CN109161497A - 一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂及应用，属于黄曲霉毒素脱毒技术领域。本发明降解黄曲霉毒素的微生物制剂的有效成分为暹罗芽孢杆菌菌悬液或暹罗芽孢杆菌全培养液培养物或暹罗芽孢杆菌的粗提物或暹罗芽孢杆菌的胞外代谢物；所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。本发明的暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素具有高效的降解作用。

Description

一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂及应用
技术领域
本发明属于黄曲霉毒素脱毒技术领域，具体涉及一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂及应用。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxin)是一类主要由黄曲霉(Aspergillusflavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)等真菌产生的次级代谢物。从分子结构上分析，该类毒素是由二呋喃环和香豆素组成的结构类似物。曲霉毒素具有极强的致畸、致癌、致突变性，广泛污染花生、玉米、棉籽、稻谷、干果、牛奶等农产品和食品。我国是花生出口大国，每年都有出口花生到日本和欧盟因为黄曲霉毒素超标而导致的退回事件，是影响我国出口花生的主要问题。现在已鉴定出二十多种黄曲霉素素，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)分布范围最广，并且毒性最强，1993年AFB1被世界卫生组织癌症研究机构(IARC)归为IA类致癌物。
目前常用的脱除AFB1方法主要是物理法和化学法。物理法包括有挑拣、漂洗、高温加热、辐射法、溶剂萃取等方法，这些方法或者耗费大量人力物力效率不高，或者会破坏农产品的营养成分，以加热去除为例，AFB1的热稳定性较高，分解温度为在268℃。化学法是利用一些氧化剂、氢氧化钠等化学试剂与毒素反应造成毒素降低，但有很大的局限性，很多试剂对操作人员的皮肤、眼睛、呼吸道造成伤害，并且化学试剂残留不易去除，影响农产品和食品的质量安全。微生物脱毒法成为近年来的研究热点，该方法主要是利用细菌、真菌等微生物及其代谢产物去除食品中污染的AFB1，该脱毒法对原料无污染、具有高度专一性、同时避免毒素重新产生，降解条件温和、特异性强和脱毒效率高等优点，因此是一种高效、安全的去毒方法。微生物不同，脱毒效率明显不同，很多微生物能去除的AFB1效率低，需要寻找脱毒效率高的菌株。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂以及使用该微生物制剂对于黄曲霉毒素污染的农产品脱毒的方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂，其有效成分为暹罗芽孢杆菌菌悬液或暹罗芽孢杆菌全培养液培养物或暹罗芽孢杆菌的粗提物或暹罗芽孢杆菌的胞外代谢物；
所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
在上述方案的基础上，暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物的制备方法为：
取50μL冻存暹罗芽孢杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中，培养12h活化菌株，向100mL LB液体培养基中接入活化的500μL菌液，在37℃震荡发酵培养48h，菌液浓度为1.6×108cfu/mL。
在上述方案的基础上，暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液的制备方法为：
取10mL的暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物，菌液浓度为1.6×108cfu/mL，经10000r/min离心10min后，分离得到菌体和上清液，制备的菌体经无菌水洗涤后离心，加入无菌水补齐至10mL，悬浮菌体获得暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液。
在上述方案的基础上，暹罗芽孢杆菌A2025胞外代谢物的制备方法为：
取10mL的暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物，菌液浓度为1.6×108cfu/mL，经10000r/min离心10min后，分离得到菌体和上清液，上清液即为暹罗芽孢杆菌A2025胞外代谢物。
在上述方案的基础上，暹罗芽孢杆菌A2025粗提物的制备方法为：
暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液经低温超声破碎后，10000r/min离心10min得到的液体经0.22μm滤膜过滤制备暹罗芽孢杆菌A2025的粗提物。
上述降解黄曲霉毒素的微生物制剂在被黄曲霉毒素污染的农产品或由该农产品进一步加工成的制品脱毒中的应用。
一种黄曲霉毒素的脱毒方法，将上述微生物制剂与含有黄曲霉毒素的样品按照5mL/g混合，于37℃下孵育72h。
在上述方案的基础上，所述微生物制剂的有效成分为暹罗芽孢杆菌A2025的胞外代谢物。
在上述方案的基础上，所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1和/或黄曲霉毒素G1。
本发明技术方案的优点
本发明的暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素具有高效的降解作用，并且对黄曲霉毒素的降解率随着孵育时间的增加而提高，其中，在37℃孵育72h时降解效果最好。本发明的暹罗芽孢杆菌A2025不仅能够高效降解黄曲霉毒素B1，降解率97.1％；还对黄曲霉毒素G1具有很好的降解作用，降解率95.9％。而且，本发明的暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素的降解作用是细菌分泌至胞外的活性代谢物质主导的生物降解作用，不是细菌细胞壁的吸附作用。用本发明的暹罗芽孢杆菌A2025的胞外代谢物处理被黄曲霉毒素污染的花生，可显著降低污染花生中的黄曲霉毒素含量。
附图说明
图1 A2025菌落形态图；
图2 A2025菌株16S rRNA琼脂糖凝胶电泳图，左边是Marker，右边两个是A2025的16S rRNA电泳图；
图3暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解图谱(A是对照组，B是试验组)；
图4不同孵育时间暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解情况。
图5暹罗芽孢杆菌A2025对AFG1的降解图谱(A是试验组，B是对照组)；
图6暹罗芽孢杆菌A2025不同组分对AFB1的降解分析。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
实施例1样品采集、菌株分离及筛选
1、样品采集时间和地点
2017年5月5日上午从山东省花生研究所试验基地(青岛市莱西市望城镇)采集花生地土壤样品。
2、样品的处理、菌株的分离和筛选
在超净台中取1g采集的土壤样品悬浮在10mL无菌水中，震荡稀释制备土壤悬浊液，然后用无菌蒸馏水稀释100倍。取100μL悬浮液涂布在LB固体平板上，放置于37℃进行培养，3天后将长出的菌落在LB固体平板上进行划线纯化，经过3次划线纯化后，得到一个菌株，编号A2025。
实施例2菌株A2025的鉴定
按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中描述的方法，对菌株A2025进行形态特征和生理生化特征鉴定，具体结果如下：
1、形态特征：菌株A2025在LB培养基上单菌落凸起，乳白色，不透明(图1)，在37℃培养2天后，菌落约为4-6mm，培养3天后菌落表面出现皱褶。
2、生理生化特征：氧化酶活性为阴性，能在4-54℃生长，革兰氏染色为阳性，能水解利用酪蛋白、明胶和淀粉，不能利用吐温40和吐温80。
3、16S rRNA基因分析
提取A2025的细菌基因组DNA，利用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示；扩增产物连接到pMD19-T载体，转化重组质粒到大肠杆菌，测序得到的1508bp基因序列。根据EzTaxon-e server数据库标准菌株序列同源性比较，菌株A2025的16S rRNA基因与标准菌株Bacillus siamensis KCTC 13613T的16S rRNA基因同源性为100％，基因分析表明该菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。
综合形态特点、生理生化鉴定和16S rDNA测序和同源性分析的结果，鉴定菌株A2025为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。命名为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏单位为山东省花生研究所，保藏编号为CGMCC NO:15611。
实施例3暹罗芽孢杆菌A2025的培养
暹罗芽孢杆菌A2025的培养基为LB培养基：10g蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母提取物，水1000mL；能在4-54℃生长，最优培养温度为26-37℃，能在pH 5-9生长，最优pH为7-8。也可以在GY培养基生长，GY液体培养基：葡萄糖20g，酵母粉5g，水1000mL；GY固体培养基：葡萄糖20g，酵母粉5g，琼脂20g，水1000mL。
从-80℃冰箱中取出冻存的暹罗芽孢杆菌A2025，在超净工作台中取50μL暹罗芽孢杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中，培养12h活化菌株。向100mL LB液体培养基中接入活化的500μL菌液，在37℃震荡培养48h，菌液浓度为1.6×108cfu/mL。
实施例4暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素B1的降解
1、黄曲霉毒素B1的配置
将1mg黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFB1贮存溶液。取0.5mL 50ppm的AFB1，加入4.5mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFB1工作母液。
2、暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解
取1.96mL的暹罗芽孢杆菌A2025菌液(菌液浓度1.6×108cfu/mL)置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFB1工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育72h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作试验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL5000ppb的AFB1工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
3、37℃条件下暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解能力分析
首先加入甲醇到试验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对试验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1(体积比)；流速0.8mL/min；色谱柱C18(150mm×4.6mm，0.5μm)；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFB1降解率(％)＝(对照组AFB1含量–试验组AFB1含量)/对照组AFB1含量×100％
结果如图3所示。图3中，A：对照组；B试验组。结果表明，37℃条件下暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1降解效果较好，降解率为97.1％。
实施例5不同孵育时间暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解情况
取1.96mL的暹罗芽孢杆菌A2025菌液(菌液浓度1.6×108cfu/mL)置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFB1工作母液至其终浓度为100ppb，共12管，每3管为一个平行；颠倒混匀后分别于37℃孵育12h、24h、48h、72h，检测不同孵育时间暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解情况，如图4所示：
由图4可知，随着孵育时间的增加，黄曲霉毒素B1的降解率逐渐增加，在孵育12h、24h、48h和72h时间，AFB1的降解率分别为16.3％、41.7％、73.2％和97.1％。
实施例6暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素G1的降解
1、黄曲霉毒素G1的配置
将1mg黄曲霉毒素G1(AFG1)标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFG1贮存溶液。取0.5mL 50ppm的AFG1，加入4.5mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFG1工作母液。
2、暹罗芽孢杆菌A2025对AFG1的降解
取1.96mL的暹罗芽孢杆菌A2025菌液(菌液浓度1.6×108cfu/mL)置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFG1工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育72h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作试验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL5000ppb的AFG1工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
3、37℃条件下暹罗芽孢杆菌A2025对AFG1的降解能力分析
首先加入甲醇到试验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对试验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1(体积比)；流速0.8mL/min；色谱柱C18(150mm×4.6mm，0.5μm)；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFG1降解率(％)＝(对照组AFG1含量–试验组AFG1含量)/对照组AFG1含量×100％
结果如图5所示。A：试验组；B对照组。结果表明，37℃条件下暹罗芽孢杆菌A2025对AFG1降解效果较好，降解率为95.9％。
实施例7暹罗芽孢杆菌A2025降解黄曲霉毒素的机理
取10mL实施例3中的暹罗芽孢杆菌A2025发酵菌液(菌液浓度1.6×108cfu/mL)，经10000r/min离心10min后，分离得到菌体和上清液(胞外代谢物)。制备的菌体经无菌水洗涤后离心，加入无菌水补齐至10mL，悬浮菌体获得暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液。暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液经低温超声破碎后，10000r/min离心10min得到的液体经0.22μm滤膜过滤制备暹罗芽孢杆菌A2025的胞内液(粗提物)。将暹罗芽孢杆菌A2025上清液、菌悬液、胞内液三种组分分别加入AFB1，使AFB1终浓度为100μg/kg，在37℃孵育72h后，检测分析各组分的AFB1降解率。
比较暹罗芽孢杆菌A2025不同组分的降解能力，发现其上清液、菌悬液、胞内液能分别降解97.1％、16.6％和9.3％的AFB1(图6)。这表明暹罗芽孢杆菌A2025降解AFB1是细菌分泌至胞外的活性代谢物物质主导的生物降解作用，而不是细菌细胞壁的吸附作用。
实施例8暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素污染的花生的脱毒
取50μL冻存暹罗芽孢杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中，培养12h活化菌株，向100mL LB液体培养基中接入活化的500μL菌液，在37℃震荡发酵培养48h，菌液浓度为1.6×108cfu/mL。
取上述在LB液体培养基中37℃震荡培养48h的暹罗芽孢杆菌A2025发酵菌液(菌液浓度为1.6×108cfu/mL)，经10000r/min离心10min后，分离得到上清液。
黄曲霉毒素污染的花生样品经研磨后分为2份，每份1g，编号分别为1号和2号。1号样品经121℃灭菌15min，加入5mL灭过菌的LB培养基；2号样品经121℃灭菌15min处理后降温，接入5mL暹罗芽孢杆菌A2025的发酵上清液，两份样品都做37℃孵育处理72h。
加入甲醇到1号或2号样品分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对1号组和2号组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到样品的AFB1进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1(体积比)；流速0.8mL/min；色谱柱C18(150mm×4.6mm，0.5μm)；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
检测到经过脱毒处理后2号样品中AFB1浓度为7.8μg/kg，而对照的1号样品中AFB1浓度为43.5μg/kg，由此可见，AFB1降解率为82.1％，结果表明暹罗芽孢杆菌A2025上清液可显著降低污染花生中的黄曲霉毒素含量。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 山东省花生研究所
<120> 一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂及应用
<130> 2018
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1508
<212> DNA
<213> 16S rRNA(Bacillus siamensis)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120
cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180
accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240
cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300
ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360
gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420
cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480
gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540
gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600
gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660
gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720
agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840
tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900
aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960
ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020
gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080
agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140
tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200
atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg 1260
aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320
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tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440
gaggtaacct ttatggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500
acaaggta 1508

Claims (9)

1.一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂，其特征在于：其有效成分为暹罗芽孢杆菌菌悬液或暹罗芽孢杆菌全培养液培养物或暹罗芽孢杆菌的粗提物或暹罗芽孢杆菌的胞外代谢物；
所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
2.根据权利要求1所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂，其特征在于：暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物的制备方法为：
取50μL冻存暹罗芽孢杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中，培养12h活化菌株，向100mL LB液体培养基中接入活化的500μL菌液，在37℃震荡培养48h，菌液浓度为1.6×108cfu/mL。
3.根据权利要求1所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂，其特征在于：暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液的制备方法为：
取10mL的暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物，菌液浓度为1.6×108cfu/mL，经10000r/min离心10min后，分离得到菌体和上清液，制备的菌体经无菌水洗涤后离心，加入无菌水补齐至10mL，悬浮菌体获得暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液。
4.根据权利要求1所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂，其特征在于：暹罗芽孢杆菌A2025胞外代谢物的制备方法为：
取10mL的暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物，菌液浓度为1.6×108cfu/mL，经10000r/min离心10min后，分离得到菌体和上清液，上清液即为暹罗芽孢杆菌A2025胞外代谢物。
5.根据权利要求1所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂，其特征在于：暹罗芽孢杆菌A2025粗提物的制备方法为：
暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液经低温超声破碎后，10000r/min离心10min得到的液体经0.22μm滤膜过滤制备暹罗芽孢杆菌A2025的粗提物。
6.权利要求1～5任一项所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂在被黄曲霉毒素污染的农产品或由该农产品进一步加工成的制品脱毒中的应用。
7.一种黄曲霉毒素的脱毒方法，其特征在于：将权利要求1～5任一项所述的微生物制剂与含有黄曲霉毒素的样品按照5mL/g混合，于37℃下孵育72h。
8.根据权利要求7所述黄曲霉毒素的脱毒方法，其特征在于：所述微生物制剂的有效成分为暹罗芽孢杆菌A2025的胞外代谢物。
9.根据权利要求7或8所述黄曲霉毒素的脱毒方法，其特征在于：所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1和/或黄曲霉毒素G1。
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