CN115927264A - 角蛋白酶及其与杜仲叶提取物、胆汁酸的复配酶制剂和在制备动物养殖饲料中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了角蛋白酶及其与杜仲叶提取物、胆汁酸的复配酶制剂和在制备动物养殖饲料中的应用。本发明通过筛选得到角蛋白酶KM8和KM9，所述突变体的突变位点依次为：Y161M/V199A和Y161M/K78R。本发明的突变体KM7、KM8和KM9在75℃水浴5分钟后，酶活残留率由20%分别提升至60%、70%，热稳定性效果提升明显。并且，本发明将突变体与杜仲叶提取物和胆汁酸复配得到的酶制剂，能够降低动物饲料中的粗蛋白，提高蛋白质的利用率，降低养殖成本。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及角蛋白酶及其与杜仲叶提取物、胆汁酸的复配酶制剂和在制备动物养殖饲料中的应用。
背景技术
角蛋白酶是一种能够降解角蛋白类底物(例如角质，皮屑，羽毛等)的特异性角蛋白酶，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物以角蛋白为单一碳源生长时产生。角蛋白中粗蛋白含量在80％以上，各种氨基酸总量在70％以上，动物必需氨基酸种类齐全，同时含有较多大量元素、微量元素和未知生长因子，是一种良好的、可替代或部分替代鱼粉的饲料蛋白来源，以及肥料来源，对它的开发利用具有重要的应用前景。
目前，国内角蛋白酶研究较多仍处于菌株的筛选、分离和角蛋白酶分离与纯化以及酶学性质的阶段。但角蛋白酶在较高温度下热稳定性较差，在75℃保温5分钟后，残余酶活仅为20%，限制了该酶的工业化生产和产品开发，尤其在饲料酶加工等领域通常涉及到较高温操作，导致酶容易失活。因此，提升角蛋白酶的热稳定性将进一步促进该酶在工业生化产中的应用和推广。
发明内容
本发明提供了一种角蛋白酶及其与杜仲叶提取物、胆汁酸的复配酶制剂和在制备动物养殖饲料中的应用。本发明筛选得到热稳定性提高的突变体：KM7、KM8、KM9，并将KM9与杜仲叶提取物和胆汁酸混合，制得的复配酶制剂具有提高蛋白质利用率的作用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种热稳定性提高的角蛋白酶，所述角蛋白酶为氨基酸序列如SEQID NO：5所示的KM8或者氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的KM9。
进一步的，所述角蛋白酶KM8是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第161位的酪氨酸变为甲硫氨酸和第199位缬氨酸变为丙氨酸获得的；所述角蛋白酶KM9是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第161位的酪氨酸变为甲硫氨酸和第78位的赖氨酸变为精氨酸获得的。
本发明还提供了一种编码基因，其编码所述的角蛋白酶。
进一步的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示或者核苷酸序列如SEQID NO：8所示。
本发明还提供了包含所述编码基因的基因工程菌，所述基因工程菌为枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌。
本发明还提供了一种复配酶制剂，所述复配酶制剂中包含权利要求1所述的角蛋白酶、杜仲叶提取物和胆汁酸。
进一步的，在所述复配酶制剂中，角蛋白酶、杜仲叶提取物和胆汁酸的体积比为3:1:2。
进一步的，所述角蛋白酶具体为角蛋白酶KM9，其酶活不低于300 U/mL。
本发明还提供了所述的复配酶制剂在制备动物养殖饲料中的应用。
进一步的，所述复配酶制剂的用量为300 g/t-500 g/t动物日粮。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
本发明以
Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶基因为基础，经过随机突变，构建突变体文库和高通量定向筛选的方法，得到了包含Y161M的单点突变体KM7，分别包含Y161M/V199A、Y161M/K78R的双位点突变体KM8和KM9。本发明改造后的突变体KM7，KM8和KM9相比于原始角蛋白酶，突变体经过75℃处理5分钟后，酶活残留率由20%分别提升至55%、60%、50%，热稳定性效果提升明显，为其产业化应用及产品推广奠定基础。并且，本发明将突变体与杜仲叶提取物和胆汁酸复配得到的酶制剂，能够降低动物饲料中的粗蛋白，提高蛋白质的利用率，降低养殖成本。
附图说明
图1是角蛋白酶基因重组质粒构建图。
图2是角蛋白酶突变体筛选过程图。
图3是角蛋白酶突变体75℃处理5分钟，酶活残留率。
图4是角蛋白酶突变体KM9在15L发酵罐中的发酵数据。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下将结合附图及实施例对本文发明做更全面、详细地说明，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J .萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
在本发明中，LB培养基配方为：1％胰蛋白胨，0 .5％酵母提取物，1％NaCl。发酵培养基配方为：豆粕3.5-10%、棉籽粕5-10%、玉米粉2-6%、PPG-20000 0.5-1.0%、蛋白酶0.5-1.0%、淀粉酶0.5-1.0%、磷酸氢二钠0.2-0.5%，以质量比计。
在本发明中，酶活力测定参照《GBT 23527-2009 蛋白酶制剂》中蛋白酶的测定方法。
实施例1：角蛋白酶基因重组菌构建及其突变体文库构建
参考
Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和DNA序列(SEQ ID NO：2)设计引物，在5’端设计Kpn I限制性酶切位点，3’端设计BamH I限制性酶切位点。进行PCR扩增目的条带：使用引物如下，
KF: CGGGGTACCATGATGAGGAAAAAGAGTTT（SEQ ID NO：9）；
KR: CGCCCATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCGA（SEQ ID NO：10）。
反应体系为：
| PCR上游引物（25pmol/µL） | 1µL |
| PCR下游引物（25pmol/µL） | 1µL |
| dNTP混合液 | 4µL |
| PCR Buffer | 5µL |
| 模板DNA | 1µL |
| DNA聚合酶 | 0.5µL |
| 加双蒸水至总体积 | 50µL |
反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，循环30次，72℃，后延伸10min，15℃保存。
将PCR产物进行电泳，将条带单一的PCR产物进行纯化，双酶切，与pWB980载体进行连接（按照试剂盒说明步骤进行），并转化枯草芽胞杆菌WB600，涂布含有抗生素的平板，筛选重组菌。
突变体文库构建，用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒，以SEQ ID NO：2的基因为模版，进行随机突变，使用的引物序列如下：
KF: CGGGGTACCATGATGAGGAAAAAGAGTTT（SEQ ID NO：11）；
KR: CGCCCATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCGA（SEQ ID NO：12）
将扩增好的随机突变PCR产物用Kpn I和BamH I双酶切，连接到pWB980载体上，转化枯草芽孢杆菌WB600，卡那霉素抗性LB平板筛选阳性克隆（图2）。
将筛选的转化子单菌落接种到96孔深孔板。每个平板接入3个表达原始角蛋白酶的单菌落为对照。每孔装入500uL 含卡那霉素抗性的LB液体培养基， 37℃200rpm震荡培养24小时后， 将发酵液离心取上清，然后检测角蛋白酶的酶活性，将酶活力高于对照K0的突变体基因进行75℃耐热性验证和测序分析。
筛选到以原始角蛋白酶为出发模板的热稳定性提高的突变体Y161M，命名为KM7，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的核苷酸序列如 SEQ ID NO：4所示。
实施例2：易错PCR方式构建角蛋白酶KM7的突变体文库
以实施例1中筛选到的角蛋白酶基因KM7为模版，进行第二轮随机突变，突变库构建过程以及使用材料试剂和操作条件等均同实施例1；突变体培养和筛选时以KM7为对照，经过检测角蛋白酶突变体的酶活力以及热稳定性，将酶活残留率高于KM7的突变体基因进行测序。
最终筛选到以下突变体：
KM8突变方式为Y161M/V199A，氨基酸序列如SEQ ID No：5所示，基因序列如SEQ IDNo：6所示；
KM9突变方式为Y161M/K78R，氨基酸序列如SEQ ID No：7所示，基因序列如SEQ IDNo：8所示。
实施例3：热稳定性提高的角蛋白酶突变体重组菌摇瓶发酵表达验证
分别将含有实施例1和2的角蛋白酶突变体KM7、KM8和KM9的重组菌接种到发酵培养基中，进行摇瓶发酵78h，将培养液离心获得上清，40℃条件下测定每个突变体发酵液上清的平均酶活，测定突变体的热稳定性。
结果如图3，突变后得到的角蛋白酶KM7，KM8和KM9，在75℃条件下处理5分钟后，酶活残留率分别为55%，60%和50%，远高于对照K0的20%的残留率，说明本发明的角蛋白酶突变体的热稳定性得到明显提升。
实施例4：角蛋白酶突变体在30L发酵罐中发酵和制备
将表达角蛋白酶突变体K0、KM7、KM8、KM9的基因工程菌分别划线于含有卡那霉素抗性的（终浓度为20μg/mL）LB平板上，37℃培养至长出单菌落，挑取长势良好的单菌落进行发酵。发酵生产工艺：
（1）重组菌接种于LB液体培养基，37℃，200 rpm，过夜震荡培养；
（2）将过夜培养的种子液接种15L发酵罐，装液量为8L；
（3）控制条件：37℃，300-600rpm；溶氧20%-60%；罐压0.05Mpa；通气量0-8h 0.6m3/h； 8h至停罐 0.8-0.9 m3/h。
（4）发酵至镜检芽孢生成率为90%以上。
（5）停罐，发酵液经过5000 rpm离心5 min后，获得上清酶液。
（6）发酵过程pH自然，发酵16h后开始，每隔4h取样测定酶活力，待发酵结束后（一般48h），发酵液通过板框过滤机处理得到粗酶液。
角蛋白酶突变体KM9的发酵过程曲线如图4所示：发酵40h时，角蛋白酶突变体KM9的酶活达到最高点。
实施例5：角蛋白酶突变体酶解豆粕实验
精确称取1.00 g豆粕，放入50 mL三角瓶内，加入25mL pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液。试验组各加入对应的角蛋白酶及其突变体，加酶量为20 U/g，每组做3个平行；对照组加入灭活的角蛋白酶（沸水浴5min），调pH至8.0，放入40℃的恒温水浴锅内，100 rpm/min，振荡酶解4 h。待酶解完毕后，取上清液测小肽含量和干物质消化率。
表1 角蛋白酶突变体酶解豆粕
| 组别 | 小肽含量（mg/g） | 干物质消化率（%） |
| 对照组 | <![CDATA[33.97<sup>a</sup>±1.25]]> | <![CDATA[4.76<sup>a</sup>±0.05]]> |
| 角蛋白酶K0 | <![CDATA[81.91<sup>b</sup>±0.83]]> | <![CDATA[8.14<sup>b</sup>±0.16]]> |
| 角蛋白酶KM7 | <![CDATA[81.80<sup>b</sup>±4.16]]> | <![CDATA[8.70<sup>b</sup>±0.06]]> |
| 角蛋白酶KM8 | <![CDATA[81.74<sup>b</sup>±3.33]]> | <![CDATA[8.78<sup>b</sup>±0.16]]> |
| 角蛋白酶KM9 | <![CDATA[82.15<sup>b</sup>±1.25]]> | <![CDATA[8.19<sup>b</sup>±0.13]]> |
从表1可知，角蛋白酶及其突变体对豆粕酶解后，小肽含量和干物质消失率基本接近，差异性不显著（p>0.05），说明角蛋白酶突变体KM7，KM8，KM9经过突变后，没有影响其酶解性能，同时进一步提升了其耐热性，为其产业化应用及产品推广奠定了基础。
实施例6：动物养殖试验
将实施例4的角蛋白酶突变体KM9的粗酶液使用饱和度（100%）的硫酸铵，按照1:1进行盐析浓缩。将盐析出的沉淀放入透析袋中透析，透析缓冲液为MES缓冲液(20mM，pH6.5)，脱盐透析后的浓缩蛋白液，进行离子交换层析，即在MES缓冲液预平衡的CM-Sephadex色谱柱(2.5×20cm)上进行离子交换层析，再用含有NaCl（0.2-2mol/L）的缓冲液MES对蛋白质进行梯度洗脱。通过测定洗脱液酶活力，将有蛋白酶活性的洗脱液过SuperdexG-75凝胶柱(1.6×80cm)，进一步纯化，用MES缓冲液缓慢（2mL/min）洗脱纯化后的蛋白质，保留洗脱酶液，即为角蛋白酶突变体的纯酶液。
将角蛋白酶突变体的纯酶液以3:2:1的体积比与胆汁酸、杜仲叶提取物混合，制得复配酶制剂，其中酶制剂中角蛋白酶的酶活不低于300 U/mL。
选取仔猪，体重在20±0.54 kg/头，对照组选取30头，做3个重复，每个重复选取10头；试验组选取30头，做3个重复，每个重复选取10头。对照组以豆粕类日粮为主，粗蛋白含量18%；试验组为低蛋白日粮（杂粕类日粮），同时添加350g/t的复配酶制剂；分别饲喂，试验期共31天。定期统计采食量，称重，计算料重比。
结果如表2所示，试验组日增重比对照组提高了2.29%，料重比基本上差异不大，说明通过添加复配酶制剂，可以很好地酶解杂粕型日粮，促进蛋白质利用率，并在一定程度上促进仔猪生长，同时可以节约养殖成本。
表2 动物养殖试验数据
| 日增重 | 料重比 | |
| 对照组 | 523±5.12 | 2.35±0.13 |
| 试验组 | 535±2.35 | 2.34±0.24 |
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种角蛋白酶，其特征在于，所述角蛋白酶为氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的KM8或者氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的KM9。
2.根据权利要求1所述的角蛋白酶，其特征在于，所述角蛋白酶KM8是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第161位的酪氨酸变为甲硫氨酸和第199位缬氨酸变为丙氨酸获得的；所述角蛋白酶KM9是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第161位的酪氨酸变为甲硫氨酸和第78位的赖氨酸变为精氨酸获得的。
3.一种编码基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的角蛋白酶。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示或者核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
5.包含权利要求3所述编码基因的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌。
6.一种复配酶制剂，其特征在于，所述复配酶制剂中包含权利要求1所述的角蛋白酶、杜仲叶提取物和胆汁酸。
7.根据权利要求6所述的角蛋白酶制剂，其特征在于，在所述复配酶制剂中，角蛋白酶、杜仲叶提取物和胆汁酸的体积比为3:1:2。
8.根据权利要求7所述的角蛋白酶制剂，其特征在于，所述角蛋白酶具体为角蛋白酶KM9，其酶活不低于300 U/mL。
9.权利要求6-8任一项所述的复配酶制剂在制备动物养殖饲料中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述复配酶制剂的用量为300 g/t-500g/t动物日粮。
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