JP4257403B2 - 酵素処理方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素処理方法に関し、詳しくは、加圧下に酵素反応を行うことを特徴とする、酵素処理方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、海洋・湖沼・河川・土壌などの環境汚染の改善、及びそれと関連してバイオマス資源などの環境保全エネルギーの開発が大きな関心となっている。バイオマス資源として、もみがらや木材、サトウキビなどの植物が利用されるが、これらに存在するセルロースやリグニンが難分解性であるゆえ、植物の利用を阻む原因となっており、これらを効率よく分解する手段が必要である。
セルロースを酵素により分解してグルコースを製造することは公知であり、このような酵素は一般にセルラーゼと称されている。セルラーゼには、(1)セルロースの固い結晶領域を非還元末端からエキソ型に加水分解しセロビオースを生成するセロビオヒドロラーゼ(アビセラーゼ)活性、(2)セルロースの非結晶領域をエンド型に加水分解しセルロース分子の低分子化と各種のセロオリゴ糖を生成するエンドグルカナーゼ(CMCase)活性、(3)セロビオースやセロオリゴ糖をグルコースに分解するβ−グルコシダーゼ活性、の3種の酵素活性が含まれており、この3種の活性によりセルロースはセロビオースやセロオリゴ糖を経てグルコースにまで分解される。
従来のセルラーゼを使用したセルロースの分解反応は、常圧下に酵素の活性を損なわない温度で行われるものであり、反応に時間がかかる。また酵素を安定な状態で作用させることが困難であることから収率も劣り、実用レベルに到達するものではなかった。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、環境保全と資源の有効活用の観点から、セルロース廃棄物の効果的な処理法や再資源化法の開発が望まれるところである。
従って、本発明は、セルラーゼを使用したセルロースの酵素分解処理を短時間で効率良く行う方法を提供することにある。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、セルラーゼによるセルロースの酵素分解反応をはじめ、各種酵素による酵素反応を加圧下に行うことにより、基質を効率よく変換して酵素反応生成物を得ることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0005】
すなわち、本発明は以下の発明に関する。
(1) セルロースにセルラーゼを作用させ、酵素反応生成物としてグルコースを得る酵素反応において、セルラーゼがAcremonium属の菌が生産するセルラーゼ系に、さらにAspergillus属の菌が生産する、エンドグルカナーゼ( CMCase )活性が加圧状態で向上するセルラーゼ製剤を混合した酵素組成物からなり、酵素反応を100〜150MPaで行うことを特徴とする、酵素処理法。
(2)Acremonium属の菌がAcremonium sp. Y-94であることを特徴とする上記(1)に記載の方法。
(3) 粉末状、シート状又は粒状のセルロースを使用することを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載の方法。
【0006】
【発明の実施の形態】
本発明においては、基質に酵素を作用させ、酵素反応生成物を得る酵素反応を、加圧下に行う。具体的には、酵素反応を0.2〜1,000MPa、好ましくは10〜500MPa、特に好ましくは100〜150Mpaの加圧下に行う。当該範囲の圧力に加圧することにより、酵素が活性化されるとともに、酵素自体の安定性も向上し、通常の酵素反応温度よりも高温での反応が可能となる。圧力が上記範囲よりも高い場合には、酵素が失活し、反応効率が低下し、また、圧力が上記範囲よりも低い場合には、所望の程度にまで反応効率が向上せず、好ましくない。
【0007】
本発明において使用する酵素としては、代表的にはセルラーゼを挙げることができるがこれに限定されるわけではなく、グルコアミラーゼ、タンナーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、キチナーゼ等の加水分解酵素のほか、各種の酸化還元酵素、転移酵素、異性化酵素、除去付加酵素、合成酵素をも同様に使用することができる。また、これらの酵素の起源は、微生物、植物、動物由来のいずれであってもよく、市販品を利用してもよい。
【0008】
例えば、セルラーゼを使用する場合、一般にセルラーゼとして知られた酵素であれば特に制限なく使用できるが、Acremonium属の菌が生産するセルラーゼ系、特にAcremonium sp. Y-94が生産するセルラーゼ系が好適に使用できる。
【0009】
また、上記Acremonium属の菌が生産するセルラーゼ系に、CMCase活性が加圧状態で向上する酵素を混合した酵素組成物を使用すると、セルロースの酵素分解反応の効率が一段と向上するので好ましい。CMCase活性が加圧状態で向上する酵素としては、例えばAspergillus属の菌が生産する酵素が挙げられる。
【0010】
このような酵素混合物を使用する場合には、酵素組成物中のAcremonium属の菌が生産する酵素とCMCase活性が加圧状態で向上する酵素との混合比を、CMCase活性当量として7:50〜50:7になるように混合とすることが例示される。
【0011】
本発明において、酵素を作用させる基質としては、酵素により加水分解、酸化還元、転移、異性化、除去付加、合成反応を触媒され、酵素反応生成物を生じるものであれば、特に制限はない。例えば、上記各酵素に対応してセルロース、デンプン、タンニン酸、フィチン酸、タンパク質、キチン等を挙げることができる。
例えば、基質がセルロースの場合は、具体的には、樹木、廃木材、紙、麦わら等各種の天然セルロース類を使用することができる。
【0012】
また、基質の形状やサイズも特に制限はないが、酵素反応を効率良く行わせるためには、粉末状、シート状又は粒状に加工したものを使用することが好ましい。
【0013】
基質と酵素の混合割合は、各酵素反応において任意に選択することができるが、例えばセルロースの場合、濾紙等の分解すべき基質1gに対して、CMCase活性当量として0.0005〜10,000国際単位(IU)程度の酵素を使用することができる。
【0014】
また、本発明による酵素処理は、通常の加圧に耐える化学反応容器中でバッチ式、半連続式、連続式等任意の状態で行うことができる。
【0015】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
(活性測定)
以下の実施例(比較例)1〜3では、酵素活性の測定は、酵素反応によってセルロースが、pH4.5,50℃,0.1MPa(常圧)の条件下で、1分間に1マイクロモルの還元糖を遊離せしめる酵素量を1国際単位(IU)と定め、反応終了後加熱失活させた反応上清液を一部採り、一定倍率に希釈し酵素反応により遊離した還元糖をSomogyi-Nelson法で定量することによって行った。
【0016】
(実施例1及び比較例1)
短冊状にカットしたWhatman No.1濾紙(FP)約150mgを基質とし、酵素としてAcremonium cellulolyticusの生産するセルラーゼ製剤(商品名:アクレモザイム)をFP糖化活性として0.0078IU使用して、恒温バス中のステンレス製耐圧容器内で水を圧力媒体として加圧することにより、セルロースの酵素分解反応を行った。
40mM Britton-Robinson広域緩衝液(以下、B-R bufferと略す)2ml(pH4.5)に酵素及び基質を添加し、60℃で1、24、48、72時間、0.1MPa(常圧:比較例1)と150MPa(実施例1)に加圧下、それぞれ反応を行った結果を表1に示す。表1の各反応時間における数値は還元糖の生成量(μg/ml反応液)を表し、加速比率(%)は0.1MPaにおける生成還元糖量に対する150MPaにおける生成還元糖量の比率で表した。
【0017】
【表1】
【0018】
(実施例2及び比較例2)
反応温度を65℃とした他は、実施例1と同様にしてセルロースの酵素分解反応を行った。結果を表2に示す。
【0019】
【表2】
【0020】
(実施例3及び比較例3)
短冊状にカットしたWhatman No.1濾紙(FP)約150mgを基質とし、酵素としてAcremonium cellulolyticusの生産するセルラーゼ製剤(商品名:アクレモザイム)をFP糖化活性として0.0078IU及びAspergillus属の生産するセルラーゼ製剤(商品名:セルソフトウルトラ)をCMCase活性として0.0188IUを混合使用して、恒温バス中のステンレス製耐圧容器内で水を圧力媒体として加圧することにより、セルロースの酵素分解反応を行った。
40mM B-R buffer 2ml(pH4.5)に酵素及び基質を添加し、65℃で1、8、24、48時間、0.1MPa(常圧:比較例3)と150MPa(実施例3)に加圧下、それぞれ反応を行った結果を表3に示す。
【0021】
【表3】
【0022】
(実施例4及び比較例4)
酵素としてRhizopus Niveusの生産するグルコアミラーゼ(生化学工業(株)製)1mgを40mMのB-R buffer(pH4.5)1mlに溶解し、酵素原液とした。基質として可溶性デンプンを5%(w/v)濃度となるように、B-R bufferに加え、加温して溶解した。
上記基質溶液11.88mlに、上記酵素原液の128倍希釈酵素液120μlを加えて混合し、45℃、55℃、65℃で、0.1MPa(常圧:比較例4)と150MPa(実施例4)に加圧下、pH4.5にてそれぞれ24時間反応を行った。反応終了後、沸騰水中で酵素を10分間加熱失活させた。反応上清液を適当な倍率に希釈し、その1mlを用いてSomogyi-Nelson法で本上清液中の還元糖量(反応生成物)を算出した。結果を表4に示す。表4の各反応温度における数値は還元糖の生成量(μg/ml反応液)を表し、加速比率(%)は0.1MPaにおける生成還元糖量に対する150MPaにおける生成還元糖量の比率で表した。
【0023】
【表4】
【0024】
(実施例5及び比較例5)
酵素としてAspergillus oryzaeの生産するタンナーゼ(和光純薬工業(株)製)5mgを40mMのB-R buffer(pH5.5)5mlに溶解し、酵素原液とした。基質としてタンニン酸を2%(w/v)濃度となるように、蒸留水に溶解した。
B-R buffer 8.9ml、2%タンニン酸水溶液1mlおよび上記酵素原液の80倍希釈酵素液100μlを混合し、30℃、55℃で、0.1MPa(常圧:比較例5)と150MPa(実施例5)に加圧下、pH5.5にてそれぞれ60時間反応を行った。反応終了後、酵素を沸騰水中で10分間加熱失活させた。反応液1mlに80%エタノール4mlを加え、波長310nmにおける吸光度の減少量を測定し、酵素反応によって分解された基質残存量から間接的に反応生成物の量を算出した。結果を表5に示す。表5の各反応温度における数値は波長310nmにおける吸光度を表し、加速比率(%)は0.1MPaにおける吸光度に対する150MPaにおける吸光度の比率で表した。
【0025】
【表5】
【0026】
(実施例6及び比較例6)
酵素として小麦由来のフィターゼ(Sigma Chemicals 社製)20mgを50mMの酢酸緩衝液(pH5.15)2mlに溶解し、酵素原液とした。基質として米由来のフィチン酸12ナトリウム塩(Inositol hexaphosphoric acid dodecasodium salt)を2%(w/v)濃度となるように、上記緩衝液に加え溶解した。
上記基質溶液9.9mlに、上記酵素原液の8倍希釈酵素液100μlを加えて混合し、55℃、65℃で、0.1MPa(常圧:比較例6)と150MPa(実施例6)に加圧下、pH5.15にてそれぞれ24時間反応を行った。反応終了後、沸騰水中で10分間酵素を加熱失活させた。酵素反応によって遊離した無機リンの定量はFiske-Subbarrow法に準拠した。すなわち、上記反応液1mlに蒸留水6.6ml、2.5%モリブデン酸アンモニウム1ml、3N硫酸1ml、アミノナフトールスルホン酸(0.5gの1,2,4アミノナフトールスルホン酸に15%亜硫酸水素ナトリウム195mlと20%亜硫酸ナトリウム七水和物5mlを加え溶解した)0.4mlを加え、混合後30分間静置した後、波長750nmにおける吸光度を測定して無機リン酸量を算出した。結果を表6に示す。表6の各反応温度における数値は無機リン酸量(μg/ml反応液)を表し、加速比率(%)は0.1MPaにおける無機リン酸量に対する150MPaにおける無機リン酸量の比率で表した。
【0027】
【表6】
【0028】
(実施例7及び比較例7)
酵素としてBacillus subtilis由来のプロテアーゼ製剤『「プロテアーゼN「アマノ」』(天野製薬(株)製)10mgを40mMのB-R buffer (pH7.0)1mlに溶解し、酵素原液とした。基質としてナトロース[Nutrose;カゼインナトリウム(和光純薬(株)製)]を1%(w/v)濃度となるように、40mMのB-R buffer (pH7.0)に懸濁し、15分間熱湯中で溶解した。
上記基質溶液9.9mlに、上記酵素原液の700倍希釈酵素液100μlを加えて混合し、55℃、70℃で、0.1MPa(常圧:比較例7)と150MPa(実施例7)に加圧下、pH7.0にてそれぞれ24時間反応を行った。反応終了後、5%三塩化酢酸(TCA)3mlを添加して酵素を失活させた。反応上清液について波長280nmにおける吸光度を測定した。結果を表7に示す。表7の各反応温度における数値は波長280nmにおける吸光度を表し、加速比率(%)は0.1MPaにおける吸光度に対する150MPaにおける吸光度の比率で表した。
【0029】
【表7】
【0030】
(実施例8及び比較例8)
酵素としてStreptomyces griseus由来のキチナーゼ(Sigma Chemical社製)5mgを40mMのB-R buffer (pH6.0)36mlに溶解し、酵素溶液とした。基質として2ml容量のキュベットに20mgのキチンを秤量した。
20mgのキチンを含む2ml容量のキュベットに2mlの上記酵素溶液を加えて混合し、30℃、60℃で、0.1MPa(常圧:比較例8)と150MPa(実施例8)に加圧下、pH6.0にてそれぞれ24時間反応を行った。反応終了後、沸騰水中で10分間酵素を加熱失活させた。反応上清液を適当に希釈し、TOCアナライザー(Total Organic Carbon analyzer)で定量した。結果を表8に示す。表8の各反応温度における数値はTOC(TOCmg/ml反応液)を表し、加速比率(%)は0.1MPaにおけるTOCに対する150MPaにおけるTOCの比率で表した。
【0031】
【表8】
【0032】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素反応を短時間に効率的に行うことのできる酵素処理方法が提供される。本発明方法においては、加圧によって酵素が活性化されるとともに、酵素自体の安定性も向上し、通常の酵素反応温度よりも高温での反応が可能となる。本発明方法によりセルロースの酵素分解を行うと、大量に発生するセルロース廃棄物を効果的に処理することができ、環境保全と資源の有効活用の面で非常に有用である。
Claims (3)
- セルロースにセルラーゼを作用させ、酵素反応生成物としてグルコースを得る酵素反応において、セルラーゼがAcremonium属の菌が生産するセルラーゼ系に、さらにAspergillus属の菌が生産する、エンドグルカナーゼ( CMCase )活性が加圧状態で向上するセルラーゼ製剤を混合した酵素組成物からなり、酵素反応を100〜150MPaで行うことを特徴とする、酵素処理法。
- Acremonium属の菌がAcremonium sp. Y-94であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 粉末状、シート状又は粒状のセルロースを使用することを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
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