CN1367841A - 合成有机产物的方法和材料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了涉及生产有机产物的方法和材料。具体地说,本发明提供了用于生产各种有机产物的各种重组酵母细胞、培养酵母细胞的方法、制备酵母细胞的方法、核酸结构、以及方法和材料。

Description

合成有机产物的方法和材料
                            背景
1.技术领域
本发明涉及生产有机产物的方法和材料。
2.背景信息
有机产物如乳酸有许多重要的工业用途。例如，有机酸可用于合成塑料材料和其它产品。为了满足对有机产物的不断需求，更多有效和经济的生产方法正在开发。其中之一涉及使用细菌。具体地说，某些细菌在某些发酵条件下可产生大量特定有机产物。然而，使用活细菌作为工厂受到随着生长培养基中有机产物的积累细菌不能生长的限制。为了克服这种限制，在产物合成过程中使用了多种不同的产物纯化技术。另外，尝试使用细菌以外的微生物。事实上，已知耐酸的酿酒酵母已被基因修饰，尝试用于生产乳酸。具体地说，通过提供牛乳酸脱氢酶cDNA并破坏内源性丙酮酸脱羧酶基因(PDC1、PDC5和PDC6)修饰酿酒酵母细胞。虽然这些修饰的酿酒酵母细胞产生一定量的乳酸，但细胞生长受到抑制，因此细胞生长和乳酸生产都需要改善。
概述
本发明总体上涉及生产有机产物的方法和材料。具体地说，本发明提供了生产各种有机产物的酵母细胞、培养酵母细胞的方法、制备酵母细胞的方法、核酸结构、以及方法和材料。本发明基于以下发现：可基因操作特定微生物(如细菌和真菌微生物)，使它们具有在特定培养条件下生长、利用不同碳源生长和产物生产、以及产生用于商业目的目标有机产物的能力。例如，这里提供的酵母细胞在低pH和高温培养时可以生长并产生有机产物。在例如低pH和高温条件下具有快速生长和有效产生有机产物的能力特别有优势。具体地说，微生物耐受低pH的能力避免了维持中性pH环境的需要，这种维持在大量生产工艺中困难且昂贵。此外，与从更中性pH培养基中回收相同有机产物所要求的方法和材料相比，从低pH培养基中回收目标有机产物所要求的方法和材料更实际且有效。例如，当pH值低于产物的pKa值，某些有机产物可从溶液中沉淀出来，使回收十分简单。此外，微生物耐受高温的能力避免了在生长和生产阶段维持较低温度的需要。显然，在大量生产工艺中降低大体积容器中培养基温度的需要使得整个工艺要有效和更经济。而且，微生物耐受低pH和高温的能力提供了在大量生产工艺中避免被其它更不耐受的微生物污染的一种方便方法。
必须注意涉及生产用于商业目的的有机产物的能力的一个重要方面是生产目标有机产物的特异性生产能力。例如，使用这里描述的方法和材料提供高特异性生产能力，可使微生物在例如低pH和高温等培养条件下产生细胞维持所需的能量。要求的能量可通过基本厌氧条件下的发酵途径产生，而不依赖通过呼吸途径产生能量。当产生不需要呼吸途径的产物时，通过发酵途径获得能量特别有优势，因为基本上所有提供的碳源都能够用来生产目标有机产物。
本发明也基于这样一个发现：某些基因操作的微生物对碳源的利用可被操纵，并主要导向生产生物量或目标有机产物。总的来说，本发明包括两种培养工艺。一种培养工艺包括根据微生物和预期结果，在促进生物量生产的特定培养条件下培养微生物，而另一种包括也根据微生物和预期结果，促进目标有机产物生产的一组不同培养条件。显然，在大规模生产工艺过程中对碳源利用的操纵能力给制造商提供了比其它可能更大的机动性和更多控制。
另外，本发明基于这样一个发现：某些微生物能够被基因操作，使碳源的绝大部分(如果不是所有的)被用来生产生物量或目标有机产物。具体地说，本发明提供修饰了的酵母细胞，使得将碳源利用从生产生物量或目标有机产物转向的生物合成途径被灭活。灭活这种生物合成途径使微生物能够有效生长并生产目标产物。
一般而言，本发明的特征为含有外源核酸分子的酵母细胞，该外源核酸分子编码在细胞内具有酶活性的多肽。核酸能够整合到细胞基因组中。这种酶活性导致有机产物的形成，在某些实施方案中该产物从细胞中分泌出来。而且这种细胞具有克拉布特里(crabtree)阴性表现型并产生该有机产物。该细胞可能来自如克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、白色假丝酵母属(Candida)、皮状丝孢酵母属(Trichosporon)或Yamadazyma。有机产物可能是例如发酵产物、来源于丙酮酸的产物、有机酸或羧酸(如乳酸)。在一个实施方案中，多肽可具有乳酸脱氢酶活性。例如，外源核酸可编码一种细菌乳酸脱氢酶或真菌乳酸脱氢酶如产乳酸克鲁维酵母的真菌乳酸脱氢酶。
在另一个实施方案中，该细胞含有四个外源核酸分子，每个编码一种不同的多肽。例如，四个外源核酸分子的第一个能编码第一种具有乳酸脱氢酶活性的多肽，第二个能编码第二种具有辅酶A转移酶活性的多肽，第三个能编码第三种具有乳酰-辅酶A脱水酶活性的多肽，第四个能编码第四种具有丙烯酰-辅酶A水合酶活性的多肽。这些细胞能产生丙烯酸作为羧酸产物。或者，四个外源核酸分子的第一个能编码第一种具有2-脱氢-3-脱氧-D-戊酸醛缩酶活性的多肽，第二个能编码第二种具有木糖酸脱水酶活性的多肽，第三个能编码第三种具有木糖内酯酶活性的多肽，第四个能编码第四种具有D-木糖脱氢酶活性的多肽。这种细胞能够产生一种碳水化合物(如D-木糖)作为有机产物。
还有另一个实施方案中，该细胞含有六个外源核酸分子，每种编码一种不同的多肽。例如，六个外源核酸分子的第一个能编码第一种具有2，5-二氧杂戊酸脱氢酶活性的多肽，第二个能编码第二种具有5-脱氢-4-脱氧-D-葡糖二酸(glucarate)脱氢酶活性的多肽，第三个能编码第三种具有葡糖二酸脱水酶活性的多肽，第四个能编码第四种具有醛脱氢酶活性的多肽，第五个能编码第五种具有葡糖醛酸内酯还原酶活性的多肽，第六个能编码第六种具有L-古洛糖酸内酯氧化酶活性的多肽。这种细胞能够产生一种维生素(如L-抗坏血酸)作为有机产物。
有机产物可含有多于三个碳原子，并且可以是例如一种氨基酸。
在另一个实施方案中，该细胞能够分解代谢戊糖碳，如核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖。
在另一个实施方案中，该细胞具有降低的丙酮酸脱羧酶活性或降低的乙醇脱氢酶活性。例如，该细胞可缺失所有丙酮酸脱羧酶活性。降低的丙酮酸脱羧酶活性可归因于破坏的基因座位，该座位通常具有编码丙酮酸脱羧酶的核酸序列。或者该细胞含有一个反义分子，如相应于一个内源核酸序列的核酶，该反义分子可降低丙酮酸脱羧酶的活性。该细胞也可含有一个功能上作为杀伤质粒的额外外源核酸分子。
在另一个实施方案中，外源核酸编码多肽的酶活性导致以消耗NADH的方式形成有机产物。
在另一个实施方案中，当细胞培养在生产有机产物的优化条件下时，细胞每消耗100克葡萄糖产生至少大约60克有机产物。
在另一方面，本发明的特色为含有外源核酸序列的细胞，如酵母细胞，其中该外源核酸分子编码促进细胞对戊糖碳分解代谢的多肽。该多肽可以是例如木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或木酮糖激酶。戊糖碳可以是例如核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖。该细胞还可分解代谢己糖碳，如果需要还可同时分解代谢己糖碳和戊糖碳。己糖碳可以是例如阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、iodose、果糖、半乳糖和塔罗糖。
在另一方面，本发明的特色为含有外源核酸分子的酵母细胞，其中该外源核酸分子编码促进细胞质中乙酰辅酶A积累的多肽。该多肽可以是具有柠檬酸裂解酶活性的多肽，或可以是促进乙酰辅酶A对线粒体膜通透性的多肽。该细胞可具有降低的丙酮酸脱羧酶活性或降低的乙醇脱氢酶活性。或者，该酵母细胞可不产生乙醇，并且在缺乏乙醇和丙酸的培养条件下的生长速率，比不产生乙醇的可比酵母细胞之生长速率更快。
另一方面，本发明的特色为一种含有降低的线粒体多肽活性的酵母细胞，其中该细胞具有克拉布特里阴性表现型。这种细胞可来自如克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、白色假丝酵母属、皮状丝孢酵母属或Yamadazyma。该细胞可完全缺乏活性。其中该细胞可含有一个破坏的座位，该座位正常含有一个编码线粒体多肽的核酸序列。该线粒体多肽可以是一种三羧酸循环酶。而且，该细胞可积累一种三羧酸循环产物。该细胞可包括一个编码在细胞内具有酶活性的多肽的外源核酸分子，该酶活性导致一种有机产物的形成，从而细胞生产有机产物。该有机产物可以是例如柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和草酰乙酸。其多肽可以是一种参与乳酸或乙酸分解代谢的多肽。
另一方面，本发明的特色为一种生产有机产物的方法。该方法包括提供酵母细胞以及用培养基培养细胞从而产生有机产物。其中细胞包括一种其编码多肽在细胞内具有酶活性的外源核酸分子，其中酶活性导致有机产物的形成，并且其中细胞具有克拉布特里阴性表现型。该酵母细胞可来自如克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、白色假丝酵母属、皮状丝孢酵母属或Yamadazyma。该有机产物可以是发酵产物、来源于丙酮酸的产物、含有多于三个碳原子的有机产物、羧酸、碳水化合物、氨基酸、维生素、或脂类产物。该有机产物还可以是乳酸、甘油、丙烯酸、木糖、抗坏血酸、柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酰-辅酶A、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和草酰乙酸。在某些实施方案中，该有机产物由细胞分泌。该方法可导致细胞具有降低的丙酮酸脱羧酶活性或降低的乙醇脱氢酶活性。该酶活性可导致以消耗NADH方式的有机产物的形成。
当生产有机产物的培养步骤为最优时，用这些方法制备的细胞每消耗100克葡萄糖产生至少大约60克有机产物。培养基(可以为液体)可包括一种细胞呼吸抑制剂，例如抗霉素A、氰化物或叠氮化物。培养步骤可包括在需氧生长条件下生长细胞，然后使上述细胞与细胞呼吸抑制物接触。
在一个可替代实施方案中，培养步骤包括在厌氧培养条件下孵育细胞。在另一个可替代实施方案中，培养步骤包括在需氧生长条件下生长细胞，然后在厌氧培养条件下孵育细胞。培养步骤也可包括在高于大约35℃的温度培养细胞。
在一个实施方案中，培养基具有低于大约3.0的有机pH值，和/或低于大约3.0的无机pH值。在另一个实施方案中，培养基含有戊糖碳例如核糖、阿拉伯糖、木糖或来苏糖。培养基也可包括一种具有例如pH值为2.0-6.5的谷物纤维水解物。
在另一方面，本发明的特色为一种生产有机产物的方法，该方法包括a)提供含有一种外源核酸分子的酵母细胞，该核酸分子编码促进细胞代谢戊糖碳的多肽，其中该细胞含有导致形成上述有机产物的酶活性，和b)用培养基培养细胞从而产生有机产物。
另一方面，本发明的特色为一种生产有机产物的方法，该方法包括a)提供酵母细胞，其中该细胞包括一种其编码多肽促进乙酰辅酶A在细胞质内积累的外源核酸分子，而且其中该细胞含有一种导致有机产物形成的酶活性，和b)用培养基培养细胞从而生产有机产物。
另一方面，本发明的特色为一种生产有机产物的方法，该方法包括a)提供具有降低的线粒体酶活性的酵母细胞，其中降低的活性导致有机产物的积累，和b)用培养基培养上述细胞从而生产有机产物。
在另一方面，本发明的特色为一种培养具有克拉布特里阴性表现型的酵母细胞的方法，该方法包括用培养基培养细胞，其中培养基具有低于大约3.0的有机pH值，和/或低于大约3.0的无机pH值。培养步骤可包括在高于大约35℃的温度下培养细胞。培养基可包括一种细胞呼吸抑制剂。培养基也可包括一种戊糖碳。在另一个实施方案中，培养基可包括一种谷物纤维水解物。
在另一方面，本发明的特色为一种培养具有克拉布特里阴性表现型的酵母细胞的方法，该方法包括用培养基培养细胞，其中培养基包括一种谷物纤维水解物。
在另一方面，本发明的特色为一种培养具有克拉布特里阴性表现型酵母细胞的方法，该方法包括用培养基在高于大约35℃的温度下培养细胞，培养基具有低于大约3.0的无机pH值。
在另一方面，本发明的特色为一种培养具有克拉布特里阴性表现型的酵母细胞的方法，该方法包括用培养基在高于大约35℃的温度下培养细胞，培养基包括一种戊糖碳。
在另一方面，本发明的特色为一种培养具有克拉布特里阴性表现型的酵母细胞的方法，该方法包括用培养基在高于大约35℃的温度下培养细胞，培养基包括一种谷物水解物。
在另一方面，本发明的特色为一种包括重组序列和所选序列的核酸构建体，重组序列相应于具有克拉布特里阴性表现型细胞的基因组序列，该基因组序列编码细胞表达的一种酶，所选序列编码一种导致在细胞内形成有机产物的酶。所选序列可在重组序列内，这样所选序列两端为重组序列。
在另一方面，本发明的特色为一种制备重组酵母细胞的方法，包括提供具有克拉布特里阴性表现型的酵母细胞，选择一种终产物，鉴定为了生产终产物而需要加入细胞的一种或多种外源性酶，鉴定为了使上述细胞生产上述终产物而在上述细胞中活性需要降低的一种或多种内源性酶，将鉴定的一种或多种外源性酶加入提供的酵母细胞，并降低鉴定的一种或多种内源性酶在提供的酵母细胞中的活性，使细胞在培养条件下生产终产物。
在另一方面，本发明的特色为一种谷物纤维水解物，该水解物具有在约2.0-约6.5之间的pH值。该水解物可包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。该水解物可包括约40克/L葡萄糖、约40克/L木糖和约20克/L阿拉伯糖。或者，该水解物可包括约38.7克/L葡萄糖、约39.1克/L木糖、约20.7克/L阿拉伯糖和约1.6克/L糖醛。
在另一方面，本发明的特色为一种制备有机产物的方法，包括a)在培养条件下培养一种微生物，其中微生物具有降低的酶活性；该酶活性可以为丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶、醛脱氢酶或乙酰辅酶A合酶活性；在没有乙醇和乙酸时，该微生物显示的生长速率是没有上述降低的酶活性的相应微生物生长速率的至少大约30％，和b)改变培养条件以促进有机产物的生产。
在另一方面，本发明的特色为一种制备有机产物的方法，包括a)在促进细胞呼吸的培养条件下培养微生物，其中微生物具有降低的酶活性；该酶活性可为丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶、醛脱氢酶或乙酰辅酶A合酶活性，在没有乙醇和乙酸时，该微生物显示的生长速率是没有上述降低的酶活性的相应微生物生长速率的至少大约30％，和b)改变培养条件降低细胞呼吸，从而促进有机产物的生产。
除非另外说明，这里所用的所有技术和科学术语与本发明涉及的本领域普通技术人员一般理解的含义相同。尽管与这里描述的那些相似或相同的方法或材料可用于实现或检验本发明，合适的方法和材料描述如下。这里提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均引入作为参考。如果有冲突，以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，不作为限制。
下列详细描述和权利要求将使本发明的其它特色和优势显而易见。
                           图表描述
图1为描述pHES质粒的图表。
图2为描述pSEH质粒的图表。
图3为描述含有Lh-ldh或Pa-ldh的pCRII质粒产生的图表。
图4为描述ldh/pCRII质粒的图表。
图5为描述含有Lh-ldh或Pa-ldh的pHES质粒产生的图表。
图6a为描述产生丙酮酸脱羧酶(PDC)敲除片段的图表。
图6b为描述围绕马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)1.7kbp PDC1的5.5kbp片段的图表。
图6c为描述5.5kbp PDC同源区的400bp缺失和卡那霉素抗性基因插入的图表。
图6d为描述含有卡那霉素抗性基因的4kb区和围绕的2.3kb PDC1的图表。
图6e为描述7.5kbp耐热克鲁维酵母PDC1和围绕区的图表。
图6f为描述从1.7kbp PDC1基因缺失750bp和插入卡那霉素抗性基因的图表。
图7为马克斯克鲁维酵母在低pH(pH2.5)和高温(40℃)条件下培养时生长(光密度；OD)相对时间(小时)的曲线图。
图8为马克斯克鲁维酵母在30℃用葡萄糖、木糖或阿拉伯糖培养时生长(OD)相对时间(小时)的曲线图。
图9为马克斯克鲁维酵母在30℃用谷物纤维水解物培养时生长(OD)相对时间(小时)的曲线图。
图10为马克斯克鲁维酵母在30℃和指示pH下培养时生长(OD)相对时间(小时)的曲线图。
图11为马克斯克鲁维酵母在30℃和指示pH下存在40克乳酸培养时生长(OD)相对时间(小时)的曲线图。
图12为S.uvarum和马克斯克鲁维酵母用含有2％葡萄糖的矿物培养基在需氧条件下培养时的三种曲线图(A)生物量生产；(B)葡萄糖消耗；和(C)乙醇生产。
图13为S.uvarum和马克斯克鲁维酵母用含有2％葡萄糖的矿物培养基在厌氧条件下培养时的三条曲线图(A)生物量生产；(B)葡萄糖消耗；和(C)乙醇生产。
图14为PDC1启动子载体的质粒图谱。
                           详细描述
本发明提供了涉及生产有机产物的方法和材料。具体地说，本发明提供了酵母细胞、培养酵母细胞的方法、制备酵母细胞的方法、核酸结构和生产各种有机产物的方法和材料。
这里提供的酵母细胞可用来生产有机产物。这些有机产物可具有广泛应用。  例如，用这里描述的酵母细胞生产的有机产物可用作食品、药物或化妆品的防腐剂或添加剂，并可用于制造塑料和其它产品。
为了本发明的目的，有机产物为含有碳原子的所有化合物。例如，羧酸(如乳酸、丙烯酸、柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、草酰乙酸)、碳水化合物(如D-木糖)、糖醇(如木糖醇、阿拉伯糖醇、核糖醇)、氨基酸(如甘氨酸、色氨酸、谷氨酸)、脂类，酯类，维生素类(如L-抗坏血酸)、多元醇(如甘油、1，3-丙二醇、赤藓糖醇)、醛类、链烯类、炔类和酮类为有机产物。这样，有机产物可含有一、二、三、四、五、六、七、八、九、十个或更多碳原子。另外，有机产物分子量可小于大约1000(如大约900、800、700、600、500、400、300、200或100)。例如，D-木糖(C5H10O5)是分子量为150的一种有机产物。而且，有机产物可以是发酵产物。术语“发酵产物”在这此是指用发酵工艺生产的所有有机化合物。一般而言，发酵工艺包括有机化合物的厌氧酶促转化例如碳水化合物转化成如乙醇的化合物，产生腺苷三磷酸(ATP)形式的能量。因此，发酵与细胞呼吸的不同在于有机产物而不是氧分子作为电子受体。发酵产物的实例包括(不限制)乙酸、乙醇、丁酸和乳酸。
有机产物也可以是来源于丙酮酸的产物。术语“来源于丙酮酸的产物”在此是指在不超过15个酶促步骤内从丙酮酸合成的所有化合物。酶促步骤是由具有酶活性的多肽催化的一个化学反应或一系列化学反应。术语“具有酶活性的多肽”在此是指催化其它物质的化学反应而自身在完成反应时不被破坏或改变的所有多肽。典型地，酶多肽催化从一种或多种底物形成一种或多种产物。这类酶多肽可具有任何类型的酶活性，包括(不限制)与下列酶有关的酶活性，如顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸硫激酶、琥珀酸脱氢酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、2，5-二氧杂戊酸脱氢酶、5-脱氢-4-脱氧-D-葡糖二酸脱氢酶、葡糖二酸脱水酶、醛脱氢酶、葡糖醛酸内酯还原酶、L-古洛糖酸内酯氧化酶、2-氢-3-脱氧-D-戊酸醛缩酶、木糖酸(xylonate)脱水酶、木糖酸内酯酶(xylonolactonase)、D-木糖-脱氢酶、乳酸脱氢酶、辅酶A转移酶、乳酰辅酶A脱水酶或丙烯酰辅酶A脱水酶。
必须注意，具有特定酶活性的多肽可以是天然或非天然的。天然多肽是具有自然界中存在的氨基酸序列的任意多肽，包括野生型和多态性多肽。这类天然多肽可获自包括(不限于)哺乳动物、真菌和细菌的所有物种。非天然多肽是具有自然界中没有的氨基酸序列的任意多肽。因此，非天然多肽可以是天然多肽的突变体，或基因工程多肽。例如，具有柠檬酸合酶活性的一种非天然多肽可以是具有柠檬酸合酶活性天然多肽的突变体，它保留了至少一些柠檬酸合酶活性。多肽可以通过如序列添加、缺失、和/或替代来突变。
如果一种有机产物需要超过15个酶促步骤从丙酮酸合成，该产物不是来源于丙酮酸的产物。来源于丙酮酸的产物实例包括(不限制)柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、草酰乙酸、2-脱氢-3-脱氧-D-木糖酸、D-木糖酸内酯、D-木糖、丙烯酸、乙酸、乙醇、丁酸和乳酸。
为了本发明的目的，可以是“自由酸”或“盐”形式的羧酸产物将参照使用盐形式命名法。例如，术语“乳酸”包括乳酸和乳酸盐。
术语“核酸”在此包括RNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA和合成的(如化学合成的)DNA。核酸可以是双链或单链。其中的单链核酸可以是有义链或无义链。另外，核酸可为环状或线性。
关于核酸分子或特定细胞的术语“外源性”在此是指不是该特定细胞自然来源的所有核酸分子。因此，一旦非天然核酸被导入细胞，那么所有这些核酸被认为对该细胞是外源性的。必须注意，非天然的核酸分子可含有自然存在的核酸序列或核酸序列片段，但自然界不存在整个这种核酸分子。例如，表达载体内含有一个基因组DNA序列的核酸分子被认为是非天然的核酸分子，因此一旦导入细胞就被认为是外源性的，因为该核酸分子作为一个整体(基因组DNA加上载体DNA)在自然界不存在。因此，作为一个整体在自然界不存在的任何载体，自主复制的质粒、或病毒(如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)被认为是非天然的核酸分子。接着，因为由PCR或限制性内切酶处理产生的基因组DNA片段和cDNA片段作为独立的分子在自然界不存在，所以也被认为是非天然的核酸分子。接着，含有一个启动子序列和多肽编码序列(如cDNA或基因组DNA)、自然界中没有其排列的任何核酸分子也被认为是非天然的核酸分子。
术语“内源性”指非外源性的基因组材料。通常，内源性基因组材料在有机体、组织或细胞内发育，没有通过重组技术插入或修饰。内源性基因组材料的范围不包括自然发生的变异。
还必须注意，天然的核酸分子对特定细胞可以为外源性的。例如，从X人的细胞分离的完整染色体，一旦该染色体导入Y人的细胞就认为它对于Y的细胞是外源性核酸分子。
在此，“基因修饰”是指例如通过添加、替代或缺失，其基因组被修饰的生物。添加或缺失基因材料的方法已知包括(但不限于)随机诱变、点突变(包括插入、缺失和替代、敲除技术)，以及利用重组技术用核酸序列转化有机体，包括稳定和瞬时转化。酵母细胞也可以代谢淀粉，天然地或由于基因修饰，甚至通过加入如真菌纤维素酶进行基因修饰以代谢纤维素。
1.具有克拉布特里阴性表现型的酵母细胞
本发明提供了各种具有克拉布特里阴性表现型的基因操作的酵母细胞。这类重组酵母细胞可用于生产有机产物。例如，本发明提供了一种具有克拉布特里阴性表现型的酵母细胞，它含有编码导致形成一种有机产物的酶活性多肽的外源性核酸分子。如果这类酵母细胞生产有机产物，就属于本发明的范围。注意，产生的有机产物可从酵母细胞分泌出来，不需要破坏细胞膜就可获得有机产物。典型地，本发明的酵母细胞产生有机产物的产量为，当在产物生产的最佳条件下培养时，每消耗100克葡萄糖产生至少40克(如至少大约45、50、55、65、70、75、80、85、90或95克)有机产物。可用任何方法检测特定酵母细胞有机产物的产量。见，例如，Kiers等，酵母(Yeast)，14(5)：459-469(1998)。也要注意，编码多肽的酶活性可导致以消耗NADH的方式形成有机产物。换句话说，有机产物的生产可要求NADH作为能源。术语“NAD”  指特别是在氧化还原反应中作为电子和氢载体的辅因子，而术语“NADH”指NAD的还原形式。其合成需用NADH的有机产物的实例包括(不限制)乳酸、乙醇、乙酸和丙烯酸。典型地，本发明范围内的酵母细胞代谢己糖碳如葡萄糖。然而，这类酵母细胞也代谢戊糖碳(如核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖)。换句话说，本发明范围内的酵母细胞可天然利用戊糖碳，或被改造后可利用戊糖碳。例如，可给予酵母细胞一个编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和/或木酮糖激酶的外源性核酸分子，这样可分解代谢木糖。酵母细胞也可以天然地或由于基因修饰而分解代谢淀粉，甚至可通过添加如真菌纤维素酶对其进行基因修饰，使其分解代谢纤维素。
具有克拉布特里阴性表现型的酵母细胞为不显示克拉布特里效应的所有酵母细胞。术语“克拉布特里阴性”指天然的和基因修饰的生物。简言之，克拉布特里效应定义为：当微生物培养在需氧条件下时，由于存在高浓度的葡萄糖(如50克葡萄糖/L)而对氧消耗的抑制。换句话说，具有克拉布特里阳性表现型的酵母细胞由于存在葡萄糖可继续发酵，与氧的提供无关，而具有克拉布特里阴性表现型的酵母细胞不显示葡萄糖介导的对氧消耗的抑制。典型具有克拉布特里阴性表现型的酵母细胞的实例包括(不限制)，来自下列种属的酵母细胞：克鲁维酵母菌、毕赤酵母、汉逊酵母、白色假丝酵母、皮状丝孢酵母、和Yamadazyma。
如这里所描述的，本发明提供了许多不同类型的能够生产许多种不同有机产物的重组酵母细胞。例如，酵母细胞可含有外源核酸分子，该核酸分子编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽，因而可产生乳酸。这类多肽的实例包括(不限制)，牛乳酸脱氢酶、细菌乳酸脱氢酶和真菌乳酸脱氢酶(如，产乳酸克鲁维酵母或耐热性克鲁维酵母的真菌乳酸脱氢酶)。同样，具有酶活性(如乳酸脱氢酶活性)的多肽可以为天然的或非天然的。
必须注意，这里描述的酵母细胞可含有一个拷贝或多个拷贝(如，约5、10、20、35、50、75、100或150拷贝)的特定外源核酸分子。例如，酵母细胞可含有大约50拷贝外源核酸分子X。也必须注意，这里描述的酵母细胞可含有一个以上的外源核酸分子。例如，酵母细胞可含有大约50拷贝外源核酸分子X和大约75拷贝外源核酸分子Y。在这些情况下，每个不同的核酸分子可编码一个具有自己独特酶活性的不同多肽。例如，酵母细胞可含有四个不同的外源核酸分子从而生产丙烯酸。在该实施例中，这种酵母细胞可含有第一个外源核酸分子，它编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽，第二个编码具有辅酶A转移酶活性的多肽，第三个编码具有乳酰辅酶A脱水酶活性的多肽，第四个编码具有丙烯酰辅酶A脱水酶活性的多肽。在另一个实施例中，酵母细胞含有四个不同的外源核酸分子从而生产D-木糖。具体地说，这种酵母细胞可含有第一个外源核酸分子，其编码具有2-脱氢-3-脱氧-D-戊酸醛缩酶活性的多肽，第二个编码具有木糖酸脱水酶活性的多肽，第三个编码具有木糖酸内酯酶活性的多肽，第四个编码具有D-木糖脱氢酶活性的多肽。在另一个实施例中，酵母细胞可含有六个不同的外源核酸分子，从而生产维生素L-抗坏血酸。具体地说，这种酵母细胞可含有第一个外源核酸分子，编码具有2，5-二氧杂戊酸脱氢酶活性的多肽，第二个编码具有5-脱氢-4-脱氧-D-葡糖二酸脱氢酶活性的多肽，第三个编码具有葡糖二酸脱水酶活性的多肽，第四个编码具有醛脱氢酶活性的多肽，第五个编码具有葡糖醛酸内酯还原酶活性的多肽，第六个编码具有L-古洛糖酸内酯氧化酶活性的多肽。
必须注意，可使用酶多肽，使目标有机产物具有光学纯度(如大约90、95、99％纯度)。例如，具有(L)-乳酸脱氢酶活性的多肽可用于生产(L)-乳酸。
本发明范围内的酵母细胞也可具有降低的酶活性，如降低的丙酮酸脱羧酶和/或乙醇脱氢酶活性。在此关于细胞和特定酶活性的术语“降低的”是指比同种可比酵母细胞测量的酶活性低的酶活性水平。因此，缺乏丙酮酸脱羧酶活性的酵母细胞被认为具有降低的丙酮酸脱羧酶活性，因为绝大多数(如果不是所有的)可比酵母细胞至少具有一些丙酮酸脱羧酶活性。这种降低的酶活性可能是较低的酶浓度、酶较低的比活性或二者联合的结果。可用许多不同的方法来制备具有降低的酶活性的酵母细胞。例如，可利用普通诱变或敲除技术改造酵母细胞，使其含有一个破坏的酶编码座位。见，如，《酵母遗传学方法》(Methods in Yeast Genetics)(1997版)，Adams，Gottschling，Kaiser和Sterns，冷泉港出版社(1998)。或者，可用反义技术降低酶活性。例如，可改造酵母细胞使其含有编码防止酶产生的反义分子的cDNA。术语“反义分子”在此包括含有相应于内源性多肽的编码链序列的所有核酸分子。反义分子也可含有旁侧序列(如调控序列)。因此，反义分子可以是核酶或反义寡核苷酸。核酶可具有任何常规序列包括(不限制)发夹结构、锤头状结构或斧头结构，只要该分子裂解RNA。
可用任一种方法鉴定具有降低的酶活性的酵母细胞。例如，用普通方法可以很容易鉴定具有降低的丙酮酸脱羧酶活性的酵母细胞。见，如，Ulbrich，《酶学方法》(Methods in Enzymology)18：109-115(1970)。
2.具有克拉布特里阳性或克拉布特里阴性表现型的酵母细胞
本发明也提供了多种不需要具有克拉布特里阴性表现型的基因操作的酵母细胞，即，这类细胞可以为克拉布特里阳性或克拉布特里阴性。这类重组酵母细胞可用于生产有机产物。例如，本发明提供了含有其编码多肽促进细胞分解代谢戊糖碳(如核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖)的外源核酸分子的酵母细胞。具体地说，酵母细胞可含有编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶、和/或木酮糖激酶的外源核酸分子，从而可以一种更有效的方式分解代谢木糖。另外，能够分解代谢戊糖碳的酵母细胞也能够顺序地或同时分解代谢己糖碳(如阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、iodose、果糖、半乳糖和塔罗糖)。例如，可以改造酵母细胞使其同时分解代谢木糖和葡萄糖。注意，可用戊糖碳分解代谢能力提高了的酵母细胞改造能够从戊糖碳源生产有机产物的酵母细胞。这一特征特别有优势，因为戊糖碳源(如木糖)通常比己糖碳源(如葡萄糖)经济。可被分解代谢的其它碳源包括(不限制)蜜二糖、蔗糖、果糖、蜜三糖、水苏糖、淀粉(如谷物淀粉和小麦淀粉)、和水解物(如谷物纤维水解物和其它纤维素水解物)。
另外，本发明提供了含有其编码多肽促进细胞质中乙酰辅酶A积累的外源核酸分子的酵母细胞。例如，酵母细胞可含有编码具有柠檬酸裂解酶活性的多肽的外源核酸分子。或者，酵母细胞可含有编码一种线粒体膜多肽的外源核酸分子，该多肽促进乙酰辅酶A穿过线粒体膜的通透性。注意，许多缺乏生产乙醇能力的酵母细胞不能在缺乏乙醇和乙酸时生长。典型地，当以某种形式缺乏丙酮酸脱羧酶或乙醇脱氢酶活性时，酵母细胞将缺乏生产乙醇的能力。例如，缺乏丙酮酸脱羧酶活性的克拉布特里阳性酵母(如酵母属)在缺乏乙醇和乙酸时生长很差。因此，为了利用丙酮酸改道生产其它有机产物(如乳酸和丙烯酸)，以降低乙醇生产的方式操纵这种克拉布特里阳性酵母，导致在缺乏乙醇和乙酸时很差的生长特征，特别是因为当存在葡萄糖时克拉布特里阳性酵母限制细胞呼吸。如这里所描述的，能够以某种形式促进细胞质中乙酰辅酶A积累的酵母细胞，而不是那些依赖细胞质中乙酸浓度和乙酰辅酶A合成酶活性的酵母细胞，在缺乏乙醇和乙酸时甚至当不能生产乙醇时能够生长。注意，在缺乏乙醇和乙酸同时缺乏生产乙醇能力时能够生长的酵母细胞可利用丙酮酸改道生产乙醇以外的有机产物。
任何类型的酵母都可含有其编码多肽促进细胞质内乙酰辅酶A积累的外源核酸分子。例如，具有克拉布特里阴性或克拉布特里阳性表现型的酵母细胞可含有其编码多肽促进细胞质内乙酰辅酶A积累的外源核酸分子。典型地，这类酵母细胞可通过以下方法鉴定：(1)操纵含有外源性核酸分子的细胞使其缺乏丙酮酸脱羧酶或乙醇脱氢酶活性，(2)在滴定量的呼吸抑制因子(如抗霉素A、氰化物或叠氮化物)存在条件下培养细胞时测定细胞的生长特征，和(3)与可比的酵母细胞比较那些生长特征，该可比细胞不含有外源核酸分子，且也被操纵使其缺乏丙酮酸脱羧酶或乙醇脱氢酶活性。通过这种比较，由于存在外源核酸分子而确定的具有更有利的生长特征的酵母细胞，被认为含有编码促进细胞质内乙酰辅酶A积累的多肽的外源核酸分子。
含有其编码多肽促进细胞质中乙酰辅酶A积累的外源核酸分子的酵母细胞也可具有降低的酶活性，如降低的丙酮酸脱羧酶和/或乙醇脱氢酶活性。例如，酵母细胞可缺乏生产乙醇的能力。典型地，这种酵母细胞在缺乏乙醇和乙酸的培养条件下的生长速率比不含有外源核酸、也在相似条件下(即缺乏乙醇和乙酸的培养条件)培养的可比酵母细胞(即缺乏生产乙醇能力的酵母细胞)的生长速率要快(如大约5、10、20、35、50、75、100、150、200％或更多)。
本发明也提供了多肽活性降低了的酵母细胞。这种酵母细胞可具有克拉布特里阳性或克拉布特里阴性表现型。例如，本发明范围内的酵母细胞可具有活性降低的原生质膜多肽(如原生质膜转运分子)、细胞质膜多肽(如丙酮酸脱羧酶)、和/或线粒体多肽(如丙酮酸脱氢酶)。术语“原生质膜转运分子”指帮助有机产物穿过原生质膜的多肽。这种多肽的实例包括(不限制)羧酸转运分子如酿酒酵母中的JEN1(Genebank登录号U24155)。术语“线粒体多肽”指在线粒体内行使功能的所有多肽，包括(不限制)丙酮酸脱氢酶、参与分解代谢乳酸或乙酰辅酶A的多肽(如细胞色素b2多肽)和三羧酸循环酶。三羧酸循环酶包括顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸硫激酶、琥珀酸脱氢酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶和柠檬酸合成酶。如这里所描述的，具有降低的酶活性的酵母细胞包括完全缺乏特定酶活性的酵母细胞。必须注意，在此关于酵母细胞和多肽活性的术语“降低的”指与同种属可比酵母细胞在相似条件下测定的活性相比较低的活性水平。因此，如果可比细胞至少具有一些转运活性，那么缺乏特定转运活性的酵母细胞被认为具有降低的转运活性。这种降低的多肽活性可能是较低的多肽浓度、多肽较低的特异活性或二者兼有的结果。可用各种方法制备具有降低的多肽活性的酵母细胞。例如，通过例如普通诱变或敲除技术可灭活具有编码线粒体多肽的核酸序列的座位。
注意，具有降低的线粒体酶活性的酵母细胞可积累三羧酸循环产物(如柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酰辅酶A、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和草酰乙酸)。例如，具有降低的延胡索酸酶活性的酵母细胞可积累延胡索酸。另外，酵母细胞可含有其编码多肽具有导致有机产物形成的酶活性的外源核酸分子，使细胞可生产有机产物。
必须注意，某些三羧酸循环产物不能穿透线粒体膜(如α-酮戊二酸和琥珀酰辅酶A)。因此，降低特定三羧酸循环酶的活性将导致特定三羧酸循环产物在线粒体腔内的积累。在这些情况下，可改造具有降低的三羧酸循环酶活性的酵母细胞，使其含有一个或多个不同的外源核酸分子，其中每一个编码一种具有不同酶活性的多肽，使三羧酸循环目标产物在细胞质中积累。例如，降低酮戊二酸脱氢酶的活性将导致α-酮戊二酸的积累，其依次将导致异柠檬酸的积累。α-酮戊二酸不能穿透线粒体膜，而异柠檬酸能够穿透线粒体膜。因此，异柠檬酸可在细胞质内积累。然而，还含有编码异柠檬酸脱氢酶活性多肽的外源核酸分子并在细胞质内表达该功能性多肽的酵母细胞可生产细胞质内α-酮戊二酸。因此，降低特定三羧酸循环酶的活性同时提供编码在细胞质内有功能的相同(或不同)三羧酸循环酶的外源核酸分子，用权可导致细胞质内不同三羧酸循环产物(或来自三羧酸循环产物的产物)的生产。
而且，本发明提供了酶活性降低的酵母细胞，该酶使碳源利用偏离生物量或目标有机产物的生产。例如，甘油或3-羟基丁酮途径的酶可被破坏，从而培养基中碳源主要用于生产生物量或目标有机产物。甘油途径的酶的实例包括(不限制)二羟丙酮磷酸还原酶。3-羟基丁酮途径的酶的实例包括(不限制)α-乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脱羧酶。同样，任何方法可用于降低酶活性。
而且，这里提供的任何酵母细胞可含有作为杀伤质粒的外源核酸分子。术语“杀伤质粒”这里是指给一种酵母提供杀伤另一种酵母的能力。例如，来自克鲁维酵母属含有杀伤质粒的酵母细胞可防止来自酿酒酵母属酵母的生长。因此，具有杀伤质粒的酵母细胞可用来防止大规模生产工艺中的污染问题。另外，可给予酵母细胞任何类型的杀伤质粒。例如，可将从产乳酸克鲁维酵母菌中分离的杀伤质粒给与马克斯克鲁维酵母酵母细胞。用普通方法可以很容易鉴定含有杀伤质粒的酵母细胞。见，如，Gunge等，J.Bacteriol.145(1)：382-390(1981)；Gunge和Kitada，Eur.J.Epidemiol.，4：409-414(1988)；和Wesolowski-Louvel等，生物技术中的非常规酵母：产乳酸克鲁维酵母菌(Nonconventional yeast inBiotechnology：KIuyveromyces lactis)，Klaus Wolf编，Springer verlag，Berlin，138-201页(1996)。
同样，这里提供的任一种酵母细胞，可含有其编码多肽具有修饰的ATP酶活性的外源核酸分子，使酵母细胞对低pH环境变得更耐受。例如，可给予酵母细胞一种在细胞外质子浓度高时可有效维持低的细胞质质子浓度的ATP酶。可通过Morsomme等描述的方法改造这类多肽(EMBOJ.15：5513-5526(1996))。
必须注意，这里描述的任一种重组酵母细胞可含有所描述的基因操作的任意结合。例如，具有克拉布特里阳性表现型的酵母细胞可含有两种外源核酸分子，一种编码具有柠檬酸裂解酶活性的多肽，另一种编码具有导致有机产物形成的酶活性的多肽。
3.合适的生物
多种生物适合根据本发明的使用。除了克拉布特里阴性和克拉布特里阳性酵母微生物如酿酒酵母属，包括酿酒酵母和S.uvarum，克鲁维酵母属，包括耐热克鲁维酵母、产乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母、毕赤酵母属、 汉逊酵母包括多形汉逊酵母、白色假丝酵母、皮状丝孢酵母、Yamadazyma，包括Y.stipitis或Torulaspora pretoriensis，来自广泛微生物种类的生物也可用作乳酸生产的宿主菌。例如，乳酸的天然生产者如米根霉可被基因修饰，从而耐酸、产量提高和生产光学纯的乳酸。曲霉属也可生产多种有机酸如柠檬酸，并且耐受低pH。已有基因修饰曲霉属生产乳酸的方法。而且，如根霉属和曲霉属的真菌生产一些酶，使它们能够将淀粉和其它碳水化合物多聚体降解成碳水化合物单体，从而用作碳源。
原核生物如大肠杆菌、可迁移发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)和芽孢杆菌属的种已经或能够被基因修饰用来乳酸生产。已经鉴定为凝结芽孢杆菌的微生物也是乳酸的天然生产者，可进一步被基因修饰以提高低pH乳酸的生产。
另外，来自古细菌家族的嗜极性生物可耐受极低的pH和高温。遗传修饰该家族的选定种类可提供乳酸生产菌株。
4.遗传方面
可使用任何方法鉴定和获得编码具有酶活性的多肽的核酸分子。例如，标准核酸测序技术和将核酸序列翻译成基于遗传密码的氨基酸序列的软件可用来测定特定核酸与已知酶多肽是否有同源序列。序列校对软件如MEGALIGN®(DNASTAR，Madison，WI，1997)可用于比较各种序列。另外，可使用普通分子克隆技术(如定点诱变)突变编码已知酶多肽的核酸分子。可能的突变包括(不限制)缺失、插入和碱基替代。而且，可用核酸和氨基酸数据库(GenBank®)鉴定编码具有酶活性的多肽的核酸序列。简言之，与具有酶活性的多肽有一些同源性的任何氨基酸序列，或与编码酶活性多肽的序列有一些同源性的任何核酸序列可用来查询GenBank®。然后可分析鉴定的多肽，以确定它们是否显示酶活性。
可使用包括PCR的普通分子克隆技术或化学核酸合成程序和技术鉴定和获得编码具有酶活性的多肽的核酸分子。PCR指与美国专利号4683195所描述的相似方式扩增目标核酸，并随后用这里描述的程序修饰的程序或技术。通常，使用目的区域末端或以外的序列信息设计与待扩增的潜在模板互补链序列相同或相似的寡核苷酸引物。使用PCR可从RNA或DNA扩增核酸序列。例如，通过PCR扩增可从总细胞RNA、总基因组DNA、cDNA以及噬菌体序列、质粒序列、病毒序列等分离一段核酸序列。当使用RNA为模板，可用反转录酶合成互补DNA链。
而且，可用核酸杂交技术鉴定和获得编码具有酶活性的多肽的核酸分子。简言之，编码已知酶多肽的任何核酸分子或其片段可作为探针通过在温和及高强度条件下杂交来鉴定相似的核酸分子。然后这种相似的核酸分子可被分离、测序和分析以确定编码多肽是否具有酶活性。
可通过DNA或RNA分析杂交来分别鉴定与探针杂交的DNA或RNA序列。探针可用放射性同位素如32P、酶、地高辛或生物素标记。待分析的DNA或RNA可分别琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转到硝酸纤维素膜、尼龙膜或其它合适的膜，并利用如Sambrook等(1989)分子克隆，第二版(冷泉港实验室，Plainview，NY.))7.39-7.52部分描述的那些本领域熟知的技术和探针杂交。典型地，探针至少长20个核苷酸。例如，相应于20个核苷酸序列的编码哺乳动物柠檬酸裂解酶的探针可用于鉴定编码具有柠檬酸裂解酶活性的的真菌多肽的核酸分子。另外，可使用比20个核苷酸长或短的探针。
可用任何方法将外源核酸分子导入细胞。实际上许多将核酸导入酵母细胞的方法为本领域技术人员所熟知。例如，转化、电穿孔、接合和原生质体融合都是将核酸导入酵母细胞的普通方法。见，如，Ito等，J.Bacterol.153：163-168(1983)；Durrens等，Curr.Genet.18：7-12(1990)；和Becker和Guarente，酶学方法(Methods in Enzymology)194：182-187(1991)。
必须注意，本发明的酵母细胞所含有的外源核酸分子可在该细胞内以任何形式存在。例如，外源核酸分子可以整合到细胞基因组或以附加体状态存在。换句话说，本发明的细胞可以被稳定或瞬时转化。另外，这里描述的酵母细胞可含有一个拷贝或多个拷贝(如5、10、20、35、50、75、100或150拷贝)的上述特定外源核酸分子。
从外源核酸分子表达氨基酸序列的方法为本领域技术人员所熟知。这些方法包括(不限制)，构建核酸使调控元件启动编码多肽的核酸序列的表达。典型地，调控元件为在转录水平上调控其它DNA序列表达的DNA序列。因此，调控元件包括(不限制)启动子、增强子等。而且，在酵母中从外源核酸分子表达多肽的方法为本领域技术人员所熟知。例如，能够在克鲁维酵母中表达外源多肽的核酸结构为熟知的。见，如，美国专利号4859596和4943529。
如这里所描述的，本发明范围内的酵母细胞含有外源核酸分子，例如，其编码多肽具有导致形成有机产物的酶活性。鉴定含有外源核酸分子的细胞的方法为本领域技术人员所熟知。这些方法包括(不限制)PCR和核酸杂交技术如RNA和DNA分析。在某些情况下，如果细胞含有特定核酸，可使用免疫组化和生化技术通过检测由该特定核酸分子编码的酶多肽的表达来测定。例如，所编码酶的特异性抗体可用于测定特定酵母细胞是否含有该编码酶。而且，如果细胞含有编码酶多肽的特定核酸分子，可使用生化技术通过检测作为酶多肽表达结果而产生的有机产物来测定。例如，在将其编码多肽具有乳酸脱氢酶活性的外源核酸分子导入正常不表达这种多肽的酵母细胞之后，检测乳酸可表明酵母细胞不仅含有导入的外源核酸分子，而且从该导入的外源核酸分子表达编码的酶多肽。检测特定酶活性或特定有机产物存在的方法为本领域技术人员所熟知。例如，可用其它描述的方法测定乳酸的存在。见，Witte等，J.BasicMicrobiol.29：707-716(1989)。
本发明也提供了含有重组序列和选定序列的核酸结构。术语“重组序列”在此是指相应于细胞内存在的基因组序列的任何核酸序列。这里描述的重组序列可用于检查产生敲除生物的重组事件。换句话说，重组序列可用于特殊破坏含有编码特定酶的核酸序列的座位。术语“选定序列”这里用来包括所有核酸序列。典型地，选定序列编码导致细胞内有机产物形成的酶的多肽。因此，本发明的核酸结构可用于在一个步骤中敲除内源酶活性并添加外源酶活性。在绝大多数情况下，选定序列位于重组序列内，使选定序列两侧为重组序列。
5.有机产物的生产和培养方法
本发明提供了使用这里提供的任一种酵母细胞或其它微生物细胞生产有机产物的方法。这些方法包括提供酵母细胞和用培养基培养提供的酵母细胞，从而生产有机产物(如甘油、丙烯酸、木糖、阿拉伯糖、乳酸、柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酰辅酶A、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和草酰乙酸)。一般而言，可将培养基和/或培养条件分成两类：那些促进细胞呼吸和/或生产生物量的，以及那些降低细胞呼吸的。典型地，促进细胞呼吸的培养基和/或培养条件用于以下情况：当需要快速生长和所要生产的有机产物在没有细胞呼吸就不能生产时。这类有机产物包括(不限制)三羧酸循环产物。另一方面，降低细胞呼吸的培养基和/或培养条件用于以下情况：不需要或不希望快速生长和所要生产的有机产物在没有细胞呼吸也能够生产时。这类有机产物包括(不限制)乳酸、丙烯酸和木糖。在此，短语“促进细胞呼吸”或“促进生物量生产”当与培养条件有关时，意思是维持细胞培养条件从而使培养基中的碳源主要通过氧化呼吸来分解代谢或分解代谢主要用来生产生物量。在此，“生物量”指生物体干重。在此，短语“分解代谢主要用来生产生物量”意思是指每消耗1克碳源(以碳水化合物的形式)生产大约0.3克生物量(如至少大约0.4、0.45、0.5或0.6克生物量)。通常，每克碳源生产大约0.3-0.6克生物量。测定培养物中生物量的量的方法是已知的，包括例如Postma等“在酿酒酵母葡萄糖限制的恒化器培养中的克拉布特里效应的酶学分析”Appl.Environ.Mocrobiol.，53，468-477(1989)和Kiers等“在产乳酸克鲁维酵母CBS2359分批和恒化器培养中酒精发酵的调节”，酵母(Yeast)，14，459-469(1998)中描述的方法。测定消耗的碳源量的方法是已知的，包括例如HPLC方法学。
应当注意，碳源利用的效率取决于碳源和生物体。因此，当使用包括碳水化合物以外的碳源的复合生长培养基时，每克碳源生产的生物量的量仅指消耗每克碳水化合物生产的生物量的量。
通常，含有细胞呼吸抑制剂(如抗霉素A和叠氮化物)的培养基可降低细胞呼吸，而缺乏这些抑制剂可促进细胞呼吸。同样，厌氧培养条件可降低细胞呼吸，而需氧培养条件可促进细胞呼吸。需氧条件是指引入氧或天然存在氧，并且氧作为呼吸途径的底物的任何条件。通常，术语“需氧”指培养基维持在空气流速至少为0.1VVM(空气体积/液体体积/分钟)(如大于0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5和2.0VVM)的培养条件。如果使用空气以外的气体，那么名义上的VVM将根据该气体中的氧含量校准成等量的空气。或者，“需氧”可定义为溶解氧含量相对于大气压下饱和空气中的含量至少为2％的培养基(如至少5、10、20、30、40、50、60、75和80％)。
厌氧条件为呼吸途径中故意或天然基本无氧，导致例如还原产物如乙醇生产的任何条件。通常，培养基中溶解氧含量(DO)少于大约2.0％(如大约1.5、1.0或0.5％，或大约等于0％)的条件被认为是厌氧条件。同样，VVM(空气体积/液体体积/分钟)少于大约0.1(如少于大约0.05或约等于0)的条件被认为是厌氧条件。典型地，在此VVM中使用的术语“空气”指存在于大气中的空气。可影响细胞呼吸的其它培养条件包括(不限制)，pH、温度和存在特定的碳源(如葡萄糖)。必须注意，在一种酵母中促进细胞呼吸的一些培养基和/或培养条件可在另一种属中降低细胞呼吸。例如，培养基中葡萄糖的存在降低克拉布特里阳性表现型酵母细胞中的细胞呼吸，而对克拉布特里阴性表现型酵母细胞中的细胞呼吸很少或无影响。
在商业化生产中直接操纵培养条件可能是获得最佳水平目标有机产物(如这里所描述的)的重要一步。典型地，本发明范围内的酵母细胞在促进细胞呼吸从而生产显著细胞密度的培养条件下生长。例如，酵母细胞可放入培养容器中，并给予充足的葡萄糖和氧。典型地，在促进细胞呼吸的条件下，这里提供的微生物的倍增时间不到10小时(如少于8、5或3小时)。一旦细胞达到显著的细胞密度，可将培养条件转换成降低细胞呼吸的条件，从而生产不需要细胞呼吸的有机产物。例如，可将酵母细胞转到一个培养容器中，并给予充足的葡萄糖，但不给氧。在这种情况下，直接操纵培养条件使它们从需氧转到厌氧从而可生产最佳水平的目标有机产物。或者，在某些情况下，细胞可以只在促进细胞呼吸的条件下培养从而生产需要细胞呼吸的有机产物。注意，在生产容器中的细胞量典型大于2g/L(如大于4、6或8g/L)。
在培养过程中，温度可大于约35℃(如大于约36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃)。另外，培养基可以是液体的。培养基典型含有碳源。通常，碳源包括含有碳水化合物的原材料。典型地，营养培养基还含有氮源。优选的氮源包括有机和无机含氮化合物的组合。
在一种操作方式中，可能希望大的发酵容器中填入包括足够用于生物量生产和目标产物生产所需的所有营养和所有碳水化合物。可在先启动生物量生产的条件下操作容器，例如，通过先提供需氧条件，然后转向厌氧条件以生产目标产物。
在一种改变的操作方式中，用较小的容器来生产生物量，用高水平的营养和充足的碳水化合物来生产如大约100g/l生物量。该容器中的内容物可转到一个大容器中，其中含有的第二种培养基含有较少的营养，例如，只有葡萄糖作为碳源或其它碳水化合物碳源水溶液。该容器可在厌氧条件下操纵以生产目标有机产物。由于降低的营养水平和厌氧条件使生物量生长降低。
在一个优选的实施方案中，为了简化目标产物的回收，营养培养基只维持所需的物质。相对于需要在厌氧条件下生长所需的培养基而言，使用需氧条件生长可使用简化的培养基。这里描述的许多酵母可在需氧条件下，在仅由糖、一种无机氮源、微量的矿物质和一些维生素组成的培养基中生长。
在作为发酵或其它工艺结果的有机产物加入到培养基中之前，培养基的pH值通常为5.0-7.0。然而，当微生物将有机产物如有机酸分泌到培养基中，培养基的pH值将降低。术语“有机pH”在此是指归因于培养基中存在的有机化合物(如碳水化合物和乳酸)的培养基pH。术语“无机pH”在此是指归因于无机化合物如HCl和H2SO4的pH。培养基可具有小于大约3.0的有机pH值(如小于大约2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6或1.5)。或小于大约3.0的无机pH值(如小于大约2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6或1.5)。在培养程序中可使用任意碳源。例如，可使用含有戊糖碳的培养基(如核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖)。另外，可使用含有谷物纤维水解物的培养基。谷物纤维水解物的pH值可为2.0-6.5。典型地，谷物水解物含有葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，大约40克/L木糖和大约20克/L阿拉伯糖。
对于大规模生产工艺，可使用下列方法。首先，用特定微生物接种含有带有例如己糖和/或戊糖碳的合适培养基的大罐(如50-、100-、200-或更大加仑罐)。接种后，可操纵培养条件使碳源主要用来生产生物量。例如，可操纵培养条件使其pH值约为7.0，温度约为35℃，溶解氧含量可使整个罐产生需氧环境。注意目标有机产物可在生物量生产期间生产。一旦达到足够的生物量，含有微生物的培养液可转到第二只罐中。第二只罐可以是任意大小。例如，第二只罐可大可小或与第一只罐的大小相同。典型地，第二只罐比第一只大，从而可向来自第一只罐的培养液中加入额外的培养基。另外，第二只罐中的培养基可与第一只罐中使用的相同或不同。例如，第一只罐可含有带有木糖和阿拉伯糖的培养基，而第二只罐含有带有葡萄糖的培养基。
一旦转移，可操纵第二只罐中的培养条件使碳源主要用来生产有机产物，其中“有机产物”包括(含在其它物质中)，来源于丙酮酸的产物和二氧化碳(CO2)，但不包括生物量(即细胞干重)。在此，短语“主要生产“选定的有机产物”或“选定的来源于丙酮酸的产物”当涉及培养条件时，是指典型地通过发酵工艺(尽管不是必要的)分解代谢培养基中的碳源，使每消耗1克碳源可形成至少0.5克有机产物(如至少0.6、0.75或0.8克有机产物)。测定产生有机产物和/或消耗碳源的量的方法为已知的，包括例如HPLC。
如前面描述的，碳源利用的效率可根据底物和微生物而变化。因此，当使用包括碳水化合物以外(如氨基酸)的碳源的合成生长培养基时，每消耗1克碳源产生的有机产物或来源于丙酮酸的有机产物的量仅指每消耗1克碳水化合物碳源产生的有机产物或来源于丙酮酸的有机产物的量。优选地，在这一阶段，每克碳源产生不超过0.3克生物量(如不超过0.2、0.1或0.05克生物量)。
例如，可操纵培养基使其含有可在整个罐中产生厌氧条件的溶解氧含量，或使其含有细胞呼吸抑制剂。另外，可操纵培养基使其维持特定pH值(如酸性、中性或碱性pH值)。或者，可周期性调整培养物pH而不维持特定pH值。典型地，当生产有机酸时，维持培养基的pH值高于至少大约1.5(如至少大约2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5或7.0)。而且，当微生物分解代谢提供的碳源时，罐中的温度会升高。因此，可操纵培养基使其维持特定温度。或者，可周期性调整培养基的温度而不维持特定温度。典型地，当使用热敏感微生物时维持温度低于大约35℃(如低于大约34、33、32、31或30℃)，而当使用热不敏感微生物时维持温度低于大约45℃(如低于大约44、43、42、41、40、39、38、37、36或35℃)。注意在有机产物生产期间可生产生物量。另外，第二只罐中的培养条件可从那些促进产物生产的条件换成促进生物量生产的那些条件，反之亦然，一次或多次。例如，第二只罐中的培养条件绝大部分时间为厌氧，短时给氧使周期性存在需氧条件。
在另一种方法中，可改变厌氧培养条件以增加培养微生物的代谢能量，例如，通过添加终端电子受体。在此，术语“代谢能量”指微生物从能源(如碳源)产生的能量(就ATP而言)。在某些条件下，微生物从代谢碳源获得的代谢能量比在不同条件下从相同碳源获得的能量要大。
活细胞是高度有序的，并且为了生存和生长必须创造秩序。为了维持生物体内的秩序，在生物体内任一时刻都发生着数以千计的不同化学反应。例如，细胞需要能量来进行生物合成反应如DNA、RNA和蛋白质聚合反应，以及形成代谢产物。细胞也需要能量将底物送到细胞内，保持细胞内的代谢物，维持合适的膨压和内部pH以及游动性。
因为不能创造和破坏能量，细胞需要从环境中输入能量以维持秩序。通常能量以电磁辐射和化学能的形式从环境中供应。细胞通过两种普通生化机制中的一种利用从环境中获得的能量：底物水平磷酸化和电子转移。
通常，在厌氧条件下，ATP(能量“细胞货币”)是由底物水平磷酸化产生的。在底物水平磷酸化中，能量由化学键释放并主要以ATP的形式贮存。
底物水平形成的实例是葡萄糖通过糖酵解转化成丙酮酸：
然后丙酮酸可转化成乳酸：
上述转化产生的净能量等于2ATP。
丙酮酸可进一步进入三羧酸(TCA)循环并产生额外的能量和氢原子：
葡萄糖呼吸净反应为：
因此，通过底物水平磷酸化，葡萄糖生成CO2的完全呼吸将提供等于4ATP和24个氢原子的净能量。
在“电子转移”中，组成“电子转移链”成员的化合物的氧化还原势使每个成员可被前一成员的还原形式所还原。因此，还原能如电子可通过载体分子链流向终端电子受体如氧(O2)、硝酸根(NO3)和延胡索酸。将终端电子受体如氧、硝酸根或延胡索酸添加到培养基中可提供给微生物增加的代谢能量(如相同碳源量增加的ATP产生)。氧是最优选的终端电子受体。
例如，如果用氧作为终端电子受体，可通过电子转移链处理氢并提供给细胞额外的能量：每个氢原子1.5ATP，每个氧原子3ATP。通常，可通过检测消耗的氧原子量对消耗的葡萄糖量的比例来测定代谢能量的量。表1表示，当在生产过程中加入氧(作为产物产量的函数)后预期的能量产量提高的最大和最小值(ATP摩尔数/摩尔葡萄糖)，由于丙酮酸通过TCA循环(和，最后通过呼吸)丢失导致氧的降低。假定P/O比值为3计算最大提高值的％数，而假定P/O比值为0.5计算最小提高值的％数。表2显示每消耗1摩尔葡萄糖而消耗氧的最大估计量。氧的加入可促进使碳用于生物合成而留下少量碳用于呼吸(因此，氧利用)的最小限度生长。表1.产物产量(g-乳酸/g-葡萄糖)  能量产生提高的最大值％  能量产生提高的最小值％
1.0                             0％                     0％
0.9                           160％                    35％
0.8                           320％                    70％
0.7                           480％                   105％
0.6                           640％                   140％
0.5                           800％                   175％
0.4                           960％                   210％
0.3                          1120％                   245％
0.2                          1280％                   280％
0.1                          1440％                   315％
0.0                          1600％                   350％表2.
产物产量(g-乳酸/g-葡萄糖)          摩尔氧/摩尔葡萄糖
             1.0                       0.0
             0.9                       0.6
             0.8                       1.1
             0.7                       1.6
             0.6                       2.1
             0.5                       2.6
             0.4                       3.1
             0.3                       3.6
             0.2                       4.1
             0.1                       4.6
             0.0                       5.1
因此，为了提高细胞培养物中微生物的代谢能量，可加入氧作为终端电子受体。尽管来自葡萄糖的乳酸最大摩尔产量为2摩尔乳酸/摩尔葡萄糖，来自葡萄糖的ATP摩尔产量为2摩尔ATP/摩尔葡萄糖，加入氧作为终端电子受体可使一些丙酮酸进入三羧酸(TCA)循环，在那里它转化成CO2和能量。因此，供应终端电子受体“增加了微生物的代谢能量”。
丙酮酸转向TCA循环将会降低生产的其它来源于丙酮酸的产物(如乳酸)的量。例如，产量降低10％可导致为生物体产生多2.6倍的代谢能量，产量降低20％可导致为生物体产生多4.2倍的代谢能量，产量降低50％可导致为生物体产生多9倍的代谢能量。
可以预料在工艺晚期，当存在高水平的代谢产物如乳酸时，细胞可能需要更多的代谢能量以维持功能。
因此，可能希望使微生物暴露在厌氧培养基中，短时给予溶解氧。优选地，“短时给予溶解氧”导致培养基中溶解氧浓度不超过0.5％，优选大约0.1-0.5％。或者，在厌氧发酵过程中微生物的生长速率或细胞维持数可通过添加其它终端电子受体如柠檬酸或延胡索酸而增加。加入氧的水平刚好足够用于增加微生物的代谢能量，同时维持生产率在预期水平。必须小心避免过多的产量丢失。该技术可有助于消耗残余的糖，并因此进一步简化回收工艺。
6.有机产物的纯化方法
一旦生产，可用任何方法分离目标产物。例如，普通分离技术可用于从培养液中去除生物量，普通提取技术(如抽提、蒸馏和离子交换程序)可用于从无微生物培养液中获得有机产物。见，如，美国专利号4275234；美国专利号5510526；美国专利号5831122；美国专利号5641406；和国际专利申请号WO93/00440。另外，可在生产的同时分离目标有机产物，或在产物生产停止后从培养液中分离目标有机产物。必须注意，可操纵第二个罐中的培养条件使分离工艺得到改良。例如，可操纵第二罐中的pH和温度使目标有机产物从溶液中沉淀出来，或为更适于分离的形式。具体地说，当培养液pH低于有机酸的pKa值时，有机酸可从溶液中沉淀出来。例如，当生产谷氨酸时，培养条件可使pH低于谷氨酸的pKa值2.19。因此，控制培养液的pH、温度和内容物可有利于有机产物的分离。另外，可选择特定基因操作的酵母和/或可操纵特殊培养条件使培养液中的任何副产物不干扰目标有机产物的回收。
可以预料这里描述的方法和材料可适用于任何类型的培养工艺，包括(不限制)通常称为“连续发酵”和“分批发酵”的工艺。另外，在一种生产工艺中使用的微生物可以回收并再使用多次，用于生产目标有机产物。而且，可使用任意碳源。例如阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、iodose、半乳糖、塔罗糖、蜜二糖、蔗糖、果糖、蜜三糖、水苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖，淀粉如谷物淀粉和小麦淀粉，水解物如谷物纤维水解物和其它纤维素水解物可用作碳源以生产生物量或目标有机产物。而且，可使用任何培养基。例如，标准培养基(如酵母基本培养基和YP培养基(酵母抽提物10g/L、蛋白胨20g/L))，也可使用培养基如谷物浸液。
本发明的一个重要优势为，优选的微生物特别是在需氧条件下生长时，可利用基本培养基。厌氧生产典型不需要额外的营养，所以可使用多种分离技术从相对干净的发酵液中分离终产物。液-液萃取是从发酵液中分离有机酸的常用技术，并导致相当高的纯度。本发明相信更简单、更经济、能量消耗更少的系统也可能是有用的。
在一个实施方案中，本发明在一种训练(train)-类型工艺中使用具有克拉布特里阴性表现型的基因修饰酵母。该工艺在达到临界细胞密度之后并且希望大大增加目标有机产物的比生产率时，在代谢途径中诱导“开关”。诱导代谢途径开关的典型方法是将生物量从一个高度通气的容器中转移到基本厌氧的容器中，引起氧饥饿。注意，普通碳水化合物(如葡萄糖或木糖)可用作生长期和生产期的碳源。使用具有克拉布特里阴性表现型的基因修饰酵母对该实施方案的成功可能是关键的。另外，目标有机产物的比生产率对该实施方案的成功可能是关键的。术语“比生产率”在此反映了生产的产物量并表示为每克生物量(干重)每小时生产的有机产物克数，即g/(g*小时)。典型地，有机产物如乳酸和丙烯酸的比生产率大于大约0.1g/(g*小时)，例如，大于0.2g/(g*小时)或大于0.5g/(g*小时)。通过提供如这里描述的高比生产率，可由基本厌氧条件下的发酵途径获得细胞维持所需的能量，而不依赖于通气经呼吸途径产生大量的能量。注意，基本厌氧的容器以小于大约0.1VVM的速度通气。在某些生产情况下不用通气。另外，该实施方案中的产量(即g有机产物/g消耗的碳源)典型大于70wt％，并且在不添加碳源如乙醇和乙酸时生产。在某些情况下，为了达到产生细胞维持所需能量需要的比生产率，除了提供生产目标产物必需的酶之外，可能必须增强从葡萄糖到丙酮酸的途径。
在另一个实施方案中，可设计训练类型工艺使只有高度通气的生长容器才具备灭菌性能。厌氧生产容器典型地在高于大约35℃(如高于大约36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃)的温度下操作。随着产物生产过程中pH的降低，很少的野生型酵母能够在这种温度下存活并与基因修饰的酵母竞争，特别是因为它们没有能够产生细胞维持能量的增强的发酵途径。另外，可改造酵母使其含有如这里所描述的“杀伤质粒”，它可防止其它种属酵母的存活。
本发明也提供了培养酵母细胞的各种方法。例如，具有克拉布特里阴性表现型的酵母细胞可培养在有机pH值小于大约3.0或含有谷物纤维水解物的培养基中。培养酵母细胞的其它方法包括(不限制)，在温度高于大约35℃，用无机pH值小于大约3.0或含有戊糖碳或谷物水解物的培养基培养具有克拉布特里阴性表现型的酵母细胞。
而且，本发明提供了制备有机产物的工艺。该工艺包括在培养条件下培养微生物，和改变培养条件以促进有机产物的生产。在该工艺中，微生物具有降低的丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶、醛脱氢酶、和/或乙酰辅酶A合成酶活性，并且在缺乏乙醇和乙酸时的生长速率为不具有降低的丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶、醛脱氢酶、和/或乙酰辅酶A合成酶活性的相应微生物生长速率的至少30％(如大约35、40、50、75、100、150、200％或更多)。典型地，促进细胞呼吸的培养条件用于需要快速生长的情形，或没有细胞呼吸所要生产的有机产物就不能生产的情形，而降低细胞呼吸的培养条件用于不需要快速生长的情形，或没有细胞呼吸所要生产的有机产物可以生产的情形。
在下列实施例中将进一步描述本发明，它并不限制权利要求中描述的本发明的范围。
                        实施例
实施例1-重组质粒pHES/pSEH
用限制性内切酶HindIII消化0.5μg Chien等描述的质粒pGAD424(Proc.Nat’l Acad.Sci.，88(21)：9578-9582(1991))。用使用TBE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳分离消化混合物。然后如Sambrook等(分子克隆第二版，冷泉港实验室，Plainview，NY(1989))所描述的从凝胶上纯化5.9kbp的片段。设计了一对互补的92bp带有多限制酶切位点的合成寡聚物。第一个命名为fwd hes oligo，序列如下：5’-CCCAAGCTTGAATTCCCCGGGGGATCCCTGCAGGGTACCACGCGTAGATCTACTAGTGCGGCCGCCTGCAGTCTAGAGGGCCCAAGCTTGGG-3’(SEQ ID NO：1)。第二个命名为comp hes oligo，序列如下：5’-CCAAGCTTGGGCCCTCTAGACTCGAGGCGGCCGCACTAGTAGATCTACGCGTGGTACCCTGCAGGGATCCCCCGGGGAATTCAAGCTTGGG-3’(SEQ ID NO：2)。500纳摩尔的两个互补寡聚物煮沸10分钟并逐渐冷至室温使彼此退火。用HindIII消化92bp的双链DNA并连接到HindIII消化的5.9kbppGAD424上。连接物通过如Sambrook等(分子克隆)第二版，冷泉港实验室，Plainview，NY(1989))所描述的电穿孔技术转化大肠杆菌DH10B(electromax cell，Life Technologies，Rockville，MD)。重组大肠杆菌涂布Luria-Bertani培养基平板，用100μg/ml氨苄青霉素选择含有质粒的细胞。筛选来自氨苄青霉素抗性大肠杆菌菌落的质粒DNA以获得质粒pHES和pSEH(图1和2)。两个质粒中乙醇脱氢酶-ADH1启动子相关的合成寡聚物方向不同。
实施例2-PCR扩增编码来自瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的乳酸脱氢酶的核酸
用PUREGENE®基因组DNA分离试剂盒(Gentra systems，Minneapolis，MN)从瑞士乳杆菌(ATCC 10797)和乳酸片球菌(ATCC25741)的过夜培养物中分离基因组DNA。设计PCR引物从瑞士乳杆菌(lh-ldh oligos)和乳酸片球菌(pa-ldh oligos)基因组DNA中分离乳酸脱氢酶编码核酸。这些引物是根据Genbank数据库中已有的乳酸脱氢酶基因序列来设计的，具有以下序列：5’lh-ldh，5’-CCGGGATCCATGGCAAGAGAGGAAAAACCT C-3’(SEQ ID NO：3)；3’lh-ldh，5’-CCAAGATCTTTATTGACGAACC  TTAACGCCAG-3’(SEQ ID NO：4)；5’pa-ldh，5’-CCGGGATCCATGT CTAATATTCAAAATCATCAAAAAG-3’(SEQ ID NO：5)；和3’pa-ldh，5’-CCAAGATCTTTATTTGTCTTGTTTTTCAGCAAG-3’(SEQ ID NO：6)。使用获自Sci-ed software(Durham，NC)的引物设计软件对引物进行优化。1微摩尔基因组DNA和100纳摩尔引物一起使用。如Sambrook等(分子克隆，第二版，冷泉港实验室，Plainview，NY(1989))所描述的，用Pfu DNA聚合酶(New England Biolabs)进行PCR扩增乳酸脱氢酶(LDH)核酸。
用相似策略分离来自下列来源的基因组DNA的L-乳酸脱氢酶编码核酸：微生物如芽孢杆菌属例如巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)(ATCC6458)或Rhizopus oryzae(ATCC 76275)，或任何其它产乳酸生物(包括微生物如真菌和细菌以及多细胞生物如哺乳动物)，或来自产乳酸生物的组织。用PUREGENE®基因组DNA分离试剂盒(Gentra systems，Minneapolis，MN)从这些生物的生长培养物中分离基因组DNA。根据Genbank中已有的这些种属的LDH基因序列设计合适的PCR引物来分离乳酸脱氢酶编码核酸。通常，1微摩尔基因组DNA和100纳摩尔适当的引物一起使用。使用如Sambrook等(分子克隆，第二版，冷泉港实验室，Plainview，NY(1989))所描述的PCR技术，用Pfu DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)或其它合适的DNA聚合酶从各自的基因组DNA扩增乳酸脱氢酶(LDH)核酸。
或者，使用下面任一种方法从耐热克鲁维酵母ATCC 52709、Trichoderma Reesei ATCC 13631、Torulaspora pretoriensis ATCC 36245或其它任何生产乳酸脱氢酶的生物中分离乳酸脱氢酶编码核酸。
1)使用标准技术(Sambrook等(1989)分子克隆：实验手册(MolecularCloning：a laboratory manual)第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY)将这些生物中任一个的基因组cDNA文库克隆到标准大肠杆菌表达载体如pUC19。用该文库转化大肠杆菌突变(ldh-pfl-)菌株NZN111(Bunch等，(1997)“编码大肠杆菌发酵的乳酸脱氢酶的ldhA基因”，分子生物学(Microbiology)，143：187-95)，并且细胞在厌氧条件下在补加了酪蛋白氨基酸的M9培养基中生长。在这些条件下生长的任何大肠杆菌或者编码乳酸脱氢酶或者为ldh或pfl的回复突变株。使用能够区分(L)-LDH和(D)-LDH的乳酸特异性软琼脂覆盖(LASSO)比色分析法(Witte等，J.BasicMicrobiol.29：707-716(1989))筛选LDH活性阳性克隆(在厌氧生长条件下形成的菌落)。然后从怀疑表达L-乳酸脱氢酶的阳性克隆中分离质粒DNA并测序。
2)耐热克鲁维酵母ATCC 52709、T.reeseiATCC 13631和TorulasporapretoriensisATCC 36245都是在厌氧条件下培养时产生L-乳酸的真核细胞(Witte等，J.Basic Microbiol.29：707-716(1989))。因此，根据该方法，至少其中一种菌株生长在厌氧条件下以诱导乳酸脱氢酶活性。然后用标准方法获得无细胞提取物，并通过已知的蛋白纯化策略分离乳酸脱氢酶。纯化乳酸脱氢酶的方法是已知的(Kelly等，(1978)“细菌乳酸脱氢酶亲和层析，”Biochem J，171(3)：543-7)。蛋白纯化后它被部分裂解并测序以确定氨基酸序列。然后用氨基酸序列设计简并性引物，用来从基因组DNA中分离编码乳酸脱氢酶的基因。
与来自细菌来源如杆菌属或乳杆菌属的LDH相比，真核LDH如从耐热克鲁维酵母、Trichoderma Reesei或Torulaspora pretoriensis分离的LDH在酵母马克斯克鲁维酵母中作用更好。
3)利用Genbank中已知的真核乳酸脱氢酶基因序列设计简并性引物从耐热克鲁维酵母ATCC 52709、T.Reesei ATCC 13631或Torulasporapretoriensis ATCC 36245基因组DNA中分离乳酸脱氢酶基因。LDH基因序列中保守的NAD+结合位点和丙酮酸结合位点被用来设计简并性引物。1微摩尔基因组DNA和100纳摩尔引物一起使用。根据已知的如Sambrook等(分子克隆，第二版，冷泉港实验室，Plainview，NY(1989))所描述的PCR方法，用Pfu DNA聚合酶(New England Biolabs)或其它任何合适的DNA聚合酶扩增L+乳酸脱氢酶(LDH)核酸的片段。
实施例3-将瑞士乳杆菌和乳酸片球菌克隆到pCRII载体
用获自Invitrogen(Carlsbad，CA)的TA克隆试剂盒将PCR扩增的LDH DNA产物与pCRII载体连接(图3和4)。然后使用Sambrook等(分子克隆，第二版，冷泉港实验室，Plainview，NY(1989))描述的方法，用连接混合物转化大肠杆菌DH10B。该试剂盒供应的pCRII载体可根据厂商说明快速克隆PCR产物。图4描述了带有来自瑞士乳杆菌和乳酸片球菌的LDH基因的pCRII载体。
实施例4-在pHES载体上带有瑞士乳杆菌和乳酸片球菌LDH基因的重组质粒pLh ldh-HES/pPa ldh-HES
用适当的限制性内切酶消化含有来自瑞士乳杆菌和乳酸片球菌的LDH基因的pCRII载体。用相同限制性内切酶类似消化载体pHES。然后如Sambrook等(分子克隆，第二版，冷泉港实验室，Plainview，NY(1989))所描述的，用T4 DNA连接酶连接来自pCRII载体含有LDH的1kb插入片段和6.0kbp的pHES载体。连接混合物用来转化大肠杆菌DH10B(electromax cell，Life Technologies，Rockville，MD)，并且筛选重组克隆的氨苄青霉素抗性。分析从重组克隆分离的DNA以证实pLhldh-HES和pPa ldh-HES载体(图5)。三种载体含有在pHES载体上受酵母乙醇脱氢酶启动子(ADH1)控制的瑞士乳杆菌和乳酸片球菌的LDH编码基因。
实施例5-克隆芽孢杆菌属、米根霉、耐热克鲁维酵母、TrichodermaReesei或Torulaspora pretoriensis的LDH基因，用于酵母PDC1基因启动子调控的表达
尽管可以利用在米根霉、耐热克鲁维酵母、Trichoderma reesei或Torulaspora pretoriensis中发现的乳酸脱氢酶启动子调控克隆到马克斯克鲁维酵母中的乳酸脱氢酶基因的表达，酿酒酵母PDC1启动子也可用来调控分离的乳酸脱氢酶基因的表达。酿酒酵母糖酵解启动子已被成功用于表达克鲁维酵母菌株中的基因(Gellissen和Hollenberg，(1997)“酵母在基因表达研究中的应用：酿酒酵母、多形汉逊酵母和产乳酸克鲁维酵母的比较--综述，”基因(Gene)，190(1)：87-97)。
因此，利用Genebank提供的酿酒酵母基因组序列设计合适的引物，从而获得来自酿酒酵母的PDC1启动子。用PCR技术扩增PDC1基因和1Kb围绕PDC1基因的区域。产生的4Kb DNA片段含有调控PDC1基因表达的启动子和终止子。在调控PDC1基因表达的启动子和终止子之间有多克隆限制性酶切位点，从而可插入多种受PDC1启动子和终止子调控的LDH基因。4Kb DNA片段可插入一个合适的载体如基于pUC19的酿酒酵母或大肠杆菌穿梭载体。然后将LDH基因导入载体中受启动子和终止子调控的一个多克隆位点，使乳酸脱氢酶基因的表达受PDC1启动子和终止子的调控。(图14)。或者，其它酵母糖酵解启动子如那些调控酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶或磷酸-甘油激酶基因表达的启动子同样可用于在马克斯克鲁维酵母中的克隆LDH基因的表达。
实施例6-用于破坏丙酮酸脱羧酶基因的同源DNA线性片段的扩增
设计了一个82bp的寡聚引物(5’kmPDC1Ko)，使它与来自马克斯克鲁维酵母的丙酮酸脱羧酶(PDC)的5’端有51bp相同，与来自pHES载体的ADH1启动子的5’端有30bp相同。5’kmPDC1Ko序列如下：5’-TAAACAGTACAATCGCAAAGAAAAGCTCCACACCCAAACCAAATAATTGCAATGCAACTTCTTTTCTTTTTTTTTCTTTTCT-3’(SEQ ID NO：7)。来自酵母(马克斯克鲁维酵母或Y.stipitis或多形汉逊酵母)的PDC基因序列获自提交的Genbank序列。同样设计了一个79bp的反向寡聚体(3’kmPDC1Ko)，使它与PDC基因的3’端有54bp相同，与ADH1终止子的3’端有22bp相同。3’kmPDC1Ko的序列如下：5’-TTATAAAATCATTAAAATCCAAAATCGTAATTTATCTCTTTATCCTCTCCCTCTCTACATGCCGGTAGAGGTGTGGTCA-3’(SEQ ID NO：8)。设计引物从pLhldh-HES和pPaldh-HES质粒扩增线性DNA片段，这样该片段含有完整乳酸脱氢酶基因和ADH1启动子和终止子(图6)。PCR扩增的产物也含有与来自马克斯克鲁维酵母PDC1、Yamadazyma stipitisPDC1和PDC2、和多形汉逊酵母PDC1和PDC2的序列同源的末端。扩增反应使用Pfu DNA聚合酶(New England Biolabs；Beverly，MA)。在反应中使用100ng pLhldh-HES和pPaldh-HES以及5单位聚合酶和100纳摩尔寡聚体。该反应根据Sambrook等(分子克隆，第二版，冷泉港实验室，Plainview，NY(1989))描述的方法进行。图6描述了带有所描述同源序列的最终线性产物。
制备了一种替代结构以提高获得pdc阴性菌株马克斯克鲁维酵母的可能性。为了制备这些结构，使用PCR和基因组步移技术(Clonetech)分离了围绕马克斯克鲁维酵母1.7kbp PDC1基因的5.5kbp的片段(图6b)。然后用标准方法将5.5kbp片段克隆到pCRII TA克隆载体(Invitrogen)。通过限制性内切酶消化(Sambrook)从马克斯克鲁维酵母5.5kbp片段上切下靠近PDC1 1.7kbp编码区中间约370bp的部分。切下的片段序列如下：CCGGTTCTTTCTCTTACTCTTACAAGACCAAGAACATTGTCGAATTCCACTCCGACTACATCAAGGTCAGAAACGCCACTTTCCCAGGTGTCCAAATGAAGTTCGTCTTGCAAAAGTTGTTGACCAAGGTCAAGGATGCTGCTAAGGGTTACAAGCCAGTTCCAGTTCCTCACGCTCCAAGAGACAACAAGCCAGTTGCTGACTCTACTCCATTGAAGCAAGAATGGGTCTGGACTCAAGTCGGTAAGTTCCTACAAGAAGGTGATGTTGTTCTAACTGAAACCGGTACCTCCGCTTTCGGTATCAACCAAACCCACTTCCCAAATGACACCTACGGTATCTCCCAAGTCTTGTGGGGTTCCATTGGTTTCA(Sequence ID No.10).
然后用标准限制酶切技术(见SambrooK等)，从pPIC9K载体(Invitrogen)分离卡那霉素抗性基因及其启动子，并克隆到5.5kbp中去除上面鉴定的片段的位点。插入pPIC9K(Invitrogen)卡那霉素抗性基因及其启动子，这样插入区域的序列如下：GTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGG  TGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATG(Sequence ID No.9).
如图6c所示，产生的结构含有G418抗性基因，其外围绕大约5kbp的pdc区域。如图6d所示，制备了相似的DNA结构，其在pCRII载体上含有内部G418区域，外面围绕2.3kbp的马克斯克鲁维酵母PDC1。
实施例子7-使用线性DNA片段破坏内源性PDC编码序列并同时插入LDH编码序列
实施例5描述的用PCR产生的线性DNA片段用来转化马克斯克鲁维酵母、Yamadazyma stipitis或多形汉逊酵母。转化方法如Wesolowski-Louvel等所述(生物技术中的非常规酵母：产乳酸克鲁维酵母，Klaus Wolf编，Springer verlag，柏林，138-201页(1996))。简言之，5ml过夜培养物离心沉降并用电泳缓冲液洗涤(10nMTris-HCl，270nM蔗糖、1nMMgCl2，pH7.5)。然后洗涤的细胞在孵育缓冲液(酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L、25nM DTT、20nM HEPES，pH8.0)中30℃孵育30分钟。然后再次洗涤细胞并重悬于400μl孵育缓冲液中。将200ngDNA加入细胞，使用Bio-Rad Gene Pulser于1800伏、1000Ω、和25μF在0.4cm小玻璃管中对细胞进行电脉冲。
将细胞涂布在常规YPD(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15％)平板上，使菌落再生72小时以上。将每个带有菌落的平板复印到新鲜YPD平板上并孵育48小时。然后用6.5％软琼脂覆盖(0.5％琼脂溶于300mM Tris-HCl，187mM谷氨酸，pH8.3)菌落。将染色混合物(3.2ml1％琼脂，1.6ml 120mM Tris，75mM谷氨酸，pH8.3，0.4ml2mg/ml吩嗪硫酸甲酯，7单位谷丙转氨酶，和7单位L(+)-猪肌肉乳酸脱氢酶)加到覆盖的平板上。该方法与Subden等建议的方法(Canadian J.Microbiol.，28：883-886(1982))相似，并由Witte等改动(J.BasicMicrobiol.29：707-716(1989))。选择菌落，从这些菌落分离的DNA用PCR分析检验并测序从而检测破坏的丙酮酸脱羧酶基因。
在另一个实施方案中，用两种限制性内切酶(见Sambrook等)消化上面实施例6和图6c、6d描述的克隆，产生接近3微克DNA片段。该片段含有包括中间序列有卡那霉素抗性基因插入的同源PDC区域。使用已知技术如电穿孔，用该片段转化马克斯克鲁维酵母以破坏马克斯克鲁维酵母的pdc。
通常，电穿孔操作如下：a)在20ml YPAD中培养微生物过夜(～15h)；b)转移500μl培养物到微量离心管中，4K离心4min，去掉上清；c)用1ml冷EB(EB＝电穿孔缓冲液：10mM Tris-HCl，pH7.5；270mM蔗糖；1mMMgCl2)洗涤沉淀；d)重新悬浮于1ml IB(IB＝孵育缓冲液：YPD；25mMDTT； 20mM Hepes，pH8.0)；e)在Eppendorf热混合仪上800rpm、30℃振荡30min；f)离心沉降，用EB洗涤一次，重新悬浮于400μlEB；g)加入3微克DNA片段(溶于10mM Tris-Cl，pH8.5)，冰浴30min；h)转到0.4cm电穿孔杯中。Bio-Rad Gene Pulser设置：1000V，1000Ω、和50μF。脉冲后时间常数：～20msec；i)转移到3ml Morton Closure管中，30℃静置孵育1小时。加入400μl液体YPAD(YPAD：10g酵母提取物；20g蛋白胨；20g葡萄糖；100mg腺苷半硫酸盐，体积＝1L，不调pH)，在Eppendorf热混合仪上800rpm、30℃振荡1小时。加入400μl液体YPAD并恢复4-6小时；j)在微量离心管中离心沉降，4K、4min，去掉上清，重新悬浮于400μl1M山梨糖醇；k)涂布在200μg/ml G418选择平板上；和I)30℃孵育3-5天。
首先通过再次涂布300μg/ml G418筛选菌落。通过标准基因组制备(Sambrook)从再次涂布的酵母中分离基因组DNA。然后经PCR筛选1)使用合适的引物和条件(Sambrook)筛选卡那霉素片段的存在和2)使用合适的引物和PCR条件(Sambrook)筛选破坏的pdc区的缺乏。然后培养选择标记阳性和pdc破坏区阴性的菌落，并用HPLC进行生理学分析。来自这些菌株的基因组DNA进一步用DNA杂交分析。
实施例8-细胞的生长特征
1.低pH/高温
马克斯克鲁维酵母过夜培养物接种到50ml根据Kiers等(酵母，14(5)：459-469(1998))的酵母基本培养基。100g/L葡萄糖作为碳源。过夜培养物维持在40℃，并接种到也维持在40℃的培养基中。接种物的加入使培养基pH值从5.5变为2.5。在实验过程中，pH维持2.5。用YSI膜测量葡萄糖浓度，使用分光光度计测量光密度(OD)。
在72小时内利用葡萄糖，表明在这期间代谢活动发生在低pH和高温培养条件下(图7)。另外，在48-72小时内生物量轻度降低，表明细胞分解代谢比合成代谢快(图7)。
2.戊糖碳源
马克斯克鲁维酵母过夜培养物接种到三个50ml含有根据Kiers等(酵母，14(5)：459-469(1998))的酵母基本培养基的瓶中。每瓶含有一种不同碳源。第一个含有10％葡萄糖，第二个含有10％D-木糖，第三个含有10％L-阿拉伯糖。这些培养瓶在30℃孵育，并定期测量OD。
40小时后，用葡萄糖和木糖培养的酵母生物量产量接近，而用阿拉伯糖培养的酵母生物量产量较低(图8)。比较用葡萄糖和那些用木糖或阿拉伯糖培养的酵母生长显示了生长的起始滞后时间。用阿拉伯糖培养的酵母滞后时间为几个小时，而用木糖培养的酵母滞后时间显著得多(图8)。滞后时间的存在表明酵母细胞需要时间来适应木糖和阿拉伯糖碳源。推测，需要该时间来诱导合成通常不表达的多肽。
3.低pH的谷物纤维水解物
马克斯克鲁维酵母过夜培养物接种到含有根据Kiers等(酵母，14(5)：459-469(1998))的酵母基本培养基的瓶中。每瓶中含有30％谷物纤维水解物作为碳源。简言之，谷物纤维水解物是通过谷物纤维与1.2％硫酸在145℃反应25分钟来制备的。在反应过程中半纤维素分解为单体产物阿拉伯糖、木糖和葡萄糖。由于反应过程中的高温，一些阿拉伯糖和木糖降解成糖醛，而一些葡萄糖降解成羟甲基糖醛。HPLC分析水解物显示有38.7克/L葡萄糖、39.1克/L木糖、20.7克/L阿拉伯糖和1.6克/L糖醛。另外，水解物pH为1.51。培养酵母前谷物纤维水解物的pH调到3.0。在培养实验中，定期测量OD。
用谷物纤维水解物培养时酵母细胞能够产生生物量(图9)。
4.不同pH条件
马克斯克鲁维酵母过夜培养物接种到四个含有50ml酵母YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)的瓶中。每瓶的pH不同，是用HCl来调整的。在培养实验过程中，温度维持在30℃，定期测量OD。观察每瓶中的生长情况(图10)。
5.不同pH条件/乳酸
马克斯克鲁维酵母过夜培养物接种到四个含有50ml酵母YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)和40g/L乳酸的瓶中。加入乳酸导致pH为2.8。因此，使用NaOH将三瓶中的pH调至指定pH。在培养实验过程中，温度维持在30℃，定期测量OD。观察每瓶中的生长情况(图11)。
实施例9-能够生产丙烯酰辅酶A的重组细胞
用丙酸梭菌(Clostridium propionium)基因组DNA文库转化能够利用丙烯酸作为碳源的生物(如大肠杆菌)。使用pHES质粒产生丙酸梭菌基因组文库，使表达丙酸梭菌基因组的10kbp片段。转化的大肠杆菌涂布仅以丙烯酸作为碳源的选择培养基。只有那些能够同化丙烯酸的细胞可以生长。丙烯酸通常通过酶介导转化成乳酸而被同化。然后，乳酸可转化成丙酮酸并通过三羧酸循环被细胞利用。
一旦选择了转化的大肠杆菌，从其基因组文库中分离质粒DNA，并测定插入片段的序列。序列一旦测定，查看片段的读码框以确定参与乳酸和丙烯酸之间转化的酶的编码序列(如丙烯酰辅酶A脱氢酶和辅酶A转移酶)。
分离的含有这些酶编码序列的菌落导入实施例6描述的酵母细胞，该酵母细胞含有乳酸脱氢酶并缺乏丙酮酸脱羧酶活性。用G418(300g/L)选择含有导入核酸的重组酵母细胞。分离后，重组酵母细胞用葡萄糖在需氧条件下培养，然后转到厌氧条件。然后收集培养液并用Danner等描述的HPLC方法分析丙烯酸盐。(来自生物量的丙烯酸生物技术化生产，：应用生物化学和生物工程学(Applied Biochemistry and Biotechnology)，70-72卷(1998))。
实施例10-能够生产抗坏血酸的重组细胞
改造表达载体使其表达下列多肽：2，5-二氧杂戊酸脱氢酶，5-脱氢-4-脱氧-D-葡糖二酸脱水酶、葡糖二酸脱水酶、醛脱水酶、葡糖醛酸内酯还原酶和L-葡糖醛酸内酯氧化酶。从各种微生物中分离编码这些多肽的核酸序列。一旦改造，表达载体通过电穿孔转化酵母细胞。一旦转化，分析酵母细胞并确定它们是否生产L-抗坏血酸。
实施例11-能够生产D-木糖的重组细胞
改造表达载体使其表达下列多肽：2-脱氢3-脱氧D-戊酸醛缩酶酶、木糖酸脱水酶、木糖酸内酯酶、和D-木糖脱氢酶。从假单胞菌属的种分离编码这些多肽的核酸序列。一旦改造，表达载体通过电穿孔转化酵母细胞。一旦转化，分析酵母细胞并确定它们是否生产D-木糖和其它戊糖碳化合物。
实施例12-能够生产柠檬酸的重组细胞
根据酿酒酵母顺乌头酸酶核酸序列设计PCR引物(ACO1，Genbank登陆号M33131)。用这些引物克隆来自克鲁维酵母属、Yamadazyma、或汉逊酵母属的顺乌头酸酶编码核酸序列。一旦测序，如实施例5所描述的制备线性结构并用来破坏酵母细胞中的顺乌头酸酶编码核酸序列。使用的选择标记为如实施例5所描述的抗生素G418而不是乳酸生产。提供抗生素G418抗性的核酸为新霉素/卡那霉素基因。该基因获自pPIC9K载体(InVitrogen)，并插入pHES载体。用PCR产生的改造后具有上述ACO1同源末端的线性片段转化酵母细胞。设计线性片段编码G418抗性基因。只有在顺乌头酸酶编码核酸中整合了线性片段的细胞对抗生素有抗性。用PCR分析那些细胞中适当的整合。通过该方法获得的酵母细胞具有部分功能性TCA循环，因此可过量生产柠檬酸。柠檬酸穿过线粒体膜转运到培养液中。另外，给予这些酵母细胞编码一种酶如ATP-柠檬酸裂解酶的外源核酸分子，使它们能够催化积累的柠檬酸向草酰乙酸的转化(见实施例13)。
实施例13-能够在细胞质中表达柠檬酸裂解酶的重组细胞
用含有其编码序列具有ATP-柠檬酸裂解酶活性的核酸序列的pHES质粒转化克拉布特里阳性表现型酵母细胞。从大肠杆菌、肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)(Genbank登陆号X79817)、或其它发表的来源分离该核酸。一旦转化，分析酵母细胞确定它们是否能够利用糖生产大量脂类。另外，分析酵母细胞确定它们是否显示如Holdsworth等(J.Gen.Microbiol.，134：2907-2915(1998))描述的ATP-柠檬酸裂解酶活性。具有ATP-柠檬酸裂解酶活性的酵母细胞能够通过由醛脱氢酶将醛分解成乙酸以外的途径，在厌氧条件下提供胞质乙酸。另外，当这种酵母缺乏丙酮酸脱羧酶或醛脱氢酶活性时，它们将能由三羧酸循环提供乙酸用于生物合成。
实施例14-不能利用乳酸作为碳源的重组细胞
改造酵母细胞使其与酿酒酵母JEN1多肽相似的羧酸转运蛋白的活性降低。这种酵母细胞转运乳酸的能力降低，因此利用乳酸的效率降低。通过破坏含有该多肽编码序列的座位使酵母细胞羧酸转运蛋白的活性降低。首先，利用根据已有JEN1序列(Genbank登陆号U24155)设计的简并性引物分离JEN1多肽的同源序列。一旦该核酸从宿主细胞分离后，测定序列。用实施例11描述的程序破坏该多肽编码序列。产生编码JEN1同源区和完整G418抗性基因的线性片段。该线性片段整合到JEN1基因组序列引起活性的破坏。根据它们不能转运羧酸因此用乳酸培养时不能生长的特点来鉴定缺乏羧酸转运蛋白活性的细胞。
另外，修饰细胞使其与酿酒酵母染色体b2多肽相当的功能性活性降低。染色体b2多肽使酿酒酵母细胞能够在线粒体内分解代谢乳酸。首先，从酵母染色体b2序列(Genbank登陆号Z46729)设计简并性引物。一旦分离，对克隆进行序列测定。使用《酵母遗传学方法》(Methods in YeastGenetics)(Alison等编，冷泉港出版社(1997))中描述的方法破坏染色体b2的酵母同源序列。重组酵母细胞将不能利用乳酸作为碳源。
实施例15-大规模生产乳酸
生产并分离了多种PDC活性降低的马克斯克鲁维酵母细胞的变异体。设计使每种变异体含有不同拷贝数编码LDH活性多肽的外源核酸分子。LDH多肽来自多种不同来源。这些变异细胞在40℃可具有不同的乳酸特异性生产能力。
每种变异体在空气流为1.5VVM的需氧条件下，在含有30％溶解氧的容器中生长，达到大约为60g/L(干重)的细胞密度。一旦细胞密度足够，关掉空气流，容器内的条件换成厌氧条件。不加入碱。可以发现在厌氧阶段具有最高特异性生产能力的变异体与具有较低特异性生产能力的变异体相比，不仅生产乳酸更快，而且在低pH时达到较高的浓度。在生产阶段使用葡萄糖的产量可超过90％。
选择某些变异体并用除空气流减至0.1VVM而非完全关闭之外其它条件都相同的培养方法处理。在这种条件下，容器中的最终pH可以更低，并且比没有空气流条件的乳酸浓度更高。使用葡萄糖的产量可能降低，但可保持大约90％。重复测试时，用0.5VVM的空气流，使用葡萄糖的产量可能降低至低于80％。
实施例16-使用一连串分批发酵的大规模乳酸生产
使用缺乏PDC活性并具有LDH活性的马克斯克鲁维酵母培养物作为一连串分批发酵的接种物。每批发酵在逐渐增大的容器中进行，其中每个容器都在临用前灭菌。另外，提供给每个容器1.5VVM的空气流并充分搅拌，以维持溶解氧浓度大于10％。最后的容器体积为6000L。容器还维持在45℃，以增强基因修饰的马克斯克鲁维酵母细胞相对于野生型酵母和其它微生物的存活力。每个容器中填充标准培养基用于最佳生长。
将最后容器中细胞密度为100克细胞/L(干重)的内容物转移到刚用蒸汽消毒的体积为300,000L的容器中。任选地，加入从前期生产工艺过滤得到的额外细胞。生产容器中的细胞密度为6克细胞/L(干重)。葡萄糖加至80g/L的水平。容器中的条件为厌氧，并且在25小时内温度为42℃。直到接近工艺结束，特异性生产能力都大于0.5克乳酸/(克生物量*小时)，然后生产能力开始下降。一旦生产能力开始下降，取出细胞并保存备用。乳酸终浓度可为75g/L，pH为2.8。去除生物量之后，溶液通过蒸发浓缩到乳酸浓度为50％。自由酸(大约占乳酸总量的86％)通过液相萃取抽提到有机相中，然后在高温下再抽提回水相中。含有乳酸盐的残余液或被清除，或作为缓冲液在生长容器中再循环，或用如硫酸酸化并纯化。
实施例17-比较克拉布特里阴性(马克斯克鲁维酵母)和克拉布特里阳性(S.uvarum)生物的需氧生产
克拉布特里阴性(马克斯克鲁维酵母)和克拉布特里阳性(S.uvarum)生物分别生长在需氧和厌氧分批发酵罐中。在工作体积为1.5L的实验室发酵罐中于30℃分批培养。通过自动添加2mol·L-1氢氧化钾(KOH)维持pH在5.0±0.1。发酵罐通入流速为0.8l·min-1空气(需氧培养)或氮气(厌氧培养)并在800rpm搅拌。用氧电极(Ingold，型号34 100 3002)连续监测溶解氧浓度。在需氧培养时，溶解氧浓度维持在大约60％。在适当的时间间隔取出10ml样品用于测定干重和代谢物浓度。将Tween-80和麦角固醇加入厌氧培养物中，以供应脂肪酸合成所需的化合物。
在指数生长期，在适当的时间间隔测定酵母培养物的干重和OD660，以及上清的葡萄糖和乙醇浓度。用下面的方程式利用线性回归分析计算比乙醇生产率(q乙醇，mmol·g-1·h-1)：
使用乙醇浓度和生物量浓度分别相对于时间的不同曲线图(μmax(h- 1))，计算dE/dt(培养物中乙醇浓度的增长速率；mmol·g-1·h-1)和dCx/dt(生物量浓度的增长速率g·l-1h-1)。从Cx相对于时间的曲线图指数部分估计使用葡萄糖的最大比生长速率。用dG(每小时消耗的葡萄糖量)替代dE计算特异性葡萄糖消耗速率(q葡萄糖，mmol·g-1·h-1)。
在需氧分批培养中，克鲁维酵母和Saccharomyces菌株使用葡萄糖的最大比生长速率分别表现为0.4 h-1和0.28h-1，高葡萄糖浓度和产生的酵母培养物的高比生长速率导致高的需氧乙醇发酵速率(表3，图1)。由于酵母菌株的强发酵能力，其葡萄糖特异性消耗速率大约为克鲁维酵母菌株的2倍。从能量来看，乙醇发酵是细胞产生ATP效率较差的途径。克鲁维酵母使用葡萄糖的生物量产量为0.38g/g，Saccharomyces uvarum则为0.14g/g。克拉布特里阴性表现型克鲁维酵母菌株使用葡萄糖的乙醇产量为0，克拉布特里阳性表现型酵母属培养则为1.83mmol/mmol。表3：用含有2％(wt/vol)葡萄糖的矿物培养基分批培养Saccharomycesuvarum和马克斯克鲁维酵母的指数生长期间最大比生长速率、乙醇比生产速率(q，mmol[g生物量]-1h-1)和葡萄糖比消耗速率、生物量产量(g/g)、产物产量(mmol/mmol)、和碳源回收(％，只计算厌氧培养)。
          马克斯克鲁维酵母                          S.uvarum
            需氧              厌氧          需氧          厌氧μmax(h-1)     0.38             0.09           0.28         0.12q葡萄糖          5.8              7.6            10.9         7.2q乙醇           0                9.9            20           9.7Yp/s            0                1.30           1.83         1.35Yx/s            0.38             0.07           0.14         0.09C-rec            --               84.6           --           73.3
与需氧条件相比，在厌氧分批培养中，两种菌株的比生长速率和生物量产量非常低(表3，图1和2)。克鲁维酵母和酵母属菌株的生物量产量分别为0.07和0.09g/g。在厌氧条件下两种菌株在乙醇比发酵速率方面的表现同样好。用CO2生产数据可证实这一点。
通常，该实施例证明生物量的需氧生产比厌氧生产快得多，而且克拉布特里阴性生物在需氧条件下的生物量产量较高(因为，克拉布特里阳性生物耗尽葡萄糖后可以有一些乙醇发酵)。该实施例也证明了克拉布特里阳性和克拉布特里阴性生物在厌氧条件下生产发酵产物的速率相同。因此，需氧生长阶段提供了高生物量产量，后来的厌氧发酵阶段将代谢能量导向产物形成(而不是更多的生长)。总之，生产与生长分离的工艺提供了更大的工艺机动性和对工艺总产量更好的控制。
实施例18：天然产生L-乳酸的宿主菌中改良的乳酸生产：用于破坏丙酮酸脱羧酶基因的线性同源DNA片段的扩增
耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)是L-乳酸的天然生产者(Kurtzman和Fell，(1998)“酵母分类学研究(The Yeasts，A TaxonomicStudy)”240-241页；Elsevier Science B.V.；阿姆斯特丹，荷兰)。耐热克鲁维酵母天然具有乳酸脱氢酶基因(ldh)，可生产L-乳酸。在厌氧条件下生产的乳酸量为大约4％g/g利用的葡萄糖，同时剩余的葡萄糖基本上转变成乙醇(42.5％g/g消耗的葡萄糖)、甘油(3％g/g消耗的葡萄糖)和乙酸(0.3g/g消耗的葡萄糖)。
表4.使用耐热克鲁维酵母厌氧发酵的结果，YAPD培养基(丰富培养基)起始葡萄糖浓度为100g/l葡萄糖。时间    葡萄糖    乳酵    乙酸      甘油      乙醇      乳酸YSI0       92.937    0        0        0         0.025     0.0612      79.603    0.476    0        0.41      3.345     0.636      38.618    2.135    0        2.011     25.642    2.0854      11.662    3.525    0.2      2.789     41.522    3.3478      1.539     4.322    0.209    3.213     42.5      3.8898      0.286     4.365    0.307    3.24      42.5      3.74
使用共有引物从耐热克鲁维酵母分离PDC1的600bp区，该引物是根据比较来自马克斯克鲁维酵母和产乳酸克鲁维酵母的PDC1基因序列而得到的序列来构建的。然后测定PDC1片段的序列(Sanger)，并利用PCR和基因组步移技术(Clonetech)用该序列来分离围绕耐热克鲁维酵母pdc1的7.5kbp的片段(图6e)。然后7.5kbp片段克隆到pCRII TA克隆载体(Invitrogen)。从耐热克鲁维酵母7.5kbp片段上去除靠近PDC1编码区中心大约730bp的部分。耐热克鲁维酵母pdc1用限制酶消化去除的部分含有以下序列：TTACCACTGTCTTCGGTCTGCCAGGTGACTTCAATCTGCGTCTGTTGGACGAGATCTACGAGGTCGAGGGTATGAGATGGGCCGGTAACTGTAACGAGTTGAACGCTTCTTACGCTGCCGACGCTTACGCCAGAATCAAGGGTATGTCCTGTTTGATCACCACCTTCGGTGTCGGTGAGTTGTCCGCTTTGAACGGTATCGCCGGTTCTTACGCTGAGCACGTCGGTGTCTTGCACATTGTCGGTGTCCCATCCGTCTCCGCCCAGGCCAAGCAGCTATTGTTGCACCACACCTTGGGTAACGGTGACTTCACTGTCTTCCACAGAATGTCCGCCAACATCTCTGAGACCACTGCTATGATCACTGATCTAGCTACCGCCCCATCTGAGATCGACAGATGTATCAGAACCACCTACATTAGACAGAGACCTGTCTACTTGGGTTTGCCATCTAACTTCGTTGACCAGATGGTCCCAGCCTCTCTATTGGACACCCCAATTGACTTGGCCTTGAAGCCAAACGACCAGCAGGCTGAGGAGGAGGTCATCTCTACTTTGTTGGAGATGATCAAGGACGCTAAGAACCCAGTCATCTTGGCTGACGCTTGCGCTTCCAGACACGATGTCAAGGCTGAGACCAAGAAGTTGATTGACATCACTCAGTTCCCATCTTTCGTTACCCCAATGGGTAAGGGTTCCATTGACGAGAAGCACCCAAGATTCGGTGGTGTCTACGTCGGTACCTTGT(Sequence ID No.XX).然后用限制酶消化，从pPIC9K载体(Invitrogen)分离编码卡那霉素抗性基因包括其启动子(Sambrook)，并克隆到7.5kbp上去除730bp片段的位点。来自pPIC9K(Invitrogen)的卡那霉素抗性基因及其启动子序列如下：GTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAA
CGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAAC
TTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCC
TACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGT
AGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAG
AAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATC
CTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCT
GAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAAT
CGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCT
TTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGA
ACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAA
AAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGC
TCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCG
AGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATA
TTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAG
TTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCC
AACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAA
GTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAG
CTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGT
CATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCC
TGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAG
GAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT
TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTCCCGG
GGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATG
CTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCA
TCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAAC
AACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGA
TTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCA
TGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGG
CTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTT
CATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGA
CACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCA
CAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGA
TCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGG
TGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTGCATG
(Sequence ID No.9)产生的结构包括卡那霉素抗性基因(G418)，如图6f所示其外围绕大约6.8kbp的PDC区域。
用两种限制性内切酶消化图6f描述的结构(Sambrook)，产生3微克含有同源PDC区和插入卡那霉素抗性基因中心序列的DNA片段。使用已知转化技术如电穿孔用该片段转化耐热克鲁维酵母从而破坏耐热克鲁维酵母的PDC。电穿孔方法如下：a)在20ml YPAD中培养微生物过夜(～15h)；b)转移500μl培养物到微量离心管中，4K离心4min，去掉上清；c)用1ml冷EB(EB＝电穿孔缓冲液：10mM Tris-HCl，pH7.5；270mM蔗糖；1mM MgCl2)洗涤沉淀；d)重新悬浮于1ml IB(IB＝孵育缓冲液：YPD；25mM DTT；20mM Hepes，pH8.0)；e)在Eppendorf热混合仪上800rpm、30℃振荡30min；f)离心沉降，用EB洗涤一次，重新悬浮于400μl EB；g)加入3微克DNA片段(溶于10mM Tris-Cl，pH8.5)，冰浴30min；h)转到0.4cm电穿孔杯中。Bio-Rad Gene Pulser设置：1000V，1000Ω、和50μF。脉冲后时间常数：～20msec；i)转移到3ml Morton Closure管中，30℃静置孵育1小时。j)加入400μl液体YPAD(YPAD：10g酵母提取物；20g蛋白胨；20g葡萄糖；100mg腺苷半硫酸盐，体积＝1L，不调pH)，在Eppendorf热混合仪上800rpm、30℃振荡1小时。k)加入400μl液体YPAD并恢复4-6小时；l)在微量离心管中离心沉降，4K、4min，去掉上清，重新悬浮于400μl 1M山梨糖醇；并涂布200μg/ml G418选择平板；和m)30℃孵育3-5天。
首先通过再次涂布到含有200μg/ml G418的培养皿中筛选菌落。用标准基因组制备(Sambrook)从再次涂布的酵母中分离基因组DNA。然后分离的基因组经PCR筛选1)使用合适的引物和条件(Sambrook)筛选卡那霉素片段的存在和2)使用合适的引物和PCR条件(Sambrook)筛选破坏的PDC区的缺乏。然后培养选择标记阳性和PDC破坏区阴性的菌落用于进一步研究，例如，通过DNA杂交分析来进一步分析这些菌株的基因组DNA。
其它实施方案
虽然与其详细描述协力描述了本发明，前面的描述应理解为为了阐明的目的，而不作为限制本发明范围的内容，后者由所附的权利要求范围限定。其它方面、优势和修改不超出后面权利要求说明书的范围。

Claims (33)

1.一种制备选定有机产物的方法，所述方法包括：
a)提供显示克拉布特里阴性表现型的生物；
b)在第一种培养基中培养克拉布特里阴性微生物，该培养基包含促进细胞呼吸的第一组培养条件的碳源；和
c)在第二种培养基中培养克拉布特里阴性微生物，该培养基包含促进选定有机产物生产的第二组培养条件的碳源。
2.根据权利要求1的方法，其中选定有机产物包含来源于丙酮酸的产物。
3.根据权利要求2的方法，其中来源于丙酮酸的产物包含乳酸。
4.根据权利要求1的方法，其中第一种培养基与第二种培养基不同。
5.根据权利要求1的方法，其中第一组培养条件包含需氧条件。
6.根据权利要求1的方法，其中第一种培养基包含的溶解氧含量至少为2％。
7.根据权利要求1的方法，其中第一组培养条件包含维持培养基空气流至少为0.1VVM。
8.根据权利要求1的方法，其中在第一组培养条件下微生物倍增时间少于10小时。
9.根据权利要求1的方法，其中在第一组培养条件下每消耗1克碳源生产至少大约0.3克生物量。
10.根据权利要求1的方法，其中第一组培养条件包含一种pH低于3.0，温度高于35℃以及溶解氧含量至少大约2％的培养基。
11.根据权利要求1的方法，其中第二组培养条件包含厌氧条件。
12.根据权利要求1的方法，其中第二种培养基包含的溶解氧含量不超过2％。
13.根据权利要求1的方法，其中第二组培养条件包含维持培养基空气流小于0.1VVM。
14.根据权利要求1的方法，其中在第二组培养条件下每消耗1克碳源生产的生物量不超过大约0.3克。
15.根据权利要求1的方法，其中第二组培养条件包含一种pH低于3.0，温度高于35℃以及溶解氧含量小于2％的培养基。
16.根据权利要求1的方法，其中第二组培养基包含一种细胞呼吸抑制剂。
17.根据权利要求1的方法，其中第一种培养基和第二种培养基中的至少一种包含戊糖碳源。
18.根据权利要求1的方法，其中克拉布特里阴性微生物包含酵母。
19.根据权利要求18的方法，其中酵母选自克鲁维酵母、毕赤酵母、汉逊酵母、白色假丝酵母、皮状丝孢酵母和Yamadazyma。
20.根据权利要求1的方法，其中克拉布特里阴性微生物为遗传修饰的。
21.根据权利要求20的方法，其中克拉布特里阴性微生物通过遗传修饰以含有外源乳酸脱氢酶基因。
22.根据权利要求21的方法，其中克拉布特里阴性微生物通过遗传修饰以含有乳酸脱氢酶基因，该基因选自牛乳酸脱氢酶、细菌乳酸脱氢酶和真菌乳酸脱氢酶。
23.根据权利要求1的方法，其还包括向第二种培养基中加入一种终端电子受体的步骤。
24.一种生产选定的来源于丙酮酸的产物的方法，包括：
a.  提供一种微生物；
b.  在促进细胞呼吸的第一组培养条件下培养该微生物；
c.  在促进选定的来源于丙酮酸的产物生产的第二组培养条件
下培养该微生物；
d.  在包含一种培养基的第三组培养条件下培养该微生物，其中所述培养基包含增加微生物代谢能量的试剂。
25.根据权利要求24的方法，其中在第一组培养条件下培养微生物的步骤包括在含有一种碳源的培养基中培养微生物，其中所述培养的产量大于0.4g微生物(干重)/克碳源。
26.根据权利要求24的方法，其中在第一种培养条件下培养微生物的步骤产生的微生物其生长速率大于0.2hr-1。
27.根据权利要求24的方法，其中在第一组培养条件下培养微生物的步骤包括在需氧条件下培养微生物。
28.根据权利要求24的方法，其中在第二组培养条件下培养微生物的步骤包括在厌氧条件下培养微生物。
29.根据权利要求24的方法，其中在所述的在第二组培养条件下培养微生物的步骤中，以至少0.1克产物/克微生物/小时的速度生产来源于丙酮酸的产物。
30.根据权利要求24的方法，其中增加微生物代谢能量的试剂包括氧。
31.基因修饰的显示克拉布特里阴性表现型的微生物在生产乳酸的工艺中的用途，其中所述工艺包括需氧阶段和厌氧阶段。
32.一种缺乏相同菌株野生型酵母的乙醇生产能力或具有其降低了的乙醇生产能力并具有一种内源乳酸脱氢酶基因的酵母菌株。
33.根据权利要求32的一种酵母菌株，其中该酵母菌株为耐热克鲁维酵母。
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