CN117946228A - Cey17_04535突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及CEY17_04535突变体及其应用。本发明提供的CEY17_04535蛋白突变体与谷氨酸棒杆菌野生型CEY17_04535蛋白相比，含有第65位的苏氨酸突变为除苏氨酸以外的氨基酸的突变。该蛋白突变体能够显著提高菌株的谷氨酰胺生产能力，有效促进菌株的谷氨酰胺产量的提升，可用于谷氨酰胺生产菌株的构建以及谷氨酰胺的发酵生产，提高谷氨酰胺的生产效率；本发明提供的修饰的谷氨酸棒杆菌的谷氨酰胺产量显著提高，为谷氨酰胺生产菌株的选育提供了基因和菌株资源。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及CEY17_04535突变体及其应用。
背景技术
谷氨酰胺的化学名称为2-氨基-4-氨甲酰基丁酸，是一种非必需氨基酸，也是蛋白质合成中的编码氨基酸，可促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的分解，可用于治疗胃及十二指肠溃疡，在医药行业具有重要作用。
目前，谷氨酰胺最常用的生产方法为发酵法，主要以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为生产菌进行发酵生产。谷氨酸棒杆菌是异养需氧型微生物，为革兰氏阳性菌，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物降解能力弱的特性。发酵法具有原料来源广泛、生产成本低、产品质量可控、产物单一等优点。但目前生产谷氨酰胺的菌种的发酵性能仍较差，谷氨酰胺的产量和转化率仍不理想，工业上对谷氨酰胺的需求量较高，现有的菌种无法满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种CEY17_04535蛋白突变体及其应用。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种CEY17_04535蛋白突变体，所述CEY17_04535蛋白突变体与谷氨酸棒杆菌野生型CEY17_04535蛋白相比，含有第65位的苏氨酸突变为除苏氨酸以外的氨基酸的突变。
上述除苏氨酸以外的氨基酸包括但不限于异亮氨酸(I)、精氨酸(R)或丙氨酸(A)。
优选地，所述CEY17_04535蛋白突变体与谷氨酸棒杆菌野生型CEY17_04535蛋白相比，含有第65位的苏氨酸突变为异亮氨酸(I)、精氨酸(R)或丙氨酸(A)的突变。
进一步优选地，所述CEY17_04535蛋白突变体与谷氨酸棒杆菌野生型CEY17_04535蛋白相比的突变为第65位的苏氨酸突变为异亮氨酸、精氨酸或丙氨酸。
以上所述的谷氨酸棒杆菌野生型CEY17_04535蛋白的氨基酸序列，本领域技术人员可通过公开的数据库获得，其中，谷氨酸棒杆菌ATCC 14067的CEY17_04535蛋白的登录号为CEY17_04535，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步优选地，所述CEY17_04535蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.1：
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SEQ ID NO.2：
mqaspefgelrskfrsfafpmtvafflwyvvyvlvasfasewmatpvfgainiglifgflqfvtrfiityiyvmfanknleprqaairqkmeg。
SEQ ID NO.3：
mqaspefgelrskfrsfafpmtvafflwyvvyvlvasfasewmatpvfgainiglifgflqfvtafiityiyvmfanknleprqaairqkmeg。
以上所述的CEY17_04535蛋白突变体能够显著提高微生物的谷氨酰胺生产能力，进而有效提升谷氨酰胺的产量。
第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码以上所述的CEY17_04535蛋白突变体。
根据CEY17_04535蛋白突变体的氨基酸序列和密码子规则，本领域技术人员能够获得编码CEY17_04535蛋白突变体的核酸分子的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，编码以上所述的CEY17_04535蛋白突变体的核酸分子的核苷酸序列为在SEQ ID NO.4所示序列的基础上将第65位苏氨酸对应的密码子突变为异亮氨酸、精氨酸或丙氨酸的密码子。
第三方面，本发明提供包含以上所述的核酸分子或表达以上所述的CEY17_04535蛋白突变体的生物材料。
以上所述的生物材料包括表达盒、载体或宿主细胞。
其中，所述表达盒为将所述核酸分子与转录或翻译调控元件可操作性地连接得到的重组核酸分子。
所述载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子。
所述宿主细胞包括微生物细胞，优选为棒状杆菌属细菌、埃希氏菌属细菌或芽孢杆菌属细菌。
第四方面，本发明提供以上所述的CEY17_04535蛋白突变体或以上所述的核酸分子或所述生物材料的以下任一种应用：
(1)在生产谷氨酰胺或其衍生物中的应用；
(2)在构建用于生产谷氨酰胺或其衍生物的微生物中的应用。
本发明还提供以上所述的CEY17_04535蛋白突变体或以上所述的核酸分子或所述生物材料在提高微生物的谷氨酰胺生产能力中的应用。
以上所述的生产能力提高可表现为谷氨酰胺的产量和/或转化率提高。
本发明中，谷氨酰胺的衍生物包括但不限于精氨酸、色氨酸等。
以上所述的应用中，所述微生物为棒状杆菌属细菌、埃希氏菌属细菌或芽孢杆菌属细菌。
优选地，所述棒状杆菌属为谷氨酸棒杆菌。所述埃希氏菌属细菌为大肠杆菌。所述芽孢杆菌属细菌为枯草芽孢杆菌。
第五方面，本发明提供一种修饰的微生物，所述修饰的微生物表达以上所述的CEY17_04535蛋白突变体。
优选地，所述修饰的微生物的染色体原位CEY17_04535蛋白基因突变为编码以上所述的CEY17_04535蛋白突变体的基因。
优选地，所述微生物为棒状杆菌属细菌、埃希氏菌属细菌或芽孢杆菌属细菌。
进一步优选地，所述棒状杆菌属为谷氨酸棒杆菌。所述埃希氏菌属细菌为大肠杆菌。所述芽孢杆菌属细菌为枯草芽孢杆菌。
在本发明的一些实施方式中，提供一种修饰的谷氨酸棒杆菌，所述修饰的谷氨酸棒杆菌表达所述CEY17_04535蛋白突变体或含有所述CEY17_04535蛋白突变体的编码基因。
以上所述的修饰的谷氨酸棒杆菌的谷氨酰胺产量较未修饰的谷氨酸棒杆菌显著提高。
在能够合成谷氨酰胺的微生物中导入CEY17_04535蛋白突变体的编码基因，使其表达CEY17_04535蛋白突变体，由此构建的修饰的微生物的谷氨酰胺的产量显著提升。
在本发明的一些实施方式中，所述修饰的微生物为表达CEY17_04535蛋白突变体的野生型微生物(野生型谷氨酸棒杆菌或野生型大肠杆菌)。
在本发明的一些实施方式中，所述修饰的微生物还包含以下修饰中的一种或多种：
1)弱化odhA基因的表达；
2)增强丙酮酸羧化酶的表达和/或酶活性；
3)腺苷酰基转移酶和谷氨酰胺酶的活性同时降低或丧失；
在本发明的一些实施方式中，所述修饰的微生物还包含以下修饰中的一种或多种：
1)弱化odhA基因的表达；
2)增强丙酮酸羧化酶的表达和/或酶活性；
3)腺苷酰基转移酶和谷氨酰胺酶的活性同时降低或丧失；
4)肌醇-3-磷酸合酶的第84位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸。
上述修饰中，弱化odhA基因的表达优选通过将其起始密码子由ATG突变为GTG实现。
增强丙酮酸羧化酶的酶活性优选通过点突变改造将微生物表达丙酮酸羧化酶的第458位脯氨酸突变为丝氨酸实现。
腺苷酰基转移酶和谷氨酰胺酶的活性同时降低或丧失通过缺失glnE基因、glsA基因的全部或部分实现。
上述修饰优选为以谷氨酸棒杆菌ATCC 14067为出发菌株进行。
在本发明的一些实施方式中，所述修饰的微生物还包含以下修饰：glnA基因的编码蛋白发生Y405F突变，以解除腺苷酰化修饰。
上述修饰优选为以谷氨酸棒杆菌ATCC 14067为出发菌株进行。
在本发明的一些实施方式中，所述修饰的微生物的出发菌分别为MHZ-0513-3、MHZ-0513-3-ino-1S84A、谷氨酸棒杆菌ATCC14067-glnAY405F。其中MHZ-0513-3已在专利申请CN106701649A中公开，其分类命名为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13405；
MHZ-0513-3-ino-1S84A已在专利申请CN202110502341.9中公开；
ATCC 14067-glnAY405F为以谷氨酸棒杆菌ATCC 14067为出发菌株，将其glnA基因突变以使得其编码蛋白产生Y405F突变(参考专利申请CN200610089484，引入点突变glnAY405F可解除腺苷酰化修饰，有利于谷氨酰胺的积累)。
本发明以不同遗传背景的谷氨酸棒杆菌为出发菌株构建了上述修饰的微生物，经验证这些出发菌株导入CEY17_04535蛋白突变体的编码基因后，其谷氨酰胺产量均显著提高。CEY17_04535蛋白突变体对于菌株的谷氨酰胺生产能力的提升作用不依赖于上述菌株所含有的其它遗传改造，这些遗传改造仅仅是为了使得菌株具有一定的谷氨酰胺生产能力。本发明在研发过程中发现，CEY17_04535蛋白突变体对于谷氨酸棒杆菌的谷氨酰胺生产能力的提升作用是普适性的，只要菌株能够合成并积累谷氨酰胺即可。
第六方面，本发明提供以上所述的修饰的微生物在生产谷氨酰胺或其衍生物中的应用。
第七方面，本发明提供一种发酵生产谷氨酰胺的方法，所述方法包括：培养以上所述的修饰的微生物获得培养物，从所述培养物中收集谷氨酰胺。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：将所述修饰的微生物接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液，将种子液接种于发酵培养基中培养，得到发酵液，从发酵液中分离提取谷氨酰胺或其衍生物。
第八方面，本发明提供一种提高谷氨酰胺的产量的方法，所述方法包括：修饰能够合成谷氨酰胺或其衍生物的菌株以使得其表达以上所述的CEY17_04535蛋白突变体。
本发明的有益效果在于：本发明还提供一种CEY17_04535蛋白突变体，该突变体能够显著提高菌株的谷氨酰胺生产能力，有效促进菌株的谷氨酰胺产量的提升，该蛋白突变体可用于谷氨酰胺生产菌株的构建以及谷氨酰胺的发酵生产，提高谷氨酰胺的生产效率，为谷氨酰胺生产菌株的选育提供了有效的基因资源。
本发明提供的修饰的谷氨酸棒杆菌的谷氨酰胺产量显著提高，为谷氨酰胺生产菌株的选育提供了菌株资源。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示。
表1引物序列
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| UP1-F | ctagTCTAGACAGGTAAAACACTACTTTTA |
| UP1-R | GTAGATGTAAGTAATGATGAATATGGTTACGAACTGAAGGAAGCCGA |
| DN1-F | TTCATCATTACTTACATCTA |
| DN1-R | cccAAGCTTATCAAGTAAAAGAGGGTAAC |
| ID1-F | ACAGAATGGTGATATGTGAAG |
| ID1-R | CCAAGAAGAACGTAGGCGAT |
| 鉴定1-F | TTCGGCTTCCTTCAGTTCGTAACCGT |
| 鉴定3-F | TTCGGCTTCCTTCAGTTCGTAACACG |
| 鉴定4-F | TTCGGCTTCCTTCAGTTCGTAACAG |
| UP2-F | ctagTCTAGATGCTCCACGCGGCAGATGATAT |
| UP2-R | TGCAGCTTCCTCTGGTGGCAGTTCGAAGAGGTCCTTGTCCACTGGAGCGT |
| DN2-F | TTCGAACTGCCACCAGAGGAAGCT |
| DN2-R | cccAAGCTTAAATGAAGGTCTGGGAGACA |
| ID2-F | AAACCGTTGACGTGCGCGAT |
| ID2-R | TGTAACGCAAGAAGCAAATA |
| 鉴定2-F | ACGCTCCAGTGGACAAGGACCTCGT |
| P82 | CTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG |
| P85 | CGCCCTGAGTGCTTGCGGCA |
以下实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1质粒pK18-CEY17_04535T65I和重组菌株MHZ-0513-3-CEY17_04535T65I的构建
1、质粒pK18-CEY17_04535T65I的构建
利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以谷氨酸棒杆菌ATCC 14067的基因组为模板，以UP1-F/UP1-R为引物，制备重组片段UP1，以DN1-F/DN1-R为引物，制备重组片段DN1，所得片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，随后以UP1、DN1为模板，以UP1-F/DN1-R为引物制备重组片段，所得重组片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化，然后利用XbaI/HindIII进行消化，同时将pK18-mobsacB(武汉淼灵生物科技有限公司)利用XbaI/HindIII进行消化，并用T4 DNA连接酶(TransGen Biotech)将片段与载体进行连接，转化Trans1T1感受态细胞(TransGen Biotech)，挑取卡那霉素抗性克隆，XbaI/HindIII酶切鉴定得到片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，进一步利用P82/P85引物测序(Invitrogen公司)鉴定插入的片段正确。将所得到的质粒命名为pK18-CEY17_04535T65I。
2、菌株MHZ-0513-3-CEY17_04535T65I的构建：
将pK18-CEY17_04535T65I转入谷氨酸棒杆菌MHZ-0513-3中，在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子，培养的温度为33℃，倒置培养。将筛选得到的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。将所筛选出的菌株进一步进行表型验证，挑选KanS的重组子利用鉴定1-F/DN1-R验证点突变重组子，通过摸索退火温度，获得含点突变的重组子，将得到的阳性重组子用ID1-F/ID1-R扩增测序，验证获得的为目的突变菌株，并命名为MHZ-0513-3-CEY17_04535T65I，该菌株为将MHZ-0513-3的CEY17_04535基因进行突变，以使得其编码蛋白产生T65I突变。
实施例2CEY17_04535T65I突变菌株构建
本实施例分别以MHZ-0513-3-ino-1S84A、ATCC 14067-glnAY405F(菌株ATCC 14067-glnAY405F为以谷氨酸棒杆菌ATCC 14067为出发菌株，将其glnA基因突变，以使得其编码蛋白产生Y405F突变，其构建方法可参考实施例1的重组菌的构建过程，所用引物为UP2-F、UP2-R、DN2-F、DN2-R、ID2-F、ID2-R、鉴定2-F、P82、P85)为出发菌株，在其CEY17_04535基因中引入突变，以使得其编码蛋白产生T65I突变。
菌株MHZ-0513-3、MHZ-0513-3-ino-1S84A均是以谷氨酸棒杆菌的模式菌株ATCC14067为出发菌株经改造后获得，两菌株的CEY17_04535基因完全相同。将质粒pK18-CEY17_04535T65I电转到MHZ-0513-3-ino-1S84A和ATCC 14067-glnAY405F中，经筛选，获得改造菌株分别命名为MHZ-0513-3-ino-1S84A-CEY17_04535T65I、ATCC14067-glnAY405F-CEY17_04535T65I，上述菌株分别为以MHZ-0513-3-ino-1S84A、ATCC 14067-glnAY405F为出发菌株，在其CEY17_04535基因中引入突变，以使得其编码蛋白产生T65I突变。
实施例3菌株的谷氨酰胺生产性能检测
对实施例1和2构建的菌株进行产谷氨酰胺的发酵试验，发酵验证谷氨酰胺产量的方法如下：
将冻存于-80℃甘油管中的菌株接种于下述斜面培养基中进行活化，于33℃下培养24h后长出菌苔，从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于下述种子培养基中，于33℃，100rpm下振荡培养至对数生长中后期，培养时间为5h，制得种子液，以10％的接种量将上述种子液接种至装有20ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在33℃，150rpm振荡培养48h。结果如表2所示(OD562为培养液在562nm的浊度，表示细胞量；Gln(g/L)表示积累的L-谷氨酰胺的含量，产酸提高率为与引入CEY17_04535基因突变的出发菌株比较计算)。
上述使用的培养基配方如下：
斜面培养基：脑心浸液37g/L，琼脂1.8％，121℃、0.1MPa灭菌20min；
种子培养基：葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，玉米浆30g/L，pH 7.0；
发酵培养基：葡萄糖90g/L，(NH4)2SO4 40g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，玉米浆10g/L，CaCO3 50g/L，pH 7.0。
表2突变菌株的生长和谷氨酰胺含量检测
| 菌株 | OD562 | Gln(g/L) | 产酸提高率％ |
| MHZ-0513-3 | 43.3 | 28.9 | -- |
| MHZ-0513-3-CEY17_04535T65I | 43.1 | 32.8 | 13.5 |
| MHZ-0513-3-ino-1S84A | 43.5 | 30.7 | -- |
| MHZ-0513-3-ino-1S84A-CEY17_04535T65I | 43.9 | 34.9 | 13.7 |
| ATCC 14067 | 43.6 | 0.3 | -- |
| ATCC 14067-glnAY405F | 43.3 | 0.6 | -- |
| ATCC 14067-glnAY405F-CEY17_04535T65I | 42.8 | 0.9 | 50.0 |
如表2所示，在MHZ-0513-3中将CEY17_04535T65I的第65位氨基酸由苏氨酸(T)突变为异亮氨酸(I)，即其编码基因的对应密码子由ACA突变为ATA后，获得菌株MHZ-0513-3-CEY17_04535T65I，摇瓶发酵谷氨酰胺产量从28.9g/L提高到32.8g/L，产酸提高13.5％，由此可见，CEY17_04535T65I突变体能够显著提高谷氨酰胺的积累。
为验证CEY17_04535T65I突变体在不同菌株中是否均有效，将其分别引入菌株MHZ-0513-3-ino-1S84A和谷氨酸棒杆菌ATCC14067-glnAY405F中。如表2所示，MHZ-0513-3-ino-1S84A中CEY17_04535T65I第65位氨基酸由苏氨酸(T)突变为异亮氨酸(I)，即其编码基因的对应密码子由ACA突变为ATA后，获得菌株MHZ-0513-3-ino-1S84A-CEY17_04535T65I，摇瓶发酵谷氨酰胺产量从30.7g/L提高到34.9g/L，产酸提高13.7％；ATCC 14067-glnAY405F中CEY17_04535T65I的第65位氨基酸由苏氨酸(T)突变为异亮氨酸(I)，获得菌株14067-glnAY405F-CEY17_04535T65I，摇瓶发酵谷氨酰胺产量从0.6g/L提高到0.9g/L，产酸提高50.0％。
由此可见，CEY17_04535T65I突变体在不同的菌株中均能够显著提高谷氨酰胺的积累。由此可以预期将该突变体基因整合到其他可以合成谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，或者其他可以合成谷氨酰胺的微生物，如其它棒杆菌属细菌、肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，均能够促进谷氨酰胺或其衍生物的积累。
实施例4CEY17_04535第65位氨基酸突变成其他氨基酸的突变菌株构建及其生产谷氨酰胺的性能检测
鉴于CEY17_04535第65位氨基酸由苏氨酸(T)突变为异亮氨酸(I)后，菌株的谷氨酰胺产量有所提升，进一步分析CEY17_04535的第65位氨基酸由苏氨酸(T)突变为精氨酸(R)、丙氨酸(A)，具体为CEY17_04535基因对应位置的密码子由ACA突变为CGA、GCA后，对菌株的谷氨酰胺积累的影响。
以MHZ-0513-3-ino-1S84A为出发菌株，在其CEY17_04535基因中引入上述突变，以使得其编码蛋白的第65位氨基酸分别由苏氨酸(T)突变为精氨酸(R)、丙氨酸(A)，菌株构建方法参考实施例1，其中摸索退火温度所用的鉴定引物分别为鉴定3-F/DN1-R、鉴定4-F/DN1-R，其他引物相同，构建的突变菌株分别命名为MHZ-0513-3--ino-1S84A-CEY17_04535T65R和MHZ-0513-3--ino-1S84A-CEY17_04535T65A。
对上述构建的突变菌株进行发酵试验，方法参考实施例3。发酵结果如表3所示。
表3突变菌株的生长和谷氨酰胺含量检测
| 菌株 | OD562 | Gln(g/L) | 产酸提高率％ |
| MHZ-0513-3-ino-1S84A | 43.5 | 30.7 | -- |
| MHZ-0513-3--ino-1S84A-CEY17_04535T65R | 42.9 | 33.4 | 8.8 |
| MHZ-0513-3--ino-1S84A-CEY17_04535T65A | 43.8 | 34.2 | 11.4 |
发酵结果表明，第65位氨基酸由苏氨酸(T)突变为精氨酸(R)、丙氨酸(A)后，突变菌株的谷氨酰胺产量均有显著提升，产量均明显高于对照菌株MHZ-0513-3-ino-1S84A，其中突变为丙氨酸(A)后，谷氨酰胺产量提高到34.2g/L，产酸提高11.4％。显而易见，该位点突变成其他氨基酸也有利于谷氨酰胺及其衍生物的生产。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种CEY17_04535蛋白突变体，其特征在于，所述CEY17_04535蛋白突变体与谷氨酸棒杆菌野生型CEY17_04535蛋白相比，含有第65位的苏氨酸突变为除苏氨酸以外的氨基酸的突变。
2.根据权利要求1所述的CEY17_04535蛋白突变体，其特征在于，所述CEY17_04535蛋白突变体与谷氨酸棒杆菌野生型CEY17_04535蛋白相比，含有第65位的苏氨酸突变为异亮氨酸、精氨酸或丙氨酸的突变；
优选地，所述CEY17_04535蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQID NO.3所示。
3.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的CEY17_04535蛋白突变体。
4.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求3所述的核酸分子或表达权利要求1或2所述的CEY17_04535蛋白突变体。
5.权利要求1或2所述的CEY17_04535蛋白突变体或权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的生物材料的以下任一种应用：
(1)在生产谷氨酰胺或其衍生物中的应用；
(2)在构建用于生产谷氨酰胺或其衍生物的微生物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述微生物为棒状杆菌属细菌、埃希氏菌属细菌或芽孢杆菌属细菌。
7.一种修饰的微生物，其特征在于，所述修饰的微生物表达权利要求1或2所述的CEY17_04535蛋白突变体。
8.根据权利要求7所述的修饰的微生物，其特征在于，所述修饰的微生物的染色体原位CEY17_04535蛋白基因突变为编码权利要求1或2所述的CEY17_04535蛋白突变体的基因。
9.根据权利要求7或8所述的修饰的微生物，其特征在于，所述微生物为棒状杆菌属细菌、埃希氏菌属细菌或芽孢杆菌属细菌。
10.一种发酵生产谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求7～9任一项所述的修饰的微生物获得培养物，从所述培养物中收集谷氨酰胺。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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