CN102747023B - 一种藤黄微球菌及其应用 - Google Patents
一种藤黄微球菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102747023B CN102747023B CN 201210264209 CN201210264209A CN102747023B CN 102747023 B CN102747023 B CN 102747023B CN 201210264209 CN201210264209 CN 201210264209 CN 201210264209 A CN201210264209 A CN 201210264209A CN 102747023 B CN102747023 B CN 102747023B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- soil
- micrococcus luteus
- raw oil
- oil
- inorganic salt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种藤黄微球菌Micrococcus luteus4006，保藏编号CGMCC No.6072。另外，本发明还公开了该藤黄微球菌在降解石油污染物中的应用。本发明的藤黄微球菌源于土壤，因此该菌株进入土壤后很快成为优势菌群，占据一定生态位，有效促进石油烃类的降解，优化土壤微生物体系，改善土壤的物理性状，增强土壤的生物活性，修复板结退化的土壤。该藤黄微球菌是以原油为唯一碳源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可改变原油的性质，使原油的组分发生变化，起到乳化、润湿和分散原油的作用，可在短时间内降解土壤中的石油污染物。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种藤黄微球菌及其应用。
背景技术
石油污染土壤的微生物修复技术，近十几年来在国外得到了较大发展，但是石油烃类污染物降解速度缓慢，致使治理过程延续时间较长，一直是这项技术的一个突出难点，因此寻找高效石油降解菌是当前石油污染土壤微生物修复技术的研究热点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种可用于降解石油污染物的藤黄微球菌。该菌株是以原油为唯一碳源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可改变原油的性质，使原油的组分发生变化，起到乳化、润湿和分散原油的作用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种藤黄微球菌，其特征在于，所述藤黄微球菌为Micrococcus luteus4006，保藏编号CGMCC No.6072，保藏日为2012年5月3日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
1、该菌株具有如下的性质：
形态特征：球状，菌落呈亮黄色，湿润，直径1mm～2mm，细胞直径≤2μm。
生理生化特征：革兰氏阳性细菌。
2、该菌株的筛选方法为：
步骤一、富集：将从西安市未央区长安大学渭水校区陕西省地下水与生态环境工程研究中心试验场土壤石油污染10000mg/kg修复区10cm左右红三叶草根际修复区采集的土样以无菌方式称取10.0g，接入100.0mL石油/无机盐液体培养基中，置于28±1℃、130r/min恒温摇床富集培养7d；然后吸取5mL培养液重新转接入新鲜的石油/无机盐液体培养基中，再进行3次富集、驯化，每次7d；所述石油/无机盐液体培养基的组成为：NaNO30.15%，(NH4)SO40.15%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，KCl0.05%，FeSO4·7H2O0.001%，CaCl20.0002%，蒸馏水1000mL，原油（延长石油脱水原油）0.5%，以上均为质量百分比，培养基pH值7.0～7.5，105KPa灭菌20min～25min；
步骤二、筛选和纯化：将步骤一中富集培养后的富集培养液按十倍稀释法稀释，取10-4、10-5、10-63个稀释度的培养液各0.1mL涂布于石油/无机盐固体平板培养基上，置于37±1℃恒温培养箱内培养48h，选取不同颜色及形态的优势单菌落，在石油/无机盐固体平板培养基上进行多次划线分离，以纯化得到形态一致的纯化菌株，将纯化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行进一步筛选、活化，得到菌株，待用；所述石油/无机盐固体平板培养基的组成为：NaNO30.15%，(NH4)SO40.15%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，KCl0.05%，FeSO4·7H2O0.001%，CaCl20.0002%，琼脂2%，蒸馏水1000mL，原油（延长石油脱水原油）0.5%，以上均为质量百分比，培养基pH值7.0～7.5，105KPa灭菌20min～25min；
步骤三、复筛：将步骤二中活化好的菌株分别接种于100mL含有1wt%正十二烷和1wt%环己烷的无机盐液体培养基中，28±1℃、130r/min摇床培养，当培养液明显浑浊后，取lmL培养液接种到含1wt%正十二烷和1wt%环己烷的无机盐固体培养基中培养，然后再将培养的菌株接种于100mL含有1wt%正十二烷和1wt%环己烷的无机盐液体培养基中培养，如此重复3次，保存最终仍能使含有正十二烷和环己烷的无机盐液体培养基变浑浊的菌株。
3、该菌株的鉴定方法为：
步骤一、提取总DNA：
101、取过夜培养菌株（至多2×109个），10000r/min离心1min收集菌体，加入180μL溶菌溶液（20mg/mL溶菌酶，20mMTris-HCl pH8，2.5mMEDTA，1%TritonX-100），重悬菌液，37℃水浴30min～60min；然后向重悬菌液中添加20μL蛋白酶K溶液（10mg/mL），充分振荡混匀，56℃水浴30min至细胞完全裂解，接着加入200μL溶液BD，充分振荡混匀，70℃水浴10min，再加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀；
102、将吸附柱放入收集管中，用移液器将101中振荡混匀后的菌液全部加入吸附柱中，静置2min，12000r/min离心3min，倒掉滤液；向吸附柱中加入500μL溶液PW，10000r/min离心1min，倒掉滤液；向吸附柱中加入500μL漂洗溶液Wash buffer，10000r/min离心1min，倒掉滤液；将吸附柱放入收集管中，于12000r/min离心2min，除去残留的漂洗液Washbuffer；
103、取出吸附柱，放入一个新的1.5mL的离心管，加入50μL预热（60℃）的洗脱液Elution buffer，静置3min，10000r/min室温离心1min，收集DNA溶液；采用浓度为2%琼脂糖对提取的总DNA进行检测，片段大小在13kb左右；
步骤二、16SrDNA的PCR扩增：以步骤一中提取的总DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：DNA模板10pmol，上游引物(10μM)1μl，下游引物(10μM)1μl；dNTP(10Mm)1μl；10×Taq reaction Buffer5μl；Taq(5U/μl)0.25μl；加水至50μl；PCR反应条件：预变性98℃5min；循环95℃35s，55℃35s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存；所述PCR扩增的引物序列为：
上游引物（SEQ ID NO.1）：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；
下游引物（SEQ ID NO.2）：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'；
步骤三、菌株16SrDNA序列分析及比对：对步骤二中PCR扩增的产物（片段大小1.4kb左右）进行测序（由生工生物工程（上海）有限公司协助完成），得到的16SrDNA部分基因序列（SEQ ID NO.3）与GenBank中已发表的藤黄微球菌（Micrococcus luteus）的16SrDNA序列进行同源性比较，相似度达99.0%。
综合生理生化鉴定、16SrDNA序列分析鉴定结果，鉴定本发明的菌株为藤黄微球菌。
本发明还提供了上述用于藤黄微球菌在降解石油污染物中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明的藤黄微球菌源于土壤，因此该菌株进入土壤后很快成为优势菌群，占据一定生态位，有效促进石油烃类的降解，优化土壤微生物体系，改善土壤的物理性状，增强土壤的生物活性，修复板结退化的土壤。
2、本发明的藤黄微球菌是以原油为唯一碳源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可改变原油的性质，使原油的组分发生变化，起到乳化、润湿和分散原油的作用。
3、本发明的藤黄微球菌可在短时间内降解土壤中的石油污染物。
下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
具体实施方式
菌株的筛选：
步骤一、富集：将从西安市未央区长安大学渭水校区陕西省地下水与生态环境工程研究中心试验场土壤石油污染10000mg/kg修复区10cm左右红三叶草根际修复区采集的土样以无菌方式称取10.0g，接入100.0mL石油/无机盐液体培养基中，置于28±1℃、130r/min恒温摇床富集培养7d；然后吸取5mL培养液重新转接入新鲜的石油/无机盐液体培养基中，再进行3次富集、驯化，每次7d；所述石油/无机盐液体培养基的组成为：NaNO30.15%，(NH4)SO40.15%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，KCl0.05%，FeSO4·7H2O0.001%，CaCl20.0002%，蒸馏水1000mL，原油（延长石油脱水原油）0.5%，以上均为质量百分比，培养基pH值7.0～7.5，105KPa灭菌20min～25min；
步骤二、筛选和纯化：将步骤一中富集培养后的富集培养液按十倍稀释法稀释，取10-4、10-5、10-63个稀释度的培养液各0.1mL涂布于石油/无机盐固体平板培养基上，置于37±1℃恒温培养箱内培养48h，选取不同颜色及形态的优势单菌落，在石油/无机盐固体平板培养基上进行多次划线分离，以纯化得到形态一致的纯化菌株，将纯化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行进一步筛选、活化，得到菌株，待用；所述石油/无机盐固体平板培养基的组成为：NaNO30.15%，(NH4)SO40.15%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，KCl0.05%，FeSO4·7H2O0.001%，CaCl20.0002%，琼脂2%，蒸馏水1000mL，原油（延长石油脱水原油）0.5%，以上均为质量百分比，培养基pH值7.0～7.5，105KPa灭菌20min～25min；
步骤三、复筛：将步骤二中活化好的菌株分别接种于100mL含有1wt%正十二烷和1wt%环己烷的无机盐液体培养基中，28±1℃、130r/min摇床培养，当培养液明显浑浊后，取lmL培养液接种到含1wt%正十二烷和1wt%环己烷的无机盐固体培养基中培养，然后再将培养的菌株接种于100mL含有1wt%正十二烷和1wt%环己烷的无机盐液体培养基中培养，如此重复3次，保存最终仍能使含有正十二烷和环己烷的无机盐液体培养基变浑浊的菌株。
菌株的鉴定：
步骤一、提取总DNA：
101、取过夜培养菌株（至多2×109个），10000r/min离心1min收集菌体，加入180μL溶菌溶液（20mg/mL溶菌酶，20mMTris-HCl pH8，2.5mMEDTA，1%TritonX-100），重悬菌液，37℃水浴30min～60min；然后向重悬菌液中添加20μL蛋白酶K溶液（10mg/mL），充分振荡混匀，56℃水浴30min至细胞完全裂解，接着加入200μL溶液BD，充分振荡混匀，70℃水浴10min，再加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀；
102、将吸附柱放入收集管中，用移液器将101中振荡混匀后的菌液全部加入吸附柱中，静置2min，12000r/min离心3min，倒掉滤液；向吸附柱中加入500μL溶液PW，10000r/min离心1min，倒掉滤液；向吸附柱中加入500μL漂洗溶液Wash buffer，10000r/min离心1min，倒掉滤液；将吸附柱放入收集管中，于12000r/min离心2min，离去残留的漂洗液Washbuffer；
103、取出吸附柱，放入一个新的1.5mL的离心管，加入50μL预热（60℃）的洗脱液Elution buffer，静置3min，10000r/min室温离心1min，收集DNA溶液；采用浓度为2%琼脂糖对提取的总DNA进行检测，片段大小在13kb左右；
步骤二、16SrDNA的PCR扩增：以步骤一中提取的总DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：DNA模板10pmol，上游引物(10μM)1μl，下游引物(10μM)1μl；dNTP(10Mm)1μl；10×Taq reaction Buffer5μl；Taq(5U/μl)0.25μl；加水至50μl；PCR反应条件：预变性98℃5min；循环95℃35s，55℃35s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存；所述PCR扩增的引物序列为：
上游引物（SEQ ID NO.1）：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；
下游引物（SEQ ID NO.2）：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'；
步骤三、菌株16SrDNA序列分析及比对：对步骤二中PCR扩增的产物（片段大小1.4kb左右）进行测序（由生工生物工程（上海）有限公司协助完成），得到的16SrDNA部分基因序列（SEQ ID NO.3）与GenBank中已发表的藤黄微球菌（Micrococcus luteus）的16SrDNA序列进行同源性比较，相似度达99.0%。
综合生理生化鉴定、16SrDNA序列分析鉴定结果，鉴定本发明的菌株为藤黄微球菌，并命名为藤黄微球菌Micrococcus luteus4006，保藏编号CGMCC No.6072。
本发明的藤黄微球菌的应用效果试验：
1、藤黄微球菌对原油的降解能力试验：
将本发明的藤黄微球菌接种于含有原油的无机盐液体培养基中，于28±1℃，130rpm发酵培养7天，培养基组成：NaNO30.15%，(NH4)SO40.15%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，KCl0.05%，FeSO4·7H2O0.001%，CaCl20.0002%，原油1%，蒸馏水1000mL，以上均为质量百分比，pH7.0～7.5，灭菌20min～25min；与未接种藤黄微球菌的培养基相比，发酵液的颜色明显加深，而且，接种藤黄微球菌的发酵液中的原油具有不挂瓶的特点。这说明，本发明的藤黄微球菌以原油为唯一碳源生长，改变了原油的性质，使原油的组分发生了变化。将接种藤黄微球菌发酵后的原油在显微镜下观察，发现原油中有菌液存在，细菌存在在油水界面上，并以油为碳源，适应环境产生趋油物质，从而起到乳化、润湿和分散原油的作用。
2、藤黄微球菌对培养基中石油的降解试验：
将本发明的藤黄微球菌接种于含有原油的无机盐液体培养基中，于28±1℃，130rpm发酵培养7天，含有原油的无机盐液体培养基组成：NaNO30.15%，(NH4)SO40.15%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，KCl0.05%g，FeSO4·7H2O0.001%，CaCl20.0002%，原油1%，蒸馏水1000mL，以上均为质量百分比，pH7.0～7.5，灭菌20min～25min；然后分别取10mL发酵液接种于100mL新鲜的含有原油的无机盐液体培养基（培养基组成同上）、含有正十二烷的无机盐液体培养基和含有环己烷的无机盐液体培养基中，于28±1℃，130rpm发酵培养7天，含有正十二烷的无机盐液体培养基组成：NaNO30.15%，(NH4)SO40.15%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，KCl0.05%g，FeSO4·7H2O0.001%，CaCl20.0002%，正十二烷1%，蒸馏水1000mL，以上均为质量百分比，pH7.0～7.5，灭菌20min～25min；含有环己烷的无机盐液体培养基组成：NaNO30.15%，(NH4)SO40.15%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，KCl0.05%g，FeSO4·7H2O0.001%，CaCl20.0002%，环己烷1%，蒸馏水1000mL，以上均为质量百分比，pH7.0～7.5，灭菌20min～25min；以未接种的三种液体培养基为空白对照，于28±1℃，130rpm发酵培养7天进行取样，分别检测接种藤黄微球菌的发酵液和空白对照的总石油烃（TPH）降解率、直链烷烃降解率和环烷烃降解率，结果见表1。
表1菌株的石油降解率及其功能
| TPH降解率 | 直链烷烃降解率 | 环烷烃降解率 | |
| 4006菌株 | 34.8% | 39.6% | 28.2% |
| 空白对照 | 9.8% | 13.8% | 11.3% |
从表1中可以看出，在本发明的藤黄微球菌存在下总石油烃的降解率比空白对照提高25%，直链烷烃和环烷烃的降解率均有较大幅度提高，说明本发明的藤黄微球菌能够有效降解直链烷烃和环烷烃。
3、藤黄微球菌对土壤中石油的降解情况
将本发明的藤黄微球菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中37±1℃活化36h，将活化后的菌种按照5%（质量百分比）比例添加到不同的污染度土壤中，土壤中均添加5%的麸皮，土壤中的C∶N∶P的比例为100∶5∶1，N、P源分别为NH4NO3和K2HPO4，土壤中石油的污染度分别为0.3%、0.7%和1.5%，保持土壤含水率为20%～25%，以未添加菌种的土壤为空白对照。经过21天的降解，TPH（总石油烃）的降解率结果如表2所示。
表2土壤石油污染菌株的石油降解率
| 石油污染度 | 0.3% | 0.7% | 1.5% |
| 4006菌株 | 46.8% | 42.6% | 40.2% |
| 空白对照 | 15.6% | 12.2% | 10.7% |
通过藤黄微球菌的降解，3种石油污染度条件下土壤中的TPH均有明显的降低，分别较空白提高了31.2%、30.4%和29.5%，可以看出藤黄微球菌在土壤中短期能够达到较好的降解效果。
综上所述，本发明的藤黄微球菌源于土壤，因此该菌株进入土壤后很快成为优势菌群，占据一定生态位，可在短时间内降解土壤中的石油污染物，有效促进石油烃类的降解，优化土壤微生物体系，改善土壤的物理性状。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (2)
1.一种藤黄微球菌（Micrococcus luteus），其特征在于，所述藤黄微球菌为Micrococcus luteus4006，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.6072。
2.一种如权利要求1所述藤黄微球菌在降解石油污染物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210264209 CN102747023B (zh) | 2012-07-27 | 2012-07-27 | 一种藤黄微球菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210264209 CN102747023B (zh) | 2012-07-27 | 2012-07-27 | 一种藤黄微球菌及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102747023A CN102747023A (zh) | 2012-10-24 |
| CN102747023B true CN102747023B (zh) | 2013-07-31 |
Family
ID=47027518
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201210264209 Expired - Fee Related CN102747023B (zh) | 2012-07-27 | 2012-07-27 | 一种藤黄微球菌及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102747023B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104803721B (zh) * | 2014-01-27 | 2018-01-05 | 中国石油天然气股份有限公司 | 一种油基钻井废弃物的生物堆肥处理方法 |
| CN104894020B (zh) * | 2015-05-30 | 2018-02-02 | 中国海洋大学 | 一种蛋白酶及其生产菌株 |
| CN113475734B (zh) * | 2021-06-21 | 2022-05-24 | 河南中烟工业有限责任公司 | 一种微球菌zy02及其在再造烟叶浓缩液降粘中的应用 |
| CN113583918B (zh) * | 2021-09-03 | 2022-04-15 | 佛山市玉凰生态环境科技有限公司 | 一种河道底泥降解菌种及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101580308A (zh) * | 2005-04-21 | 2009-11-18 | 揖斐电株式会社 | 含有机物废液的处理方法 |
| CN102060350B (zh) * | 2010-11-18 | 2012-02-08 | 中国海洋石油总公司 | 一种含油废水的深度处理工艺方法 |
| CN102464438B (zh) * | 2010-11-18 | 2013-07-31 | 中国石油天然气股份有限公司 | 一种利用微生物降解井场含油污泥的方法 |
-
2012
- 2012-07-27 CN CN 201210264209 patent/CN102747023B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102747023A (zh) | 2012-10-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105925507B (zh) | 具有重金属钝化和促进植物生长功能的蜡样芽孢杆菌及应用 | |
| CN102757920B (zh) | 一种短小芽孢杆菌及其应用 | |
| CN102839137B (zh) | 一种用于降解石油的固体微生物菌剂及其制备方法 | |
| CN109161497B (zh) | 一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂及应用 | |
| CN110283741B (zh) | 一株具有高效降解多环芳烃功能的玫瑰变色菌及其应用 | |
| CN106497810B (zh) | 一种嗜麦芽寡养单胞菌、含有该菌的菌剂及其应用和降解柴油的方法 | |
| CN102747023B (zh) | 一种藤黄微球菌及其应用 | |
| Gohel et al. | Molecular phylogeny and diversity of the salt-tolerant alkaliphilic actinobacteria inhabiting coastal Gujarat, India | |
| CN104651280A (zh) | 一种石油降解菌p-6及其应用 | |
| Kanno et al. | Detection and isolation of plant‐associated bacteria scavenging atmospheric molecular hydrogen | |
| CN102757921B (zh) | 一种蜡状芽孢杆菌及其应用 | |
| CN108611291A (zh) | 一株耐盐性动性球菌及其应用 | |
| CN109112086B (zh) | 一株暹罗芽孢杆菌及其用途 | |
| Barua et al. | Studies on non-symbiotic diazotrophic bacterial populations of coastal arable saline soils of India | |
| Yang et al. | Sinorhodobacter ferrireducens gen. nov., sp. nov., a non-phototrophic iron-reducing bacterium closely related to phototrophic Rhodobacter species | |
| Dasman et al. | Paenibacillus glycanilyticus sp. nov., a novel species that degrades heteropolysaccharide produced by the cyanobacterium Nostoc commune. | |
| Ogbonna et al. | Characterization of hydrocarbon utilizing bacteria and fungi associated with crude oil contaminated soil | |
| Jhala Yogeshvari et al. | Rapid methods for isolation and screening of methane degrading bacteria | |
| CN109749973A (zh) | 一株中华单胞菌及其在降解黄曲霉毒素方面的应用 | |
| CN106834165B (zh) | 可降解青霉素的副球菌、细胞级分及其组合物 | |
| CN114196590B (zh) | 分泌脂肪酶的假单胞菌及其在餐厨废水处理中的应用 | |
| CN112251373B (zh) | 一种用于石油烃降解的菌-酶复合制剂的制备及其应用 | |
| CN107964402A (zh) | 一种降解石油的生物质微生物菌剂及其制备方法 | |
| CN103497909A (zh) | 菌株jy9及其应用 | |
| Goodfellow et al. | Gordonia |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130731 Termination date: 20140727 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |