CN109266570A - 一种拮抗黄曲霉生长的微生物制剂及应用 - Google Patents

一种拮抗黄曲霉生长的微生物制剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种拮抗黄曲霉生长的微生物制剂及应用，属于有害微生物防除技术领域。本发明拮抗黄曲霉生长的微生物制剂的有效成分为暹罗芽孢杆菌菌悬液或暹罗芽孢杆菌全培养液培养物或暹罗芽孢杆菌的芽孢；所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。本发明的微生物制剂对黄曲霉具有很好的拮抗作用。

Description

一种拮抗黄曲霉生长的微生物制剂及应用
技术领域
本发明属于有害微生物防除技术领域，具体涉及一种拮抗黄曲霉生长的微生物制剂及应用。
背景技术
黄曲霉属于半知菌类，是一种常见腐生真菌。多见于发霉的粮食、粮制品及其它霉腐的有机物上。菌落生长较快，结构疏松，表面灰绿色，背面无色或略呈褐色。菌体有许多复杂的分枝菌丝构成。营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，表面产生许多小梗(一般为双层)，小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。
黄曲霉的有些菌系能产生黄曲霉毒素，不仅能引起禽畜中毒致死，亦有致癌作用。黄曲霉毒素(aflatoxins)，是一组化学结构类似的化合物，黄曲霉毒素存在于土壤，动植物，各种坚果，特别是花生和核桃中。黄曲霉毒素对人和动物健康的危害均与黄曲霉毒素抑制蛋白质的合成有关。黄曲霉毒素分子中的双呋喃环结构，是产生毒性的重要结构。研究表明，黄曲霉毒素的细胞毒作用，是干扰信息RNA和DNA的合成，进而干扰细胞蛋白质的合成，导致动物全身性损害。
目前对于黄曲霉的防治方法主要有物理法、化学法和生物法；生物方法因其安全、高效而受到广泛关注；目前已通过分离纯化获得多数微生物如黄曲霉拮抗菌、不产毒黄曲霉用于黄曲霉的生物防治。然而，现有微生物培养条件复杂，对黄曲霉的拮抗效果较差等问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种拮抗黄曲霉生长的微生物制剂，及使用该微生物制剂拮抗黄曲霉生长的方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种拮抗黄曲霉生长的微生物制剂，其有效成分为暹罗芽孢杆菌菌悬液或暹罗芽孢杆菌全培养液培养物或暹罗芽孢杆菌的芽孢；
所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
在上述方案的基础上，暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物的获得方法，步骤如下：
取50μL冻存暹罗芽孢杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中，培养12h活化菌株，向100mL LB液体培养基中接入活化的500μL菌液，在37℃震荡培养48h，菌液浓度为1.6×108cfu/mL。
在上述方案的基础上，暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液的制备方法为：
取10mL的暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物，菌液浓度为1.6×108cfu/mL，经10000r/min离心10min后，分离得到菌体和上清液，制备的菌体经无菌水洗涤后离心，加入无菌水补齐至10mL，悬浮菌体获得暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液。
上述拮抗黄曲霉的微生物制剂在农产品贮存过程中防止黄曲霉污染的应用。
一种防止黄曲霉污染贮存农产品的方法，是向贮存农产品表面喷洒上述的微生物制剂，阴凉晾干后，置于室温下，通风干燥贮存。
在上述方案的基础上，微生物制剂的喷洒量为3mL/20g。
本发明技术方案的优点
本发明的暹罗芽孢杆菌A2025与黄曲霉对峙培养，能够显著抑制黄曲霉的生长；此外，暹罗芽孢杆菌A2025对花生中的黄曲霉也具有较好的拮抗作用；将暹罗芽孢杆菌A2025处理花生，还能显著的降低黄曲霉对花生的侵染，延长花生的贮存期。
附图说明
图1 A2025菌落形态图；
图2 A2025菌株16S rRNA琼脂糖凝胶电泳图，左边是Marker，右边两个是A2025的16S rRNA电泳图；
图3暹罗芽孢杆菌A2025与黄曲霉对峙培养(A中间是黄曲霉NRRL 3357，四周的四个菌落是暹罗芽孢杆菌A2025；B左边是暹罗芽孢杆菌A2025，右边是黄曲霉NRRL 3357)；
图4标准菌株海假单胞菌JCM15562T(Pseudomonas pelagia JCM15562T)与黄曲霉对峙培养(中间是黄曲霉NRRL 3357，四周的四个菌落是海假单胞菌JCM15562T)；
图5暹罗芽孢杆菌A2025对花生中黄曲霉的拮抗，其中A为对照组，B为添加暹罗芽孢杆菌A2025组。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
实施例1样品采集、菌株分离及筛选
1、样品采集时间和地点
2017年5月5日上午从山东省花生研究所试验基地(青岛市莱西市望城镇)采集花生地土壤样品。
2、样品的处理、菌株的分离和筛选
在超净台中取1g采集的土壤样品悬浮在10mL无菌水中，震荡稀释制备土壤悬浊液，然后用无菌蒸馏水稀释100倍。取100μL悬浮液涂布在LB固体平板上，放置于37摄氏度进行培养，3天后将长出的菌落在LB固体平板上进行划线纯化，经过3次划线纯化后，得到一个菌株，编号A2025。
实施例2菌株A2025的鉴定
按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中描述的方法，对菌株A2025进行形态特征和生理生化特征鉴定，具体结果如下：
1、形态特征：菌株A2025在LB培养基上单菌落凸起，乳白色，不透明(图1)，在37℃培养2天后，菌落约为4-6mm，培养3天后菌落表面出现皱褶。
2、生理生化特征：氧化酶活性为阴性，能在4-54℃生长，革兰氏染色为阳性，能水解利用酪蛋白、明胶和淀粉，不能利用吐温40和吐温80。
3、16S rRNA基因分析
提取A2025的细菌基因组DNA，利用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示；扩增产物连接到pMD19-T载体，转化重组质粒到大肠杆菌，测序得到的1508bp基因序列。根据EzTaxon-e server数据库标准菌株序列同源性比较，菌株A2025的16S rRNA基因与标准菌株Bacillus siamensis KCTC 13613T的16S rRNA基因同源性为100％，基因分析表明该菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。
综合形态特点、生理生化鉴定和16S rDNA测序和同源性分析的结果，鉴定菌株A2025为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。命名为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏单位为山东省花生研究所，保藏编号为CGMCC NO:15611。
实施例3暹罗芽孢杆菌A2025的培养
暹罗芽孢杆菌A2025的培养基为LB培养基：10g蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母提取物，水1000mL；能在4-54℃生长，最优培养温度为26-37℃，能在pH 5-9生长，最优pH为7-8。也可以在GY培养基生长，GY液体培养基：葡萄糖20g，酵母粉5g，水1000mL；GY固体培养基：葡萄糖20g，酵母粉5g，琼脂20g，水1000mL。
从-80℃冰箱中取出冻存的暹罗芽孢杆菌A2025，在超净工作台中取50μL暹罗芽孢杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中，培养12h活性菌株。向100mL LB液体培养基中接入活化的500μL菌液，在37℃震荡培养48h，菌液浓度为1.6×108cfu/mL。
实施例4暹罗芽孢杆菌A2025与黄曲霉对峙培养
将50μL暹罗芽孢杆菌A2025菌液(浓度1.6×108cfu/mL)和10μL黄曲霉NRRL 3357(黄曲霉NRRL 3357(Aspergillusflavus NRRL 3357)标准菌株，由中山大学贺竹梅教授友情提供)的孢子液(孢子液浓度为6.1×105个/mL)接种在GY培养基固体平板上；对照菌将50μL海假单胞菌JCM15562T(浓度1.6×108cfu/mL)和10μL黄曲霉NRRL 3357孢子液(孢子液浓度为6.1×105个/mL)接种在GY培养基固体平板上，在28℃培养6天后，观察暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉的拮抗作用。
所述对照菌为海假单胞菌JCM15562T，购自日本JCM菌种库的标准菌株。
结果如图3、4所示：在图3A中，中间是黄曲霉，四周的四个菌落是暹罗芽孢杆菌A2025；图3B中，左边是暹罗芽孢杆菌A2025，右边是黄曲霉NRRL 3357，由图3可看出：暹罗芽孢杆菌A2025菌落表面呈现皱褶，靠近暹罗芽孢杆菌A2025的黄曲霉落明显被抑制。
图4中，中间是黄曲霉，四周的四个菌落是海假单胞菌JCM15562T；由图知对照菌不能抑制黄曲霉的生长。
实施例5暹罗芽孢杆菌A2025对花生中黄曲霉的拮抗
取25粒花生分别放进2个三角瓶中，瓶子编号为A和B。取灭过菌的3mL LB培养基，加入10μL的6.1×105个/mL黄曲霉NRRL 3357孢子，充分混匀后加入A瓶，作为对照组；取3mL培养48h的暹罗芽孢杆菌A2025菌液(浓度1.6×108cfu/mL)，加入10μL的6.1×105个/mL黄曲霉NRRL 3357孢子，充分混匀后加入B瓶。放置于28℃，培养6天后，如图5，A瓶花生表面长满了黄曲霉，B瓶花生表面没有长黄曲霉，表明暹罗芽孢杆菌A2025能显著抑制花生中黄曲霉的生长。
实施例6暹罗芽孢杆菌A2025防止黄曲霉侵染贮存花生
取120g新收获、籽粒饱满、未被黄曲霉污染的花生，每60g一组，随机分为2组，每组设3个平行；向第一组花生表面喷洒灭过菌的LB培养基，喷洒量为3mL/20g，记为对照组；向第二组的花生表面喷洒培养48h的暹罗芽孢杆菌A2025菌液(浓度1.6×108cfu/mL)，喷洒量为3mL/20g，记为试验组；上述各组花生于阴凉晾干后，置于室温下，通风干燥贮存。每30天取样检测花生中黄曲霉的含量，共计90天，各组黄曲霉含量情况如表1所示。
表1黄曲霉含量(cfu/g)
天数 30d 60d 90d
对照组 3.8×10<sup>2</sup> 8.1×10<sup>3</sup> 5.7×10<sup>4</sup>
试验组 未检出 47 1.5×10<sup>2</sup>
由表1可知，随着时间的增加，试验组中黄曲霉的含量远远少于对照组中的含量；喷洒培养暹罗芽孢杆菌A2025菌液能够有效的防止花生中黄曲霉的污染，延长花生贮存期。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
&lt;110&gt; 山东省花生研究所
&lt;120&gt; 一种拮抗黄曲霉生长的微生物制剂及应用
&lt;130&gt; 2018
&lt;160&gt; 1
&lt;170&gt; SIPOSequenceListing 1.0
&lt;210&gt; 1
&lt;211&gt; 1508
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 16S rRNA(Bacillus siamensis)
&lt;400&gt; 1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120
cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180
accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240
cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300
ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360
gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420
cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480
gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540
gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600
gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660
gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720
agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840
tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900
aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960
ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020
gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080
agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140
tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200
atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg 1260
aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320
tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440
gaggtaacct ttatggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500
acaaggta 1508

Claims (6)

1.一种拮抗黄曲霉生长的微生物制剂，其特征在于：其有效成分为暹罗芽孢杆菌菌悬液或暹罗芽孢杆菌全培养液培养物或暹罗芽孢杆菌的芽孢；
所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
2.根据权利要求1所述拮抗黄曲霉生长的微生物制剂，其特征在于：暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物的获得方法为：
取50μL冻存暹罗芽孢杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中，培养12h活化菌株，向100mL LB液体培养基中接入活化的500μL菌液，在37℃震荡培养48h，菌液浓度为1.6×108cfu/mL。
3.根据权利要求1所述拮抗黄曲霉生长的微生物制剂，其特征在于：暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液的制备方法为：
取10mL的暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物，菌液浓度为1.6×108cfu/mL，经10000r/min离心10min后，分离得到菌体和上清液，制备的菌体经无菌水洗涤后离心，加入无菌水补齐至10mL，悬浮菌体获得暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液。
4.权利要求1～3任一项所述拮抗黄曲霉的微生物制剂在农产品贮存过程中防止黄曲霉污染的应用。
5.一种防止黄曲霉污染贮存农产品的方法，其特征在于：向贮存农产品表面喷洒权利要求1～3任一项所述的微生物制剂，阴凉晾干后，置于室温下，通风干燥贮存。
6.根据权利要求5所述防止黄曲霉污染贮存农产品的方法，其特征在于：微生物制剂的喷洒量为3mL/20g。
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