CN112831439A - 伯克霍尔德菌在黄曲霉毒素降解中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了伯克霍尔德菌在黄曲霉毒素降解中的应用，属于有害物质降解技术领域。本发明的伯克霍尔德菌为伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)G12；该菌株于2020年9月25日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20817，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的伯克霍尔德菌G12对黄曲霉毒素的降解率高、特异性强，且作用条件温和，脱除效率高，在黄曲霉毒素降解和脱除领域具有较好的应用前景。

Description

伯克霍尔德菌在黄曲霉毒素降解中的应用
技术领域
本发明属于有害物质降解技术领域，具体涉及伯克霍尔德菌在黄曲霉毒素降解中的应用。
背景技术
黄曲霉毒素是一类由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等真菌产生的次级代谢产物。20世纪60年代英国发生了十万只火鸡死亡事件，调查发现火鸡食用了黄曲霉毒素污染的花生粕导致中毒死亡。黄曲霉毒素具有致突变、致癌性、强肝毒性、致畸性，严重危害人和动物健康。黄曲霉毒素性质稳定，在花生、玉米等农产品及制品、粮油和饲料中广泛存在，污染后难以消除，能残留在肉、蛋、奶等畜产品中，并随着食物链的传递和富集而威胁人类健康和生命安全。目前已经发现了二十多种黄曲霉毒素，其中黄曲霉毒素B1毒性最强、分布最广、危害最大、致癌力最强。因此，采取有效措施对已污染黄曲霉毒素的农产品和食品进行脱毒，成为粮食与食品工业、饲料业和畜牧业亟待解决的难题。
目前黄曲霉毒素脱毒的方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法包括剔除发霉粮食颗粒法、硅藻土等吸附剂吸附法、紫外线辐照法、高温处理法、熏蒸法等；化学法包括臭氧、过氧化氢等氧化法、有机试剂脱毒法、氨处理法等；生物法主要包括生物吸附法和生物降解法。物理法和化学法存在转移而未降解黄曲霉毒素、向食品中引入化学残留、破坏食品营养等问题，而生物降解法因为对毒素高度专一性、无污染、不破坏食品营养等优点，成为近年来黄曲霉毒素脱毒的研究热点。该方法主要是利用微生物及其代谢产物去除食品中污染的黄曲霉毒素，该脱毒法对原料无污染、具有高度专一性、同时避免毒素重新产生，降解条件温和、特异性强和脱毒效率高等优点，因此是一种高效、安全的去毒方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供伯克霍尔德菌在黄曲霉毒素降解中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
伯克霍尔德菌在黄曲霉毒素降解中的应用。
在上述方案的基础上，所述伯克霍尔德菌为伯克霍尔德菌(Burkholderialatens)G12；该菌株于2020年9月25日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20817，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在上述方案的基础上，所述的黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1或黄曲霉毒素G1。
保藏编号为CGMCC No.20817的伯克霍尔德菌G12在制备降解黄曲霉毒素的制剂中的应用。
一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂，有效成分包含保藏编号为CGMCC No.20817的伯克霍尔德菌G12的发酵液。
在上述方案的基础上，所述发酵液中伯克霍尔德菌G12的含量≥2.9×108cfu/mL。
在上述方案的基础上，所述伯克霍尔德菌G12的发酵液是将伯克霍尔德菌G12接种于LB液体培养基中培养获得。
上述降解黄曲霉毒素的微生物制剂在粮食、饲料、食品中黄曲霉毒素降解中的应用。
一种降解黄曲霉毒素的方法，向待降解的样品中加入伯克霍尔德菌G12发酵液，然后置于30℃，避光孵育3天；其中伯克霍尔德菌G12发酵液的菌浓度≥2.9×108cfu/mL。
在上述方案的基础上，所述伯克霍尔德菌G12发酵液添加量为10mL/20g的样品。
本发明技术方案的优点
本发明的伯克霍尔德菌G12对黄曲霉毒素具有较好的降解效果，黄曲霉毒素B1降解率高达93.6％，黄曲霉毒素G1降解率高达73.3％；采用本发明的伯克霍尔德菌G12制备成发酵液对污染黄曲霉毒素的花生粕进行脱毒，结果显示，花生粕中黄曲霉毒素的脱除率为89％；由此可见，本发明的伯克霍尔德菌G12对黄曲霉毒素的降解率高、特异性强，且作用条件温和，脱除效率高，在黄曲霉毒素降解和脱除领域具有较好的应用前景。
附图说明
图1菌株G12菌落形态图；
图2菌株G12的16S rRNA电泳图(1为菌株G12 16S rRNA扩增条带，2为Marker)；
图3黄曲霉毒素B1降解前后的液相色谱图；
图4黄曲霉毒素G1降解前后的液相色谱图；
图5菌株G12对花生粕样品中黄曲霉毒素的降解结果。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1菌株G12的分离、纯化、鉴定
(1)分离纯化
2018年5月采用稀释培养法从青岛沿海的海水中分离细菌。具体步骤为：
取1mL海水，加入100mL灭菌水，进行稀释，取稀释液在LB固体平板上分离细菌菌株，根据菌株的颜色、形态等特征进行初步分类，通过划线纯化得到纯的菌株，编号为G12，在LB液体培养基中培养，加入终浓度为20％的甘油，冻存于-20℃冰箱备用。
(2)菌株鉴定
按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中描述的方法，对菌株G12进行形态特征和生理生化特征鉴定，具体结果如下：
1、形态特征：菌株G12在LB培养基上单菌落凸起，不透明，培养2天后，菌落约为5-8mm(图1)。
2、菌株G12具有如下生物学性质：能在4-42℃生长，革兰氏染色为阴性，能利用葡萄糖、阿拉伯糖、D-甘露糖，D-甘露醇，己二酸，不能利用麦芽糖。
3、16S rRNA基因分析
提取G12的细菌基因组DNA，利用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示；扩增产物连接到pMD19-T载体，转化重组质粒到大肠杆菌，测序得到的基因序列。根据EzTaxon-e server数据库标准菌株序列同源性比较，菌株G12的16S rRNA基因与标准菌株Burkholderia latens LMG 24064T的16S rRNA基因同源性为100％，基因分析表明该菌为伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)。所述的G12的16S rRNA序列如SEQ IDNo.1所示。
SEQ ID No.1
Figure BDA0002924321500000031
Figure BDA0002924321500000041
综合形态特点、生理生化鉴定和16S rDNA测序和同源性分析的结果，鉴定菌株G12为伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)。命名为伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)G12，于2020年09月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏单位为山东省花生研究所，保藏编号为CGMCC NO.20817。
实施例2菌株G12对黄曲霉毒素B1降解作用
将菌株G12接种于LB液体发酵培养基(g/L)：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，pH 7.0，培养2天。取1980μL菌液(菌浓度为2.9×108cfu/mL)加入20μL的10mg/kg黄曲霉毒素B1标准品，30℃避光孵育3天。
孵育完成后的菌液10 000r/min离心10min，上清液经0.22μm滤膜过滤后过免疫亲和柱，先用超纯水洗两遍，然后用色谱级甲醇洗脱，收集洗脱液。采用高效液相色谱检测溶液中黄曲霉毒素B1的含量，HPLC检测条件为：C-18色谱柱(4.6mm×15cm×5μm)，进样量为20μL，流动相为甲醇：水＝1：1(V/V)，流速0.8mL/min，荧光检测器激发波长为360nm，发射波长为440nm。利用以下公式计算菌株对黄曲霉毒素B1的降解率：
Figure BDA0002924321500000042
C代表降解前黄曲霉毒素B1的峰面积，S代表G12菌液处理样品中残留黄曲霉毒素B1的峰面积，Y代表黄曲霉毒素B1降解率。
检测结果如图3所示，经菌株G12孵育后，黄曲霉毒素B1降解率高达93.6％，降解率较高。
实施例3菌株G12对黄曲霉毒素G1的降解作用
将菌株G12接种于LB液体培养基(g/L)：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，pH7.0，培养2天。取1980μL菌液(菌浓度为2.9×108cfu/mL)加入10μL的5mg/kg AFG1标准品，30℃避光孵育3天。
孵育完成后的菌液10 000r/min离心10min，上清液经0.22μm滤膜过滤后过免疫亲和柱，先用超纯水洗两遍，然后用色谱级甲醇洗脱，收集洗脱液。采用高效液相色谱检测溶液中黄曲霉毒素G1的含量，HPLC检测条件为：C-18色谱柱(4.6mm×15cm×5μm)，进样量为20μL，流动相为甲醇：水＝1：1(V/V)，流速0.8mL/min，荧光检测器激发波长为360nm，发射波长为440nm。利用以下公式计算菌株对黄曲霉毒素G1的降解率：
Figure BDA0002924321500000051
C代表降解前黄曲霉毒素G1的峰面积，S代表G12菌液处理样品中残留黄曲霉毒素G1的峰面积，Y代表黄曲霉毒素G1降解率。
检测结果如图4所示，经菌株G12孵育后，黄曲霉毒素G1被降解，降解率为73.3％，结果表明菌株G12可降解黄曲霉毒素G1。
实施例4菌株G12对花生样品中黄曲霉毒素的降解作用
以黄曲霉毒素B1超标的花生粕样品为研究对象，检测伯克霍尔德菌G12对花生粕中黄曲霉毒素的降解情况，具体步骤为：
样品S1为黄曲霉毒素B1超标的20g花生粕样品；经过灭菌处理后，加入10mL的灭菌的发酵培养基，作为对照；样品S2为黄曲霉毒素B1超标的20g花生粕样品经过灭菌处理后，加入10mL的LB培养基发酵培养的菌株G12(浓度为4.7×108cfu/mL)菌液，作为实验组。
两组避光30℃孵育72h后，检测两者样品中黄曲霉毒素含量结果如图5所示：样品S1的黄曲霉毒素B1的含量为139μg/kg，而加入菌株G12菌液处理的样品S2经72h孵育后，黄曲霉毒素B1的含量明显降低至15μg/kg。经过菌株G12的处理，花生粕中的黄曲霉毒素B1可显著降低89％。因而，本发明的菌株G12能显著降解黄曲霉毒素超标的花生样品中黄曲霉毒素B1。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 山东省花生研究所
<120> 伯克霍尔德菌在黄曲霉毒素降解中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1427
<212> DNA
<213> 伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)
<400> 1
cctccttgcg gttagactag ccacttctgg taaaacccac tcccatggtg tgacgggcgg 60
tgtgtacaag acccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt 120
ccagcttcat gcactcgagt tgcagagtgc aatccggact acgatcggtt ttctgggatt 180
agctccccct cgcgggttgg caaccctctg ttccgaccat tgtatgacgt gtgaagccct 240
acccataagg gccatgagga cttgacgtca tccccacctt cctccggttt gtcaccggca 300
gtctccttag agtgctcttg cgtagcaact aaggacaagg gttgcgctcg ttgcgggact 360
taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acagccatgc agcacctgtg cgccggttct 420
ctttcgagca ctcccgaatc tcttcaggat tccgaccatg tcaagggtag gtaaggtttt 480
tcgcgttgca tcgaattaat ccacatcatc caccgcttgt gcgggtcccc gtcaattcct 540
ttgagtttta atcttgcgac cgtactcccc aggcggtcaa cttcacgcgt tagctacgtt 600
actaaggaaa tgaatcccca acaactagtt gacatcgttt agggcgtgga ctaccagggt 660
atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg tgcatgagcg tcagtattgg cccagggggc 720
tgccttcgcc atcggtattc ctccacatct ctacgcattt cactgctaca cgtggaattc 780
tacccccctc tgccatactc tagcctgcca gtcaccaatg cagttcccag gttgagcccg 840
gggatttcac atcggtctta gcaaaccgcc tgcgcacgct ttacgcccag taattccgat 900
taacgcttgc accctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg gtgcttattc 960
ttccggtacc gtcatccccc ggctgtatta gagccaagga tttctttccg gacaaaagtg 1020
ctttacaacc cgaaggcctt cttcacacac gcggcattgc tggatcaggc tttcgcccat 1080
tgtccaaaat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg 1140
tggctggtcg tcctctcaga ccagctactg atcgtcgcct tggtaggcct ttaccccacc 1200
aactagctaa tcagccatcg gccaacccta tagcgcgagg cccgaaggtc ccccgctttc 1260
atccgtagat cgtatgcggt attaatccgg ctttcgccgg gctatccccc actacaggac 1320
atgttccgat gtattactca cccgttcgcc actcgccacc aggtgcaagc acccgtgctg 1380
ccgttcgact tgcatgtgta aggcatgccg ccagcgttca atctgag 1427

Claims (10)

1.伯克霍尔德菌在黄曲霉毒素降解中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述伯克霍尔德菌为伯克霍尔德菌(Burkholderia latens)G12；该菌株于2020年9月25日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20817，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1或黄曲霉毒素G1。
4.保藏编号为CGMCC No.20817的伯克霍尔德菌G12在制备降解黄曲霉毒素的制剂中的应用。
5.一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂，其特征在于，有效成分包含保藏编号为CGMCCNo.20817的伯克霍尔德菌G12的发酵液。
6.根据权利要求5所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂，其特征在于，所述发酵液中伯克霍尔德菌G12的含量≥2.9×108cfu/mL。
7.根据权利要求5或6所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂，其特征在于，所述伯克霍尔德菌G12的发酵液是将伯克霍尔德菌G12接种于LB液体培养基中培养获得。
8.权利要求7所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂在粮食、饲料、食品中黄曲霉毒素降解中的应用。
9.一种降解黄曲霉毒素的方法，其特征在于，向待降解的样品中加入伯克霍尔德菌G12发酵液，然后置于30℃，避光孵育3天；其中伯克霍尔德菌G12发酵液的菌浓度≥2.9×108cfu/mL。
10.根据权利要求9所述降解黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述伯克霍尔德菌G12发酵液添加量为10mL/20g的样品。
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