물에는 Alatospora acuminata, Alatospora flagellata, Alteromonas, Anguillospora crassa, Anguillospora longissima, Articulospora tetracladia, Calcalispora hiemalis, Clavariopsis aquatica, Culicidospora gravida, Dactylella aquatica, Dendrospora erecta, Diadema setosum, Flagellospora penicillioides, Gyoerffyella gemellipara, Gyoerffyella rotula, Gyoerffyella speciosa, Heliscella stellata, Lateriramulosa uni-inflata, Lemonniera aquatica, Lemonniera centrosphaera, Lemonniera cornuta, Lemonniera terrestris, Margaritispora aquatica, Microbulbifer elongatus, Nectria lugdunensis, pleuropedium tricladioides, Pseudoalteromonas carrageenovora, Pseudomonas carrageenovora, Pyramidospora densa, Sigmoidea prolifera, Taeniospora gracilis, Tetrachaetum elegans, Tetracladium marchalianum, Tetracladium maxilliforme, Tetracladium setigerum, Tricellula aquatica, Tricladium splendens, Varicosporium elodeae, Vibrio sp., Volucrispora graminea 등이 있다.(http://www.brenda-enzymes.info)

그러나 아직까지 한천과 카라기난을 함유하고 있는 홍조류를 직접적으로 분 해하는 미생물에 대해 개발된 바는 없으며, 동시에 한천과 카라기난을 함께 분해하는 미생물 역시 현재 보고되지 않았다.

이에, 본 발명자들은 홍조류 가공공정에서 발생되거나 홍조류 추출 공정 중에 발생되는 부산물인 한천 및 카라기난을 재활용하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 신규 미생물 바실러스 알칼로필러스이 한천 및 카라기난을 동시에 분해하는 능력이 뛰어나다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 한천 및 카라기난 분해능을 가지는 신규 미생물 및 상기 신규 미생물을 이용하여, 홍조류 또는 한청 및 카라기난을 분해하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한천 및 카라기난 분해능을 가지는 바실러스 알칼로필러스 KACC91705P를 제공한다.

본 발명은 또한, 바실러스 알칼로필러스 KACC91705P를 이용하여 홍조류를 분해하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 바실러스 알칼로필러스 KACC91705P를 이용하여 한천 및 카라기난을 분해하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 홍조류 가공공정에서 발생되거나 홍조류 추출 공정 중에 발생되는 처리하기 어려운 부산물인 한천 및 카라기난으로부터 갈락토오스, 글루코오스 등의 환원당을 생산할 수 있어 환경보호 효과가 있으며, 생리활성물질이나 바이오에탄올 생산 등으로 재활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 6종의 순수균주 (1) SY1, (2) SY2, (3) SY3, (4) SYR1, (5) SYR2 및 (6) SYY1를 김 파우더 고체 평판 배지에 4일 간 37 ℃에서 배양한 후, 형성된 콜로니(A)와 루골용액(Lugol's solution)을 투여하여 김 분해에 의한 투명환(clear zone) (B)을 형성하는 모습을 비교하여 나타낸 결과이다.
도 2는 6종의 순수균주 (1) SY1, (2) SY2, (3) SY3, (4) SYR1, (5) SYR2, 및 (6) SYY1 를 한천 고체 평판 배지, 카라기난 고체 평판 배지에 4일간 37 ℃에서 배양한 후, 형성된 콜로니(A)와 루골용액(Lugol's solution)을 투여하여 한천 분해, 카라기난 분해에 의한 투명환(clear zone)을 형성하는 모습을 비교하여 나타낸 결과이다.
도 3은 분리 균주를 8일 간 250-ml 플라스크에서 배양 시, 김 파우더의 각 농도별 (a) 10 g·l^-1, (b) 5 g·l^-1 분리 균주의 김 분해 반응결과를 나타낸 그래프이다[pH (▲); Cell density (●); Total reducing sugars (·)].
도 4는 분리 균주를 8일 간 250ml 플라스크에서 배양 시, 한천 및 카라기난 각 농도별 (a) 3 g·l^-1, (b) 1 g·l^-1 분리 균주의 한천 및 카라기난 분해 반응결과를 나타낸 그래프이다 [pH (▲); Cell density (●); Total reducing sugars (·)].
도 5는 한천 고체 평판 배지에 분리 균주를 6일 간 37 ℃에서 배양하였을 때 한천 분해에 의한 투명환(clear zone)을 형성하는 모습(A)과 카라기난 고체 평판 배지에 분리 균주를 6일 간 37 ℃에서 배양하였을 때 카라기난 분해에 의한 투명환(clear zone)을 형성하는 모습(B)을 나타내는 결과이다.

본 발명은 일 관점에서, 한천 및 카라기난 분해능을 가지는 바실러스 알칼로필러스 KACC91705P에 관한 것이다.

현재까지 한천과 카라기난을 함유하고 있는 홍조류를 직접적으로 분해하는 미생물에 대해서는 개시된 바가 없으며, 동시에 한천과 카라기난을 함께 분해하는 미생물 역시 현재 보고되지 않고 있었다.

본 발명의 바실러스 알칼로필러스 KACC91705P 균주는 한천과 카라기난을 함유하고 있는 홍조류를 직접적으로 분해하는 미생물인 동시에 아가라제와 카라기나제를 생산하여 한천뿐만 아니라 카라기난도 함께 분해하는 신규의 균주로서, 홍조류 가공 및 추출 공정 시 발생되는 부산물이나 폐기물의 문제를 처리하고 바이오 연료 및 생리활성물질을 생산할 수 있다.

본 발명에서는 홍조류 가공공정 및 추출공정에서 발생되는 폐기 해조다당류인 한천 및 카라기난을 효율적으로 분해할 수 있는 미생물을 흙, 해수, 갯벌 등 다양한 환경에서 수집된 샘플로부터 분리하고, 상기 순수분리 미생물 바실러스 알칼로필러스 KACC91705P이 한천 및 카라기난을 분해한다는 것을 확인하였다. 또한, 상기 미생물에 의해 한천 및 카라기난이 분해되면, 분해 산물로서는 갈락토오스, 글루코오스 및 올리고당의 환원당이 생성됨을 확인하였다.

다른 관점에서, 본 발명은 바실러스 알칼로필러스 KACC91705P를 이용하여 홍조류를 분해하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 바실러스 알칼로필러스 KACC91705P는 한천과 카라기난을 함유하는 홍조류를 분해할 수 있으며, 일 실시예에서는 김 파우더를 함유하는 고체 배지에서 바실러스 알칼로필러스 KACC91705P를 배양한 결과, 루골용액을 통한 확인 결과, 김을 분해를 투명환을 형성하는 것을 확인하였다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 또한, 바실러스 알칼로필러스 KACC91705P를 이용하여 한천 및 카라기난을 분해하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 바실러스 알칼로필러스 KACC91705P는 한천과 카라기난을 분해할 수 있으며, 일 실시예에서는 한천 및 카라기난을 각각 함유하는 각각의 고체 배지에서 바실러스 알칼로필러스 KACC91705P를 배양한 결과, 루골용액을 통한 확인 결과, 한천 및 카라기난을 분해하여, 투명환을 형성하는 것을 확인하였다.

본 발명의 바실러스 알칼로필러스 KACC91705P는 홍조류에 함유된 한천 및 카라기난을 분해하고, 분해 산물로서는 갈락토오스, 글루코오스 및 올리고당의 환원당을 생성시킨다. 이러한 환원당은 바이오에탄올 생산에 사용될 수 있어, 결과적으로, 홍조류를 이용한 바이오에탄올 생산에 본 발명의 바실러스 알칼로필러스 균주가 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 한천 및 카라기난 분해 미생물의 순수분리

토양, 갯벌 및 해산 동물의 내장으로부터 채취한 샘플에서 효과적으로 한천 및 카라기난을 분해하는 세균을 분리하였다. ·

채취해온 샘플을 100ml 플라스크의 김 첨가 배지(김 자체 1.5 g, Sea water, pH 7.42)에 접종하여 21일 간 37 ℃, 100 rpm에서 진탕배양하거나 250-ml 플라스크의 김 파우더 배지(김 파우더 10 g·l^-1, NH₄Cl 1 g·l^-1, Tap water, pH 6.8)에 접종하여 7일 간 37 ℃, 180 rpm에서 진탕배양한 후, 각각 1% 김 파우더 배지(NH₄Cl 1 g·l^-1, Tap water, pH 6.8)에 1.5% 한천을 첨가한 고체배지에 도말하였다. 배양된 각 미생물은 순수한 콜로니로 분리될 때까지 계속하여 새로운 고체배지에 도말하여 각 균주를 최종 순수 분리하였다. 순수 콜로니를 형성하는 6종의 균주를 확인하였고, 상기 분리된 6개 균주를 각각 SY1, SY2, SY3, SYR1, SYR2 및 SYY1으로 명명하였다. 분리된 순수 균주는 4℃에 보관하면서 2주에 한 번씩 계대배양 하였다.

상기 분리된 순수 균주에서 유용한 미생물을 스크리닝하기 위하여, 김 파우더 배지(김 파우더 10 g·l^-1, NH₄Cl 1 g·l^-1, Tap water, pH 6.8)에 지시약 Bromocresol Purple(0.5 g·l^-1)와 1.5% 한천을 첨가한 고체배지에 상기 순수 균주를 도말하였다.

그 결과, 6종의 균주 중, 지시약을 첨가한 김 파우더 한천배지에서 pH 변화에 따른 배지색의 변화를 나타내는 균주 SYR1을 확인하였다.

실시예 2: 한천 및 카라기난 분해 미생물의 선별

실시예 1에서 분리한 6개의 순수균주 중에서 김을 분해하는 것을 확인하기 위하여 김 파우더 고체 배지에 도말하여 37℃에서 1~2일 동안 배양하였으며, 각 균주들을 10 ml 튜브 내의 5 ml 김 파우더 액체배지에 접종하여 37 ℃, 180 rpm에서 1~2일 간 진탕배양을 하고, 각 균주 배양액 10 ㎕를 김 파우더 고체 평판 배지에 점적(drop)하여 건조시킨 후, 4일 간 37 ℃에서 배양하였다. 각 균주가 형성한 배지 위에 콜로니를 확인한 후, 김 파우더 평판배지에 루골용액(Lugol's 용액)(KI 10 g·l^-1, I 5 g·l^-1) 10 ml을 투여하여 5분 간 염색하고 나서 용액을 버린 다음, 김 분해에 의한 투명환(clear zone)을 확인하여 김의 분해능을 실험하였다.

그 결과, 분리된 6종의 균주 중, 김 파우더 고체 평판 배지에서 가장 높은 분해능을 보인 균주가 SYR1임을 확인하였다 (도 1).

위의 결과를 토대로 분리한 6개의 순수 균주 중에서 SYR1 균주의 한천 및 카라기난을 분해하는 것을 확인하기 위하여, 김 파우더 고체 배지에 도말하여 37 ℃에서 1~2일 동안 배양하였으며, 각 균주들을 10 ml 튜브 내의 5 ml 김 파우더 액체배지에 접종하여 37 ℃, 180 rpm에서 1~2일 간 진탕배양을 하고, 각 균주 배양액 10 ㎕를 한천 고체 평판 배지 및 카라기난 고체 평판 배지에 점적(drop)하여 건조시킨 후, 4일 간 37 ℃에서 배양하였다. 각 균주가 형성한 배지 위에 콜로니를 확인한 후, 한천 및 카라기난 평판배지에 루골용액 10 ml을 투여하여 5분간 염색하고 나서 용액을 버린 다음, 한천 및 카라기난 분해에 의한 투명환(clear zone)을 확인하여 한천 및 카라기난의 분해능을 실험하였다.

그 결과, 분리된 6종의 균주 중, 한천 및 카라기난 고체 평판 배지에서 가장 높은 분해능을 보인 균주가 SYR1임을 확인하였다 (도 2).

실시예 3. 한천 및 카라기난 분해 미생물의 동정

실시예 2에서 가장 높은 한천 및 카라기난 분해능을 보인 SYR1 균주를 그람염색(Gram staining), 카탈라제 테스트, 콜로니 형태 및 현미경 검사를 통하여 일차적으로 동정하였다.

상기 SYR1 균주는 배지의 종류 및 상태마다 다양한 특성을 가진다. 영양 상태의 고체배지에서 활발한 운동성을 가지고, 0.5~1.2 μm의 넓이와 2~4 μm의 길이를 가지는 그람 양성의 간균이며, pH 6.8과 pH 8 사이에서 최적 분해 능력을 가졌다. 0.8% 영양 고체 배지, 1% 김 파우더 고체 배지, 1% 한천 고체배지 및 1% 카라기난 고체배지에 37 ℃, 2일 간 배양하였을 때, 각각 주황색 콜로니, 분홍색 콜로니와 흰색 콜로니를 형성하였으며, 카탈라제 테스트 결과, 양성임을 나타내었다.

배지	김		영양배지 (Nutrient broth)	한천		카라기난
배지상태	고체	액체	고체	고체	액체	고체	액체
넓이 (㎛)	0.5-1.2	0.5-1.2	1-1.2	0.8-1	0.8-1	0.8-1	0.8-1
길이 (㎛)	3-4	2-4	2-4	2	2-3	2-3	2-3
포자 형태	타원형	타원형	타원형	타원형	타원형	타원형	타원형
포자 위치	말단	말단	말단	중심에 가까운 또는 말단	중심에 가까운 또는 말단	중심에 가까운	중심에 가까운 또는 말단
운동성	+	+	+	-	+	-	+
콜로니 색상	옅은 분홍색	-	옅은 주황색	흰색	-	흰색	-
그람 염색	+
카탈라제	+

2차 동정은 16S-rRNA 서열을 분석하여 수행하였다. 각 균주의 염색체 DNA는 AccuPrep 염색체 DNA 추출 킷트(바이오니아, 한국)를 사용하여 분리하였으며, 분리된 DNA를 주형으로 하여 하기의 프라이머를 이용하여 PCR을 사용하여 수행하였으며, 그 결과, 각각의 균주에서 약 1500 bp 크기 단편의 16SrRNA 유전자가 증폭되었다.

518F 프라이머: 5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3' (서열번호 1)

800R 프라이머: 5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3‘ (서열번호 2)

DNA의 PCR product를 16SrRNA sequencing 분석(마크로젠, 한국)을 의뢰한 후, (주)마크로젠에서 분석하여 결정된 16SrRNA 부분 서열의 결과는 SYR1 균주의 16S-rRNA 염기서열을 서열번호 3에 나타내었다.

상기 결과를 BioEdit Sequence Alignment Editor(ver. 5.0.9, Hall, T., Nucleic Acids Symposium Series, 41: 95, 1999)를 이용하여 GenBank의 Advanced BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 상동성 검색을 수행하였다(Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389, 1997). 그 결과, SYR1 균주는 바실러스 알칼로필러스 종으로 동정되었다.

미생물	16S-rDNA 크기	GenBank Accession No.	균주명	상동성
SYR1	1560 bp	EU231621.1	Bcillus alcalophilus	97%

상기 SYR1 균주는 2012년 1월 20일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁번호 KACC 91705P로 기탁하였다.

실시예 4. 김 파우더 농도별 SYR1의 분해 반응

본 실시예에서는 SYR1 균주가 5 및 10 g·l^-1의 다른 김 파우더 농도에서 김을 분해하여 유용물질 생산 가능성을 확인하였다.

실시예에서 사용할 SYR1 균주는 1% 김 파우더 액체배지에 접종하여 37 ℃, 180 rpm에서 1~2일 간 진탕배양을 한 후, 대수 증식기가 끝났을 때 사용하였다.

배양은 250ml 플라스크를 사용하여, 각각의 다른 농도의 김 파우더가 함유된 50 ml 액체 배지에 상기 SYR1 균주 2% 을 접종하여 30 ℃, 150 rpm에서 8일 간 분해 반응을 수행하였다.

상기와 같이 생분해 반응을 수행하는 동안 2일 간격으로 플라스크 내의 샘플을 채취하여 분해 반응의 특성을 분석하였다. 분해 반응 동안 배양 배지 내 pH의 변화는 pH meter (이스텍, 한국)을 이용해 측정하였으며, 3일 간격으로 멸균된 NaOH와 HCl을 이용하여 pH 7과 pH 8 사이가 되도록 조절하였다. 미생물의 농도는 3배로 희석한 샘플을 큐벳에 담은 후, 분광광도계(한빛 나노 바이오테크, 한국)를 이용하여 특정 파장(400nm)에서 측정하였다. 분해 반응에서 생성되는 총 환원당 (Total Reducing sugars) 농도는 배양액을 원심 분리(7000 rpm, 10분) 한 상등액 100 ㎕과 1 ml DNS (3.5-dinitrosalicylic acid) 용액을 vortex를 이용하여 균일하게 혼합한 다음, 끓는 물에서 10분 간 반응시킨 후, 5분간 냉수에서 식힌 다음, 분광광도계를 이용하여 570nm 파장에서 그 값을 측정하였다.

각 김 파우더 농도별 분해실험 결과를 살펴보면, 5 g·l^-1와 10 g·l^-1김 파우더 농도에서 배양 초기 7.8이었던 pH 값은 최종 배양 8일 후에 각각 8.26 및 8.19이였고, 미생물의 밀도는 배양 6일 때 가장 높은 값을 보이며, 생성된 총 환원당은 각각 0.76 g·l^-1 및 1.8 g·l^-1이었다 (도 3).

김 파우더 각 농도별 분해 실험결과에서 낮은 농도보다 농도가 높은 10 g·l^-1의 김 파우더 농도에서 더 좋은 분해반응이 일어남을 알 수 있었다.

실시예 5. 한천 및 카라기난 농도별 SYR1의 분해 반응

본 실시예에서는 SYR1 균주가 1 및 3 gl^-1 의 다른 한천 및 카라기난 농도에서 한천 및 카라기난을 분해하여 유용물질 생산 가능성을 확인하였다.

실험에 사용할 SYR1 균주는 1% 김 파우더 고체배지에 37 ℃에서 1~2일 간 배양을 한 후, 대수 증식기가 끝났을 때 사용하였다.

각각의 다른 농도의 50 ml 한천 액체 배지 (Agar, NaNO₃2 g·l^-1, K₂HPO₄0.5 g·l^-1, MgSO₄7H₂O 0.5 g·l^-1,KCl 0.5 g·l^-1, CaCl₂2H₂O 0.1 g·l^-1, FeSO₄7H₂O 0.02 g·l^-1, Yeast extract 0.5 g·l^-1, Tap water, pH 7.8) 및 50 ml 카라기난 액체 배지(Carrageenan, NH₄Cl 1 g·l^-1, K₂HPO₄0.3 g·l^-1, KH₂PO₄0.1 g·l^-1, Yeast extract 0.4 g·l^-1, Tap water, pH 7.8)가 담겨진 250ml 플라스크를 사용하여, 상기 SYR1 균주를 접종하여 30 ℃, 150 rpm에서 8일 배양하였고, 실시예 4와 동일한 분석 방법을 사용하여 실험을 수행하였다.

각 한천 농도별 분해실험 결과를 살펴보면, 1 g·l^-1와 3 g·l^-1한천 농도에서 배양 초기 7.8 이었던 pH 값은 최종 배양 8일 후에 각각 7.93 및 7.77이였고, 미생물의 밀도는 배양 2일 후부터 거의 일정한 농도를 유지하며 각각 배양 8일, 4일 때 가장 높은 값을 보였다. 생성된 총 환원당은 각각 0.24 g·l^-1 및 0.41 g·l^-1이었다 (도 4).

각 카라기난 농도별 분해실험 결과를 살펴보면, 1 g·l^-1와 3 g·l^-1카라기난 농도에서 배양 초기 7.8 이었던 pH 값은 최종 배양 8일 후에 7.72이였고, 미생물의 밀도는 배양 2일 후부터 거의 일정한 농도를 유지하며 각각 배양 8일, 2일 때 가장 높은 값을 보였다. 생성된 총 환원당은 각각 0.21 g·l^-1 및 0.38 g·l^-1이었다 (도 4).

한천 및 카라기난 각 농도별 분해 실험결과에서 낮은 농도보다 농도가 높은 3 g·l^-1의 한천 및 카라기난 농도에서 더 좋은 분해반응이 일어남을 알 수 있었다.

실시예 6. 한천 및 카라기난 분해 능력 측정

실시예 2에서는 분리 균주 SYR1가 한천 외에 홍조류의 대표적 다당류인 카라기난을 분해할 수 있는 능력이 있음을 확인하였다.

본 실시예에서는 상기 분리된 SYR1 균주가 한천 및 카라기난을 분해할 수 있는 능력이 있음을 확인하고 시간별로 관찰하였다.

한천 배지(Agar 10 g·l^-1, NaNO₃2 g·l^-1, K₂HPO₄0.5 g·l^-1, MgSO₄7H₂O 0.5 g·l^-1,KCl 0.5 g·l^-1, CaCl₂2H₂O 0.1 g·l^-1, FeSO₄7H₂O 0.02 g·l^-1, Tap water)와 카라기난 배지(Carrageenan 10 g·l^-1, NH₄Cl 1 g·l^-1, Tap water)의 중앙에 2일간 김 파우더 액체 배지(1%)에서 배양한 SYR1 균주 배양액 20 ㎕을 점적(drop)하여 건조시킨 후, 37 ℃ 배양기에서 배양하였다. SYR1 균주가 배지 위에 콜로니를 형성한 후, 한천 평판배지에 Lugol's 용액(KI 10 gl^-1, I 5 gl^-1) 10 ml을 투여하여 5분간 염색하고 나서 용액을 버린 다음, 루골용액으로 인해서 보라색으로 염색된 한천 평판배지 상의 콜로니 주변에 주황색의 환의 형성 유무 및 시간에 따른 환의 크기 변화를 관찰하였다. 한천과 비슷한 구조의 성분으로 이루어진 카라기난 고체 평판 배지에도 루골용액(KI 10 g·l^-1, I 5 g·l^-1) 10 ml을 투여하여 5분간 염색하고 나서 용액을 버린 다음, 루골용액으로 인해서 갈색으로 염색된 카라기난 평판배지 상의 콜로니 주변에 노란색의 환의 형성 유무 및 시간에 따른 환의 크기 변화를 관찰 하였다 (Saraswathi, S. et al., African Journal of Microbiology Research. 5:2960, 2011).

상기의 방법대로 실험한 결과, 한천 평판배지에서 배양된 콜로니 주변이 2일, 4일, 6일이 지남에 따라 반지름이 0.8 ㎝, 1.15 ㎝, 1.6 ㎝인 주황색 환이 형성되어 시간이 경과하면서 SYR1 균주의 한천의 분해에 의해 그 환의 크기가 점차 커지는 것을 확인하였고, 카라기난 평판배지에서도 콜로니 주변의 노란색 환이 2일, 4일, 6일이 지남에 따라 SYR1 균주의 카라기난의 분해에 의해 환의 반지름이 1 ㎝, 1.45 ㎝, 1.9 ㎝로 점차 커지는 것을 확인하였다 (도 5).

순수 분리한 SYR1 균주는 홍조류가 함유하는 다당류 중 한천 외의 카라기난도 분해하는 능력을 가지고 있음을 확인하였다.

실시예 7. 김 배양액의 상등액에 대한 한천 및 카라기난 분해 능력 측정

본 실시예에서는 상기 분리된 SYR1 균주 배양액의 상등액이 한천 및 카라기난을 분해할 수 있는 능력여부를 확인하였다.

한천 배지와 카라기난 배지의 중앙에 2일 간 김 파우더 액체 배지(1%)에서 배양한 SYR1 균주 배양액을 원심 분리(7000 rpm, 10분) 한 상등액 20 ㎕을 점적(drop)하여 건조시킨 후, 3일 간 37 ℃ 배양기에 두었다. 3일 후, 상기 실시예 6과 동일한 분해 능력 측정 방법을 사용하여 실험을 수행하였다.

상기 방법대로 실험한 결과, 상등액의 한천 및 카라기난의 분해에 의해 투명환(clear zone)을 형성하지 않았다.

결과적으로 순수 분리한 SYR1 균주는 세포내 한천 및 카라기난 분해 효소를 가지고 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

농업생명공학연구원

KACC91705P

20120207

<110> Pukyong National University Industry-University cooperation Foundation <120> Novel Microorganism Degrading agar and carrageenan <130> P12-B060 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ccagcagccg cggtaatacg 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 taccagggta tctaatcc 18 <210> 3 <211> 1559 <212> DNA <213> Bcillus alcalophilus <400> 3 attttttggc gtttttggtt ttggttccct gcttcaggac gaacgctggc cggcgtgcct 60 taatccatgc aaagtcgaag cggattgatg ggaagctggt tccctgttat caccgccgaa 120 cggttgatta ccacgtggtt accttcctgg taggactggg ataattccgg gaacccgggg 180 ttattcccgg ttaattcatt tcttgccagg aggaaatgtg aaaaggtggt ttcggctatc 240 acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga 300 cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 360 tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg 420 ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtac 480 cgttcgaata gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc 540 cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc 600 gcgcaggtgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg agggtcattg 660 gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga aagtggaatt ccaagtgtag cggtgaaatg 720 cgtagatatt tggaggaaca ccagtggcga aggcgacttt ctggtctgta actgacactg 780 agcggaaaga gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 840 gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc 900 cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 960 cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 1020 tctgacaacc ctagagatag ggctttcccc ttcgggggac agagtgacag gtggtgcatg 1080 gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1140 atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaagatgac tgccggtgac aaaccggagg 1200 aaggtggggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1260 aatggacggt acaaagggca gcgagaccgc gaggtttagc caatcccata aaaccgttct 1320 cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagctg gaatcgctag taatcgcgga 1380 tcaccatgcc gcggttgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga 1440 agagtttgta acacccgaag tccggtgagg taaccttttt ggagccagcc gcctaaggtg 1500 ggacagatga ttgggggtga tctacaaagg gggaggcgcg atatatataa ggagacaga 1559

Claims

한천 및 카라기난 분해능을 가지는 바실러스 알칼로필러스 KACC91705P.
바실러스 알칼로필러스 KACC91705P를 이용하여 홍조류를 분해하는 방법.
바실러스 알칼로필러스 KACC91705P를 이용하여 한천 및 카라기난을 분해하는 방법.