CN109749973A - 一株中华单胞菌及其在降解黄曲霉毒素方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株中华单胞菌及其在降解黄曲霉毒素方面的应用，属于微生物技术领域。本发明的中华单胞菌AW31为黄质中华单胞菌AW31(Sinomonas flava)AW31，于2018年12月27日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:17042，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。本发明分离获得的黄质中华单胞菌AW31能够高效降解黄曲霉毒素。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株中华单胞菌及其在降解黄曲霉毒素方面的应用。
背景技术
黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的次级代谢物。黄曲霉毒素低剂量可抑制动物免疫，高剂量会诱导机体癌变、畸形甚至死亡。传统的脱除黄曲霉毒素的方法主要是物理法和化学法，但存在破坏粮食营养、引入新的污染物等问题。微生物脱毒法成为近年来的研究热点，该方法主要是利用细菌等微生物及其代谢产物去除食品中污染的AFB1，该脱毒法对原料无污染、具有高度专一性、同时避免毒素重新产生，降解条件温和、特异性强和脱毒效率高等优点，因此是一种高效、安全的脱毒方法。目前只发现少部分微生物能脱除AFB1毒性，并且微生物种类不同，脱毒效率明显不同，已经报道的一些脱毒微生物降解AFB1效率低，需要寻找降解效率高的菌株。
黄质中华单胞菌(Sinomonas flava)首次分离自中国森林土壤样品中，是2008年报道的一个新种，截至目前属于该种的菌株报道仍然不多。
目前，对于黄质中华单胞菌应用的研究较少。而对于黄质中华单胞菌在降解黄曲霉毒素中的应用，国内外就更没有学者研究过此方面的内容。可见，黄质中华单胞菌在降解黄曲霉毒素中的应用研究可弥补该菌的应用研究不足，拓宽研究领域范围。
发明内容
针对现有技术中存在的中华单胞菌在降解黄曲霉毒素中的应用研究不足等问题，本发明的目的在于提供一种高效降解黄曲霉毒素的菌株及其应用。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：
黄质中华单胞菌，所述黄质中华单胞菌为黄质中华单胞菌(Sinomonas flava)AW31，于2018年12月27日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:17042，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
在上述方案的基础上，所述的黄质中华单胞菌，分离于青岛市附近海域的海水。
在上述方案的基础上，所述的黄质中华单胞菌菌落形态为：在LB培养基上单菌落凸起，淡黄色。
在上述方案的基础上，所述的黄质中华单胞菌具有如下菌学性质：能在4-40℃生长，最适生长温度范围为28-37℃，能水解利用吐温40和吐温80，能利用果糖、葡萄糖、甘油、乳糖、麦芽糖、蔗糖等碳源。
在上述方案的基础上，所述的黄质中华单胞菌的16S rRNA基因序列如SEQ IDNo.1所示。
在上述方案的基础上，所述黄质中华单胞菌的菌悬液或全培养液培养物或粗提物或胞外代谢物应用于降解黄曲霉毒素。
本发明技术方案的优点
本发明的黄质中华单胞菌AW31对黄曲霉毒素具有高效的降解作用。本发明的黄质中华单胞菌AW31不仅能够高效降解黄曲霉毒素B1，降解率99.2％；还对黄曲霉毒素G1具有很好的降解作用，降解率88.9％。用本发明的黄质中华单胞菌AW31的发酵液处理被黄曲霉毒素污染的花生，可显著降低污染花生中的黄曲霉毒素含量。
附图说明
图1 AW31菌株16S rRNA基因的琼脂糖凝胶电泳图，右边是Marker，左边是AW31的16S rRNA电泳图；
图2黄质中华单胞菌AW31对AFB1的降解图谱(A是对照组，B是试验组)；
图3黄质中华单胞菌AW31对AFG1的降解图谱(A是对照组，B是试验组)；
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明所述黄质中华单胞菌(Sinomonas flava)AW31，于2018年12月27日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:17042，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
实施例1样品采集、菌株分离及筛选
1、样品采集时间和地点
2017年4月6日上午从青岛附件海域采海洋样品。
2、样品的处理、菌株的分离和筛选
在超净台中取1mL采集的海水样品加入在10mL无菌水中，震荡稀释制备稀释液，然后用无菌蒸馏水稀释100倍。取50μL悬浮液涂布在LB固体平板上，放置于37℃摄氏度进行培养，2天后将长出的菌落在LB固体平板上进行划线纯化，经过5次划线纯化后，得到一个菌株，编号AW31。
实施例2菌株A31的鉴定
按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中描述的方法，对菌株AW31进行形态特征和生理生化特征鉴定，具体结果如下：
1、形态特征：菌株AW31在LB培养基上单菌落凸起，淡黄色。
2、生理生化特征：能在4-40℃生长，最适生长温度范围为28-37℃，能水解利用吐温40和吐温80，能利用果糖、葡萄糖、甘油、乳糖、麦芽糖、蔗糖等碳源。
3、16S rRNA基因分析
提取AW31的细菌基因组DNA，利用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示；测序得到的16S rRNA基因序列。根据标准菌株序列同源性比较，菌株AW31的16S rRNA基因与标准菌株Sinomonas falva DSM 20127T的16S rRNA基因同源性高，相似度超过99％，基因分析表明该菌为黄质中华单胞菌(Sinomonas falva)。
综合形态特点、生理生化鉴定和16S rDNA测序和同源性分析的结果，鉴定菌株AW31为黄质中华单胞菌(Sinomonas falva)。命名为黄质中华单胞菌(Sinomonas falva)AW31，于2018年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏单位为山东省花生研究所，保藏编号为CGMCC NO：17042。
实施例3黄质中华单胞菌AW31的培养
中华单胞菌AW31的培养基为LB培养基：10g蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母提取物，水1000mL；能在4-40℃生长，最优培养温度范围为28-37℃，能在pH 5-9生长，最优pH为7-8。
从-80℃冰箱中取出冻存的中华单胞菌AW31，在超净工作台中取10μL中华单胞菌AW31菌液接种到装有10mL的LB液体培养基试管中，培养16h活化菌株。向200mL LB液体培养基中接入活化的500μL菌液，在37℃震荡培养48h，菌液浓度为1.9×108cfu/mL。
实施例4黄质中华单胞菌AW31对黄曲霉毒素B1的降解
1、黄曲霉毒素B1的配置
将5mg黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品溶解于100mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFB1贮存溶液。取1mL 50ppm的AFB1，加入9mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFB1工作母液。
2、中华单胞菌AW31对AFB1的降解
取1.96mL的黄质中华单胞菌AW31菌液(菌液浓度1.9×108cfu/mL)置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFB1工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育18h，记作试验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL 5000ppb的AFB1工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
3、37℃条件下中华单胞菌AW31对AFB1的降解能力分析
首先加入甲醇到试验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对试验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1(体积比)；流速0.8mL/min；色谱柱C18(150mm×4.6mm，0.5μm)；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFB1降解率(％)＝(对照组AFB1含量–试验组AFB1含量)/对照组AFB1含量×100％
结果如图2所示。图2中，A：对照组；B试验组。结果表明，37℃条件下中华单胞菌AW31对AFB1降解效果较好，降解率为99.2％。
实施例5黄质中华单胞菌AW31对黄曲霉毒素G1的降解
1、黄曲霉毒素G1的配置
将1mg黄曲霉毒素G1(AFG1)标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFG1贮存溶液。取0.5mL 50ppm的AFG1，加入4.5mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFG1工作母液。
2、黄质中华单胞菌AW31对AFG1的降解
取1.96mL的中华单胞菌AW31菌液(菌液浓度1.9×108cfu/mL)置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFG1工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育24h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作试验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL 5000ppb的AFG1工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
3、37℃条件下中华单胞菌AW31对AFG1的降解能力分析
首先加入甲醇到试验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对试验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1(体积比)；流速0.8mL/min；色谱柱C18(150mm×4.6mm，0.5μm)；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFG1降解率(％)＝(对照组AFG1含量–试验组AFG1含量)/对照组AFG1含量×100％
结果如图3所示。A：试验组；B对照组。结果表明，37℃条件下AW31对AFG1降解效果较好，降解率为88.9％。
实施例6黄质中华单胞菌AW31对黄曲霉毒素污染的花生的脱毒
取10μL冻存中华单胞菌AW31菌液接种到装有10mL的LB液体培养基试管中，培养16h活性菌株，向200mL LB液体培养基中接入活化的500μL菌液，在37℃震荡发酵培养48h，菌液浓度为1.9×108cfu/mL。
黄曲霉毒素污染的花生样品经研磨后分为2份，每份1g，编号分别为1号和2号。1号样品经121℃灭菌20min，加入5mL灭过菌的LB培养基；2号样品经121℃灭菌20min处理后降温，接入5mL中华单胞菌AW31的发酵液，两份样品都做37℃孵育处理30h。
加入甲醇到1号或2号样品分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对1号组和2号组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到样品的AFB1进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1(体积比)；流速0.8mL/min；色谱柱C18(150mm×4.6mm，0.5μm)；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
检测到经过脱毒处理后2号样品中AFB1浓度为12.5μg/kg，而对照的1号样品中AFB1浓度为76.1μg/kg，由此可见，AFB1降解率为83.6％，结果表明中华单胞菌AW31上清液可降低污染花生中的黄曲霉毒素含量。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 山东省花生研究所
<120> 一株中华单胞菌及其在降解黄曲霉毒素方面的应用
<130> 2019
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1388
<212> DNA
<213> Sinomonas flava
<400> 1
cggctccctc ccacaagggg ttgggccacc ggcttcgggt gttaccgact ttcgtgactt 60
gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc agcgttgctg atctgcgatt 120
actagcgact ccgacttcat ggggccgagt tgcagacccc aatccgaact gagaccggct 180
ttctgggatt ggctccacct cacagtatcg caaccctttg taccggccat tgtagcatgc 240
gtgaagccca agacataagg ggcatgatga tttgacgtcg tccccacctt cctccgagtt 300
gaccccggca gtctcccatg agtccccacc cgaagtgctg gcaacatgga acgagggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 420
cctgtgaacc ggccccgaag ggaagcccca tctctgggac ggtccggcac atgtcaagcc 480
ttggtaaggt tcttcgcgtt gcatcgaatt aatccgcatg ctccgccgct tgtgcgggcc 540
cccgtcaatt cctttgagtt ttagccttgc ggccgtactc cccaggcggg gcacttaatg 600
cgttagctgc ggcgcggaaa ccgtggaatg gcccccacac ctagtgccca acgtttacgg 660
catggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccatg ctttcgctcc tcagcgtcag 720
ttacagccca gagacctgcc ttcgccatcg gtgttcctcc tgatatctgc gcatttcacc 780
gctacaccag gaattccagt ctcccctact gcactccagc ctgcccgtac ccactgcaga 840
cccggggttg agccccgggc tttcacagca gacgcgacaa accgcctacg agctctttac 900
gcccaataat tccggataac gctcgcgccc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt 960
tagccggcgc ttcttccgca ggtaccctca ccccaagagg cttgttccct gccgaaaggg 1020
gtttacaacc cgaaggccgt catcccccac gcggcgtcgc tgcatcaggc ttccgcccat 1080
tgtgcaatat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg 1140
tggccggtca ccctctcagg ccggctaccc gtcgtcgcct tggtaggcca tcaccccacc 1200
aacaagctga taggccgcga gcccatccaa gaccgcacaa ggctttccac cccccaccat 1260
gcggcagagg gtactatccg gtattagacc cagtttccca ggcttatccc agagtcaagg 1320
gcaggttgct cacgtgttac tcacccgttc gccactaatc cacccccgaa agggcttcat 1380
cgtccgac 1388
Claims (6)
1.中华单胞菌，其特征在于：所述中华单胞菌为黄质中华单胞菌(Sinomonas flava)AW31，于2018年12月27日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:17042，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
2.根据权利要求1所述的黄质中华单胞菌，其特征在于：分离于青岛市附近海域的海水。
3.根据权利要求1所述的黄质中华单胞菌，其特征在于：菌落形态为：在LB培养基上单菌落凸起，淡黄色。
4.根据权利要求1～3任一项所述的黄质中华单胞菌，其特征在于：具有如下菌学性质：能在4-40℃生长，最适生长温度为28-37℃，能水解利用吐温40和吐温80，能利用果糖、葡萄糖、甘油、乳糖、麦芽糖、蔗糖等碳源。
5.根据权利要求4所述的黄质中华单胞菌，其特征在于：其16S rRNA序列如SEQ IDNo.1所示。
6.权利要求1～5任一项所述黄质中华单胞菌的菌悬液或全培养液培养物或粗提物或胞外代谢物应用于降解黄曲霉毒素。
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