CN115927267A - 一种胆汁酸复合酶制剂及其在制备提高动物蛋白消化率的饲料添加剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胆汁酸复合酶制剂及其在制备提高动物蛋白消化率的饲料添加剂中的应用。本发明所述的角蛋白酶来源于Bacillus licheniformis，经过随机突变和定向筛选，获得突变体KM1、KM2和KM3，所述突变体的突变位点依次为：S294P、S294P/K34L和S294P/G270E。本发明的突变体KM1、KM2和KM3经过75℃处理5分钟后，酶活残留率由20%分别提升至45%、48%、50%，热稳定性效果提升明显，并且，本发明将突变体与胆汁酸复合得到的复合酶制剂，证实突变体及复合酶制剂均能够有效提高养殖动物对蛋白的消化利用率，有利于动物养殖并节约养殖成本。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种胆汁酸复合酶制剂及其在制备提高动物蛋白消化率的饲料添加剂中的应用。
背景技术
角蛋白酶是一种能够降解角蛋白类底物(例如角质，皮屑，羽毛等)的特异性角蛋白酶，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物以角蛋白为单一碳源生长时产生。角蛋白中粗蛋白含量在80％以上，各种氨基酸总量在70％以上，动物必需氨基酸种类齐全，同时含有较多大量元素、微量元素和未知生长因子，是一种良好的、可替代或部分替代鱼粉的饲料蛋白来源，以及肥料来源，对它的开发利用具有重要的应用前景。
目前，国内角蛋白酶研究较多仍处于菌株的筛选、分离和角蛋白酶分离与纯化以及酶学性质的阶段。但角蛋白酶在较高温度下热稳定性较差，在75℃保温5分钟后，残余酶活仅为20%，限制了该酶的工业化生产和产品开发，尤其在饲料酶加工等领域通常涉及到较高温操作，导致酶容易失活。因此，提升角蛋白酶的热稳定性将进一步促进该酶在工业生化产中的应用和推广。
发明内容
本发明提供了一种胆汁酸复合酶制剂及其在制备提高动物蛋白消化率的饲料添加剂中的应用。本发明筛选得到热稳定性提高的突变体：KM1、KM2、KM3，该突变体及其与胆汁酸制成的复合酶制剂具有能够提高动物蛋白消化率的作用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种角蛋白酶突变体，所述角蛋白酶突变体具有以下氨基酸序列之一：
（1）如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
（2）如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
（3）如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
进一步的，所述SEQ ID NO：3所示的角蛋白酶突变体是由SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第294位的丝氨酸变为脯氨酸获得的；所述SEQ ID NO：5所示的角蛋白酶突变体是由SEQID NO：1的角蛋白酶的第294位的丝氨酸变为脯氨酸和第34位赖氨酸变为亮氨酸获得的；所述SEQ ID NO：7所示的角蛋白酶突变体是由SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第294位的丝氨酸变为脯氨酸和第270位的甘氨酸变为谷氨酸获得的。
本发明还提供了一种编码基因，其编码所述的角蛋白酶突变体，其具有以下核苷酸序列之一：
（1）如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
（2）如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；
（3）如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组表达载体，其中包含所述的编码基因。
本发明还提供了一种基因工程菌，其中包含所述的编码基因。
本发明还提供了一种胆汁酸复合酶制剂，所述胆汁酸复合酶制剂是由权利要求1所述的角蛋白酶突变体和胆汁酸制备而成的。
进一步的，在制备胆汁酸复合酶制剂时，每毫升胆汁酸中添加150U/mL~400 U/mL的角蛋白酶突变体。
本发明还提供了所述的角蛋白酶突变体或者所述的胆汁酸复合酶制剂在制备提高动物蛋白消化率的饲料添加剂中的应用。
进一步的，将所述角蛋白酶突变体或者胆汁酸复合酶制剂添加到动物饲料中，混合均匀，进而能够提高动物对蛋白的消化利用率。
进一步的，所述角蛋白酶突变体或者胆汁酸复合酶制剂的用量是动物饲料中蛋白原料用量的5%~15%。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
本发明以
Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶基因为基础，经过随机突变，构建突变体文库和高通量定向筛选的方法，得到了包含S294P的单点突变体KM1，以及包含S294P/K34L、S294P/G270E的双位点突变体KM2和KM3。本发明改造后的突变体KM1，KM2和KM3相比于原始角蛋白酶，突变体经过75℃处理5分钟后，酶活残留率由20%分别提升至45%、48%、50%，热稳定性效果提升明显，为其产业化应用及产品推广奠定基础。并且，本发明将突变体与胆汁酸复合得到的复合酶制剂，证实突变体及复合酶制剂均能够有效提高养殖动物对蛋白的消化利用率，有利于动物养殖并节约养殖成本。
附图说明
图1是角蛋白酶基因重组质粒构建图。
图2是角蛋白酶突变体75℃处理5分钟，酶活残留率（热稳定性）。
图3是角蛋白酶突变体KM3在15L发酵罐中的发酵数据。
图4是角蛋白酶突变体的最适温度。
图5是角蛋白酶突变体的最适pH。
图6是角蛋白酶突变体pH稳定性。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下将结合附图及实施例对本文发明做更全面、详细地说明，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
在本发明中，LB培养基配方为：1％胰蛋白胨，0 .5％酵母提取物，1％NaCl。发酵培养基配方为：豆粕3.5-10%、棉籽粕5-10%、玉米粉2-6%、PPG-20000 0.5-1.0%、蛋白酶0.5-1.0%、淀粉酶0.5-1.0%、磷酸氢二钠0.2-0.5%，以质量比计。
在本发明中，酶活力测定参照《GBT 23527-2009 蛋白酶制剂》中蛋白酶的测定方法。
实施例1：角蛋白酶基因重组菌构建及其突变体文库构建
参考
Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和DNA序列(SEQ ID NO：2)设计引物，在5’端设计Kpn I限制性酶切位点，3’端设计BamH I限制性酶切位点。
进行PCR扩增目的条带：使用引物如下，
KF: CGGGGTACCATGATGAGGAAAAAGAGTTT（SEQ ID NO：9）；
KR: CGCCCATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCGA（SEQ ID NO：10）。
反应体系为：
| PCR上游引物（25pmol/µL） | 1µL |
| PCR下游引物（25pmol/µL） | 1µL |
| dNTP混合液 | 4µL |
| PCR Buffer | 5µL |
| 模板DNA | 1µL |
| DNA聚合酶 | 0.5µL |
| 加双蒸水至总体积 | 50µL |
反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，循环30次，72℃，后延伸10min，15℃保存。
将PCR产物进行电泳，将条带单一的PCR产物进行纯化，双酶切，与pWB980载体进行连接（按照试剂盒说明步骤进行），并转化枯草芽胞杆菌WB600，涂布含有抗生素的平板，筛选重组菌。
突变体文库构建，用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒，以SEQ ID NO：2的基因为模版，进行随机突变，使用的引物序列如下：
KF: CGGGGTACCATGATGAGGAAAAAGAGTTT（SEQ ID NO：9）；
KR: CGCCCATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCGA（SEQ ID NO：10）。
将扩增好的随机突变PCR产物用Kpn I和BamH I双酶切，连接到pWB980载体上，转化枯草芽孢杆菌WB600，卡那霉素抗性LB平板筛选阳性克隆。
将筛选的转化子单菌落接种到96孔深孔板。每个平板接入3个表达原始角蛋白酶的单菌落为对照。每孔装入500uL 含卡那霉素抗性的LB液体培养基， 37℃，200rpm震荡培养24小时后， 将发酵液离心取上清，然后检测角蛋白酶的酶活性，将酶活力高于对照K0的突变体基因进行75℃耐热性验证和测序分析。
筛选到以原始角蛋白酶为出发模板的热稳定性提高的突变体S294P，命名为KM1，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的核苷酸序列如 SEQ ID NO：4所示。
实施例2：易错PCR方式构建角蛋白酶KM1的突变体文库
以实施例1中筛选到的角蛋白酶基因KM1为模版，进行第二轮随机突变，突变库构建过程以及使用材料试剂和操作条件等均同实施例1；突变体培养和筛选时以KM1为对照，经过检测角蛋白酶突变体的酶活力以及热稳定性，将酶活残留率高于KM1的突变体基因进行测序。
最终筛选到以下突变体：
KM2突变方式为S294P/K34L，氨基酸序列如SEQ ID No：5所示，基因序列如SEQ IDNo：6所示；
KM3突变方式为S294P/G270E，氨基酸序列如SEQ ID No：7所示，基因序列如SEQ IDNo：8所示。
实施例3：热稳定性提高的角蛋白酶突变体重组菌摇瓶发酵表达验证
分别将含有实施例1和2的角蛋白酶突变体KM1、KM2和KM3的重组菌接种到发酵培养基中，进行摇瓶发酵78h，将培养液离心获得上清，40℃条件下测定每个突变体发酵液上清的平均酶活，测定突变体的热稳定性。
结果如图2所示，突变后得到的角蛋白酶KM1，KM2和KM3，在75℃条件下处理5分钟后，酶活残留率分别为45%，48%和50%，远高于对照K0的20%的残留率，说明本发明的角蛋白酶突变体KM1、KM2和KM3的热稳定性得到明显提升。
实施例4：角蛋白酶突变体在15L发酵罐中发酵和制备
将表达角蛋白酶突变体K0、KM1、KM2、KM3的基因工程菌分别划线于含有卡那霉素抗性的（终浓度为20μg/mL）LB平板上，37℃培养至长出单菌落，挑取长势良好的单菌落进行发酵。发酵生产工艺：
（1）重组菌接种于LB液体培养基，37℃，200 rpm，过夜震荡培养；
（2）将过夜培养的种子液接种15L发酵罐，装液量为8L；
（3）控制条件：37℃，300-600rpm；溶氧20%-60%；罐压0.05Mpa；通气量0-8h 0.6m3/h； 8h至停罐 0.8-0.9 m3/h。
（4）发酵至镜检芽孢生成率为90%以上。
（5）停罐，发酵液经过5000 rpm离心5 min后，获得上清酶液。
（6）发酵过程pH自然，发酵16h后每隔4h取样测定酶活力，待发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理得到粗酶液，用于应用测试。
角蛋白酶突变体KM3的发酵过程曲线如图3所示，发酵48h时，突变体的酶活达到最高点。
实施例5：角蛋白酶突变体酶学性质
将实施例4的角蛋白酶及其突变体粗酶液使用饱和度（100%）的硫酸铵，按照1:1进行盐析浓缩。将盐析出的沉淀放入透析袋中透析，透析缓冲液为MES缓冲液(20mM，pH6.5)，脱盐透析后的浓缩蛋白液，进行离子交换层析，即在MES缓冲液预平衡的CM-Sephadex色谱柱(2.5×20cm)上进行离子交换层析，再用含有NaCl（0.2-2mol/L）的缓冲液MES对蛋白质进行梯度洗脱。通过测定洗脱液酶活力，将有蛋白酶活性的洗脱液过Superdex G-75凝胶柱(1.6×80cm)，进一步纯化，用MES缓冲液缓慢（2mL/min）洗脱纯化后的蛋白质，洗脱酶液经过冷冻干燥获得酶粉备用。
最适温度：在pH 10.0的条件下分别测定角蛋白酶及其突变体在30-70℃之间的酶活，以最高酶活为100%。
结果如图4所示，角蛋白酶及其突变体的最适温度为55℃。
最适pH：在温度55℃的条件下分别测定角蛋白酶及其突变体pH 5.0-10.5之间的酶活。
结果如图5所示，角蛋白及其突变体的最适pH为10.0。
pH稳定性：将角蛋白酶及其突变体分别溶解于pH 6.0-10.0之间的磷酸缓冲液中，在37℃温度条件下，保温4h后，测定其残余酶活。
结果如图6所示，角蛋白酶及其突变体在pH 6.0及以上的缓冲液中稳定性较好，均在80%以上。
实施例6：角蛋白酶对鱼粉、DDGS蛋白原料的体外酶解
豆粕、花生粕、鱼粉、玉米酒精糟（DDGS）等是最常用的蛋白原料，其中鱼粉中粗蛋白含量达到70%，DDGS中粗蛋白含量达到30%。本实施例模拟体外酶解，即单胃动物胃和小肠的消化过程，分析添加角蛋白酶对鱼粉、DDGS的消化率影响。体外酶解试验步骤：
（1）称取待酶解的底物，用无菌水配制成0.5g/mL，震荡混匀，分成3组每组取10mL配制好的底物，调pH 6.0。
（2）向角蛋白酶突变体KM3的提纯酶液中加入胆汁酸制备复合酶制剂，以每毫升胆汁酸中添加200U/mL的角蛋白酶突变体KM3的用量记。
（3）实验组分别加入1mL的角蛋白酶K0以及角蛋白酶突变体KM3 (200U/mL)或1mL复合酶制剂，对照组加入1mL无菌水，40度震荡酶解1h。
（4）将上述实验组和对照组分别加入5mL的胃蛋白酶（3000U/g底物）用盐酸调pH2.5，37度震荡酶解30分钟。
（5）将上述实验组和对照组分别加入5mL的胰蛋白酶（终浓度1%）用氢氧化钠调pH6.8，37度震荡酶解3小时。
（6）参照《饲料中粗蛋白测定方法(GB/T 6432-1994)》中的方法，处理酶解后的食糜，抽滤烘干，测定残渣重量，计算底物蛋白消化率。
表1角蛋白酶对鱼粉、DDGS消化率影响
从表1可以看出，添加角蛋白酶可以明显提高鱼粉、DDGS蛋白原料的蛋白消化率，并且本发明获得的角蛋白酶突变体KM3对底物的消化率优于原始角蛋白酶K0，且利用KM3和胆汁酸复合的酶制剂消化率优于单独使用KM3，说明本发明的角蛋白酶突变体及其复合酶制剂添加到饲料日粮里能有效提高养殖动物对蛋白的消化利用率，节约成本提高效益。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种角蛋白酶突变体，其特征在于，所述角蛋白酶突变体具有以下氨基酸序列之一：
（1）如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
（2）如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
（3）如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的角蛋白酶突变体，其特征在于，所述SEQ ID NO：3所示的角蛋白酶突变体是由SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第294位的丝氨酸变为脯氨酸获得的；所述SEQID NO：5所示的角蛋白酶突变体是由SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第294位的丝氨酸变为脯氨酸和第34位赖氨酸变为亮氨酸获得的；所述SEQ ID NO：7所示的角蛋白酶突变体是由SEQID NO：1的角蛋白酶的第294位的丝氨酸变为脯氨酸和第270位的甘氨酸变为谷氨酸获得的。
3.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1所述的角蛋白酶突变体，其具有以下核苷酸序列之一：
（1）如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
（2）如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；
（3）如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中包含权利要求3所述的编码基因。
5.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中包含权利要求3所述的编码基因。
6.一种胆汁酸复合酶制剂，其特征在于，所述胆汁酸复合酶制剂是由权利要求1所述的角蛋白酶突变体和胆汁酸制备而成的。
7.根据权利要求6所述的胆汁酸复合酶制剂，其特征在于，在制备胆汁酸复合酶制剂时，每毫升胆汁酸中添加150U/mL~400 U/mL的角蛋白酶突变体。
8.权利要求1所述的角蛋白酶突变体或者权利要求6所述的胆汁酸复合酶制剂在制备提高动物蛋白消化率的饲料添加剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述角蛋白酶突变体或者胆汁酸复合酶制剂添加到动物饲料中，混合均匀，进而能够提高动物对蛋白的消化利用率。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述角蛋白酶突变体或者胆汁酸复合酶制剂的用量是动物饲料中蛋白原料用量的5%~15%。
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