FI107342B - Menetelmä ksylitolin tuottamiseksi modifioidusta hiivaisännästä - Google Patents

Description

107342

Menetelmä ksylitolin tuottamiseksi modifioidusta hii-vai s ännäs tä

Keksinnön ala 5 Keksintö on metaboliamanipuloinnin alalta. Spesi fisesti keksintö koskee menetelmää ksylitolin tuottamiseksi käyttämällä uusia hiivakantoja, joiden ksylitolime-taboliaa on modifioitu. Keksintö koskee edelleen uusia hiivakantoja ja menetelmää tällaisten kantojen tuottami-10 seksi.

Keksinnön tausta

Ksylitolia valmistetaan tavallisesti menetelmillä, joissa ensin hydrolysoidaan ksylaanipitoinen materiaali ksyloosia sisältävän monosakkaridiseoksen tuottamiseksi. 15 Sitten ksyloosi pelkistetään ksylitoliksi tavallisesti nikkelikatalysaattorin läsnä ollessa. Lukuisia tämäntyyppisiä menetelmiä on kuvattu tämän alan kirjallisuudessa. US-patenttijulkaisut nro 3 784 408, 4 066 711, 4 075 406, 4 008 285 ja 3 586 537 voidaan mainita esimerkkeinä.

20 Kaikki nämä aiemmat menetelmät ovat kuitenkin moni vaiheisia prosesseja, jotka ovat suhteellisen kalliita ja joiden tehokkuus on suhteellisen alhainen. Suurimmat ongelmat liittyvät ksyloosin tehokkaaseen ja täydelliseen erottamiseen muista hydrolyysisivutuotteista. Puhdistus on :: 25 hyvin vaativaa, koska ksyloosin pelkistysreaktiossa käyte tyt katalysaattorit ovat hyvin herkkiä. Lopputuotteen puhtaus toisaalta on hyvin riippuvainen siitä, miten hyvin ksylitoli kyetään erottamaan muista pelkistysreaktiossa muodostuneista tuotteista.

30 Ksylitolin tuottaminen bioteknisellä menetelmällä on erittäin kiinnostavaa, mikäli tällaisella menetelmällä kyetään saamaan hyvin korkealaatuinen tuote kustannuksiltaan verraten edullisella menetelmällä. Kuitenkin ksylitolin tuottamiseksi hiivafermentoinnilla edellä mainittuihin 35 tarkoituksiin on löydettävä hiivakanta, joka ei ole pato- 107342 2 vaatimukset. Edelleen, jotta hiivafermentoinnilla päästäisiin suuriin ksylitolisaantoihin, on oleellista käyt -tää hiivaa, joka kykenee pelkistämään ksyloosin ksyliteliksi. Edullisesti tällainen kanta olisi myös suhteella -5 sen tehoton ksylitolin aineenvaihdunnallisessa edelleer -konvertoinnissa.

Monet hiivakannat tuottavat reduktaasientsyymejc, jotka katalysoivat sokerien pelkistystä vastaaviksi soke-rialkoholeiksi. Monet hiivat kykenevät myös pelkistämään 10 ksyloosia ksylitoliksi ksyloosimetaboliansa ensimmäisenä vaiheena ja useat hiivakannat kykenevät käyttämään ksyloc-siä ainoana hiili- ja energialähteenä. Ksyloosin käytin reaktiotie tai -reitti tutkitulle hiivalle on seuraave: ksylitolia syntetisoidaan ensimmäisessä vaiheessa, jossa 15 ksyloosireduktaasi pelkistää ksyloosin ksylitoliksi. Syl ten ksylitoli metaboloidaan (käytetään) sarjassa toisien n seuraavia vaiheita. Ensiksi ksylitolidehydrogenaasi hapsi-taa ksylitolin ksyluloosiksi, ksyluloosikinaasi (jota kutsutaan myös ksylulokinaasiksi) fosforyloi ksyluloosin ksy-20 luloosi-5-fosfaatiksi ja sitten osa ksyluloosi-5-fosfnatista muutetaan pyruvaatiksi ja etanoliksi useiden välivaiheiden kautta. Saadut päätuotteet ja sivutuotteet väittelevät hiivakannasta ja fermentointiolosuhteista riippuen. Reaktiot eivät ole tiukasti toisiinsa kytkettyjä, : 25 minkä vuoksi jonkin verran ksylitolia muodostuu aina kas vualustaan.

Tämän alan tutkimuksessa on yleensä keskitytty yrityksiin identifioida hiivakantoja, joilla on tehostunut kyky tuottaa etanolia pikemminkin kuin ksylitolia.. 30 Ksylitolin tuottaminen on kuitenkin ksyloosia käyttävien hiivojen suhteellisen yleinen piirre. Esimerkiksi 44 hiivasta viidestä suvusta (Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia ja Pachysolen) '42 tuotti jonkin verran ksylitolia kasvualustaan [Barbosa, M.F.S., et ai., J. Industr. Micrc- 107342 3 biol. 3 (1988) 241 - 251; ja Enzyme Microb. Technol. 10 (1988) 66 - 81].

Tällaisten kantojen käyttöä ksylitolin teolliseen tuotantoon on ehdotettu. Esimerkiksi hiivoja Candida tro-5 picalis, Candida guillermondii ja Candida parapsilosis on ehdotettu käytettäväksi teollisesti (PCT-patenttihakemus-julkaisut PCT/FI90/00015, C^_ tropicalis, PCT/FI91/00011, C. tropicalis, ja PCT/FI87/00162, C_^ guillermondii, ja FR-patenttihakemusjulkaisu 2 641 545, C. parapsilosis). Kaik-10 ki edellä mainitut Candida-kannat ovat kuitenkin mahdollisia patogeenejä, jotka eivät täytä elintarviketeollisuuden vaatimuksia. Barbosa et ai., J. Industr. Microbiol. 3 (1988) 241 - 251, kuvaavat ksylitolin tuottamisen suhteen seulottuja hiivoja. Kuitenkin kannat, joilla saatiin hy-15 väksyttäviä saantoja, ovat myös kaikki mahdollisia patogeenejä. Tämän vuoksi ei ole kuvattu ksylitolin tuottamiseen käyttökelpoisia ei-patogeenisia hiivakantoja, joita voidaan käyttää elintarviketeollisuudessa ja/tai ksylitolin tuottamiseen suuressa mittakaavassa.

20 Lisäksi ksylitolin kannattava teollinen tuotanto ksyloosin entsymaattisella konversiolla on mahdollista vain, jos saanto on hyvin suuri. Millään villihiivakannal-la ei kuitenkaan voida päästä tähän. Tutkittaessa erilaisia hiivakantoja optimaalisissa reaktio-olosuhteissa to-25 dettiin, että tietyt Candida tropicalis -kannat tuottivat parhaan ksylitolisaannon. Tämän hiivalajin kannat ovat, kuten edellä mainittiin, kuitenkin mahdollisesti patogeenisiä, minkä vuoksi niitä ei voida käyttää elintarviketeollisuudessa. Elintarviketeollisuudelle hyväksyttä-30 viä lajeja ovat Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis ja Kluyveromyces marxianus. Saccharomyces cerevisiae ei normaalisti ilmennä ksyloosireitin entsyymejä, vaikka Hallborn, J., et ai., Bio/Technology 9 (1991) 1090, kuvaavat Pichia stipitiksen kloonatun ksyloosireduktaasigeenin 35 käyttöä Saccharomyces cerevisiae -kantojen rakentamiseksi, 107342 4 jotka kykenevät muuttamaan ksyloosia ksylitoliksi väitetyn saannon ollessa 95 %.

On kuvattu mutantteja, joiden ksyloosin käyttö en puutteellista. Julkaisussa Hagedorn,, J., et ai., Curi .

5 Genet. 16 (1989) 27 - 33 julkistetaan, että on identifioitu hiivan stipitis mutantteja, jotka eivät kyenneet käyttämään ksyloosia ainoana hiililähteenä ja joilla jol^o ksyloosireduktaasi tai ksylitolidehydrogenaasi oli puut -teellinen. Julkciisussa James, A. P., et ai., Appi. Er -10 viron. Microbiol. 55 (1989) 2871 - 2876 julkistetaan h;.J -van Pachysolen tannophilus mutantteja, jotka eivät kykere metaboloimaan D-ksyloosia. Julkaisussa Stevis, P. E., et ai., Appi. Biochem. Biotechnol. 20 (1989) 327 - 334 julkistetaan hiivaksylulokinaasimutanttien rakentaminen yh-15 distelmä-DNA-tekniikoilla.

Hiivoilla Candida utilis ja K1uyveromyees marxiani s on ksyloosin hajottamiselle välttämättömät luonnollisesti indusoituvat entsyymit ksyloosireduktaasi, ksylitolidehyc-rogenaasi ja ksyluloosikinaasi. Yritykset säätää Candle a 20 utilis- ja Kluyveromyces marxianus -hiivojen kemiallista ja fysikaalista ympäristöä ksylitolin saannon nostamiseksi ovat kuitenkin epäonnistuneet.

Keksinnön yhteenveto

Nyt on havaittu, että hiivojen ksylitolimetabol:<a .: 25 voidaan modifioida, jolloin muodostuu uusia hiivakanto.jc , jotka tuottavat ksylitolia suurin saannoin.

Täten keksintö kohdistuu ensiksi uusiin hiivakin töihin, jotka hiivakannat kykenevät ksylitolin synteesiin ksyloosista, mutta joilla yksi tai useampi ksylitolinne :a-30 bolian entsyymi on puutteellinen, jolloin ksylitolia kes-rääntyy kasvualustaan, josta se voidaan ottaa talteen.

Keksintö kohdistuu edelleen menetelmiin ksylito L:.n tuottamiseksi tällaisia hiivakantoja käyttäen.

Keksintö kohdistuu edelleen menetelmään modifioitu-35 jen hiivakantojen rakentamiseksi, jotka kykenevät pelkin- 107342 5 tämään ksyloosia ja jotka eivät kykene ilmentämään ksyli-tolidehydrogenaasi- ja/tai ksyluloosikinaasiaktiivisuutta tai joiden ksylitolidehydrogenaasi- ja/tai ksyluloosiki-naasiaktiivisuuden ilmentäminen on puutteellinen.

5 Yksityiskohtainen kuvaus

Keksinnön mukaiset modifioidut hiivakannat kykenevät syntetisoimaan ksylitolia ksyloosista, mutta niiden ksylitolin käytön yksi tai useampi entsyymi on puutteellinen, jolloin ksylitolia kerääntyy kasvualustaan kasvatet-10 taessa modifioitua hiivaisäntää ksyloosin avulla. Täten uusissa kannoissa ksyloosireduktaasiaktiivisuutta on läsnä, mutta ksylitolimetabolia on merkittävästi alentunut. Uudet kannat eivät siten kykene käyttämään ksyloosia ainoana hiililähteenään, vaikka ksyloosi indusoi ksyloosi-15 reduktaasiaktiivisuutta ja siten ksyloosin konversiota ksylitoliksi.

Ksyloosin pelkistysreaktion kulku esitetään seuraa- vassa.

Ksyloosireduktaasi katalysoi reaktiota: 20 ksyloosi

/ NADPH

J.(

NADP

ksylitoli . 25 Ksylitolin käytön ensimmäinen entsyymi, ksylitoli- • · dehydrogenaasi, katalysoi reaktiota: ksylitoli «ΝΑΟ ,r(

30 NADH

ksyluloosi • · ·

Keksinnön mukaisella menetelmällä tuotetut uudet hiivakannat tuottavat ksylitolia ksyloosista, kun kasvualustaan on lisätty hiivakannan kasvua ja ylläpitoa varten 35 muutakin hiili- ja energialähdettä. Viljelyolosuhteissa, 107342 6 joissa halutaan tuottaa ksylitolia ksyloosista, keksinnön mukaiset isännät ovat geneettisesti kykenemättömiä käyttämään ksyloosia ainoana hiililähteenä, koska ne ovat geneettisesti kykenemättömiä täydellisesti metaboloimaan 5 ksylitolin. Koska kannat eivät kykene metaboloimaan ksylitolia, ksylitoli kerääntyy kasvualustaan. "Geneettisesti kykenemättömällä" tarkoitetaan, että natiivia hiiva-DNA:ta on muutettu siten, että tuloksena on modifioitu hiivaisän-tä, jolla on haluttu mutaatio tai muu geneettinen muuton, 10 joka periytyy stabiilisti.

Täten keksinnön mukaisten modifioitujen hiivakanro-jen glukoosimetabolia ja ksyloosin pelkistys ovat vilkkaita, mutta samanaikaisesti nopeus, jolla ne hapettavat ksylitolia ksyluloosiksi, on kuitenkin, merkittävästi alerrni-15 nut. Uudet kannat ovat siten hyvin tehokkaita ksylitolin tuottajia. Tunnekaan monia ksyloosia käyttäviä hiivakam-toja, mukaan lukien esimerkiksi Cr frareli (kuten FTl-20038); guillermondii (kuten FTI-20037, IZ-803, iz- 1739, IZ-1231, 12:-1322, IZ-1239, IZ-1422, c-138, 17-07 ia 20 1Z-1735); intermedia (kuten RJ-245); pseudotropica- lis (kuten IZ-431 ja 1006); tropicalis (kuten 1004, iz-1824, IZ-1958 ja 53-51); Cl utilis (kuten FTI-20039, '4-64, 1009, EQ2, IZ-1166, IZ-1840 ja IZ-1841); anomala (kuten IZ-1420, IZ-229, IZ-781, IZ-1033, RJ-510, IZ-271, 25 IZ-1224, IZ-1260 ja FTPTAT-106); fragilis (kuten FTI- 20066); K. marxianus (kuten IZ-1821, 145, IZ-1339, 276 la IZ-619); Pach. tannophilus (kuten NRRL Y2460); butönii (kuten 68-1111) ja P^ stipitis (kuten 79-261). Tällaisia hiivoja voidaan saada lukuisista eri lähteistä, kuten eai-30 merkiksi laitokset ATCC, NRRL, the Agronomic Institute (UNICAMP, Campinas, Brasilia); the Foundation for Industrial Technology (FTI, Sao Paulo, Brasilia); the Microbiology Institute (UFRJ, Rio de Janeiro) ja the ZymA-technic Institute (ESALQ, Piracicaba). Kaikkia voidaan 35 ylläpitää agar-vinopinnoilla tai -maljoilla alalla kuva- • · 107342 7 tun mukaisesti, esimerkiksi kasvualustassa, joka sisältää 10 g/litra hiivauutetta, 20 g/litra peptonia ja 20 g/lit-ra D-glukoosia [Barbosa, M. F. S., et ai., J. Industr. Microbiol. 3 (1988) 241 - 251].

5 Kun uusien kantojen tuottamiseen käytetään ei-pato- geenisia alkuperäiskantoja, saadut mutantit täyttävät myös elintarviketeollisuuden asettamat erityisvaatimukset sekä laadun että saannon suhteen. Edullisesti käytetään lajin Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia tai Pachysolen 10 hiivaa, ja etenkin hiivaa Candida utilis tai Kluyveromyces marxianus. Erittäin edullisessa suoritusmuodossa käytetään kantaa Kluyveromyces marxianus var. marxianus (kuten CBSC12) tai kantaa Kluyveromyces marxianus var. bulgari-cus (kuten ATCC 16045) tai kantaa Kluyveromyces marxianus 15 var. lactis. Keksinnön mukaiset menetelmät sopivat minkä tahansa hiivan modifiointiin haluttaessa rakentaa tai identifioida hiiva, joka kykenee tuottamaan ksylitolia mutta jolla yksi tai useampi ksylitolin käytön entsyymi on puutteellinen. Menetelmiä, joista jäljempänä esitetään 20 esimerkkejä, joissa hiivaa Kluyveromyces marxianus on käytetty mallina ja lähtömateriaalina, voidaan laajemmin soveltaa muidenkin hiivalajien modifiointiin keksinnön mukaisiin modifioituihin hiivaisäntiin pääsemiseksi.

Kluyveromyces marxianus on hyvin tunnettu, elintar-25 viketeollisuudessa paljon käytetty ei-patogeeninen hiiva.

Hiivaa on kuvattu esimerkiksi julkaisussa "The Yeasts, A Taxonomic Study", toim. N. J. W. Kreger-van Rij, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1984, jossa myös tämän hiivan synonyymejä on mainittu sivulla 234. Tämä julkaisu 30 ja kaikki muut tässä mainitut viitteet liitetään täten viitteinä osaksi tätä hakemusta. Villikanta käyttää nor-maalisti glukoosia energialähteenään, mutta se kykenee myös metaboloimaan ksyloosia. Muitakin elintarviketeollisuuden erityisvaatimukset täyttäviä hiivoja, kuten tietty- • « 107342 8 jä Candida-kantoja, voidaan käyttää keksinnön mukais:.in tarkoituksiin.

Edullisesti geenit, joiden ilmentäminen halutuen inaktivoida, ovat natiivissa hiivaisännässä ksylitolicis:-5 hydrogenaasia ja ksyluloosikinaasia koodittavat geenit. Nämä geenit ovat edullisia, koska ne ovat yleensä ksylito-limetabolian ainoa reitti isännässä. Tämän vuoksi jommankumman (tai kummankin) entsyymin ilmentämisen salpaamimn viimekädessä salpaa ksylitolin käytön ja tekee mahdoin -10 seksi ksylitolin kerääntymisen kasvualustaan kasvatettane -sa isäntää ksyloosin läsnä ollessa.

Keksinnön mukaiset isännät voidaan tuottaa mill ä tahansa menetelmällä, joka salpaa ksylitolimetabolian edellä kuvatulla tavalla. Yhdessä suoritusmuodossa keks:.r|-15 nön mukaiselle menetelmälle uusien hiivakantojen tuottamiseksi on tunnusomaista, että lähtökantaa viljellään assimiloituvia hiili- ja energialähteitä sisältävässä kasvualustassa, viljelmälle suoritetaan mutageenikäsittely Ja mahdollisesti käsittely aineella, joka häiritsee kromoso-20 mien jakautumista tai tumasukkuloiden muodostumista, nu-tantit rikastetaan antibioottia käyttäen ja hiivakannaf, joiden ksylitolimetabolia on puutteellinen, seulotaan ;a otetaan talteen.

Tässä suoritusmuodossa käytetään esimerkiksi mute -25 genisointia kemiallisen tai fysikaalisen käsittelyn keinoin. Esimerkkejä sopivista kemiallisista mutageeneisl a ovat emäsanalogit, kuten 5'-bromourasiili, 2'-aminopurii.r i ja 5'-deoksiuridiini, deaminoivat aineet, kuten typpihappo ja hydroksyyliamiini, alkyloivat aineet, kuten etyyIiris -30 taanisulfonaatti ja nitrosoguanidiini, ja akridiinijol.-dannaiset, kuten akriflaviini ja etidiumbromidi. Menetti.-lyjärjestelyjä näiden aineiden käyttämiseksi tunnetaan alalla.

Esimerkkejä käyttökelpoisista fysikaalisista mutc-35 genisointimenetelmistä ovat esimerkiksi UV- ja röntgen: « 107342 9 desäteilytys. Menettelyjärjestelyjä näidenkin aineiden käyttämiseksi tunnetaan alalla.

Hiivaa voidaan mahdollisesti käsitellä aineella, joka häiritsee kromosomien jakautumista tai tumasukkuloi-5 den muodostumista mitoosisyklissä. Benomyylin käyttäminen on edullinen suoritusmuoto. Tällä käsittelyllä kromosomi, jossa on haluttu mutaatio, eristetään läsnä olevista homologisista kromosomeista. Tätä käsittelyä ei tarvita hap-loideille hiivakannoille.

10 Lopuksi edellä kuvatun mukaisella kemiallisella tai fysikaalisella menetelmällä modifioidut hiivat seulotaan niiden suhteen, joilla on keksinnön mukaisille modifioiduille hiivaisännille toivotut ominaispiirteet. Voidaan käyttää auksotrofisten solujen rikastamista antibiootilla, 15 kuten nystatiini, joka tappaa vain solut, joilla on aktiivinen metabolia. Käsittely suoritetaan ksyloosin läsnä ollessa. Kasvualustasta voidaan määrittää suoraan ksyloosi-määrä alalla tunnettujen menetelmien mukaan parhaiden hii-vatuottajien määrittämiseksi.

20 Uudet kannat voidaan siis tuottaa viljelemällä läh- tökantaa sopivassa kasvualustassa tavanomaiseen tapaan. Saadulle viljelmälle voidaan suorittaa mutageenikäsittely kemiallisilla tai fysikaalisilla menetelmillä, esimerkiksi käyttäen insertioita tai deleetioita aiheuttavaa mutagee-25 nia, kuten akriflaviinia tai proflaviinia, pistemutaatioi-ta aiheuttavaa mutageenia, etyylimetaanisulfonaattia, UV-säteilyä tai vastaavaa. Mahdollisen benomyylikäsittelyn jälkeen mutantit voidaan rikastaa esimerkiksi käsittelemällä nystatiinilla ja lopuksi hiivakannat seulotaan vil-30 jelemällä niitä paljon ksyloosia ja vähän glukoosia sisältävillä agar-maljoilla. Ksyloosimetabolialtaan puutteelliset hyvin pienet pesäkkeet noukitaan talteen ja niistä muodostetaan puhdasviljelmiä tavanomaisilla tekniikoilla. Kemiallisten tai fysikaalisten menetelmien käyttämisen 35 keksinnön mukaisen isännän rakentamiseksi etu on, että • 107342 10 tällaiset menetelmät toimivat vaivattomasti minkä tahansa lähtöhiivalajin kanssa ja valikointimenetelmiä (ksylitolin tuotannon määritys kasvualustasta) voidaan niinikään vaivatta käyttää minkä tahansa hiivallajin yhteydessä. Esi-5 merkiksi esimerkeissä kuvatuilla menetelmillä voitaisiin odottaa saatavan keksinnön mukaisia isäntiä ei ainoastaan esimerkkinä esitetystä lajista, vaan myös mistä tahansa hiivaisännästä, joka luontaisesti kykenee metaboloirnaan ksyloosia.

10 Vaihtoehtoiseen menettelyyn keksinnön mukaisten isäntien rakentamiseksi liittyy yhclistelmä-DNA-tekniikoiden käyttö. Ensimmäisessä suoritusmuodossa ksylitolimeti i-bolian entsyymiä koodittavaa DNA-sekvenssiä muutetaan koodi-informaation tuhoamiseksi tällaisessa geenissä ja mou-15 tettu geeni insertoidaan hiivan kromosomiin natiivin hil-vageenin tilalle käyttäen homologisen DNA-yhdistämisen tai geenikatkaisun tekniikoita. Esimerkkejä geeneistä, jotka voidaan valita tällaisiksi kohteiksi, ovat ksylitolidehya-rogenaasi ja ksyluloosikinaasi. Ksylitolidehydrogenaani 20 valitaan edullisesti inaktivoinnin kohteeksi, koska tänä on ksylitolin käytön ensimmäinen entsyymi. KsyluloosikL-naasin inaktivointi on riittävä varmistamaan suuren ksylL-tolisaannon, koska ksylitolidehydrogenaasin katalysoiman reversiibelin reaktion tasapaino siirtyy hyvin voimakkaas-25 ti suosimaan ksylitolia hiivasolun sisässä vallitsevissa olosuhteissa. Jos kumpaakin entsyymiä koodittavat geenit valitaan inaktivoinnin kohteeksi, ksylitolidehydrogenaasin aktiivisen muodon (tai fragmentin) mahdollisesti jäljelLä olevan alhaisen ilmentämistason kompensoi isännässä ksylj-30 loosikinaasiaktiivisuuden puuttumisin.

Menetelmät näiden hiivageenien kloonaamiseksi ovat alalla tunnettuja (katso esimerkit). Ksylitolidehydroga-naasia tai ksyluloosikinaasia koodittavat geenit voidaan kloonata esimerkiksi täydentämällä vastaavat mutaatiot 35 Escherichia coltssa tai hiivassa. Kloonattuja geenejä no- 107342 11 difioidaan insertoimalla hiivassa valikoitava DNA-sekvens-si kloonatun geenin koodialueelle, edullisesti etäisyydelle, joka ei ole vähempää kuin useampi sata emäsparia kloonatun geenin kummastakin päästä. Valikointimerkki (edulli-5 sesti dominoiva merkki, joka tuottaa antibioottiresisten-tin fenotyypin) voidaan joko insertoida sopivaan restrik-tiokohtaan tai manipuloida korvaamaan fragmentti rikotussa geenissä. Saatua plasmidirakennetta monistetaan bakteereissa. Sitten käytetään sopivia restriktioentsyymejä DNA-10 fragmentin leikkaamiseksi, jossa on ksylitolidehydrogenaa-si- (tai ksyluloosikinaasi-) geenisekvenssit kummassakin päässään ja hiivavalikointimerkki keskialueella. Tätä DNA-fragmenttia käytetään sitten hiivakannan transformoimisek-si antibioottiresistentiksi. Yksittäisten transformantti-15 kloonien kyky kasvaa maljoilla, jotka sisältävät ksyloosia ainoana hiililähteenä, tarkastetaan. Onnistunut geenikat-kaisu voidaan lopuksi vahvistaa mittaamalla vastaava entsyymiaktiivisuus transformoidussa kannassa ja/tai analysoimalla hiivakromosomin oleellisen alueen rakenne South-20 ern-hybridisaationa tunnetulla menetelmällä.

Sopiva modifikaatio on esimerkiksi kloonatun geenin sisäisen fragmentin korvaaminen dominoivalla valikointi-merkillä hiivalle. DNA:t, jotka koodittavat bakteeriperäistä kanamysiiniresistenssigeeniä tai bleomysiiniresis-25 tenssigeeniä, ovat esimerkkejä käyttökelpoisista dominoivista valikointimerkeistä hiivalle. Tällaiset rakenteet voidaan kytkeä operatiivisesti hiivapromoottorisekvenssei-hin tai ne voivat käyttää homologisen DNA-yhdistymisen kohdassa läsnä olevaa hiivapromoottoria. Kun käytetään 30 sellaisen geenin promoottoria, jonka koodaussekvenssi kat kaistaan, valikoiduiksi tulevat vain ne transformantit, jotka insertoivat koodaussekvenssin faasiin halutun trans-lationaalisen lukukehyksen kanssa. On siis usein kätevämpää käyttää promoottorisekvenssiä, joka jo on operatiivi-35 sesti kytketty rakenteeseen. Mitä tahansa muitakin geene- 107342 12 jä, jotka tekevät mahdolliseksi transformoivan DNA:n sl-sältävien solujen seulonnan, voidaan käyttää antibiootti-resistenssigeenin asemesta, esimerkiksi välttämätöntä proteiinia koodattavaa geeniä.

5 Voidaan suorittaa hiivasolujen transformointi li neaarisella DNA-fragmentilla, jossa on osasekvenssit hali-tusta kohteesta (kuten ksylitolidehydrogenaasi- tai ksytu-loosikinaasigeenin osasekvenssi) kummassakin DNA-päässä ; a valikointimerkki fragmentin sisällä. Tällaisen transfoi -10 moinnin tiedetään johtavan suureen osuuteen transformaatteja, joissa on deleetiomutaatio vastaavassa geenissä.

Vaihtoehtoisesti, jos halutaan säilyttää natiivj n hiivan kyky ilmentää ksylitolidehydrogenaasia ja/tai ksj-luloosikinaasia, voidaan käyttää vaihtoehtoisia DNA-yhdis-15 tämismenetelmiä, joilla saadaan kohde-entsyymin ilmentymisen selektiivinen inhibitio. Tällaisiin menetelmiin lukeutuu antisense-RNA:n tai ribotsyymin rakentaminen, joka kohdistuu tarkoituksenmukaista haluttua kohdetta vastaan, kuten ksylitolidehydrogenaasia tai ksyluloosikinaasia koo-20 dittava mRNA. Antisense-RNA:ta koodittavalla DNA-raker-teella on DNA-sekvenssi, joka on komplementaarinen kohtein mRNA:n sekvenssiin nähden ja joka on riittävän pituinen tunnistaakseen tällaisen kohde-mRNAn ja hybridisoituekseen siihen estäen täten kohteen mRNA:n translaation isän-25 täsolussa. Tarkoituksenmukaista ribotsyymiä koodattavat] a DNA-rakenteella on myös riittävä DNA-sekvenssi hybridised-tumaan kohteen mRNA:han; kuitenkin tällaiseen mRNA:hän hybridisoiduttuaan ribotsyymiaktiivisuus katalysoi mRNA:n pilkkomista kohdassa, joka tuhoaa tällaisen mRNA:n ky/yn 30 ylläpitää siinä kooditetun aktiivisen proteiinin translaatiota (katso esimerkiksi EP 321 201). Antisense-RNA-raken-ne tai ribotsyymisekvenssi voidaan kytkeä operatiivisesti mihin tahansa tarkoituksenmukaiseen hiivapromoottorisekvenssiin käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä ja trans-35 formoida hiivaisäntiin geneettisesti stabiililla tavalta 107342 13 käyttäen tavallisia transformointitekniikoita alalla samoin tunnetun mukaisesti. Tällaisten rakenteiden ilmentämisen määräävät operatiivisesti kytketyn hiivapromoottorin ominaisuudet ja ilmentäminen voi olla konstitutiivinen tai 5 indusoituva tai repressoituva erilaisissa kasvualustoissa toivomusten mukaisesti. Tällaisten rakenteiden etu on, että natiivin isännän kykyä ilmentää kohde-entsyymi ei tuhota. Tällaisten rakenteiden ilmentämisen tekemisen säädettäväksi pois päältä/päällä -tapaan etu on, että isännän 10 kykyä ilmentää kohde voidaan tiukasti kontrolloida, jolloin kohteen ilmentäminen estetään vain haluttaessa saada ksylitolisynteesi.

Esillä olevan keksinnön mukaan rakennettujen uusien hiivakantojen tehokkuutta voidaan edelleen parantaa ilmen-15 tämällä hyvin voimakkaasti ksyloosireduktaasi, joka on kloonattu samasta hiivasta tai eri hiivakannasta. Menetelmää hiivan ksyloosireduktaasigeenin kloonaamiseksi ovat kuvanneet useat kirjoittajat [Hallborn, J., et ai., Bio/ Technology 9 (1991) 1090 - 1094; Takuma et ai., Appi.

20 Biochem. Biotechnol. 28/29 (1991) 327 - 340; ja Strasser et ai., DE 4 009 676 (1991)]. Menetelmää tämän kloonatun geenin käyttämiseksi ksyloosi-ksylitolikonversioon hiivassa on niinikään kuvattu [Hallborn, J., et ai., Bio/Tech-nology 9 (1991) 1090 - 1094]. Kloonattu ksyloosireduktaa-25 sigeeni voidaan siirtää sopivaan vektoriin, joka kykenee lisääntymään valitussa hiivalajissa. pKDl-pohjaiset vektorit esimerkiksi ovat edullinen vektorityyppi korkean eks-pressiotason saamiseksi hiivassa K_^ marxianus [Bianchi, M. M., et ai., Curr. Genet. 12 (1987) 185 - 192]. Ksyloosire-30 duktaasigeeni voidaan vaihtaa toiseen promoottoriin, jonka tiedetään toimivan tehokkaasti valitussa hiivassa. Esillä olevan keksinnön mukaan saatuja mutanttihiivakantoja voidaan sitten käyttää isäntinä transformoinnissa vektorilla (vektoreilla), jolla (joilla) saadaan ksyloosireduktaasi-35 geenin hyvin voimakas ilmentäminen.

107342 14

Kalkissa suoritusmuodoissa riippumatta siitä, mittin ne on tuotettu, saaduille keksinnön mukaisille uusille hiivakannoille on tunnusomaista, että niillä on merkittävästi alentunut kyky metaboloida ksylitolia natiiviin h.L:.-5 vakantaan verrattuna. Tämä johtuu siitä, että ksylitoliin* s-tabolian yhtä tai useampaa entsyymiä, kuten ksylitolid* i-hydrogenaasiaktiivisuutta ja/tai ksyluloosikinaasiaktiiv:.-suutta, on modifioitu siten, että tällaisen entsyymin ilmentyminen joko häviää tai laskee (joko pysyvästi tai sää-10 dettävällä tavalla) tuloksena hiivan modifioinnista. Mitä tahansa hiililähdettä, jota isäntä kykenee käyttämään energian tuotantoon, voidaan käyttää keksinnön mukailen hiivan kasvun ylläpitämiseksi ja antamaan käyttöön pelk.tii-tysekvivalentit ksyloosin pelkistykseen. Tämä funk b;.o 15 (pelkistyspotentiaalin käyttöön antaminen) on ehkä tärkeämpää keksinnön mukaiselle menetelmälle kuin isäntäsoLun kasvun ylläpitäminen. Esimerkiksi glukoosia lisätään edullisesti kasvualustaan energialähteeksi määrinä, jotka alalla tiedetään välttämättömiksi isännän kasvun ylläpita-20 miseksi. Kasvatuksen ilmastus- ja scikoitusolosuhteiden tulisi olla isännälle optimaaliset olosuhteet.

Annettaessa ksyloosia keksinnön mukaisille isännille ksyloosihiili tulee oleellisesti "vangituksi" ksylitolina eikä ole käytettävissä isännän energiavaatimuksiin.

. 25 Tämän ominaisuuden vuoksi keksinnön mukaiset uudet kannat

• «. I

ovat erittäin käyttökelpoisia ksylitolin tuotannossa. Vil-jeltäessä keksinnön mukaisia mutagenisoituja kantoja paljon ksyloosia sisältävässä ravintoliuoksessa ne muuttajat ksyloosia ksylitoliksi hyvin tehokkaasti. Niiden konvar-30 siotehokkuutta ja käyttökelpoisuutta haluttuun menetelmään voidaan arvioida käyttämällä mitä tahansa ksyloosipitoisia liuoksia ja hydrolysaatteja, esimerkiksi puhtaita ksyloo-siliuoksia tai puunjalostusteollisuuden jätelientä, kutnn keiton jätelientä tai keittolientä tai niiden paljon ksy-35 loosia sisältävää osaa. Tehokkaimmat ksylitolin tuottajat 107342 15 otetaan talteen ja niitä käytetään ksylitolin tuotantoon teollisessa mittakaavassa.

Edellä kuvatun käsittelyn (edellä kuvattujen käsittelyjen) tuloksena saadaan täten uusia, kantoja, jotka me-5 taboloivat ksyloosia ksylitoliksi suurin saannoin. Koska kantojen ksylitolimetabolia on puutteellinen, kannat eivät hajota (pilko tai metaboloi tai käytä) ksylitolia, vaan ksylitoli kerääntyy kasvualustaan ja otetaan talteen esimerkiksi kromatografisesti hiivasolujen poistamisen jäl-10 keen. Voidaan käyttää mitä tahansa alalla tunnettua menetelmää ksylitolin puhdistamiseksi kasvualustasta (esimerkkien osalta katso US 5 081 026, joka julkaisu liitetään täten viitteellä osaksi tätä hakemusta).

Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisesti seuraavien 15 esimerkkien avulla, joiden tarkoituksena ei ole rajoittaa keksintöä. Todettakoon tässä yhteydessä, että menetelmää ei ole optimoitu ksylitolituotannon suhteen vaan hiivakan-tojen erojen esilletuomisen suhteen.

Esimerkki 1 20 Uusien hiivakantojen muodostaminen

Kluyyeromyces marxianus -kantaa ATCC 8608 viljeltiin YDP-, DYM- tai DYM-tartraattikasvualustalla pH:ssa 6,0 ja 30 °C:ssa. YDP (1 000 ml) sisälsi 10 g hiivauutet-ta, 20 g glukoosia ja 20 g peptonia. DYM (1 000 ml) sisäl-25 si 5,0 g (NH2 )2S04: ää, 1,0 g KH2P04:ää, 0,5 g MgS04 · 7H20: ta, 0,1 g NaCl:ää ja 0,1 g CaCl2·2H20:ta. DYM-tartraatti sisälsi 7,1 g Na2S04:ää, 27,6 g (NH4)2-tartraattia, 6,8 g KH2P04: ää, 0,5 g MgS04*7H20:ta, 0,1 g NaCltää ja 0,1 g CaCl2*2H20:ta. DYM- ja DYM-tartraattikasvualustoihin lisät-30 tiin hivenaineliuosta (1:1 000), vitamiiniliuosta (1:100) ja hiililähdettä? viimeiset kaksi lisättiin autoklavoinnin ‘ jälkeen. Sokerit ja sokerialkoholit autoklavoitiin erik seen 20-%:isinä (w/v) liuoksina ja vitamiiniseos steriloitiin suodattamalla. Vitamiiniliuos (1 000 ml) sisälsi 35 100 mg L-histidiini*HCl«H20:ta, 0,2 mg biotiinia, 40 mg 107342 16 kalsiumpantotenaattia, 0,2 mg foolihappoa, 200 mg inositc-lia, 40 mg niasiinia, 20 mg para-ami.noberrtsoehappoa, 40 ng pyridoksiini*HCl:ää; 20 mg riboflaviinia ja 40 mg taimiini »HC1: ää. Hivenaineseoksessa (1 000 ml) oli 500 n g 5 H3B03:ea, 40 mg CuS04 · 5H20: ta, 100 mg Kiitä, 200 mg Fed · 6H20:ta, 400 mg MnS04*H20: ta, 200 mg Na2Mo04 · 2H20: ta ;a 400 mg ZnS04·7H20:ta.

A. Mutageenikäsittely a) 100 ml DYM-glukoosia (1 % w/v), jossa oJ i 10 0,001 % (w/v) akriflaviinia, siirrostettiin hiivalla Kluy- veromyces marxianus ATCC 8608 ja tätä kasvatettiin ravii -telijassa 3 päivän ajan. Solut sentrifugoitiin eroon, r.e pestiin 100 ml:1.1a steriiliä 0,9-%:ista NaCl-liuosta ; a suspendoitiin uudelleen 500 ml:aan tuoretta YDP:tä. Y4 n 15 yli kasvaneet viljelmät siirrettiin edelleen 2 % glukoosia sisältävään DYM-kasvualustaan benomyylikäsittelyä varter.

b) Etyylimetaanisulfonaatti (EMS) -mutagenisoinbja varten YDP-kasvualustalla yön yli kasvaneet viljelnct sentrifugoitiin ja konsentroitiin solutiheyteen 2 x 109/n] .

20 EMS:ää lisättiin loppupitoisuuteen 30 mg/ml ja suspensiota inkuboitiin 2 tuntia 15 minuuttia. Tämä käsittely tappoi noin 70 % hiivasta. 2 ml mutagenisoitua solususpensiola laimennettiin 100 ml:ksi lisäämällä tuoretta YDP:tä, kaivatettiin 2 päivän ajan ja siirrettiin sitten edelleen be-25 nomyylikäsittelyä varten glukoosia sisältävään DYM-kasvn -alustaan.

c) Vastaavasti voidaan käyttää mitä tahansa kemial lista tai fysikaalista mutagenisointimenetelmää. Annosti s optimoidaan siten, että mikrobien kuolleisuus on 10 - 30 100 %. Käsittelyn jälkeen mikrobit siirretään kasvualul taan tai -paikkaan, jossa kasvu on optimaalinen. Täinen jälkeen siirrytään vaiheeseen B.

B. Benomyylikäsittely

Akriflaviinilla tai EMS:llä mutagenisoituja ja sen 35 jälkeen glukoosia sisältävässä DYM-kasvualustassa kasva- • < 107342 17 tettuja soluja otettiin talteen sentrifugoimalla ja niitä lisättiin tuoreeseen YDP-kasvualustaan solutiheyteen 108/ml. Benomyyli (10 mg/ml) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin, liuos steriloitiin suodattamalla ja sitä lisättiin 5 solususpensioon benomyylin loppupitoisuuteen 100 pg/ml.

Viljelmää ravisteltiin 30 °C:ssa 2 päivän ajan. Sitten solut otettiin talteen sentrifugoimalla, ne pestiin kahdesti steriilillä 0,9-%:isella NaCl-liuoksella ja suspendoitiin uudelleen 5-kertaiseen tilavuuteen tuoretta YDP:tä. Kahden 10 päivän inkuboinnin jälkeen viljelmä siirrettiin glukoosia sisältävään DYM-kasvualustaan nystatiinirikastusta varten. Benomyylikäsittelyn tehokkuutta seurattiin arvioimalla mikroskoopin avulla kaksi tumaa käsittävien solujen esiintymistiheyttä. Ennen mikroskooppitarkastelua hiivasolut 15 kiinnitettiin etikkahappo-formaldehydi-alkoholilla ja vär jättiin HCl-Giemsa-liuoksella Streiblovan yksityiskohtaisesti julkaisussa "Yeast, A Practical Approach", toim. I. Campbell ja J. A. Duffus, IRL Press, Oxford, 1988, kuvaaman mukaisesti. Vastaavasti voidaan käyttää jotain muuta 20 yhdistettä, joka häiritsee kromosomien jakautumista tai tumasukkuloiden muodostumista.

C. Antibioottirikastus

Glukoosia sisältävässä kasvualustassa kasvatetut, mutagenisoidut ja benomyylillä käsitellyt solut sentrifu-25 goitiin eroon, pestiin suolaliuoksella ja suspendoitiin uudelleen solutiheyteen 107/ml DYM-kasvualustaan, jossa ei ollut hiililähdettä. Soluja nälkiinnytettiin 8-15 tunnin ajan, minkä jälkeen lisättiin 1 g ksyloosia 100 ml solu-suspensiota kohden. Nystatiini suspendoitiin etanoliin 30 (1 mg/ml) mikro-organismien tappamista varten (sen huonon liukoisuuden vuoksi sitä ei voida suodattaa). Suspensiota laimennettiin 1:10 lisäämällä steriiliä vettä ja sitä lisättiin viljelmiin (10 % v/v) 15 tunnin kuluttua ksyloosin lisäämisestä. Tappamisvaikutuksen tehostamiseksi toinen 35 erä hiililähdettä lisättiin yhdessä nystatiinin kanssa.

• 107342 18

Inkubointia ravistelijassa 30 °C:ssa jatkettiin vieli* 2 tunnin ajan, minkä jälkeen solut otettiin talteen ja pes-tiin fysiologisella suolaliuoksella. Pesty pelletti susi-pendoitiin sitten uudelleen alkuperäiseen tilavuuteen YDI'-5 kasvualustaa. Kun elävät hiivasolut olivat toipuneet (1 -3 päivää), viljelmä siirrettiin DYM-kasvualustaan, joka sisälsi glukoosia ainoana hiililähteenä. Nystatiinikäsit-telyn aiheuttama kuolleisuus määritettiin maljalaskennoil-la (YDP-kasvualusta) ennen käsittelyä ja sen jälkeen; yli 10 99,999 % soluista kuoli. Hiililähteen puuttuessa nystatii- ni tappoi vastaavasti 0 - 40 % soluista. Vastaavasti voidaan käyttää muuta antibioottia, jonka tappava vaiku n s kohdistuu vain kasvaviin soluihin.

D. Paikkakohdennettu mutagenisointi 15 On kuvattu menetelmää hiivan ksylitolidehydrogenae- sin kloonaamiseksi [Kötter, P., et ai., Curr. Genet. 18 (1990) 493 - 500] sekä menetelmää ksyluloosikinaasigeenjn kloonaamiseksi eri hiivalajeista [Ho, N. W. Y., et ai., Enzyme Microbiol, Technol. 11 (1989) 417 - 421; Stev: s, 20 E.P., et ai.. Appi. Environ. Microbiol. 53 (1987) 2975 - 2977]. Sopiva dominoivan valikointimerkin lähde hiivan integratiiviseen transformointiin on esimerkiksi plasmrc i pUT332 [Gatignol, A., et ai., Gene 91 (1990) 35 - 41].

Plasmidi, joka sisältää fleomysiiniresistenssimerkin ksy-25 litolidehydrogenaasigeeniin insertoituna, voidaan rakentaa tavanomaisilla yhdistelmä-DNA-menetelmillä. Lukuisia transformointimenetelmiä voidaan käyttää ksylitolia kate -boloivan geenin mutagenisoidun alleelin viemiseksi hiivakromosomiin, esimerkiksi voidaan käyttää litiumkloridilJa 30 käsiteltyjen hiivasolujen transformointia tai hiivan soli-seinän lyysillä sopivalla entsyymivalmisteella (esim. Lj-ticase-valmiste) valmistettujen hiivasferoplastien transformointia. Joillekin hiivakannoille elektroporaatio en edullinen transformointimenetelmä. Transformantit valitelen 35 maljoilla, joissa kasvualusta sisältää runsaasti ravintei- 107342 19 ta sekä 5 - 20 pg fleomysiiniä/ml, ja seulotaan niiden kyvyn suhteen syntetisoida ksylitolia.

E. Mutanttien seulonta

Nystatiinikäsittelyn läpikäyneet mahdolliset mutan-5 tit maljätettiin DYM-agarille, joka sisälsi 100 mg glukoosia ja 10 g ksyloosia litraa kohden. Tällöin mutantit, jotka eivät kyenneet käyttämään ksyloosia hiililähteenään, muodostivat vain hyvin pieniä pesäkkeitä. Ksyloosia meta-boloivat hiivat puolestaan saivat riittävästi hiiltä ja 10 muodostivat siksi suuria pesäkkeitä. Pienet pesäkkeet noukittiin talteen ja niitä viljeltiin edelleen YDP-agarilla. Eristettyjen mutanttikantojen kyky kasvaa glukoosilla, ksyloosilla ja ksyluloosilla määritettiin kasvattamalla ensin ymppiä yön yli nestemäisessä YDP-kasvualustassa. 15 Silmukallinen viljelmää siirrettiin sitten 25 ml:aan DYM-tartraattikasvualustaa, joka sisälsi eri hiililähteitä (glukoosi, ksyloosi tai ksyluloosi). Kahden tai kolmen päivän kuluttua mutanttien ja villikannan kasvu mitattiin määrittämällä A600. Mahdollisesti käyttökelpoiset mutantit 20 kasvoivat helposti glukoosilla, mutta ne eivät kyenneet käyttämään ksyloosia. Kantoja, joilla oli tämä ominaisuus, karakterisoitiin edelleen.

Jatkotutkimuksiin valittuja mutanttikantoja viljeltiin yön yli YDP-kasvualustassa, minkä jälkeen ne siirret-25 tiin kasvualustaan, joka sisälsi 0,5 - 1,0 % glukoosia kasvusubstraattina ja 1,0 - 5,0 % ksyloosia toimimaan ksy-litolituotannon substraattina. Viljelmistä otettiin näyte kolmen ja seitsemän päivän kuluttua siirrostuksesta sokeri- ja sokerialkoholianalyysiä varten. Näytteet suodatet-30 tiin 0,2 pm: n suodattimien läpi solujen ja saostumien poistamiseksi, suodokset laimennettiin ja analysoitiin HPLC:llä. Kolonnina käytettiin Ca2+-muodossa olevaa vahvaa kationinvaihtajaa (pituus 25 cm, halkaisija 8 mm), johon oli asetettu Bio Rad Aminex MicroGuard -suolaa poistava 35 esikolonni (Richmond, CA, USA). Kolonnin lämpötila oli > « i « 107342 20 85 °C ja sitä eluoitiin H20:lla nopeudella 0,6 ml/min. 2r-jektiotilavuus oli 10 μΐ ja yhdisteiden eluutiota seurat -tiin RI-detektorilla. Menetelmässä käytettiin ulkoisia standardej a.

5 Myös Kluyveromyces marxianus var. marxianusi-, esimerkiksi kanta CBSC12, var. bulcraricus-, esimerkiksi kanta ATCC 16045, ja var. 1actis-kannat, jotka käyttävät ksyloosia, ovat käyttökelpoisia lähtökantoina. Mutanttien tuottamiseen voidaan vastaavasti käyttää mitä tahansa nrnu-10 ta ksyloosilla kasvavaa marxianus -alalajia tai -a3a-kantaa. Ensin hiivakannan mutagenisointi optimoidaan millä tahansa mutageenilla. Vaihtelemalla käsittelyn kestoa tai voimakkuutta (esimerkiksi kemiallisen mutageenin pitoisuus, UV-säteilyn intensiteetti tai etäisyys) määrite-15 tään yli 10 % mutta alle 100 % organismeista tappava en-nos. Mutagenisoituja hiivoja kasvatetaan benomyylin tai jonkin muun tumasukkuloiden muodostumista häiritsevän yhdisteen läsnä ollessa (subletaali pitoisuus). Haploicit hiivakannat eivät tarvitse benomyylikäsittelyä tai vaste a-20 vaa. Viljelmä siirretään tuoreeseen kasvualustaan, jossa käytetään kasvusubstraattina hiililähdettä, joka tekee mahdolliseksi myös haluttujen mutanttien kasvun. Kasvun käynnistyttyä solut siirretään nälkiinnyttämistä varten kasvualustaan, jossa ei ole mitään hiililähdettä. Ksyloa-.. 25 siä tai ksylitolia ja kasvavat solut tappavaa antibioottia (esimerkiksi nystatiinia) lisätään. Antibiootin pitoisuus ja käsittelyaika optimoidaan etukäteen siten, että käsittely ksyloosin läsnä ollessa tappaa noin 100 % ei-mutace-nisoiduista soluista, mutta ilman hiililähdettä alle 90 %. 30 Ksyloosilla tai ksylitolilla kasvavat solut kuolevat, mut-ta halutut mutantit jäävät henkiin. Elävistä soluista seulotaan oikeanlaiset mutantit edellä esitetyn mukaisesti.

Hiivojen entsyymiaktiivisuus ja ksylitolin tuottokyky määritettiin esimerkeissä 2 - 4 kuvatulla tavalla., 107342 21

Esimerkki 2

Uuden hiivakannan entsyymiaktiivisuus Tärkeimpien ksyloosi/ksylitoli-metaboliaan vaikuttavien entsyymien aktiivisuudet määritettiin lähtökannal-5 le ja uusille hiivakannoille seuraavalla tavalla:

Kluyveromyces marxianus -kantaa kasvatettiin yön yli 50 ml:ssa YDP-kasvualustaa käytettäväksi ymppinä yhteen litraan DYM-tartraattikasvualustaa, jossa oli 10 g ksyloosia ja 20 g glukoosia hiililähteinä ja/tai indusoi-10 jina. Kahden päivän kasvatuksen jälkeen viljelmä sentrifu-goitiin ja pelletti pestiin Sörensenin fosfaattipuskurilla, pH 7, jäämäsokerin poistamiseksi. Solut suspendoitiin uudelleen samaan puskuriin ja rikottiin käyttämällä ne 5 kertaa X-puristimen läpi -20 °C:ssa. Sulaan uutteeseen li-15 sättiin DNaasia tyyppi I (50 mg/ml) ja seosta inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Saatua raakauutetta sentrifugoitiin 185 000 x g:ssä 60 minuutin ajan. Määritettävät entsyymit olivat liukoisia ja jäivät supernatant-tiin. Proteiinipitoisuus määritettiin Lowryn menetelmällä 20 [J. Biol. Chem. 193 (1951) 265 - 275].

Ksyloosireduktaasiaktiivisuus määritettiin seuraamalla NADPH:n hapettumista spektrofotometrisesti aallonpituudella 340 nm. Reaktioseos sisälsi 700 μΐ 50 mM Tris-HCl-puskuria, pH 7,5, 100 μΐ 100 mM ksyloosiliuosta, 25 100 μΐ laimennettua solu-uutetta ja 100 μΐ 1 mM NADPH- liuosta. Reaktio käynnistettiin lisäämällä pelkistynyt nukleotidi ja sitä seurattiin 2 minuutin ajan. Reaktion alkunopeutta käytettiin spesifisen ksyloosireduktaasiak-tiivisuuden määrittämiseksi.

30 Ksylitolidehydrogenaasiaktiivisuus määritettiin “ seuraamalla NADH:n hapettumista NAD:ksi, joka reaktio on kytketty ksyluloosin pelkistymiseen ksylitoliksi. Määritys suoritettiin samalla tavalla kuin ksyloosireduktaasimääri-tys, paitsi että ksyloosin ja NADPH:n asemesta käytettiin 35 vastaavasti ksyluloosia ja NADH:ta.

Saadut tulokset esitetään taulukossa 1.

• 107342 22

Esimerkki 3

Ksylitolini muodostus uusien hiivakantojen avulla

Fermentoirmit suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulia tavalla ravistelupullossa käyttäen ksyloosilähteenä ksy-5 loosin vesiliuosta. Fermentointiliemeen lisättiin glukoosia energia- ja hiililähteeksi. Pulloja ravisteltiin ;a ilmastettiin tehokkaasti.

Lähtökcinncilla ja uusilla mutagenisoiduilla hii’/a-kannoilla saadut tulokset esitetään taulukossa 1.

10

Taulukko 1

Ravistelupulloissa viljeltyjen Kluyveromyces marxiani is -kantojen ksylitolidehydrogenaasiaktiivisuus Kanta Ksylitoli- Ksylitolidehydro- 15 saanto, % genaasi (XDH) nmol/min/mg villi 42 330 II-7 64 76 II-8 51 39 20 II-l 60 255 II-2 52 185 II-3 54 289 II-4 57 329 II-5 55 315 ·: 25 II-6 57 352

Mutanteilla II-l - II-6 saadut tulokset suhtautuvat johdonmukaisesti mutaatioon ksyluloosikinaasigeenLs-sä, sillä näillä isännillä on yhä tallella ksylitolideh/d-30 rogenaasiaktiivisuus.

Esimerkki 4

Ksylitolin muodostus suuremmassa mittakaavassa

Lähtökannan ja uusien hiivakantojen kykyä tuottaa ksylitolia suuremman mittakaavan menetelmässä on niinikään 35 tutkittu. Kaikki fermentoinneissa käytetyt kemikaalit oL

107342 23 vat teknistä laatua. Ksyloosilähteenä käytettiin kahta eri lehtipuulajia käyttävistä sulfiittiprosesseista saatua keittolientä.

Ymppi valmistettiin siirrostamalla hiivapesäke YM-5 liemeen (100 ml) ja kasvattamalla viljelmää yhden päivän ajan 30 °C:ssa ravistelijassa (200 kierr./min). Viljelmä siirrettiin sitten 900 ml:aan NH4-tartraatilla puskuroitua substraattia, pH 6,0, joka sisälsi 30 g/litra glukoosia. Ymppiä kasvatettiin jälleen yhden päivän ajan 30 °C:ssa 10 ravistelijassa (200 kierr./min), minkä jälkeen se siirret tiin aseptisesti fermentoriin.

Ksyloosi, ksylitoli, etanoli ja glukoosi analysoitiin HPLC:llä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Solumassa määritettiin kuivapainomittauksella. Fermentointiliemi 15 sentrifugoitiin, solumassa pestiin vedellä ja sitä kuivattiin yön yli 105 °C:ssa.

Volumetrinen ksylitolin tuottonopeus määritettiin siten, ettei otettu huomioon aikaa, joka tarvittiin ksy-loosikulutuksen käynnistymiseen. Ksylitolisaanto lasket-20 tiin tuotetun ksylitolin suhteena kulutettuun ksyloosiin.

Fermentointiparametrit olivat seuraavat: pH 6,0 (25 % NaOH), sekoitus 500 kierr./min, ilmastus 4,0 Nl/min (vvm) ja lämpötila 30 °C.

Kasvualustan koostumus oli seuraava: *: 25 240 g glukoosia 250 g CSL:ää (maissinliotusvesi; 45,5 % k.a.) 20 g (NH4)2S04:ää 20 g (NH4) 2HP04: ää 8 g KH2P04:ää 30 8 g MgS04 ♦ 7H20: ta 5 litraa H20:ta noin 600 g ksyloosia/5 litraa (12 - 13 %)

Tulokset esitetään taulukossa 2.

« 10734:! 24

Taulukko 2

Kluyveromyces marxianus -kantojen kyky tuottaa ksylitol i a suuremmassa mittakaavassa

Kanta Syötetty glukoosi Saanto Ksylitolin 5 g/litra/tunti % tuottonopeus g/litra/tunti [g/(g/litra/tunti/ ] villi - 35,0 1,6 [0,060] 10 villi 0,80 36,7 1,9 [0,076] II-7 0,65 68,5 2,8 [0,130] II-7 - 55,0 1,2 [0,094] II-8 0,70 60,0 1,6 [0,09] II-l 0,77 57,0 2,8 [0,09] 15 II-4 0,80 46,0 1,7 [0,07] II-6 0,65 40,1 2,0 [0,10]

Spesifinen ksylitolin tuottonopeus (g ksylitolin/ g hiivaa) esitetään sulkeissa.

20 Tulokset osoittavat, että uudet hiivakannat ovat erinomaisia ksylitolin tuottajia lähtökantaan verrattuna.

Täten käyttämällä keksinnön mukaista menetelmää saatiin useita Kluyveromyces marxianus -mutanttikantoja, joiden ksylitolidehydrogenaasin (XDH) tai ksyluloosikinaa-*: 25 sin tai kummankin spesifinen aktiivisuus on merkittävästi alempi kuin aiempien hiivakantojen ja jotka pystyvät täten tuottamaan enemmän ksylitolia ksyloosista kuin nämä. Esimerkki 5

Antisense-RNA-hiivakantojen rakentaminen yhdisteL-30 mä-DNA-menetelmillä ·’ Hiivan ksylitolidehydrogenaasigeeni tai ksyluloosi- kinaasigeeni halutusta hiivaisännästä voidaan kloonata alalla näiden geenien kloonaamiseksi tunnettujen menetelmien mukaan [Kötter, P., et ai., Curr. Genet. 18 (1993) 35 493 - 500; Ho, N. W. Y., et ai., Enzyme MicrobioL.

« i 107342 25

Technol. 11 (1989) 417 - 421; Stevis, P. E., et ai., Appi. Environ. Microbiol. 53 (1987) 2975 - 2977]. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää ensimmäisestä hiivalajista kloonattua ksylitolidehydrogenaasi- tai ksyluloosikinaasigeeniä 5 tuon geenin identifioimiseksi ja kloonaamiseksi toisesta hiivalajista, mikäli nämä geenit ovat toisiinsa nähden riittävän komplementaarisia, jotta niiden ristihybridisaa-tio on mahdollinen, esimerkiksi kuten osoitettiin alustavissa kokeissa, joissa käytettiin ensimmäisestä hiivaisän-10 nästä kloonattua DNA:ta hybridisaatiokoettimena toisen halutun hiivaisännän restriktioentsyymeillä pilkotulle genomi-DNA:lie Southern blot -analyysiä käyttäen.

Kloonatusta DNA:sta ennustetaan komplementaarinen sekvenssi, joka hybridisoituu halutun entsyymin koodaus-15 sekvenssiin. Tämä sekvenssi voidaan syntetisoida in vitro kemiallisin keinoin, kuten kuvataan julkaisussa "Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach", M.J. Gait, toim., IRL Press, Oxford, 1984. Antisense-sekvenssi voidaan saada jopa tarkkaa koodaussekvenssiä tuntematta mistä 20 tahansa kloonatusta DNA:sta, joka kohdistuu haluttuun geenisekvenssiin. Edullisesti tällainen kloonattu DNA on kak-sisäikeisessä muodossa, jossa yksi säie on "sense"- (tai koodaus-) säie ja yksi säie on "antisense"- (tai ei-koo-daava-) säie. Antisense-rakenteita voidaan valmistaa käyt-,·; 25 tämällä edellä kuvatun ja alalla tunnetun mukaisia tek niikoita kytkemällä operatiivisesti tällainen kaksisäikei-nen DNA haluttuun hiivapromoottoriin tavalla, joka johtaa sellaisen RNA:n transkriptioon, jolla on antisense- (ei-koodaava-) sekvenssi. Antisense-DNA on edullisesti opera-30 tiivisesti kytketty sekvenssiin, jossa on hiivan ksylito-lidehydrogenaasipromoottori tai hiivan ksyluloosikinaasi-promoottori, jolloin antisense-RNA:n ilmentäminen tapahtuu niissä olosuhteissa, joissa kohde-entsyymin mRNA:n ilmentäminen tapahtuu.

107342 26 Tällaiset antisense-rakenteet voidaan viedä vektc -reihin, transformoida hiivaisäntiin, esimerkiksi hiivuin lajeista Candida,. Hansenula, Kluyveromyces, Pichia tel Pachysolen, ja edullisesti Kluyveromyces marxianus ja 5 dida utilis ja edullisimmin Kluyveromyces marxianus vao. marxianus, Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus Ja Kluyveromyces marxianus var. laet is,, ja kasvattaa käyttäen antibioottia, esimerkiksi kuten edellä kuvattiin nystat:,i-nia. Hiivat kasvatetaan kuten edellä kuvattiin ja jatka— 10 tutkimuksiin valitaan mutanttikannat, jotka eivät kyker.e käyttämään kasvuun ksyloosia tai jotka ksyloosia käyttäessään kasvavat hyvin huonosti mutta jotka kykenevät kasvimaan glukoosia käyttäen.

Esimerkki 6 15 Ribotsyymihiivakantojen rakentaminen yhdistein*- DNA-menetäimillä

Hiivan ksylitolidehydrogenaasigeeni tai ksyluloc — sikinaasigeeni halutusta hiivaisännästä voidaan kloonata alalla tunnettujen menetelmien mukaan [Kötter, P., et ai. , 20 Curr. Genet. 18 (1990) 493 - 500; Ho, N. W. Y., et ai., Enzyme Microbiol, Technol. 11 (1989) 417 - 421; Stevis, P.E., et ai., Appi. Environ. Microbiol. 53 (1987) 297Ϊ- -2977].

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää hiivalajista kloo-·; 25 nattua ksylitolidehydrogenaasi- tai ksyluloosikinaasigjee- niä tuon geenin identifioimiseksi ja kloonaamiseksi toisesta hiivalajista, jos nämä geenit ovat toisiinsa nähden riittävän komplementaarisia, jotta niiden ristihybridisaa-tio on mahdollinen, esimerkiksi kuten osoitettiin alusia-30 vissa kokeissa, joissa käytettiin ensimmäisestä hiivaisäm-·*’' nästä kloonattua DNA:ta hybridisaatiokoettimena toisen ha lutun hiivaisännän restriktioentsyymeillä pilkotulle ge:«p-mi-DNA:lle Southern blot -analyysiä käyttäen.

Komplementaarinen sekvenssi ennustetaan kloonatun 35 DNA:n sekvenssistä, joka hybridisoituu halutun entsyymin 107342 27 koodaussekvenssiin, kuten antisense-RNA-rakenteen yhteydessä. Tämä sekvenssi voidaan syntetisoida in vitro kemiallisin keinoin, kuten kuvataan julkaisussa "Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach", M.J. Gait, 5 toim., IRL Press, Oxford, 1984. Tällainen DNA saadaan edullisesti kloonatusta DNA:sta kaksisäikeisessä muodossa, jossa yksi säie on "sense"- (tai koodaus-) säie ja yksi säie on "antisense"- (tai ei-koodaava-) säie.

Keksinnön mukainen ribotsyymirakenne sisältää ri-10 botsyymin, kuten Tetrahymena-ribotsyymin, katalyyttisen aktiivisuuden, kuten esitetään julkaisussa EP 321 201, ja riittävän pituuden halutun kohde-mRNA:n mRNA:ta vastaan kohdistuvaa antisense-RNA-sekvenssiä siten, että keksinnön mukainen antisense-RNA-rakenne hybridisoituu kohde-15 mRNA:han ja saa ribotsyymin pilkkomaan mRNA:n liian pieneen muotoon, jotta syntyisi aktiivinen entsyymi.

Ribotsyymirakenteita voidaan valmistaa käyttämällä edellä kuvatun ja alalla tunnetun mukaisia tekniikoita kytkemällä operatiivisesti tällainen kaksisäikeinen DNA 20 haluttuun hiivapromoottöriin tavalla, josta seuraa ri- botsyymi-antisense-RNA:n transkriptio. Ribotsyymi-anti-sense-DNA on edullisesti kytketty operatiivisesti sekvenssiin, jossa on hiivan ksylitolidehydrogenaasipromoottori tai hiivan ksyluloosikinaasipromoottori, siten että ribo-*: 25 tsyymi-antisense-RNA:n ilmentäminen tapahtuu niissä olo suhteissa, joissa kohde-entsyymin mRNA:n ilmentäminen tapahtuu .

Tällaiset ribotsyymirakenteet voidaan viedä vekto-reihin, transformoida hiivaisäntiin, esimerkiksi hiivaan 30 lajeista Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia tai ' Pachysolen, ja edullisesti Kluyveromyces marxianus ja Can- i « t dida utilis ja edullisimmin Kluyveromyces marxianus var. marxianus, Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus ja Kluyveromyces marxianus var. lactis, ja kasvattaa käyttäen 35 antibioottia, esimerkiksi nystatiinia kuten edellä kuvat- • 107342 28 tiin. Hiivat kasvatetaan kuten edellä kuvattiin ja jatkotutkimuksiin valitaan mutanttikannat, jotka eivät kykene käyttämään kasvuun ksyloosia tai jotka kasvavat ksyloo!=ia käyttäessään hyvin huonosti mutta jotka kykenevät kasva-5 maan glukoosia käyttäen.

Kun keksintö on nyt täydellisesti kuvattu, alan ammattilaiset ymmärtävät, että keksinnön kattama alue voidaan suorittaa käyttäen laajaa valikoimaa samanarvoisia olosuhteita, parametrejä ja vastaavia vaikuttamatta kek-10 sinnön tai sen minkään suoritusmuodon henkeen tai suoja-piiriin.

• I

Claims (12)

107342

1. Menetelmä ksylitolin tuottamiseksi hiivaisännäs-tä, tunnettu siitä, että 5 a. valitaan hiivaisäntä, joka kykenee syntetisoi maan ja metaboloimaan ksylitolia, jolloin mainittu hiiva-isäntä valitaan ryhmästä, jonka muodostavat lajit Candida. Hansenula. Kluvveromvces ja Pichia: b. modifioidaan yhden tai useamman ksylitolimetabo- 10 liaan osallistuvan entsyymin ilmentymistä vaiheen (a) hiivassa siten, että ksylitolin metabolia vähenee tai poistuu; c. kasvatetaan vaiheen (b) hiivaa olosuhteissa, joissa saadaan ksylitolin synteesi; ja 15 d. otetaan talteen vaiheessa (c) tuotettu ksyli toli .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että modifiointi vaiheessa (b) poistaa ksylitolidehydrogenaasia tai ksyluloosikinaasia 20 koodittavan geenin tai sekä ksylitolidehydrogenaasia koodattavan geenin että ksyluloosikinaasia koodittavan geenin, ilmentämisen tai vähentää ilmentämistä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että modifiointi vaiheessa (b) kä- 25 sittää hiivan altistamisen mutageenille tai aineelle, joka häiritsee kromosomien jakautumista tai tumasukkuloiden muodostumista.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromosomien jakautumista tai 30 tumasukkuloiden muodostumista häiritsevä aine on beno-myyli . ‘ · ·

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että modifiointi vaiheessa (b) kä-. sittää altistamisen aineelle, joka aiheuttaa insertion, 35 deleetion tai pistemutaation hiivan geeniin. 107342

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aine valitaan ryhmästä, jonka muodostavat akriflaviini, etyylimetaanisulfonaatti, tV-säteily ja röntgensädesäteily.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että modifiointi vaiheessa (b) käsittää sen, että hiivaisännän kyky ilmentää yksi t:ai useampi ksylitolimetaboliaan osallistuva entsyymi modifioidaan geenimanipulaatiomenetelmillä, edullisesti geeni -10 katkaisulla.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geenimanipulaatiomenetelmä käsittää vaiheen (a) hiivan transf:ormoinnin yhdistelmä-DNA-rakenteella, joka koodittaa ksylitolimetabolian ert- 15 syymiä vastaan kohdistuvaa ribotsyymi- tai antisense - RNA:t a.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiiva valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Kluvveromvces marxianus ja Candida utilis.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Kluvveromvces marxianus valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Kluvveromvces marxianus var. marxianus. Kluvveromvces marxianus var. bulgaricus j s Kluvveromvces marxianus var. lactis. : 25 11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää lisäksi vaiheen (b) hiivan kasvattamisen antibiootin, edullisesti nystatiinin, läsnä ollessa.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että vaihe (b) edelleen käsittää kasvatuksen ja valikoinnin paljon ksyloosia ja vähän glukoosia sisältävässä kasvualustassa. • * 107342