CN102089436A - 通过在低pH下发酵生产二羧酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产二羧酸的方法。所述方法包括在下述pH下在存在含碳水化合物的底物和少量氧时发酵酵母，所述pH下二羧酸中的至少50％是酸性形式。本发明的方法提供了二羧酸产物的高产率并且比现有的方法更具成本效益，现有方法中生产的盐在回收期间必须被转化成酸。本发明的方法还导致更简单和更便利的下游加工。

Description

通过在低pH下发酵生产二羧酸
发明领域
本发明涉及生产二羧酸的方法。本发明特别涉及通过酵母的发酵来生产二羧酸。
发明背景
二羧酸(例如延胡索酸和琥珀酸)是重要的化合物，其在食品工业中用于食物制备和防腐，在医药工业中用于配制药物制品，以及用于其他工业用途，例如(生物)聚合物的单体。为了满足对二羧酸的日益增加的需要，正在开发更高效和更具成本效益的生产方法。传统上通过发酵能够生产大量二羧酸的细菌来制造二羧酸。这例如描述于US 5,573,931中，其中描述了通过使用细菌菌株生产高浓度的琥珀酸的方法。然而，与用细菌生产二羧酸的用途相关的一个主要的缺点是二羧酸盐的形成。如果使用细菌，则发酵期间的pH需要被维持在pH 6-7的范围内，这高于所有二羧酸的pKa值。因此，大部分酸将以其盐的形式被生产，这些盐必须被转化成酸。在大规模生产方法中这不实用不高效，并且提高生产成本。此外，并非细菌的微生物也已被用于生产有机酸。EP 0 424 384公开了在含有碳酸钙的培养基中通过Rhizopus生产有机酸的需氧方法。EP 1 183 385公开了经遗传操纵的酵母细胞，所述酵母细胞具有Crabtree阴性表型并且含有用于生产乳酸的外源核酸分子。
发明详述
本发明涉及用于生产二羧酸的方法。所述方法包括在低于二羧酸pKa的pH值下，在存在含碳水化合物的底物和少量氧时发酵酵母。本发明的方法提供了二羧酸产物的高产率，允许更简单的下游加工，并且比现有方法更具成本效益，现有方法中生产的是盐，其必须随后被转化成酸。因为二羧酸具有多于一个的pKa值，所以pH应当低于二羧酸的最低pKa。对大部分酸而言，pH应典型地在pH 1.0到pH 5.5的范围内，优选地在pH 2.0和pH 4.0之间。在一个实施方案中，在3.0的pH值下生产琥珀酸。另一优点是由于pH低，所以污染的风险被降低。
酸生产阶段之前优选是针对最优生物质生产的生物质形成阶段。在生物质形成阶段中，pH在pH 2到pH 7的范围内。优选地，pH在pH 3到pH 6的范围内，更优选地，pH在pH 4到pH 5的范围内。
根据本发明的方法更具成本效益，并可导致低30％的成本价格。原因之一是滴定剂成本被显著降低。
本发明的方法可被用于生产任何二羧酸。合适的例子包括己二酸、延胡索酸、衣康酸(itaconic acid)、琥珀酸、苹果酸、草酸。优选地，二羧酸是琥珀酸、延胡索酸或苹果酸。
在本发明方法中使用的酵母可以是任何合适的酵母。酵母的合适例子包括Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia和Yarrowia，例如Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyvermoces lactis、Candida sonorensis、Pichia stipidis和Yarrowia lipolytica的物种。在一个实施方案中，本发明方法中使用的真核微生物是Saccharomyces cerevisiae——一种广泛使用的工业上感兴趣的微生物。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的酵母是经遗传修饰的酵母。在本文中使用时，在根据本发明的方法中经遗传修饰的酵母被定义为下述酵母细胞，其含有所述酵母细胞中天然不存在的核苷酸序列或多肽，或者经所述酵母细胞中天然不存在的核苷酸序列或多肽转化或遗传修饰过，或者其含有内源核酸序列的额外的一个或多个拷贝。野生型酵母细胞在本文中被定义为重组细胞的亲本细胞。
优选地，根据本发明的方法中的酵母是经遗传修饰的酵母，其包含编码选自下组的异源酶的核苷酸序列，所述组由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、延胡索酸还原酶和延胡索酸酶组成。异源酶的优选的实施方案如下文定义。
当用于指出给定的(重组)核酸或多肽分子与给定的宿主生物或宿主细胞之间的关系时，术语“同源的”应当被理解为表示该核酸或多肽分子天然地由相同物种、优选地相同品种或株系的宿主细胞或生物生产。
在关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质的方面，使用术语“异源的”表示下述核酸或蛋白质，其不作为其存在的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的部分天然存在，或其被发现于与其天然被发现的细胞或基因组或DNA或RNA序列中的位点不同的细胞或位点。异源核酸或蛋白质对其被引入的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或是以合成方式或重组方式生产的。
优选地，经遗传修饰的酵母包含编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的核苷酸序列。PEP羧激酶(EC 4.1.1.49)优选地是异源酶，优选地源于细菌，更优选地具有PEP羧激酶活性的酶源于Escherichia coli、Mannheimia sp.、Actinobacillus sp.或Anaerobiospirillum sp.，更优选地，Mannheimia succiniciproducens或Actinobacillus succinogenes。在一个实施方案中，PEP羧激酶源于Actinobacillus succinogenes(PCKa)，其中PCKa优选地已被修饰为在第120-122位上用DAF氨基酸序列代替EGY。优选地，用与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性的PEP羧激酶对根据本发明的酵母细胞进行了遗传修饰。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的方法中经遗传修饰的酵母包含编码延胡索酸还原酶的核苷酸序列。优选地，延胡索酸还原酶是异源酶，优选地是NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶，其可源于任何合适的来源，例如细菌、真菌、原生动物或植物。优选地，根据本发明的方法中的酵母包含异源的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶，优选地源于Trypanosoma sp.，例如源于Trypanosoma brucei。在一个优选的实施方案中，编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列在胞质溶胶中表达。在编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列包含过氧化物酶体或线粒体靶向信号的情况下，可能必须修饰或缺失大量氨基酸(和编码核苷酸序列中相应的核苷酸序列)，从而阻止酶的过氧化物酶体或线粒体靶向。过氧化物酶体靶向信号的存在可例如通过
Figure BPA00001293327700031
et al，Nucleic acid Research 2007，35，D815-D822所公开的方法来确定。优选地，用与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶来对根据本发明的酵母细胞进行遗传修饰。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的方法中经遗传修饰的酵母包含编码延胡索酸酶的核苷酸序列，所述延胡索酸酶可以是异源或同源的酶。编码异源延胡索酸酶的核苷酸序列可以源于任何合适的来源，优选地来自微生物来源，优选地来自酵母，例如Saccharomyces cerevisiae，或来自丝状真菌，例如Rhizopus oryzae。优选地，根据本发明方法中的酵母过表达编码与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或100％的序列同一性的延胡索酸酶的核苷酸序列。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的方法中经遗传修饰的酵母还包含编码苹果酸脱氢酶(MDH)的核苷酸序列，所述苹果酸脱氢酶在所述核苷酸序列表达后在胞质溶胶中有活性。优选地，MDH缺乏过氧化物酶体或线粒体靶向信号，以将酶定位于胞质溶胶中。胞质溶胶MDH可以是任何合适的同源或异源苹果酸脱氢酶。优选地，根据本发明的酵母细胞包含编码下述苹果酸脱氢酶的核苷酸序列，所述苹果酸脱氢酶与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少70％，优选地至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
在另一实施方案中，根据本发明的方法中经遗传修饰的酵母包含编码二羧酸转运蛋白(优选地，苹果酸转运蛋白(MAE))的核苷酸序列。二羧酸转运蛋白可以是同源或异源的蛋白质。优选地，二羧酸转运蛋白是异源的蛋白质。二羧酸转运蛋白可源于任何合适的生物，优选地源于Schizosaccharomyces pombe。优选地，二羧酸转运蛋白是下述苹果酸转运蛋白(MAE)，所述苹果酸转运蛋白与SEQ ID NO：10具有至少80％、85％、90％、95％或99％或100％的序列同一性。
优选地，根据本发明的方法中使用的酵母是包含异源PEP-羧激酶、异源NAD(P)H-依赖型延胡索酸还原酶、异源延胡索酸酶、异源苹果酸转运蛋白和胞质溶胶苹果酸脱氢酶的经遗传修饰的酵母。这些酶的优选的实施方案如本文上文中定义。
序列同一性在本文中被定义为通过比较序列测定的两条或更多条氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两条或更多条核酸(多核苷酸)序列之间的关系。通常，在被比较的序列的整个长度上比较序列同一性或相似性。在本领域中，“同一性”也表示氨基酸或核酸序列之间的序列相关度，这根据情况通过这类序列串之间的匹配测定。
测定同一性的优选方法被设计为在测试的序列之间给予最大匹配。测定同一性和相似性的方法被编码于公众可获得的计算机程序中。测定两条序列之间同一性和相似性的优选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN，公众可从NCBI和其它来源(BLAST Manual，Altschul，S.，等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894)获得。使用BLASTP的氨基酸序列比较的优选参数为缺口开放11.0，缺口延伸1，Blosum 62矩阵。
在本文中使用时，术语“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体，即多核苷酸，除非另有限制，其包括具有天然核苷酸主要特性的已知类似物，因为它们能够以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如肽核酸)。多核苷酸可以是天然或异源的结构基因或调节基因的全长或亚序列。除非另有说明，该术语包括特定的序列及其互补序列。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法中的酵母过表达编码本文上文定义的任何酶的核苷酸序列。本领域可获得多种手段用于在本发明方法中在酵母中过量表达编码酶的核苷酸序列。具体地，可以通过提高细胞中编码酶的基因的拷贝数，例如通过在细胞的基因组中整合额外的基因拷贝，通过表达来自着丝粒载体、来自附加体多拷贝表达载体的基因，或者通过引入包含多拷贝基因的(附加体)表达载体，来过量表达编码酶的核苷酸序列。优选地，用(强)组成型启动子实现根据本发明的酶的过量表达。
含碳水化合物的底物可以是任何含碳水化合物的底物，包括糖蜜(molasse)，甘蔗汁，戊糖和己糖，例如葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖。优选地，含碳水化合物的底物是含葡萄糖的底物，如麦芽糖、蔗糖、葡萄糖或葡萄糖浆。含碳水化合物的底物的碳水化合物含量以干物质含量为基础优选地多于50％w/w，更优选地多于55％、60％、65％、70％、75％、80％w/w，最优选地多于85％、90％、95％或99％w/w。
根据本发明的方法优选地包括在碳(C)-受限的条件下发酵酵母。C-受限的条件在本文中被定义为溶解的碳水化合物的浓度低于1g/l，优选地低于0.9g/l、0.8g/l或低于0.5g/l溶解的碳水化合物。发现在C-受限的条件下发酵酵母导致与非C-受限的条件相比提高的琥珀酸产率。
用于发酵的氧可以以任何合适的形式供应。在一个实施方案中，氧以空气的形式供应。氧应当小量供应。这反映于酵母的氧吸收速率(OUR)和/或氧吸收比速率(qO2)中。本发明中的OUR低于约8.0mmol氧/L/小时，优选地低于约5.0、4.0、3.0或2.0mmol氧/L/小时，更优选地低于约1.0或0.5mmol氧/L/小时，优选地高于0.01mmol氧/L/小时。
本发明方法中的氧吸收比速率(qO2)范围在8mmol氧/g生物质干重/小时到0.5mmol氧/g生物质干重/小时之间，优选地在5、4、3或2mmol氧/g生物质/小时到约0.4、0.3或0.2mmol/氧/g生物质/小时之间。
根据本发明的方法可以以分批、补料分批或连续模式进行。这些发酵模式是本领域技术人员已知的。取决于发酵模式，发酵期间的生物质浓度可在发酵期间或多或少地变化。在分批和补料分批模式中，生物质浓度通常提高。因此，在分批和补料分批模式中，氧吸收比速率通常降低。
本发明方法的温度典型地在10℃和40℃之间，优选地在20℃和35℃之间，更优选地在30℃和35℃之间。
在根据本发明方法的一个实施方案中，除了含碳水化合物的底物之外还存在额外的电子供体。额外的电子供体优选地是有机电子供体。有机电子供体的合适例子包括甘油、甲酸盐/酯和多元醇例如甘露醇、山梨醇和木糖醇。
附图说明
图1.应用的OUR对pH 3下进行90小时后的琥珀酸生产的影响。
实施例
实施例1.通过Saccharomyces cerevisiae生产琥珀酸
1.1.构建酵母菌株
1.1.1.构建表达构建体
对S.cerevisiae表达载体pRS414(Sirkoski R.S.and Hieter P，Genetics，1989，122(1)：19-27)进行BamHI/NotI限制性消化，随后在该载体中连接由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(来源Actinobacillus succinogenes)合成基因构建体(SEQ ID NO：1)构成的BamHI/NotI限制性消化片段之后，制造了表达构建体pGBS414PPK-3。使用连接混合物转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS414PPK-1。随后用AscI和NotI限制性消化pGBK414PPK-1。为了制造pGBS414PPK-3，将由来自T.brucei(FRDg)合成基因构建体(SEQ ID NO：2)的酵解酶体延胡索酸还原酶构成的AscI/NotI限制性消化片段连接进经限制性消化的pGBS414PPK-1载体中。连接混合物被用于转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS414PPK-3。
对S.cerevisiae表达载体pRS415(Sirkoski R.S.and Hieter P，Genetics，1989，122(1)：19-27)进行BamHI/NotI限制性消化，随后在该载体中连接由延胡索酸酶(来源Rhizopus oryzae)合成基因构建体(SEQ ID NO：3)构成的BamHI/NotI限制性消化片段之后，制造了表达构建体pGBS415FUM-3。使用连接混合物转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS415FUM-1。随后用AscI和NotI限制性消化pGBK415FUM-1。为了制造pGBS415FUM-3，将由来自S.cerevisiae(MDH3)合成基因构建体(SEQ ID NO：4)的过氧化物酶体苹果酸脱氢酶构成的AscI/NotI限制性消化片段连接进经限制性消化的pGBS415FUM-1载体中。连接混合物被用于转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS415FUM-3。
对S.cerevisiae表达载体pRS416(Sirkoski R.S.and Hieter P，Genetics，1989，122(1)：19-27)进行BamHI/NotI限制性消化，随后在该载体中连接由Schizosaccharomyces pombe苹果酸转运蛋白合成基因构建体(SEQ ID NO：5)构成的BamHI/NotI限制性消化片段之后，制造了表达构建体pGBS416MAE-1。使用连接混合物转化E.coli TOP10(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS416MAE-1。
1.1.2.构建S.cerevisiae菌株
通过电穿孔将质粒pGBS414PPK-3、pGBS415FUM-3和pGBS416MAE-1(在1.1.下描述)转化进S.cerevisiae菌株RWB064(MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox)中，制造过表达PCKa、MDH3、FUMR、FRDg和SpMAEI的菌株SUC-200。根据WO2008/000632，针对在S.cerevisiae中的表达对所有基因都进行了密码子对优化。
1.2.在低pH和氧受限条件下的S.cerevisiae琥珀酸生产
在30℃和220rpm下，在摇瓶(2x300ml)中将酵母菌株SUC-200(过表达PCKa、MDH3、FUMR、FRDg和SpMAEI的MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox)培养3天。培养基以Verduyn(Verduyn et.al.，1992，Yeast 8，501-517)为基础，但是如表1中所示对碳源和碳源进行了改动。
表1.预培养摇瓶培养基组成
  化合物   浓度(g/l)
  C6H12O6·H2O   20.0
  (NH2)2CO   2.3
  KH2PO4   3.0
  MgSO4·7H2O   0.5
  1
  1
a维生素溶液
  组分  通式   浓度(g/kg)
  生物素(D-)  C10H16N2O3S   0.05
  Ca D(+)泛酸盐  C18H32CaN2O10   1.00
  烟酸   C6H5NO2   1.00
  Myo-肌醇   C6H12O6   25.00
  盐酸氯化硫胺   C12H18Cl2N4OsxH2O   1.00
  盐酸吡哆醇   C8H12ClNO3   1.00
  对氨基苯甲酸   C7H7NO2   0.20
b微量元素溶液
 通式   浓度(g/kg)
 C10H14N2Na2O8·2H2O(EDTA)   15.00
 ZnSO4·7H2O   1.50
 MnCl2·2H2O   0.84
 CoCl2·6H2O   0.30
 CuSO4·5H2O   0.30
 Na2MoO4·2H2O   0.40
 CaCl2·2H2O   4.50
 FeSO4·7H2O   3.00
 H3BO3   1.00
 KI   0.10
随后，将摇瓶内容物转移至含有以下培养基的10L发酵罐(初始重量6kg)中：
表2.主要发酵培养基组成
  原材料  通式   浓度(g/l)
  硫酸铵  (NH4)2SO4   2.5
  磷酸二氢钾  KH2PO4   3.0
  硫酸镁  MgSO4·7H2O   0.5
  微量元素溶液   1
  维生素溶液   1
通过添加6N KOH将pH控制在3.0。将温度控制在30℃。通过控制对发酵罐的补料添加，使葡萄糖浓度保持受限(＜1g/l)。对发酵应用导致氧限制的不同的氧吸收速率(OUR)(图1)。
应用0.33vvm的包括10％CO2的总气流，从而为高效的琥珀酸生产提供足够的CO2。
对琥珀酸生产应用的不同OUR的结果展示于图1中。在pH 3下需要最小量的通气维持琥珀酸生产。高于5mmol/L/h的OUR导致更低的琥珀酸生产。
在90小时的培养期间，生长发生至8g干重/L的典型生物质浓度。结果，在发酵期间氧吸收比速率(qO2)持续降低。在一次发酵中应用的10mmol/L/h的OUR与从10降低至1.25mmol/g生物质干重/h的qO2相关，1mmol/L/h的OUR与从1降至0.1mmol/g生物质干重/h的qO2相关。
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Claims (10)

1.用于制备二羧酸的方法，所述方法包括在低于有机酸最低pKa的pH值下，在存在含碳水化合物的底物和少量氧时发酵酵母。
2.根据权利要求1的方法，其中所述二羧酸是延胡索酸、苹果酸或琥珀酸。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述pH在pH 1.0到pH 5.5的范围内。
4.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中所述氧以低于约8mmol氧/L/小时的氧吸收速率被供应。
5.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中所述氧以8到0.5mmol/g生物质干重/小时之间的范围内的氧吸收比速率被供应。
6.根据权利要求1到5中任一项的方法，所述方法包括在碳受限的条件下发酵酵母。
7.根据权利要求1到6中任一项的方法，所述方法在存在额外的电子供体时进行。
8.根据权利要求1到7中任一项的方法，其中所述酵母是Saccharomyces cerevisiae。
9.根据权利要求1到8中任一项的方法，其中所述酵母是经遗传修饰的酵母。
10.根据权利要求9的方法，其中所述经遗传修饰的酵母包含编码选自下组的异源酶的核苷酸序列，所述组由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、延胡索酸还原酶和延胡索酸酶组成。
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