CN102177243A

CN102177243A - 利用双相萃取发酵生产丁醇的方法

Info

Publication number: CN102177243A
Application number: CN2009801205453A
Authority: CN
Inventors: M·C·格拉迪; M·贾希克; R·帕特奈克
Original assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Current assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Priority date: 2008-06-04
Filing date: 2009-06-04
Publication date: 2011-09-07
Also published as: AU2009256148B2; WO2009149270A2; EP2657344B1; MX2010013182A; US20090305370A1; CA2723877A1; NZ588988A; EP2657344A1; BRPI0909965A2; US20110294179A1; JP2011522543A; ZA201007949B; WO2009149270A3; CA2723877C; KR20110015045A; AU2009256148A1; EP2283141B1; EP2283141A2

Abstract

本发明公开了从至少一种可发酵的碳源生产丁醇的方法，通过利用一种重组的微生物宿主进行发酵，其中在发酵过程中丁醇被萃取到特定的有机萃取剂中，所述方法克服了毒性问题，并导致丁醇生产的有效滴度、有效速率和有效产量的提升。

Description

利用双相萃取发酵生产丁醇的方法

本专利申请要求2008年6月4日提交的美国临时专利申请61/058567的优先权。

发明领域

本发明涉及生物燃料领域。更具体地讲，本发明涉及一种通过微生物发酵生产丁醇的方法，其中丁醇产品通过在发酵期间萃取至一种不能与水混溶的有机萃取剂而除去。

发明背景

丁醇是一种重要的工业化学品，具有多种用途，例如用作燃料添加剂，在塑料工业中用作化学原料，以及在食品和食用香料工业中用作食品级的萃取剂。每年通过石油化学方法生产的丁醇有100至120亿磅，并且对这种化学品的需求可能还会增长。

有若干种化学合成方法是已知的，然而这些生产丁醇的方法利用来源于石油化工产品的原料，并且普遍成本高昂和有害生态环境。若干种通过发酵生产丁醇的方法同样是已知的，例如ABE方法，这种发酵方法产生一种丙酮、1-丁醇和乙醇的混合物。通过丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)进行的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵是已知最古老的工业发酵之一；负责产生这些溶剂的途径和基因也同样如此。通过ABE方法进行的1-丁醇生产受1-丁醇对丙酮丁醇梭菌的毒性效应限制。已有报导称，利用对细菌无毒的特定有机萃取剂的原位萃取发酵方法提高了用丙酮丁醇梭菌发酵进行的1-丁醇生产(Roffler等人，Biotechnol.Bioeng.31：135-143，1988；Roffler等人，Bioprocess Engineering 2：1-12，1987；和Evans等人，Appl.Environ.Microbiol.54：1662-1667，1988)。

与上述野生型的丙酮丁醇梭菌不同，重组的表达宿主菌还被报导表达1-丁醇、2-丁醇和异丁醇的生物合成途径。这些重组的宿主具有以比ABE方法更高的产量生产丁醇的潜能，因为它们不产生诸如丙酮和乙醇这样的副产品。然而，这些重组的宿主的问题在于，丁醇的生物生产似乎受限于丁醇对发酵中所用宿主微生物的毒性阈值。萃取发酵方法已被应用于利用重组的微生物菌株进行的丁醇生产中。

本发明满足了上述需求，并且提供了从至少一种可发酵碳源制取丁醇的方法，该方法克服了毒性的问题，从而在利用重组微生物宿主进行的发酵中带来丁醇生产的有效滴度、有效速率和有效产量的提升，其中在发酵过程中，丁醇被萃取至特定的有机萃取剂。

发明概述

本发明提供了一种从发酵培养基中回收丁醇的方法，所述方法包括：

a)提供包含丁醇、水和从至少一种可发酵的碳源生产丁醇的经基因修饰的微生物的发酵培养基；

b)使所述发酵培养基与下列接触：i)至少一种选自下列的第一不能与水混溶的有机萃取剂：C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，以及任选地(ii)选自下列的一种第二不能与水混溶的有机萃取剂：C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物；

c)将所述含丁醇的有机相从所述水相分离；以及

d)从所述含丁醇的有机相回收丁醇以制得回收的丁醇。

本发明提供了生产丁醇的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供从至少一种可发酵的碳源生产丁醇的经基因修饰的微生物；

b)在包含水相和不能与水混溶的有机萃取剂的双相发酵培养基中使所述微生物生长足以使丁醇被萃取到所述有机萃取剂中以形成含丁醇的有机相的时间，其中所述不能与水混溶的有机萃取剂选自C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，并且其中所述双相发酵培养基包含按体积计约3％至约60％的不能与水混溶的有机萃取剂；

c)将所述含丁醇的有机相从所述水相分离；以及

d)从所述含丁醇的有机相回收丁醇以制得回收的丁醇。

本发明的一个实施方案提供了生产丁醇的方法，所述方法包括以下步骤：

b)使上述微生物在发酵培养基中生长，其中上述微生物将所述丁醇产生到所述发酵培养基中，从而产生一种含丁醇的发酵培养基；

c)使所述含丁醇的发酵培养基与下列接触：i)至少一种选自下列的第一不能与水混溶的有机萃取剂：C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，以及任选地(ii)选自下列的第二不能与水混溶的有机萃取剂：C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物；

d)将所述含丁醇的有机相从所述水相分离；以及

e)从所述含丁醇的有机相回收丁醇。

b)在有氧条件下，使上述微生物在发酵培养基中生长足以达到预选的生长水平的时间；

c)转至微需氧或厌氧条件以刺激向所述发酵培养基中生产丁醇以形成含丁醇的发酵培养基；

d)使所述含丁醇的发酵培养基与下列接触：i)至少一种选自下列的第一不能与水混溶的有机萃取剂：C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，以及任选地(ii)选自下列的第二不能与水混溶的有机萃取剂：C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物；

e)将所述含丁醇的有机相从所述水相分离；以及

f)从所述含丁醇的有机相回收丁醇。

本发明的另一个实施方案提供了生产丁醇的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含丁醇、水和从包含至少一种可发酵的碳源的发酵培养基生产丁醇的经基因修饰的微生物的发酵培养基；

b)通过一种顺流的或逆流的萃取剂流，使所述发酵培养基与下列接触：i)至少一种选自下列的第一不能与水混溶的有机萃取剂：C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，以及任选地(ii)选自的一种第二不能与水混溶的有机萃取剂：C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物；

c)将所述含丁醇的有机相从所述水相分离；以及

d)从所述含丁醇的有机相回收丁醇以制得回收的丁醇。

本发明的萃取发酵法提供丁醇，包括全部的丁醇异构体，已知其具有与汽油相似的能含量并能够与任何化石燃料混合。丁醇是优选的燃料或燃料添加剂，因为它在标准内燃机中燃烧时仅生成CO₂，并且几乎不产生或根本不产生SO_X或NO_X。另外，丁醇的腐蚀性不及乙醇，因此是目前为止最优选的燃料添加剂。

除了用作一种生物燃料或燃料添加剂之外，本发明的方法所生产的丁醇还具有冲击燃料电池工业中的氢分配问题的潜在可能。如今，由于氢的运输和分配存在安全隐患，燃料电池饱受困扰。可以容易地对丁醇重整其氢含量，并且可以通过现有的加油站以燃料电池或汽车所需的纯度进行分配。

最后，本发明的方法从植物来源的碳源生产丁醇，从而避免了标准的石油化学的丁醇生产工艺所涉及的对环境的负面影响。

附图简述和序列说明

图1显示的是如实施例6中所述的利用油醇作为有机萃取剂并通过汽提的一个发酵过程(■)，和如实施例7中所述的单独通过汽提的一个发酵过程(●)中，发酵培养基(即水相)中异丁醇的浓度。图1所显示的数据系利用一种重组的大肠杆菌(Escherichia coli)生产丁醇而产生。

图2显示的是如实施例8中所述的利用油醇作为有机萃取剂并通过汽提的一个发酵过程(■)，和如实施例9中所述的单独通过汽提的一个发酵过程(●)中，发酵培养基(即水相)中异丁醇的浓度。图2所显示的数据系利用一种重组的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生产丁醇而产生。

图3是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中在使发酵培养基与萃取剂在一个发酵容器中接触之前，所述第一不能与水混溶的萃取剂和所述任选的第二不能与水混溶的萃取剂在一个容器中被合并。

图4是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中所述第一不能与水混溶的萃取剂和所述任选的第二不能与水混溶的萃取剂被分别加入到一个发酵容器中，发酵培养基在该容器中与萃取剂接触。

图5是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中所述第一不能与水混溶的萃取剂和所述任选的第二不能与水混溶的萃取剂被分别加入到不同的发酵容器中，以使发酵培养基与萃取剂接触。

图6是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中对产物的萃取在发酵罐的下游进行，并且在使发酵培养基与萃取剂在一个容器中接触之前，所述第一不能与水混溶的萃取剂和所述任选的第二不能与水混溶的萃取剂在一个不同的容器中被合并。

图7是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中对产物的萃取在发酵罐的下游进行，并且所述第一不能与水混溶的萃取剂和所述任选的第二不能与水混溶的萃取剂被分别加入到一个发酵容器，发酵培养基在该容器中与萃取剂接触。

图8是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中对产物的萃取在发酵罐的下游进行，并且所述第一不能与水混溶的萃取剂和所述任选的第二不能与水混溶的萃取剂被分别加入到不同的发酵容器中，以使发酵培养基与萃取剂接触。

图9是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中对产物的萃取在至少一个分批发酵罐中进行，通过与发酵醪液底部或接近底部处的(使发酵罐充满萃取剂)一种萃取剂共流，其中所述萃取剂在该发酵罐的顶部或接近顶部处的一点流出该发酵罐。

下列序列符合37 C.F.R.1.821 1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)和EPO和PCT的序列列表要求(规则5.2和49.5(a bis)，以及行政指导的208节和附录C)相一致。

表1

基因和蛋白质SEO ID号汇总

SEQ ID NOs：11至22系用于构建下文的实施例的一般方法部分所描述的重组大肠杆菌菌株的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：23系来自大肠杆菌菌株K-12MG1655的pflB基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：24系来自大肠杆菌菌株K-12MG1655的ldhA基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：25系来自大肠杆菌菌株K-12MG1655的adhE基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：26系来自大肠杆菌菌株K-12MG1655的frdA基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：27系来自大肠杆菌菌株K-12MG1655的frdB基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：28系来自大肠杆菌菌株K-12MG1655的frdC基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：29系来自大肠杆菌菌株K-12MG1655的frdD基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO；30系pLH475-Z4B8的核苷酸序列。

SEQ ID NO；31系CUP1启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO；34系CYC1终止子的核苷酸序列。

SEQ ID NO；35系ILV5启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO；38系ILV5终止子的核苷酸序列。

SEQ ID NO；39系FBA1启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO；42系pLH468的核苷酸序列。

SEQ ID NO；47系pNY8的核苷酸序列。

SEQ ID NO；48系GPD1启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：49、50、54、55、62至71、73至83和85至86系实施例中所用的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO；51系pRS425::GPM-sadB的核苷酸序列。

SEQ ID NO；52系GPM1启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：53系ADH1终止子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：56系pRS423 FBA ilvD(链球菌的)的核苷酸序列

SEQ ID NO：57系FBA终止子的核苷酸序列

SEQ ID NO：60系GPM-SadB-ADHt片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：61系pUC19-URA3r的核苷酸序列。

SEQ ID NO：72系ilvD-FBA1t片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：84系URA3r2模板DNA的核苷酸序列

发明详述

除非另外指明，如以上及本发明的整个说明书中所用，以下术语将定义如下：

本文所用术语“丁醇”是指1-丁醇、2-丁醇、异丁醇或它们的混合物。

本文所用术语“有氧条件”是指有氧气存在下的生长条件。

本文所用术语“微需氧条件”是指有低水平的氧气(即低于正常的大气氧气水平)存在的生长条件。

本文所用术语“厌氧条件”是指不存在氧气的生长条件。

本文所用术语“可发酵的碳源”是指能被本文所公开的微生物代谢的碳源。适当的可发酵的碳源包括但不限于单糖，如葡萄糖或果糖；二糖，如乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖，如淀粉或纤维素；一碳底物；以及它们的混合物。

本文所用术语“萃取剂”是指用于萃取任何丁醇异构体的有机溶剂。

本文所用术语“双相发酵培养基”是指包含一种发酵培养基(即水相)和一种适当量的不能与水混溶的有机萃取剂的一种双相生长培养基。

本文所用术语“丁醇生物合成途径”是指产生1-丁醇、2-丁醇或异丁醇的一种酶途径。

本文所用术语“1-丁醇生物合成途径”是指从乙酰-辅酶A(acetyl-CoA)产生1-丁醇的一种酶途径。

本文所用术语“2-丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生2-丁醇的一种酶途径。

本文所用术语“异丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生异丁醇的一种酶途径。

本文所用术语“脂肪酸”是指具有一条长脂肪链(即C₁₁-C₂₂)的羧酸，其中的脂肪链为饱和的或不饱和的。

本文所用术语“脂肪醇”是指具有一条长脂肪链(即C₁₁-C₂₂)的醇，其中的脂肪链为饱和的或不饱和的。

本文所用术语“脂肪醛”是指具有一条长脂肪链(即C₁₁-C₂₂)的醛，其中的脂肪链为饱和的或不饱和的。

本文所用术语“有效滴度”是指每升发酵培养基通过发酵产生的丁醇的总量。丁醇的总量包括发酵培养基中丁醇的量和从有机萃取剂中，以及当采用了汽提时从气相中所回收的丁醇的量。

本文所用术语“基本培养基”是指包含能容许生长的最低限度的营养物质的生长培养基，其通常不含氨基酸。一种基本培养基典型地包含一种可发酵的碳源和多种可随微生物和生长条件的不同而不同的盐类。这些盐通常提供了必需元素如镁、氮、磷和硫，从而允许微生物合成蛋白质和核酸。

本文所用术语“确定成分培养基”是指所有成分的量均已知的生长培养基。例如，微生物所需的碳源、氮源以及痕量元素和维生素均为确定的。

本文所用术语“OD”是指光密度。

本文所用术语“OD₆₀₀”是指波长为600nm时的光密度。

本文所用术语“id”是指内直径。

本文所用术语“Aq”是指水相。

本文所用术语“Org”是指有机相。

本文所用术语“IPTG”是指异丙基β-D-硫代半乳糖苷。

本文所用术语“vvm”是指每分钟的体积对体积之比。

本文所用术语“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，弗吉尼亚州。

术语“vol”是指体积。

术语“rpm”是指每分钟转数。

术语“sec”是指秒。

术语“min”是指分钟。

术语“h”是指小时。

术语“μL”是指微升。

术语“mL”是指毫升。

术语“L”是指升。

术语“mL/min”是指毫升每分钟。

术语“mmol”是指毫摩尔。

术语“mM”是指毫摩尔浓度。

术语“M”是指摩尔浓度。

术语“μm”是指微米。

术语“g”是指克。

术语“μg”是指微克。

术语“g/g”是指克每克。

术语“g/L”是指克每升。

术语“μg/mL”是指微克每升。

术语“mg/L”是指毫克每升。

术语“mmol/min/mg”是指毫摩尔每分钟每毫克。

术语“g/L/h”是指克每升每小时。

术语“HPLC”是指高压液相色谱法。

术语“GC”是指气相色谱法。

经基因修饰的微生物

用于生产丁醇的微生物宿主可以选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。所使用的微生物宿主应能耐受所产生的丁醇产物，以使产量不受产物对宿主的毒性限制。用于丁醇生产的一种微生物宿主的选择详述如下。

在高滴度水平的丁醇存在下具有代谢活性的微生物并不为本领域所熟知。尽管已从产溶剂梭菌(solventogenic Clostridia)中分离了丁醇耐受性突变体，但有关其他潜在可用的细菌菌株的丁醇耐受性方面的信息几乎没有。关于细菌中醇耐受性的比较的大部分研究表明，丁醇的毒性大于乙醇(de Cavalho等人，Microsc.Res.Tech.64：215-22(2004)和Kabelitz等人，FEMS Microbiol.Lett.220：223-227(2003))。Tomas等人(J.Bacteriol.186：2006-2018(2004))报导称丙酮丁醇梭菌在发酵过程中的1-丁醇产量可能受丁醇毒性限制。1-丁醇对丙酮丁醇梭菌的主要影响是破坏膜功能(Hermann等人，Appl.Environ.Microbiol.50：1238-1243(1985))。

被选用于丁醇生产的微生物宿主应能耐受丁醇，并应能利用引入的生物合成途径将碳水化合物转化为丁醇，如下所述。选择合适微生物宿主的标准包括如下：对丁醇的内在耐受，高效率的碳水化合物利用，用于基因操作的基因工具的可用性，以及产生稳定的染色体变化的能力。

对丁醇具有耐受性的适当的宿主菌株，可以通过基于该菌株的内在耐受性的筛选而得到鉴定。微生物对丁醇的内在耐受性，可以通过测定当其于一种基本培养基中生长时，导致生长速率被抑制50％的丁醇浓度(IC50)而得到测量。IC50值可以利用本领域已知的方法来确定。例如，可以在不同量的丁醇的存在下培养所感兴趣的微生物，并通过测量600纳米下的光密度监测生长速率。倍增时间可以从生长曲线的对数部分计算并用作生长率的量度。导致生长受到50％抑制的丁醇浓度，可以通过生长受抑制的百分比对丁醇浓度的作图而得到测定。优选地，宿主菌株应具有大于约0.5％的丁醇的IC50。更适合的宿主菌株具有大于约1.5％的丁醇的IC50。尤其适合的宿主菌株具有大于约2.5％的丁醇的IC50。

用于丁醇生产的微生物宿主还应以高效率利用葡萄糖和/或其他碳水化合物。大多数微生物都能够利用碳水化合物。但是，某些环境微生物不能有效地利用碳水化合物，因此不是适当的宿主。

在基因方面修饰宿主的能力对任何重组微生物的产生来说十分关键。可使用的转基因技术的模式包括电穿孔、接合、转导或自然转化。可利用多种宿主接合性质粒和药物抗性标记。用于一种微生物的克隆载体系基于能在该宿主微生物中起作用的抗生素抗性标记的性质而针对该宿主特别设计的。

微生物宿主还可以是经过操作，以通过使多个基因失活而使碳流的竞争性途径失活的。这需要有转座子或染色体整合载体来指导失活作用。此外，能经受化学诱变的生产宿主还可通过进行化学诱变和突变体筛选获得对丁醇的内在耐受性方面的改进。

基于上述标准，用于生产丁醇的适当的微生物宿主包括但不限于发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)、产碱菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)和糖酵母属(Saccharomyces)的成员。优选的宿主包括：大肠杆菌(Escherichia coli)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、恶臭假单胞菌(Rhodococcus erythropolis)、红串红球菌(Pseudomonas putida)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

上述微生物可以是用本领域已知的方法进行过基因修饰，以将可发酵的碳源转化为丁醇的，其中所述丁醇具体而言包括1-丁醇、2-丁醇或异丁醇。特别适合的微生物包括埃希氏菌属、乳杆菌属和糖酵母属，其中大肠杆菌植物乳杆菌和啤酒糖酵母为尤其优选的。此外，所述微生物还可以是以上所列微生物之一的一种用Bramucci等人所述的方法(共同待决和共同持有的美国专利申请11/761497；和WO 2007/146377)分离的丁醇耐受的菌株。一种这样的菌株的例子是植物乳杆菌菌株PN0512(ATCC：PTA-7727，于2006年7月12日因美国专利申请11/761497进行生物保藏)。

这些微生物可经基因修饰以包含一种1-丁醇生物合成途径从而产生1-丁醇，如Donaldson等人在WO 2007/041269中所述，该专利以引用方式并入本文。例如，所述微生物可经基因修饰以表达一种1-丁醇生物合成途径，所述途径包括下列底物向产物的、酶催化的转化：

a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA；

b)乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酸-CoA；

c)3-羟丁酸-CoA至丁烯酰-CoA；

d)丁烯酰-CoA至丁酰1-CoA；

e)丁酰-CoA至丁醛；以及

f)丁醛至1-丁醇。

所述微生物还可经基因修饰以表达一种2-丁醇生物合成途径从而产生2-丁醇，如Donaldson等人在美国专利申请公布2007/0259410和2007/0292927，WO 2007/130518和WO 2007/130521中所述，这些专利均以引用方式并入本文。例如，在一个实施方案中，所述微生物可经基因修饰以表达一种2-丁醇生物合成途径，所述途径包括下列产物向底物的、酶催化的转化：

a)丙酮酸至α-乙酰乳酸；

b)α-乙酰乳酸至乙偶姻；

c)乙偶姻至2，3-丁二醇；

d)2，3-丁二醇至2-丁酮；以及

e)2-丁酮至2-丁醇。

所述微生物还可经基因修饰以表达一种异丁醇生物合成途径从而产生异丁醇，如Donaldson等人在美国专利申请公布2007/0092957和WO 2007/050671中所述，此二专利以引用方式并入本文。例如，所述微生物可经基因修饰以包含一种异丁醇生物合成途径，所述途径包括下列产物向底物的、酶催化的转化：

a)丙酮酸至乙酰乳酸；

b)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；

c)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；

d)α-酮异戊酸至异丁醛；以及

e)异丁醛至异丁醇。

经基因修饰从而能将可发酵的碳源转化为丁醇的微生物可以是一种重组的大肠杆菌菌株，该菌株包含：一种如上所述的异丁醇生物合成途径；对下列基因的删除以去除限制异丁醇生产的竞争性途径，列为SEQ ID NO：23的pflB(编码丙酮酸甲酸裂解酶)，列为SEQ ID NO：24的ldhA(编码乳酸脱氢酶)，列为SEQ ID NO：25的adhE(编码乙醇脱氢酶)；以及至少一种包含frdABCD操纵子(编码延胡索酸还原酶)的基因，具体而言，列为SEQ ID NO：26的frdA，列为SEQ ID NO：27的frdB，列为SEQ ID NO：28的frdC和列为SEQ ID NO：29的frdD。

所述大肠杆菌菌株可包含：(a)由下列基因编码的一种异丁醇生物合成途径：来自肺炎克雷伯氏菌的budB(列为SEQ ID NO：1)，其编码乙酰乳酸合酶(列为SEQ ID NO：2)，来自大肠杆菌的ilvC(列为SEQ ID NO：3)，其编码乙酰羟酸还原异构酶(列为SEQ ID NO：4)，来自大肠杆菌的ilvD(列为SEQ ID NO：5)，其编码乙酰羟酸脱水酶(列为SEQ ID NO：6)，来自乳酸乳球菌的kivD(列为SEQ ID NO：7)，其编码支链酮酸脱羧酶(列为SEQ ID NO：8)，以及来自木糖氧化无色杆菌的sadB(列为SEQ ID NO：9)，其编码一种丁醇脱氢酶(列为SEQ ID NO：10)；以及(b)对下列基因的删除：pflB(SEQ ID NO：23)，ldhA(SEQ ID NO：24)，adhE(SEQ ID NO：25)，和frdB(SEQ ID NO：27)。所述异丁醇生物合成途径的基因所编码的酶，催化将丙酮酸转换为异丁醇所需的底物向产物的转化，如上所述。具体而言，乙酰乳酸合酶催化丙酮酸向乙酰乳酸的转化，乙酰羟酸还原异构酶催化乙酰乳酸向2，3-二羟基异戊酸的转化，乙酰羟酸脱水酶催化2，3-二羟基异戊酸向α-酮异戊酸的转化，支链酮酸脱羧酶催化α-酮异戊酸向异丁醛的转化，丁醇脱氢酶催化异丁醛向异丁醇的转化。所述重组的大肠杆菌菌株可以采用本领域已知的方法构建，如本文的实施例部分的一般方法部分所示。

所述啤酒糖酵母菌株可包含：一种由下列基因编码的异丁醇生物合成途径：来自枯草芽孢杆菌的alsS编码区(SEQ ID NO：32)，其编码乙酰乳酸合酶(SEQ ID NO：33)，来自啤酒糖酵母的ILV5(SEQ ID NO：40)，其编码乙酰羟酸还原异构酶(KARI；SEQ ID NO：41)和/或一种突变的KARI如Pf5.IlvC-Z4B8(SEQ ID NO：36；蛋白质SEQ ID NO：37)所编码的，来自变形链球菌的ilvD(SEQ ID NO：58)，其编码乙酰羟酸脱水酶(SEQ ID NO：59)，来自枯草芽孢杆菌的kivD(SEQ ID NO：43)，其编码支链酮酸脱羧酶(SEQ ID NO：44)，以及来自木糖氧化无色杆菌的sadB(SEQ ID NO：9)，其编码一种丁醇脱氢酶(SEQ ID NO：10)。所述异丁醇生物合成途径的基因所编码的酶，催化将丙酮酸转换为异丁醇所需的底物向产物的转化，如本文所述。

一种表达一种异丁醇途径的优选的酵母菌株在其胞质中具有乙酰乳酸合酶(ALS)活性，并包含对内源性丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的删除，如共同持有的和共同未决的美国专利申请#61/058970中所述，该专利以引用方式并入本文。胞质的ALS和降低的PDC表达的组合，被发现大大提高了从丙酮酸至乙酰乳酸的流量，乙酰乳酸进而流向产生丁醇的途径。

这种重组的啤酒糖酵母菌株可采用本领域已知的方法构建，如下文的实施例部分的一般方法部分所示。

有机萃取剂

本文所述的方法中有用的萃取剂为不能与水混溶的有机溶剂。适当的有机萃取剂应符合一种用于商业化地生产或回收丁醇的双相萃取发酵的理想溶剂的标准。具体而言，所述萃取剂应(i)对生产丁醇的微生物，例如经基因修饰的大肠杆菌、植物乳杆菌和啤酒糖酵母无毒，(ii)充分地与发酵培养基不能混溶，(iii)对于丁醇的萃取具有高的分配系数，(v)具有低的与发酵培养基形成乳剂的趋势，(vi)为低成本和无毒害的。用于本文所公开的方法的适当的有机萃取剂选自：C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物。如文本所用，术语“它们的混合物”既包括这些组的成员内部的混合物，也包括这些组的成员之间的混合物，例如C₁₂-C₂₂脂肪醇内部的混合物，以及C₁₂-C₂₂脂肪醇和C₁₂-C₂₂脂肪酸之间混合物。

在某些情况下，小于12-碳链长度的萃取剂可对所述微生物有害，并因而对通过生物合成途径生产丁醇的过程有害。就一种11-碳萃取剂而言，其对微生物的影响可依赖于条件，但亦可为有害的。当一种C₁₁脂肪醇、一种C₁₁脂肪酸、一种C₁₂脂肪酸的酯、一种C₁₁醛，以及它们的混合物可对所述过程有害时，例如当一种微生物在所采用的条件下受到上述C₁₁混合物的不利影响时，应避免使用这样的萃取剂。适当的有机萃取剂进一步选自：油醇(CAS No.143-28-2)，二十二醇(CAS No.661-19-8)，鲸蜡醇(CAS No.36653-82-4)，月桂醇，亦称1-十二烷醇(CAS No.112-53-8)，肉豆蔻醇(112-72-1)，硬脂醇(CAS No.112-92-5)，1-十一醇(CAS No.112-42-5)，油酸(CAS No.112-80-1)，月桂酸(CAS No.143-07-7)，肉豆蔻酸(CAS No.544-63-8)，硬脂酸(CAS No.57-11-4)，肉豆蔻酸甲酯(CAS No.124-10-7)，油酸甲酯(CAS No.112-62-9)，十一醛(CAS No.112-44-7)，月桂醛(CAS No.112-54-9)，2-甲基十一醛(CAS No.110-41-8)，以及它们的混合物。这些有机萃取剂有多种商品化来源，例如Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，其商品有多种等级，其中许多可适用于生产或回收丁醇的萃取发酵。工业级商品包含化合物的混合物，包括所期望的组分以及高级和低级脂肪组分。例如，一种可商购获得的工业级油醇包含约65％的油醇和一种高级和低级脂肪醇的混合物。

具有本领域的适当技能的人能够理解，使用一种所述有机萃取剂的混合物可能是有利的。例如，可使用溶剂混合物来提高产物的分配系数。此外，可使用溶剂混合物来调整或优化所述溶剂的物理特性，如密度、沸点和粘度。

利用双相萃取发酵生产丁醇的方法

可于一个适当的发酵罐内在一种适当的发酵培养基中培养所述微生物以生产丁醇。可使用任何适当的发酵罐，包括搅拌槽发酵罐，气升式发酵罐，气泡发酵罐，或它们的任何组合。用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法，为微生物学或发酵科学领域的技术人员所熟知(例如参见Bailey等人Biochemical Engineering Fundamentals，第二版，McGraw Hill，New York，1986)。基于所述的微生物、发酵和方法的具体要求，必须考虑适当的发酵培养基、pH、温度以及对有氧、微需氧和厌氧条件的需求。对所使用的发酵培养基要求并不严格，但其必须支持所使用的微生物的生长并活化生产所期望的丁醇产品所必需的生物合成途径。可使用一种常规的发酵培养基，包括但不限于，包含有机氮源如酵母提取物或蛋白胨和至少一种可发酵的碳源的复合培养基；基本培养基；以及组合培养基。适当的可发酵的碳源包括但不限于，单糖，如葡萄糖或果糖；二糖，如乳糖和蔗糖；低聚糖；多糖，如淀粉或纤维素；一碳底物；以及它们的混合物。除上述适当的碳源之外，所述发酵培养基还可包含一种适当的氮源如一种铵盐，酵母提取物或蛋白胨，矿物质，盐类，辅因子，缓冲液以及其他组分，如本领域的技术人员所已知(Bailey等人，见上文)。所述萃取发酵的适当条件依赖于所使用的具体微生物，并且本领域的技术人员可采用常规实验方便地予以确定。

利用双相萃取发酵回收丁醇的方法

可自一种发酵培养基回收丁醇，所述发酵培养基包含丁醇，水，至少一种可发酵的碳源，以及一种经基因修饰以通过一种生物合成途径从至少一种碳源生产丁醇的(即遗传工程的)微生物。此类经基因修饰的微生物可选自：大肠杆菌，植物乳杆菌和啤酒糖酵母。所述方法的第一步为使所述发酵培养基与一种不能与水混溶的有机萃取剂接触，如上所述，以形成一种包含一种水相和一种含丁醇的有机相的双相混合物。“接触”是指所述发酵培养基与所述有机萃取剂在所述发酵过程的任何时间发生物理接触。在一个实施方案中，所述发酵培养基还包含乙醇，并且所述含丁醇的有机相可包含乙醇。

所述有机萃取剂可以在发酵开始的时候与所述发酵培养基接触，从而形成一种双相的发酵培养基。作为另外一种选择，所述有机萃取剂可以在当所述微生物达到一个期望的生长量之后与所述发酵培养基接触，其中所述生长量的达到可以通过测定培养物的光密度而确定。

进一步地，所述有机萃取剂可以在当所述发酵培养基中的丁醇水平达到一个预先确定的水平时与所述发酵培养基接触，例如在丁醇浓度达到有毒水平之前。所述丁醇浓度可以利用本领域已知的方法，例如气相色谱法或高效液相色谱法，在发酵期间加以监测。

发酵可以在有氧条件下进行一段足以使培养物达到一个预先选定的生长水平的时间，如通过测量光密度确定生长水平。然后可加入一种诱导剂以在所述经修饰的微生物中诱导所述丁醇生物合成途径的表达，并将发酵条件转至微需氧或厌氧条件，以刺激丁醇的生产，如下文的实施例6中所详述。所述萃取剂于转至微需氧或厌氧条件之后加入。

在所述发酵培养基与所述有机萃取剂接触之后，丁醇产物分配至所述有机萃取剂，降低了包含所述微生物的水相中的浓度，从而限制了生产丁醇的微生物在抑制性的丁醇产品中的暴露。所使用的有机萃取剂的体积依赖于多种因素，包括所述发酵培养基的体积，所述发酵罐的尺寸，丁醇产物在所述萃取剂中的分配系数，以及发酵模式的选择，如下所述。所述有机萃取剂的体积为发酵罐工作容积的约3％至约60％。

下一步为利用本领域已知的方法，包括但不限于虹吸、滗析、离心、利用重力分离器以及膜辅助的相分裂等等，将所述含丁醇的有机相从所述水相分离。丁醇从所述含丁醇的有机相中的回收可以用本领域已知的方法进行，这些方法包括但不限于蒸馏、树脂吸附、通过分子筛分离以及全蒸发等等。具体而言，可以采用蒸馏从所述含丁醇的有机相中回收丁醇。

可与所述有机萃取剂同时地采用汽提从所述发酵培养基中除去丁醇产物。汽提可以通过将一种气体，如空气、氮气或二氧化碳，通过所述发酵培养基，从而形成一种含丁醇的气相。丁醇产物可以用本领域已知的方法，如利用一种冷却水装置或用一种溶剂洗涤所述气相，从所述含丁醇的气相中得到回收。

发酵过程完成之后存在于发酵培养基中的任何丁醇均可通过用新鲜的或循环利用的有机萃取剂持续萃取而得到回收。作为另外的选择，丁醇可以用本领域已知的方法，如蒸馏、共沸蒸馏、液-液萃取、吸附、汽提、膜蒸发以及全蒸发等等，从所述发酵培养基中得到回收。

所述双相萃取发酵方法可于一个搅拌槽发酵罐中以连续模式进行。在这种模式中，所述发酵培养基和所述含丁醇的有机萃取剂的混合物被从发酵罐中除去。通过本领域已知的方法，包括但不限于虹吸、滗析、离心、利用重力分离器以及膜辅助的相分裂等等，将此两相分离，如上所述。分离之后，所述发酵培养基可放回发酵罐中回收利用，或者也可用新鲜的培养基取而代之。然后，对所述萃取剂进行处理以回收丁醇产物，如上所述。萃取剂接下来可被放回发酵罐中回收利用，用于进一步萃取产物。作为另外一种选择，可持续地将新鲜的萃取剂加入到发酵罐中，以替换被移除的萃取剂。这种连续的运行模式具有若干优点。由于产物被不断地从反应器中除去，只需较小体积的有机萃取剂就能允许较大体积的发酵培养基的使用。结果带来较高的产品收率。所述有机萃取剂的体积可以为所述发酵罐工作容积的约3％至约50％；为所述发酵罐工作容积的3％至约20％；或为所述发酵罐工作容积的3％至约10％。使用尽可能最小量的萃取剂以使所述水相的体积最大化，从而使所述发酵罐内细胞的量最大化，是有利的。所述过程可以以一种完全连续的模式运行，在这种模式中，萃取剂在发酵罐和一种分离设备之间连续循环利用，而发酵培养基被连续地从所述发酵罐中除去并由新鲜的培养基补足。在这种完全连续的模式中，丁醇产物不被允许达到毒性临界浓度，并且新鲜的营养物质被连续地提供，因此发酵可以长时间进行。可用于进行这些模式的双相萃取发酵的设备为本领域所熟知。例如，实例由Kollerup等人描述于美国专利4,865,973中。

也可以采用分批发酵模式。为本领域所熟知的分批发酵系一种封闭系统，其中发酵培养基的组成设定于发酵开始的时候，并且在发酵过程中不受人为的调整。在这种模式中，一定体积的有机萃取剂被加入发酵罐中，并且这些萃取剂在发酵过程中不被除去。虽然这种模式比上述连续的或者完全连续的模式更简单，但它需要更大体积的有机萃取剂，以使发酵培养基中抑制性的丁醇产物的浓度最小化。因此，发酵培养基的体积相对更少，所生产的产物的量也比采用上述连续模式时所获得的更少。在这种分批模式中，有机溶剂的体积可以是发酵罐工作容积的20％至约60％；或发酵罐工作容积的30％至约60％。基于上文所述原因，在发酵罐中使用尽可能最小体积的萃取剂是有利的。

还可采用分批补料发酵模式。分批补料发酵是标准的分批系统的一种变型，在这种模式中，营养物质如葡萄糖在发酵期间被分批加入。营养物质加入的量和速率可通过常规实验确定。例如，可以在发酵期间监测发酵培养基中关键营养物质的浓度。作为另外的选择，可以对更易测量的因素，如pH、溶解氧以及废气，如二氧化碳的分压，加以监测。从这些测量参数可以确定营养物质添加的速率。在这种模式中使用的有机溶剂的量与在分批模式中所使用的相同，如上文所述。

产物的萃取可以在发酵罐的下游，而不是在原位进行。在这种外部模式中，丁醇产物向所述有机萃取剂中的萃取，系采用已自发酵罐中移出的发酵培养基进行。所使用的有机溶剂的量为发酵罐工作容积的约20％至约60％；或者为发酵罐工作容积的30％至约60％。所述发酵培养基可以连续地或者间歇地从发酵罐中移除，并且用所述有机萃取剂对丁醇产物进行的萃取可以在从发酵培养基中去除或者不去除细胞的情况下进行。细胞可以通过本领域已知的方法从发酵培养基中去除，所述方法包括但不限于过滤或离心。在用上述方法将发酵培养基与萃取剂分离之后，所述发酵培养基可放入发酵罐中回收利用，或者被丢弃，或者进行取出任何残余的丁醇产物的处理。类似地，分离出的细胞也可放入发酵罐中回收利用。在进行回收丁醇产物的处理之后，萃取剂可被回收利用于萃取过程中。作为另外一种选择，也可以使用新鲜的萃取剂。在这种模式中，溶剂不存在于发酵罐中，因此所述溶剂的毒性远不是一个问题。如果在使发酵培养基与溶剂接触之前即将细胞从所述发酵培养基中分离，则进一步减小了溶剂毒性的问题。此外，采用这种外部模式时，形成乳液的可能性更小，并且溶剂的蒸发被最小化，减轻了环境问题。

提供了一种生产丁醇的方法，其中一种微生物被培养于一种双相发酵培养基中，所述微生物系经过基因修饰，从而能将至少一种可发酵的碳源转化为丁醇。所述双相发酵培养基由一种水相和一种不能与水混溶的有机萃取剂组成，如上文所述，其中，这种双相发酵培养基包含以体积计从约3％至约60％的所述有机萃取剂。所述微生物可于所述双相发酵培养基中生长一段时间，其足以使丁醇被萃取至所述萃取剂，从而形成一种含丁醇的有机相。当所述发酵培养基还包含乙醇时，所述含丁醇的有机相可包含乙醇。然后，将所述含丁醇的有机相从所述水相分离，如上文所述。随后，从所述含丁醇的有机相回收丁醇，如上文所述。

异丁醇可通过萃取发酵生产，所述萃取发酵使用一种经修饰的大肠杆菌或啤酒糖酵母菌株，并且以油醇作为有机萃取剂。就异丁醇而言，采用本文所述的方法可提供一个高的有效滴度。Atsumi等人(Nature 451(3)：86-90，2008)报导了用一种经过基因修饰从而包含一种异丁醇生物合成途径的大肠杆菌进行发酵时，最高22g/L的异丁醇滴度。用本文所公开的方法生产的丁醇具有一个大于22g每升发酵培养基的有效滴度。或者，用本文所公开的方法生产的丁醇具有一个至少25g每升发酵培养基的有效滴度。或者，用本文所公开的方法生产的丁醇具有一个至少30g每升发酵培养基的有效滴度。或者，用本文所公开的方法生产的丁醇具有一个至少37g每升发酵培养基的有效滴度。

不受理论的约束，据信用本文所公开的萃取发酵方法获得的较高的丁醇滴度，部分地是由于有毒的丁醇产物从发酵培养基中的移除，从而保持了其水平低于对所述微生物有毒的水平。

油醇作为有机萃取剂的使用具有一种令人吃惊的，并且在本发明被提出时并未得到很好了解的额外的有益效果。具体而言，油醇作为萃取剂的使用与汽提相结合提供了与单独采用汽提时相比显著更高的滴度，尽管单独采用汽提亦能有效地使丁醇保持在毒性水平以下。包含油醇或者基本上由油醇组成的有机萃取剂能在本文所述的过程中提供更高的滴度。

现在参见图3，显示的是采用原位萃取发酵生产和回收丁醇的过程的一个实施方案的示意图。含至少一种可发酵的碳源的水流10被引入一个发酵罐20，该发酵罐内装有至少一种经基因修饰以将所述至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的微生物(未示出)。所述第一不能与水混溶的萃取剂的流12和所述任选的第二不能与水混溶的萃取剂的流14被引入一个容器16，上述萃取剂在该容器中合并形成萃取剂18。上述萃取剂18的流被引入发酵罐20，上述发酵培养基和萃取剂在其中发生接触，从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含上述水相和有机相的流26被引入一个容器38，在该容器中，进行上述水相和有机相的分离，从而产生一种含丁醇的有机相40和一种水相42。

现在参见图4，显示的是采用原位萃取发酵生产和回收丁醇的过程的一个实施方案的示意图。含至少一种可发酵的碳源的水流10被引入一个发酵罐20，该发酵罐内装有至少一种经基因修饰以将所述至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的微生物(未示出)。所述第一不能与水混溶的萃取剂的流12和所述任选的第二不能与水混溶的萃取剂的流14被分别引入上述发酵罐20，上述发酵培养基和萃取剂在其中发生接触，从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含上述水相和有机相的流26被引入一个容器38，在该容器中，进行上述水相和有机相的分离，从而产生一种含丁醇的有机相40和一种水相42。

现在参见图5，显示的是采用原位萃取发酵生产和回收丁醇的过程的一个实施方案的示意图。含至少一种可发酵的碳源的水流10被引入第一发酵罐20，该发酵罐内装有至少一种经基因修饰以将所述至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的微生物(未示出)。所述第一不能与水混溶的萃取剂的流12被引入上述发酵罐20，并且包含由上述第一溶剂和发酵罐20的内容物组成的混合物的流22被引入一个第二发酵罐24。所述任选的第二不能与水混溶的萃取剂的流14被引入上述第二发酵罐24，上述发酵培养基和萃取剂在其中发生接触，从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含上述水相和有机相的流26被引入一个容器38，在该容器中，进行上述水相和有机相的分离，从而产生一种含丁醇的有机相40和一种水相42。

现在参见图6，显示的是生产和回收丁醇的过程的一个实施方案的示意图，其中对产物的萃取在发酵罐的下游，而不是在原位进行。含至少一种可发酵的碳源的水流110被引入一个发酵罐120，该发酵罐内装有至少一种经基因修饰以将所述至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的微生物(未示出)。所述第一不能与水混溶的萃取剂的流112和所述任选的第二不能与水混溶的萃取剂的流114被引入一个容器116，上述不能与水混溶的萃取剂在该容器中合并形成萃取剂118。发酵罐120中的发酵培养基的至少一部分，显示为流122，被引入容器124。所述萃取剂118的流也被引入容器124，上述发酵培养基和萃取剂在其中发生接触，从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含上述水相和有机相的流126被引入一个容器138，在该容器中，进行上述水相和有机相的分离，从而产生一种含丁醇的有机相140和一种水相142。

现在参见图7，显示的是生产和回收丁醇的过程的一个实施方案的示意图，其中对产物的萃取在发酵罐的下游，而不是在原位进行。含至少一种可发酵的碳源的水流110被引入一个发酵罐120，该发酵罐内装有至少一种经基因修饰以将所述至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的微生物(未示出)。所述第一不能与水混溶的萃取剂的流112和所述任选的第二不能与水混溶的萃取剂的流114被分别引入一个容器124，上述不能与水混溶的萃取剂在该容器中合并形成萃取剂118。发酵罐120中的发酵培养基的至少一部分，显示为流122，也被引入容器124，上述发酵培养基和萃取剂在其中发生接触，从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含上述水相和有机相的流126被引入一个容器138，在该容器中，进行上述水相和有机相的分离，从而产生一种含丁醇的有机相140和一种水相142。

现在参见图8，显示的是生产和回收丁醇的过程的一个实施方案的示意图，其中对产物的萃取在发酵罐的下游，而不是在原位进行。含至少一种可发酵的碳源的水流110被引入一个发酵罐120，该发酵罐内装有至少一种经基因修饰以将所述至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的微生物(未示出)。所述第一不能与水混溶的萃取剂的流112被引入一个容器128，并且发酵罐120中的发酵培养基的至少一部分，显示为流122，也被引入容器128。包含由上述第一不能与水混溶的萃取剂和发酵罐120的内容物组成的混合物的流130被引入一个第二发酵罐132。所述任选的第二不能与水混溶的萃取剂的流114被引入上述第二发酵罐132，上述发酵培养基和萃取剂在其中发生接触，从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含上述水相和有机相的流134被引入一个容器138，在该容器中，进行上述水相和有机相的分离，从而产生一种含丁醇的有机相140和一种水相142。

本文所述的萃取过程可以作为分批过程运行，或者可以以一种连续模式运行，其中新鲜的萃取剂被加入而使用过的萃取剂被泵出，使得发酵罐中的萃取剂的量在整个发酵过程中保持不变。如此对发酵培养基中产物和副产物的连续萃取能提高有效速率、滴度和产量。

在另一个实施方案中，还可以在一种柔性顺流中，或者作为另外一种选择，以逆流方式进行液-液萃取，其中当使用一系列分批发酵罐时，所述逆流方式是导致分批操作模式的差异的原因。在这种方案中，只要设备在运行，提供了至少一种可发酵的碳源和微生物的发酵醪液就会以连续方式一个接一个地充满发酵罐。参见图9，一旦发酵罐F100被醪液和微生物填满，所述醪液和微生物就进一步填入发酵罐F101，继而填入发酵罐F102，然后回到发酵罐F100形成一个连续循环。在任何一个发酵罐中，一旦醪液和微生物同时存在，发酵即开始，并持续至发酵完全。醪液和微生物的充填时间等于发酵罐的数量除以总的循环时间(填充，发酵，排空和清洗)。若总的循环时间为60小时且有3个发酵罐，则充填时间为20小时。若总的循环时间为60小时且有4个发酵罐，则充填时间为15小时。

适合的顺流萃取所根据的发酵模式假定，以较高的肉汤相滴度运行的发酵罐能够利用丁醇浓度最高的萃取溶剂，而以最低的肉汤相滴度运行的发酵罐能受益于丁醇浓度最低的萃取溶剂流。例如，再次参见图9，考虑此种情况，即发酵罐F100位于一次发酵的启始并以相对低的丁醇肉汤相(B)滴度运行，发酵罐F101位于发酵的中部并以相对中等的丁醇肉汤相滴度运行，并且发酵罐F102靠近发酵的末端并以相对高的丁醇肉汤相滴度运行。这种情况下，不含或仅含极少的萃取的丁醇的贫萃取溶剂(S)，可被供给发酵罐F100，来自发酵罐F100的含有萃取的丁醇组分的“流出溶剂”(S’)可作为“流入溶剂”被供给发酵罐F101，而来自F101的流出溶剂可继而作为流入溶剂供给发酵罐F102。然后，来自F102的流出溶剂可接受处理以回收该溶剂流中存在的丁醇。绝大多数丁醇已被除去的经过处理的溶剂流，可作为贫萃取溶剂加回到体系中，并作为供给上述发酵罐F100的流入溶剂。

随着发酵以一种有序方式进行，可重置萃取溶剂多歧管的阀门，以将最贫的萃取溶剂供给以最低的丁醇肉汤相滴度运行的发酵罐。例如，假定(a)发酵罐F102完成了其发酵过程，已被重新装料并重新开始发酵，(b)发酵罐F100处于其发酵过程的中期，正以中等的丁醇肉汤相滴度运行，以及(c)发酵罐F101接近其发酵过程的末期，正以相对较高的丁醇肉汤相滴度运行。在这种情形中，最贫的萃取溶剂将会供给F102，自F102流出的萃取溶剂将会供给发酵罐F100，而自发酵罐F100流出的萃取溶剂将会供给发酵罐F101。

以这种方式运行的好处在于可在尽量长的时间里保持肉汤相丁醇滴度尽可能地低，从而实现生产率的提升。此外，在已进一步进入以较高的丁醇肉汤相滴度运行的发酵过程的其他发酵罐中，是有可能降低温度的。温度的降低能允许对较高丁醇肉汤相滴度的耐受力的提升。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步限定。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的实质性特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。

所有的溶剂(即萃取剂)均自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)获得，并在未经进一步纯化的情况下被使用。所使用的油醇为工业级，其包含油醇(65％)以及高级和低级脂肪醇的混合物。所使用的其他溶剂的纯度如下：油酸，65至88％；辛酸，98％；壬醇，98％；1-十二烷醇，98％；1-壬醛，95％，以及1-癸醇，98％。异丁醇自Sigma-Aldrich获得，并在未经进一步纯化的情况下被使用。

一般方法

重组的大肠杆菌菌株NGCI-031的构建

如下所述，构建了一种重组的大肠杆菌菌株，所述菌株包含一种异丁醇生物合成途径和对下列基因的删除：pflB(SEQ ID NO：23，编码丙酮酸甲酸裂解酶)，ldhA(SEQ ID NO：24，编码乳酸脱氢酶)，adhE(SEQ ID NO：25，编码乙醇脱氢酶)，以及frdB(SEQ ID NO：27，编码延胡索酸还原酶的一个亚基)。上述异丁醇生物合成途径中的基因为：来自肺炎克雷伯氏菌的budB(列为SEQ ID NO：1)，来自大肠杆菌的ilvC(列为SEQ ID NO：3)，来自大肠杆菌的ilvD(列为SEQ ID NO：5)，来自乳酸乳球菌的kivD(列为SEQ ID NO：7)，以及来自木糖氧化无色杆菌的sadB(列为SEQ ID NO：9)。上述重组菌株的构建通过两步完成。首先，构建了一种具有前述基因删除的大肠杆菌菌株。然后，将编码上述异丁醇生物合成途径的基因引入该菌株。

具有pflB、ldhA、adhE和frdB基因删除的重组大肠杆菌菌株的构建

大肠杆菌的Keio菌株集(Baba等人，Mol.Syst.Biol.，2：1-11，2006)被用于构建具有目的基因删除的大肠杆菌菌株，所述菌株在本文中称为四重敲除大肠杆菌菌株。Keio菌株集是用Datsenko和Wanner的方法(Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.976640-6645，2000)在大肠杆菌菌株BW25113中构建的一个单基因敲除库。在这个菌株集中，每一被删除的基因均被一个侧翼与FRT相接的卡那霉素标记所取代，所述标记可被Flp重组酶移除。通过将上述敲除-卡那霉素标记从Keio供体菌株转移至一种受体菌株，构建了上述四重敲除的大肠杆菌菌株，其中所述转移系通过P1转导进行。在每次产生了一个敲除的P1转导之后，通过Flp重组酶移除了上述卡那霉素标记。这种不带标记的菌株被作为下一次P1转导的新的供体菌株。

所述四重敲除的大肠杆菌菌株系通过P1_vir转导在Keio菌株JW0886中构建，所述转导系用自JW0886以及另外三种Keio菌株制备的P1噬菌体溶菌产物进行。所用的Keio菌株如下：

-JW0886：kan标记被插入至pflB基因

-JW4114：kan标记被插入至frdB基因

-JW1375：kan标记被插入至ldhA基因

-JW1228：kan标记被插入至adhE基因

P1_vir转导的进行在Miller所述的基础上有所改变(Miller，J.H.1992.A Short Course in Bacterial Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y)。简而言之，供体菌株的细胞在Luria-Bertani(LB)培养基中于37℃振荡培养过夜，以制备一种转导溶菌产物。在包含0.005M CaCl₂的LB培养基中，并置于不通气的37℃水浴中，对生长过夜的细胞进行继代培养。在加入噬菌体之前一小时，将细胞于37℃振荡孵育。在上述细胞进行最后的生长之后，将一份1.0mL的等分试样分配至14-mL管中，并加入大约10⁷ P1_vir噬菌体。将上述管在37℃水浴中孵育20min，然后向每管中加入2.5mL的0.8％LB上层琼脂。将上述管中的内容物涂布于一块LB琼脂板上，并于37℃孵育。于次日将软琼脂层刮入一个离心管中。用LB培养基清洗板的表面并加入到上述离心管中，加入几滴CHCl₃，然后用涡旋搅拌器剧烈振荡离心管。于4,000rpm离心10min之后，收集包含P1_vir溶菌产物的上清液。

将受体菌株在1-2mL的LB培养基中于37℃振荡培养过夜，以用于转导。通过以一台微型离心机(Eppendorf)在10,000rpm室温离心1min使培养物沉淀。上述细胞沉淀被重悬于等体积的MC缓冲液(0.1M MgSO₄，0.005M CaCl₂)中，并以0.1mL的等分试样被分配至管中，然后加入0.1mL和0.01mL的P1_vir溶菌产物。实验同时包括一不含P1_vir的对照管。将上述管于37℃孵育20min，之后加入0.2mL 0.1M柠檬酸钠以终止P1感染。向每管中加入1mL LB培养基，然后于37℃孵育1h。孵育之后如上所述使细胞沉淀，再重悬于50-200μL的LB中，然后涂布于含25μg/mL的卡那霉素的LB平板上，于37℃培养过夜。通过菌落PCR对转导体进行筛选，所述PCR采用包围了上述卡那霉素标记插入上游和下游区域的染色体特异性引物。

通过用质粒pCP20(Cherepanov，P.and Wackernagel，W.，Gene，158：9-14，1995)转化上述卡那霉素-抗性菌株，然后涂布于LB氨苄青霉素(100μg/mL)平板并置于30℃孵育，实现上述卡那霉素标记自染色体上的移除。上述pCP20质粒携带受λ_PR启动子控制的酵母FLP重组酶。来自该启动子的表达受位于该质粒上的cI857温度敏感的阻遏子控制。pCP20的复制起点同样是温度敏感的。将氨苄青霉素抗性菌落在LB琼脂板上划线，并于42℃孵育。较高的孵育温度同时诱导了FLP重组酶的表达和从细胞中活化了pCP20质粒。分离的菌落以网格方式接种至包含卡那霉素(25μg/mL)的LB平板、LB氨苄青霉素(100μg/mL)平板和LB平板。通过菌落PCR对得到的卡那霉素敏感的、氨苄青霉素敏感的菌落进行了筛选，以确认上述卡那霉素标记从染色体上的移除。

菌落PCR扩增使用HotStarTaq Master Mix(Qiagen，Valencia，CA；目录号71805-3)按照制造商规程进行。在一个25μL Master Mix反应中包含每种染色体特异性PCR引物0.2μM，并加入了少量体积的一种菌落。扩增在DNA热循环仪GeneAmp 9700(PE Applied Biosystems，Foster city，CA)中进行。典型的菌落PCR条件如下：95℃ 15min；95℃ 30sec，50-58℃范围的退火温度30sec，引物在72℃按照约1min/kb DNA的时间延伸，30个循环；72℃10min，然后将温度保持在4℃。PCR产物的大小通过凝胶电泳和与已知分子量的标准品的比较确定。

coli如Ausubel，F.M.等人(Current Protocols in Molecular Biology，1987，Wiley-Interscience，)所述制备了电感受态的大肠杆菌细胞，以用于转化。细胞被培养于25-50mL的LB培养基中，培养温度为30-37℃，然后通过在10,000rpm离心10min收集OD₆₀₀在0.5-0.7的细胞。以与上述培养物的初始体积等体积的冰冷无菌水洗涤收集的细胞两遍。在最后一次洗涤之后，细胞被重悬于无菌水中，并加入了待转化的DNA。上述细胞和DNA被转移到冷的小皿中，并在一台Bio-Rad Gene Pulser II中按照制造商的说明书进行电转化(Bio-Rad Laboratories，Inc Hercules，CA)。

用质粒pCP20转化了菌株JW0886(ΔpflB::kan)，将转化后的菌株涂布于包含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板并于30℃培养。然后选择氨苄青霉素抗性的转化体，在LB平板上划线并于42℃培养。分离的菌落被接种至氨苄青霉素和卡那霉素选择培养基平板和LB平板上。利用引物pflB CkUp(SEQ ID NO：11)和pflB CkDn(SEQ ID NO：12)进行菌落PCR，对卡那霉素敏感的和氨苄青霉素敏感的菌落进行了筛选。通过凝胶电泳对一份10μL的PCR反应混合液等分试样进行了分析。观察到了大约0.4kb的目的PCR产物，从而确认了上述标记的移除和“JW0886 markerless”菌株的构建成功。该菌株包含pflB基因的删除。

用来自JW4114(frdB::kan)的P1_vir溶菌产物对上述“JW0886 markerless”菌株进行了转导，并将其涂布接种于包含25μg/mL卡那霉素的LB平板上。利用引物frdB CkUp(SEQ ID NO：13)和frdB CkDn(SEQ ID NO：14)进行菌落PCR，对卡那霉素抗性的转导体进行了筛选。如上所述，将产生了所预期的约1.6kb PCR产物的菌落制备为电感受态，并用pCP20对其进行转化以移除标记，如上文所述。转化体首先在30℃被涂布于包含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，然后选择氨苄青霉素抗性的转化体划线接种至LB平板上并于42℃培养。分离的菌落被接种至氨苄青霉素和卡那霉素选择培养基平板和LB平板上。利用引物frdB CkUp(SEQ ID NO：13)和frdB CkDn(SEQ ID NO：14)进行PCR，对卡那霉素敏感的、氨苄青霉素敏感的菌落进行了筛选。观察到了大约0.4kb的目的PCR产物，从而确认了上述标记的移除和双敲除菌株“ΔpflB frdB”的构建成功。

用来自JW1375(ΔldhA::kan)的P1_vir溶菌产物对上述双敲除菌株进行了转导，并将其涂布于包含25μg/mL卡那霉素的LB平板上。利用引物ldhA CkUp(SEQ ID NO：15)和ldhA CkDn(SEQ ID NO：16)进行菌落PCR，对卡那霉素抗性的转导体进行了筛选。如上所述，将产生了所预期的约1.1kb PCR产物的菌落制备为电感受态，并用pCP20对其进行转化以移除标记。转导体在30℃被涂布于包含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，氨苄青霉素抗性的转化体被划线接种至LB平板上并于42℃培养。分离的菌落被接种至氨苄青霉素和卡那霉素选择培养基平板和LB平板上。利用引物ldhA CkUp(SEQ ID NO：15)和ldhA CkDn(SEQ ID NO：16)，针对0.3kb的产物进行PCR，对卡那霉素敏感的、氨苄青霉素敏感的菌落进行了筛选。产生了所预期的大约0.3kb的PCR产物的菌落确认了标记的移除，从而构建了称为“三敲除菌株”(ΔpflB frdB ldhA)的三重敲除的菌株。

用来自JW1228(ΔadhE::kan)的P1_vir溶菌产物对上述三敲除菌株进行了转导，并将其涂布于包含25μg/mL卡那霉素的LB平板上。利用引物adhE CkUp(SEQ ID NO：17)和adhE CkDn(SEQ ID NO：18)进行菌落PCR，对卡那霉素抗性的转导体进行了筛选。将产生了所预期的约1.6kb PCR产物的菌落制备为电感受态，并用pCP20对其进行转化以移除标记。转导体在30℃被涂布于包含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。氨苄青霉素抗性的转化体被划线接种至LB平板上并于42℃培养。分离的菌落被接种至氨苄青霉素和卡那霉素选择培养基平板和LB平板上。利用引物adhE CkUp(SEQ ID NO：17)和adhE CkDn(SEQ ID NO：18)进行PCR，对卡那霉素敏感的、氨苄青霉素敏感的菌落进行了筛选。产生了所预期的大约0.4kb的PCR产物的菌落被命名为“四敲除菌株”(ΔpflB frdB ldhA adhE)。

编码一种异丁醇生物合成途径的一组基因向上述四敲除大肠杆菌菌株中的引入。

如共同待决和共同持有的美国专利申请公布2007/0092957的实施例9-14中所述，构建了质粒pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD，上述专利以引用方式并入本文。该质粒包含下列基因：来自肺炎克雷伯氏菌的编码乙酰乳酸合酶的budB(SEQ ID NO：1)，来自大肠杆菌的编码乙酰羟酸还原异构酶的ilvC基因(SEQ ID NO：3)，来自大肠杆菌的编码乙酰羟酸脱水酶的ilvD(SEQ ID NO：5)，以及来自乳酸乳球菌的编码支链酮酸脱羧酶的kivD(SEQ ID NO：7)。来自木糖氧化无色杆菌的编码一种丁醇脱氢酶的sadB基因(SEQ ID NO：9)被亚克隆至pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD质粒中，如下所述。

采用标准条件，从木糖氧化无色杆菌基因组DNA中扩增了来自木糖氧化无色杆菌的编码一种丁醇脱氢酶的一段DNA片段(DNA：SEQ ID NO：9；protein：SEQ ID NO：10)(公开于共同待决和共同持有的美国专利申请61/048291)。按照针对革兰氏阴性菌推荐实验规程，使用Gentra Puregene试剂盒(Gentra Systems，Inc.，Minneapolis，MN；产品目录号D-5500A)制备了上述DNA。PCR扩增系用正向和反向引物N473和N469(SEQ ID NO分别为19和20)以及Phusion high Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs，Beverly，MA)进行。PCR产物被TOPO-Blunt克隆至pCR4 BLUNT(Invitrogen)，从而得到pCR4Blunt::sadB，然后将该质粒转入了大肠杆菌coli Mach-1细胞。随后从四个克隆中分离了质粒，并对序列进行了验证。

然后，sadB编码区被克隆至载体pTrc99a(Amann等人，Gene 69：301-315，1988)。用EcoRI消化上述pCR4Blunt::sadB，释放出sadB片段，将该片段与经EcoRI消化的pTrc99a连接，从而形成质粒pTrc99a::sadB。该质粒被转入大肠杆菌Mach 1细胞，所得到的转化体被命名为Mach1/pTrc99a::sadB。以异丁醛作为标准品进行分析，上述细胞中表达自sadB基因的酶的活性经测定在无细胞抽提液中为3.5mmol/min/mg蛋白质。

然后，上述sadB基因被亚克隆至pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD如下。利用Phusion High Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs，Beverly，MA)和引物N695A(SEQ ID NO：21)和N696A(SEQ ID NO：22)，从pTrc99a::sadB扩增出sadB编码区。扩增按以下程序进行：首先于98℃变性1min；然后是98℃变性10sec，62℃退火30sec，72℃延伸20sec，30个循环；然后于72℃进行5min最后的延伸，最后将温度保持于4℃。引物N695A包含一个用于克隆的AvrII限制性位点和一个位于sadB编码区的起始密码子上游的RBS(核糖体结合位点)。引物N696A包含一个用于克隆的XbaI位点。以AvrII和XbaI(New England Biolabs，Beverly，MA)对上述1.1kb PCR产物进行了消化，并用Qiaquick Gel Extraction Kit(Qiagen Inc.，Valencia，CA))进行了凝胶纯化。利用T4 DNA连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)，将上述经纯化的片段与已用相同的限制酶酶切过的pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD连接。连接混合物被置于16℃孵育过夜，然后按照制造商规程转入大肠杆菌Mach 1^TM感受态细胞(Invitrogen)。获得的转化体培养于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。利用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen Inc.，Valencia，CA)，按照制造商规程制备了来自上述转化体的质粒DNA。得到的质粒称为pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD-sadB。用pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD-sadB转化了如上文所述制备的电感受态四敲除大肠杆菌细胞。转化体被划线接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上。所得到的重组大肠杆菌菌株包含由质粒pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD-sadB编码的一种异丁醇生物合成途径，和pflB、frdB、ldhA以及adhE基因的删除，并被命名为菌株NGCI-031。

酵母菌株NGI-049的构建

NGI-049是一种含内源性PDC1、PDC5和PDC6基因的插入失活，并包含表达载体pLH475-Z4B8和pLH468的啤酒糖酵母菌株。PDC1、PDC5和PDC6基因编码丙酮酸脱羧酶的三种主要的同功酶。该菌株表达编码一种异丁醇生物合成途径的酶的基因，所述基因为整合的或者位于质粒上。

表达载体pLH475-Z4B8

构建了用于在酵母中表达ALS和KARI的质粒pLH475-Z4B8(SEQ ID NO：30)。pLH475-Z4B8是一种包含下列嵌合基因的pHR81载体(ATCC#87541)。

1)CUP1启动子(SEQ ID NO：31)，来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合酶编码区(AlsS；SEQ ID NO：32；蛋白质SEQ ID NO：33)和CYC1终止子(SEQ ID NO：34)；

2)ILV5启动子(SEQ ID NO：35)，Pf5.IlvC-Z4B8编码区(SEQ ID NO：36；蛋白质SEQ ID NO：37)和ILV5终止子(SEQ ID NO：38)；以及

3)FBA1启动子(SEQ ID NO：39)，啤酒糖酵母KARI编码区(ILV5；SEQ ID NO：40；蛋白质SEQ ID NO：41)和CYC1终止子。

所述Pf5.IlvC-Z4B8编码区系一段编码来自荧光假单胞菌的KARI但包含突变的序列，其被描述于共同持有的和共同待决的美国专利申请#12/337736中，该专利以引用方式并入本文。上述Pf5.IlvC-Z4B8编码的KARI(SEQ ID NO：37；)与野生型荧光假单胞菌KARI相比，具有下列的氨基酸变换：

C33L：位于位点33的半胱氨酸变为亮氨酸，

R47Y：位于位点47的精氨酸变为酪氨酸，

S50A：位于位点50的丝氨酸变为丙氨酸，

T52D：位于位点52的苏氨酸变为天冬酰胺，

V53A：位于位点53的缬氨酸变为丙氨酸，

L61F：位于位点61的亮氨酸变为苯丙氨酸，

T80I：位于位点80的苏氨酸变为异亮氨酸，

A156V：位于位点156的丙氨酸变为苏氨酸，以及

G170A：位于位点170的甘氨酸变为丙氨酸。

上述Pf5.IlvC-Z4B8编码区系基于针对在啤酒糖酵母中的表达优化的密码子，利用DNA 2.0(Palo Alto，CA；SEQ ID NO：6)合成的。

表达载体pLH468

构建了用于在酵母中表达DHAD、KivD和HADH的质粒pLH468(SEQ ID NO：42)。

subtilis基于针对在啤酒糖酵母中的表达优化的密码子，利用DNA2.0合成了枯草芽孢杆菌酮异戊酸脱羧酶(KivD)和马肝脏醇脱氢酶(HADH)的编码区(SEQ ID NO分别为43和45)，并提供于质粒pKivDy-DNA2.0和pHadhy-DNA2.0中。所编码的蛋白质为别为SEQ ID NOs：44和46。构建了KivD和HADH单独的表达载体。用AscI和SfiI酶对载体pNY8(SEQ ID NO：47；也称为pRS426.GPD-ald-GPDt，描述于共同持有的和共同待决的US Patent App.Pub.US2008/0182308，实施例17，该专利以引用方式并入本文)进行了消化，从而切下上述GPD1启动子和ald编码区，以装配pLH467(pRS426::P_GPD1-kivDy-GPD1t)。用5’引物OT1068和3’引物OT1067(SEQ ID NOs：49和50)对来自pNY8的一段GPD1启动子片段(SEQ ID NO：48)进行了PCR扩增，以在5’端加上一个AscI位点，并在3’端加上一个SpeI位点。将上述经AscI/SfiI消化的pNY8载体片段，与经AscI和SpeI消化的GPD1启动子PCR产物，以及分离自载体pKivD-DNA2.0的包含经密码子优化的kivD编码区的SpeI-SfiI片段相连接。这种三方连接产生了载体pLH467(pRS426::P_GPD1-kivDy-GPD1t)。通过限制性图谱和测序对pLH467进行了验证。

pLH435(pRS425::P_GPM1-Hadhy-ADH1t)源自载体pRS425::GPM-sadB(SEQ ID NO：51)，后者描述于共同持有的和共同待决的US Patent App.#61/058970，实施例3，该专利以引用方式并入本文。pRS425::GPM-sadB系包含了一个嵌合基因的pRS425载体(ATCC#77106)，所述嵌合基因包含GPM1启动子(SEQ ID NO：52)，来自木糖氧化无色杆菌的一种丁醇脱氢酶的编码区(sadB；SEQ ID NO：9；蛋白质SEQ ID NO：10：公开于共同持有的和共同待决的US Patent App.#61/048291)，以及ADH1终止子(SEQ ID NO：53)。pRS425::GPMp-sadB在上述sadB编码区的5’和3’端分别包含BbvI和PacI位点。通过利用引物OT1074和OT1075(SEQ ID NO：54和55)进行定点诱变，在上述sadB编码区的5’端加上了一个NheI位点，从而产生载体pRS425-GPMp-sadB-NheI，该载体经过了测序验证。用NheI和PacI消化pRS425::P_GPM1-sadB-Nhe以释放出sadB编码区，并将来自载体pHadhy-DNA2.0的包含经密码子优化的HADH编码区的NheI-PacI片段与上述经消化的质粒连接，从而得到pLH435。

用SacI和NotI消化了酵母载体pRS411(ATCC#87474)，并在一个三方连接反应中，将上述经消化的载体与来自pLH467的包含P_GPD1-kivDy-GPD1t表达盒的SacI-SalI片段和来自pLH435的包含P_GPM1-Hadhy-ADH1t表达盒的SalI-NotI片段相连接，以将KivD和HADH表达盒联合于同一载体中。这样就产生了载体pRS411::P_GPD1-kivDy-P_GPM1-Hadhy(pLH441)，该载体经过了限制性图谱验证。

为了构建下游的异丁醇途径ilvD、kivDy和Hadhy中的全部三种基因的一种共表达载体，我们使用描述于共同持有的和共同待决的美国专利申请#61/100792中的pRS423 FBA ilvD(链球菌的)(SEQ ID NO：56)作为IlvD基因的来源。这种穿梭载体包含一个在大肠杆菌中共生所需的F1复制起点(nt 1423至1879)和一个在酵母中复制所需的2微米起点(nt 8082至9426)。该载体含有一个FBA启动子(nt 2111至3108；SEQ ID NO：39)和FBA终止子(nt 4861至5860；SEQ ID NO：57)。此外，它还携带用于在酵母中进行选择的His标记(nt 504至1163)和用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗性标记(nt 7092至7949)。来自变形链球菌UA159(ATCC#700610)的ilvD编码区(nt 3116至4828；SEQ ID NO：58；蛋白质SEQ ID NO：59)位于上述FBA启动子和FBA终止子之间，从而构成了一个用于表达的嵌合基因。此外，上述ilvD编码区还融合了一个lumio标签(nt 4829-4849)。

第一步是用SacI和SacII将pRS423 FBA ilvD(Strep)(也叫做pRS423-FBA(SpeI)-IlvD(Streptococcus mutans)-Lumio)线性化(并利用T4 DNA聚合酶将SacII位点平末端化)，从而得到一种全长为9,482bp的载体。第二步是用SacI和KpnI从pLH441分离出kivDy-hADHy盒(并利用T4 DNA聚合酶将KpnI位点平末端化)，得到一种6,063bp的片段。将该片段与来自pRS423-FBA(SpeI)-IlvD(Streptococcus mutans)-Lumio的9,482bp载体片段相连接。如此产生了载体pLH468(pRS423::P_FBA1-ilvD(Strep)Lumio-FBA1t-P_GPD1-kivDy-GPD1t-P_GPM1-hadhy-ADH1t)，该载体经过了限制性图谱和测序确认。

pdc6::GPMp1-sadB整合盒和PDC6删除的构建：

通过将来自pRS425::GPM-sadB(如上所述)的GPM-sadB-ADHt片段(SEQ ID NO：60)，与来自pUC19-URA3r的URA3r基因相联，构建了一种pdc6::GPM1p-sadB-ADH1t-URA3r整合盒。pUC19-URA3r(SEQID NO：61)包含来自pRS426(ATCC#77107)的URA3标记，该标记两翼为75bp的同源重复序列，以允许体内同源重组和URA3标记的移除。以pRS425::GPM-sadB和pUC19-URA3r质粒DNA作为模板，利用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs Inc.，Beverly，MA；目录号F-540S)和引物114117-11A至114117-11D(SEQ ID NOs：62，63，64和65)以及114117-13A和114117-13B(SEQ ID NOs：66和67)，通过重叠延伸PCR(SOE PCR)(如Horton等人(1989)Gene 77：61-68所述)将上述两种DNA片段相连。

SOE PCR的外侧引物(114117-13A和114117-13B)包含5’和3’～50bp分别与PDC6启动子和终止子的上游和下游区域同源的区域。利用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.201-202)，将完整的盒PCR片段转入了BY4700(ATCC#200866)，并将转化体在30℃培养于不含尿嘧啶且补充了2％葡萄糖的合成的完全培养基上。利用引物112590-34G和112590-34H(SEQ ID NOs：68和69)，以及112590-34F和112590-49E(SEQ ID NOs：70和71)，通过PCR对转化体进行了筛选，以验证PDC6编码区的删除在PDC6基因座处的整合。通过按照标准规程在30℃涂布于补充了2％葡萄糖和5-FOA的合成的完全培养基上，对上述URA3r标记进行了回收利用。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，生长的被抑制确认了标记的移除。得到的经过鉴定的菌株具有下列基因型：BY4700pdc6::P_GPM1-sadB-ADH1t。

pdc1::PDC1-ilvD整合盒PDC1删除的构建：

利用SOE PCR(如Horton等人(1989)Gene 77：61-68所述)，通过将来自pLH468(参见上文)的ilvD-FBA1t片段(SEQ ID NO：72)与来自pUC19-URA3r的URA3r基因相连，构建了一种pdc1::PDC1p-ilvD-FBA1t-URA3r整合盒，其中所述SOE PCR系用pLH468和pUC19-URA3r质粒DNA作为模板，利用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs Inc.，Beverly，MA；目录号F-540S)和引物114117-27A至114117-27D(SEQ ID NOs：73，74，75和76)进行。

SOE PCR的外侧引物(114117-27A和114117-27D)包含5’和3’～50bp与PDC1启动子的下游区域和PDC1编码区的下游区域同源的区域。利用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.201-202)，将完整的盒PCR片段转入了BY4700 pdc6::P_GPM1-sadB-ADH1t，并将转化体在30℃培养于不含尿嘧啶且补充了2％葡萄糖的合成的完全培养基上。利用引物114117-36D和135(SEQ ID NOs：77和78)，以及112590-49E和112590-30F(SEQ ID NOs：70和79)，通过PCR对转化体进行了筛选，以验证PDC1编码区的删除在PDC1基因座处的整合。通过按照标准规程在30℃涂布于补充了2％葡萄糖和5-FOA的合成的完全培养基上，对上述URA3r标记进行了回收利用。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，生长的被抑制确认了标记的移除。得到的经过鉴定的菌株“NYLA67”具有下列基因型：BY4700 pdc6::GPM1p-sadB-ADH1t pdc1::PDC1p-ilvD-FBA1t。

HIS3删除

为了删除内源的HIS3编码区，从URA3r2模板DNA(SEQ ID NO：84)PCR扩增了一种his3::URA3r2盒。URA3r2包含来自pRS426(ATCC#77107)的URA3标记，该标记两翼为500bp的同源重复序列，以允许体内同源重组和URA3标记的移除。PCR系利用Phusion DNA聚合酶和引物114117-45A和114117-45B(SEQ ID NOs：85和86)进行，其产生了一种～2.3kb PCR产物。每种引物的HIS3部分来源于HIS3启动子上游的5’区域和编码区下游的3’区域，如此URA3r2标记的整合导致HIS3编码区的置换。利用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.201-202)，将上述PCR产物转入了NYLA67，并在30℃于不含尿嘧啶且补充了2％葡萄糖的合成的完全培养基上对转化体进行了选择。通过在30℃利用复制平板培养法在不含组氨酸且补充了2％葡萄糖的合成的完全培养基上对转化体进行了筛选，以验证正确的整合。通过按照标准规程在30℃涂布于补充了2％葡萄糖和5-FOA的合成的完全培养基上，对上述URA3r标记进行了回收利用。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，生长的被抑制确认了标记的移除。得到的经过鉴定的菌株“NYLA73”具有下列基因型：BY4700 pdc6::GPM1p-sadB-ADH1t pdc1::PDC1p-ilvD-FBA1tΔhis3。

pdc5::kanMX整合盒以及PDC5删除的构建：

利用Phusion DNA聚合酶和引物PDC5::KanMXF和PDC5::KanMXR(SEQ ID NOs：80和81)，从菌株YLR134W染色体DNA(ATCC No.4034091)PCR扩增了一种pdc5::kanMX4盒，产生了一种～2.2kb PCR产物。每种引物的PDC5部分来源于PDC5启动子上游的5’区域和编码区下游的3’区域，如此kanMX4标记的整合导致PDC5编码区的置换。利用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.201-202)，将上述PCR产物转入了NYLA73，并在30℃于补充了1％乙醇和基因霉素(geneticin)(200μg/ml)的YP培养基上对转化体进行了选择。利用引物PDC5kofor和N 175(SEQ ID NOs：82和83)，通过PCR对转化体进行了筛选，以验证PDC5编码区的删除在PDC基因座处的整合。经鉴定的正确的转化体具有下列基因型：BY4700pdc6::GPM1p-sadB-ADH1t pdc1::PDC1p-ilvD-FBA1t Δhis3pdc5::kanMX4。

利用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.201-202)，将质粒载体pLH468和pLH475-Z4B8同时转入了菌株BY4700pdc6::GPM1p-sadB-ADH1t pdc1::PDC1p-ilvD-FBA1t Δhis3pdc5::kanMX4，并在30℃培养于不含组氨酸和尿嘧啶且补充了1％乙醇的合成的完全培养基上。

用于测定异丁醇的GC方法

下列GC方法用于在下述的实施例1-7中测定所述水相和有机相中的异丁醇的量。所述GC方法利用来自Agilent Technologies(Santa Clara，CA)的一种HP-InnoWax柱(30m×0.32mm ID，0.25μm膜)。载气为流速1mL/min的氦气，测量于150℃、恒定的头部压力；注射分流比在200℃为1∶10；炉温为45℃1min，以10℃/min从45℃至230℃，以及230℃30sec。在260℃并使用40mL/min氦尾吹气，进行火焰离子化检测。在注射前先通过0.2μm旋转过滤器对培养物肉汤样品进行了过滤。根据所期望的分析灵敏度，使用了0.1μL或0.5μL的注射体积。对于下列化合物，产生了校准过的标准曲线：乙醇，异丁醇，乙偶姻，内消旋-2，3-丁二醇，以及(2S，3S)-2，3-丁二醇。还利用了分析标准品来鉴定异丁醛、异丁酸和异戊醇的保留时间。这这些条件下，异丁醇的保留时间为约5.33分钟。

用于测定水相中的葡萄糖和异丁醇的HPLC方法

对于实施例7和8，采用上述GC方法测定了所述有机相中的异丁醇。对于实施例7和8，所述水相中的异丁醇和葡萄糖浓度系利用一Shodex sugar SH1011柱，8.0mm×300mm，(Showa Denko K.K.，Kanagawa，Japan(通过Thompson Instruments，Clear Brook，VA))，用0.01N硫酸溶液作为洗脱剂等度洗脱，通过HPLC(Waters Alliance Model，Milford，MA或Agilent 1100 Series，Santa Clara，CA)测量。样品通过一个0.2μm注射式过滤器(PALL GHP膜)注入一个HPLC样品瓶。HPLC运行条件如下：

注射体积：10μL

流速：0.80mL/分钟

运行时间：32分钟

柱温：50℃

检测器：折射指数

检测器温度：40℃

UV检测：210nm，4nm带宽

运行结束后，根据标准曲线测定每个化合物在样本中的浓度。异丁醇和葡萄糖的保留时间分别为27.0和8.7分钟。

实施例1

溶剂的筛选

本实施例的目的是筛选用于丁醇的萃取发酵的各种有机溶剂。所研究的溶剂特性为丁醇在所述溶剂与一种水相之间的分配、所述溶剂在上述双相体系中的乳液形成趋势、以及所述溶剂与一种野生型啤酒糖酵母菌株的生物相容性。

研究了丁醇在水与下列溶剂之间的分配：油酸(CAS No.112-80-1)，油醇(CAS No.143-28-2)，辛酸(CAS No.124-07-2)，1-壬醇(CAS No.28473-21-4)，1-十二烷醇(CAS No.112-53-8)，1-壬醛(CAS No.124-19-6)，和1-癸醇(CAS No.112-30-1)。异丁醇被加入水中，以形成异丁醇终浓度为10、30、50和70g/L的水溶液。这些异丁醇水溶液(12mL)被分别加入到试管中，并加入4mL的待测溶剂。每种溶剂在每一异丁醇浓度均以一式两份进行测试。上述试管边混匀边于30℃孵育3小时。之后，通过离心将来自每一试管的水相和溶剂相分离，并用上文的一般方法部分中所描述的GC方法对异丁醇进行了分析。对异丁醇在每种溶剂相和水相之间的分配系数进行了计算，即K_p＝[Isobutanol]_Org/[isobutanol]_Aq。结果总结于表2中。

表2

丁醇的分配系数

溶剂	平均分配系数
		油酸	2.7
油醇	3.7
		辛酸	6.7
壬醇	6.7
		1-十二烷醇	5.2
1-壬醛	5.7
		1-癸醇	4.7

从表中的数据可以看出，对于丁醇，所有被测试的溶剂均具有令人满意的分配系数。

通过对获得自ATCC的啤酒糖酵母BY4741进行摇瓶研究，测定了每种溶剂的生物相容性。200μL的啤酒糖酵母BY4741种菌被接种至包含700mL的酵母提取物/蛋白胨/右旋糖(YPD)培养基的种子摇瓶中，并将摇瓶于30℃以250rpm振荡培养过夜，直到OD₆₀₀达到约0.5。从上述培养物中提取了样品，用于用分光光度计测量OD₆₀₀和用HPLC测量葡萄糖浓度。

所得到的种子培养物被分装进八个125mL培养瓶，如下所述。在一个用作对照的培养瓶中，加入了100mL的上述种子培养物。在其余七个培养瓶中，加入了75mL的上述种子培养物和25mL的待测溶剂。上述培养瓶被置于30℃孵育，并用一台桌面摇床(Innova 4230，New Brunswick Scientific，Edison，NJ)以250rpm振荡，在不同时间从每一培养瓶中取出样品测定OD₆₀₀和葡萄糖浓度。结果总结于表3和4中。

表3

光察度结果

表4

葡萄糖结果

从表3和4的结果可以看出，在油酸、油醇和1-十二烷醇的存在下培养的啤酒糖酵母，显示出与不存在溶剂的对照组相同水平的葡萄糖利用和生长，表明这些溶剂与受试的啤酒糖酵母菌株具有生物相容性。溶剂辛酸、1-壬醛、1-癸醇和壬醇均抑制了上述啤酒糖酵母菌株的生长和葡萄糖利用。

实施例2和实施例3(比较)

啤酒糖酵母在异丁醇和油醇存在下的生长

这些实施例的目的在于证明油醇能减缓异丁醇对啤酒糖酵母的毒性。在油醇存在(实施例2)和油醇不存在(实施例3，比较)下的包含高浓度异丁醇的野生型啤酒糖酵母BY4741菌株摇瓶培养物中，测量了该菌株的葡萄糖消耗速率和生长速率。

分别将100、300和1000μL的啤酒糖酵母BY4741种菌接种至包含600mL YPD培养基的种子摇瓶中。将上述摇瓶于30℃以250rpm振荡培养过夜，直到OD₆₀₀达到约0.1。从每种培养物中提取了样品，并测量了OD₆₀₀和葡萄糖浓度，如上所述。

将来自上述300μL种菌(实施例3，比较)的培养物100mL加入一个125mL培养瓶中。向另一个125mL培养瓶中加入了75mL的上述培养物和25mL的油醇(即25％体积)(实施例2)。将上述培养瓶于30℃以100rpm振荡培养。提取了样品用于测量OD₆₀₀和葡萄糖。当OD₆₀₀达到约0.4时，向两个培养瓶中均加入终浓度为30g/L水相的异丁醇。一个包含75mL的上述培养物和25％体积的油醇但不加入异丁醇的第三培养瓶用作阳性对照。在不同的时间从所有培养瓶中提取样品，用于测定OD₆₀₀和葡萄糖浓度。光密度结果和葡萄糖结果分别显示于表5和6中。

表5

油醇存在和不存在下的光密度结果

表6

油醇存在和不存在下的葡萄糖浓度

从表5和6中的数据可以看出，当油醇不存在时(实施例3，比较)，浓度为30g/L的异丁醇几乎完全抑制了葡萄糖的利用和生物质的生长。但是，当培养物中加入了油醇时，所述培养物能够在浓度为30g/L的异丁醇存在下生长和利用葡萄糖。包含异丁醇和油醇的培养物的生长和葡萄糖利用率与仅含油醇的对照组是相当的。这些结果证明油醇减缓了异丁醇对受试的啤酒糖酵母菌株的毒性。可以合理地预期，油醇能用于减缓异丁醇以及其他的丁醇对包括重组菌株在内的其他啤酒糖酵母菌株的毒性。

实施例4和实施例5(比较)

植物乳杆菌在异丁醇和油醇存在下的生长

这些实施例的目的在于证明油醇能减缓异丁醇对植物乳杆菌的毒性。在油醇存在(实施例4)和油醇不存在(实施例5，比较)下的包含高浓度异丁醇的植物乳杆菌PN0512菌株摇瓶培养物中，测量了该菌株的葡萄糖消耗速率和生长速率。

分别将200、500和1000μL的植物乳杆菌PN0512菌株种菌(ATCC：PTA-7727，于2006年7月12日因美国专利申请11/761497进行生物保藏)接种至包含50mL的de Man-Rogosa-Sharpe(MRS)培养基的三个种子摇瓶中。将上述培养瓶于30℃以250rpm振荡培养过夜，直到OD₆₀₀为介于2和5之间。从一个OD₆₀₀＝3的上述种子培养瓶中接种至一个包含600mL MRS培养基的1-L培养瓶中，使后者的初始OD₆₀₀＝0.1并于30℃以180rpm对其振荡培养。培养4至5小时之后，OD₆₀₀为介于0.5和1.0之间。从每一培养物中提取样品，并如上文所述测量了OD₆₀₀和葡萄糖浓度。

向一个125mL培养瓶中加入了100mL的来自上述1-L培养瓶(实施例3，比较)的培养物。向另一个125mL培养瓶中加入了75mL的上述培养物和25mL的油醇(即25％体积)(实施例2)。将上述培养瓶瓶于30℃以100rpm振荡培养。提取了样品用于测量OD₆₀₀和葡萄糖。当OD₆₀₀达到约1.5时，向两个培养瓶中均加入终浓度为30g/L水相的异丁醇。一个包含75mL的上述培养物和25％体积的油醇但不加入异丁醇的第三培养瓶用作阳性对照。在不同的时间从所有培养瓶中提取样品，用于测定OD₆₀₀和葡萄糖浓度。光密度结果和葡萄糖结果分别显示于表7和8中。

表7

油醇存在和不存在下的光密度结果

表8

油醇存在和不存在下的葡萄糖浓度

从表7和8中的数据可以看出，当油醇不存在时(实施例3，比较)，浓度为30g/L的异丁醇几乎完全抑制了上述乳杆菌菌株对葡萄糖的利用和生物质的生长。但是，当培养物中加入了油醇时，所述培养物能够在浓度为30g/L的异丁醇存在下生长和利用葡萄糖。包含异丁醇和油醇的培养物的生长和葡萄糖利用率与仅含油醇的对照组是相当的。这些结果证明油醇减缓了异丁醇对受试的植物乳杆菌菌株的毒性。可以合理地预期，油醇能用于减缓异丁醇以及其他的丁醇对包括重组菌株在内的其他植物乳杆菌菌株的毒性。

实施例6

利用萃取发酵通过重组的大肠杆菌生产异丁醇

本实施例的目的，在于证明利用萃取发酵、通过一种包含一种异丁醇生物合成途径的重组的大肠杆菌菌株对异丁醇的生产，其中所述萃取发酵以油醇作为不能与水混溶的有机萃取剂。

所用的菌株为大肠杆菌NGCI-031菌株，该菌株的构建如上文的一般方法部分所述。用于菌种制备的所有种子培养物均培养于Luria-Bertani(LB)培养基中，并以氨苄青霉素(100mg/L)作为选择性抗生素。发酵培养基为一种半合成培养基，其组成列于表9中。

表9

发酵培养基组成

成分	量/L
		磷酸85％	0.75mL
硫酸(18M)	0.30mL
		Balch′s w/Cobalt-1000X(组成列于表10)	1.00mL
磷酸二氢钾	1.40g
		一水合柠檬酸	200g
七水合硫酸镁	200g
		柠檬酸铁铵	0.33g
二水合氯化钙	0.20g
		酵母提取物^a	5.00g
止泡剂204^b	0.20mL
		硫胺素·HCl，5g/L储液	1.00mL
氨苄青霉素，25mg/mL储液	4.00mL
		葡萄糖50重量％储液	33.3mL

^a购自BD Diagnostic Systems，Sparks，MD

^b购自Sigma-Aldrich

表10

Balch氏改进的痕量金属-1000X

成分	浓度(g/L)
		一水合柠檬酸	40.0
MnSO₄·H₂O	30.0
		NaCl	10.0
FeSO₄·7H₂O	1.0
		CoCl₂·6H₂O	1.0

ZnSO₄·7H₂O	1.5
		CuSO₄·5H₂O	0.1
硼酸(H₃BO₃)	0.1
		钼酸钠(NaMoO₄·2H₂O)	0.1

表9中的成分1-10以所规定的浓度加入水中，在发酵罐中定容至终体积为1.5L。发酵罐中的内容物以高压蒸汽法灭菌。将组分11-13混合，用过滤器除菌，待上述经高压蒸汽灭菌的培养基冷却后将其加入。所述发酵培养基(水相)总的终体积为约1.6L。

发酵使用一个工作体积为2.0L的Biostat-B DCU-3发酵罐(Braun Biotech International，Melesungen，Germany)进行。在整个发酵期间，温度维持于30℃，pH用氢氧化铵维持在6.8。将种子培养物(2-10体积％)接种至上述无菌的发酵培养基，然后以30％的溶解氧(DO)设定值，并通过对搅拌速率(rpm)的自动控制以0.5vvm的气流，使发酵罐有氧运行。一旦光密度(OD₆₀₀)达到期望值(即OD₆₀₀＝10)，即加入0.4-0.5mM IPTG以诱导培养物过表达上述异丁醇生物合成途径。诱导四小时之后，通过将搅拌器速率降至200rpm，将发酵条件转至微需氧条件。向微需氧条件的转换启动了丁醇的生产，同时使流向生物质生产的碳的量最小化，从而使生物质的形成与异丁醇的生产解偶联。于上述异丁醇生产阶段加入油醇(约780mL)，以减缓异丁醇在水相中的积累所导致的抑制问题。葡萄糖以一个大丸剂(50重量％储备液)的形式加入发酵罐，以保持葡萄糖的水平介于30g/L和2g/L之间。

因异丁醇的有效生产要求微需氧条件以满足所述生物合成途径中的氧化还原平衡，故以0.5vvm的速率持续向所述发酵罐中供给空气。持续通气导致了异丁醇从发酵罐中的水相显著地发生汽提。为了定量因汽提导致的异丁醇损失，来自发酵罐的尾气被通过一个冷却的(6.5℃)脱水器以冷凝异丁醇，然后用上文的一般方法部分中所述的GC方法对异丁醇进行定量。作为另外一种选择，从发酵罐排出的气流被直接送至一台质谱仪(Prima dB质谱仪，Thermo Electron Corp.，Madison，WI)并定量所述气流中异丁醇的量。对质荷比为74或42的异丁醇峰进行连续监测，以定量上述气流中异丁醇的量。

异丁醇生产的有效滴度、有效速率和有效产量均以因汽提导致的异丁醇损失校正之后，分别为37g/L、0.40g/L/h和0.33g/g。通过将上述结果与不用油醇作为萃取剂所获得的结果(如实施例7中所示，比较如下)相比可以看出，在生产异丁醇的萃取发酵中使用油醇带来了明显更高的有效滴度、有效速率和有效产量。对细菌宿主具有毒性的丁醇产物，被持续萃取至油醇相，降低了其在水相中的浓度，从而减小了其对微生物的毒性。此外，油醇似乎对异丁醇的生产还具有另一预料之外的有益效应。这点通过与实施例7(比较)的比较可以看出。在实施例7中，单独通过汽提从发酵培养基中持续移除异丁醇，使发酵培养基中的异丁醇浓度限制在约8-10g/L，这一水平与用油醇和汽提联合萃取时观察到的水平相当(参见图1)。在这两个实施例中，发酵的大部分过程中异丁醇的浓度均低于抑制性水平。然而，联合使用油醇萃取发酵和汽提时(实施例6)与单独使用汽提时(实施例7)相比，获得了显著更高的有效滴度、有效速率和有效产量，暗示油醇对异丁醇的生产还具有另一预料之外的有益效应。

实施例7(比较)

利用不添加萃取剂的发酵，通过重组的大肠杆菌生产异丁醇

本比较实施例的目的，在于证明不加入油醇时异丁醇的生产因产物的毒性而受到抑制。

除了在异丁醇生产阶段不向发酵培养基中加入油醇之外，发酵的进行如实施例6中所述。此外还进行了下列改变。通过加入IPTG对培养物进行的诱导系当OD₆₀₀达到6时进行，并且向微需氧条件的转换系于诱导3小时后进行。为了定量因汽提导致的异丁醇损失的量，来自发酵罐的尾气被直接送至一台质谱仪(Prima dB，Thermo Electron Corp.，Madison，WI)。对质荷比为74或42的异丁醇峰进行连续监测，以定量因汽提导致的异丁醇损失的量。

异丁醇生产的有效滴度、有效速率和有效产量均以因汽提导致的异丁醇损失校正之后，分别为13g/L、0.21g/L/h和0.22g/g。因异丁醇通过汽提被持续地自发酵培养基中移除，发酵期间水相中的异丁醇浓度被限制在最高8-10g/L，并且在发酵的大部分过程中低于抑制性水平(参见图1)。

实施例8

利用萃取发酵通过量组的啤酒糖酵母生产异丁醇

本实施例的目的，在于证明利用萃取发酵、通过一种包含一种异丁醇生物合成途径的重组的啤酒糖酵母菌株对异丁醇的生产，其中所述萃取发酵以油醇作为不能与水混溶的有机萃取剂。

所使用的菌株为啤酒糖酵母NGCI-049菌株，该菌株的构建如上文的一般方法部分所述。用于菌种制备的所有种子培养物均培养于添加了氨基酸Dropout混合物(1.4g/L)、亮氨酸(100mg/L)和色氨酸(20mg/L)的无氨基酸酵母氮源(YNB)培养基(6.7g/L)中。对于所有种子培养物，均以1％(v/v)的乙醇作为唯一的碳源。所用发酵培养基为一种半合成培养基，其组成列于表11中。

表11

发酵培养基组成

成分	量/L
		1.YNB w/o氨基酸^a	6.7g
2.Sigma Dropout Mix(Y2001)^b	2.8g
		3.亮氨酸(10g/L)	20mL
4.色氨酸(10g/L)	4mL
		5.乙醇	10mL
6.葡萄糖50重量％储液	4g

^a购自BD Diagnostic Systems，Sparks，MD

^b购自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO

表11中的成分1-4以所规定的浓度加入水中，在发酵罐中定容至终体积为0.54L。发酵罐中的内容物以高压蒸汽法灭菌。将组分5和6混合，用过滤器除菌，待上述经高压蒸汽灭菌的培养基冷却后将其加入。所述发酵培养基(水相)总的终体积为约0.54L。

发酵使用一个工作体积为900mL的1L耐高压加热生物反应器Bio Console ADI 1025(Applikon，Inc，Holland)进行。在整个发酵期间，温度维持于30℃，pH用氢氧化钠维持在5.5。将种子培养物(10体积％)接种至上述无菌的发酵培养基，然后以30％的溶解氧(DO)设定值，并通过对搅拌速率(rpm)的自动控制以0.3vvm的气流，使发酵罐有氧运行。一旦首批加入的2g/L葡萄糖被消耗，即用一台泵以使发酵罐中的葡萄糖从不积累至超过0.2g/L的指数速率供给葡萄糖。一旦光密度(OD₆₀₀)达到期望值(即OD₆₀₀＝6)，即通过以使发酵期间葡萄糖一直维持过量(＞2g/L)的方式供给葡萄糖，而将培养物诱导进入丁醇生产阶段。葡萄糖过量两小时后，加入60mL经过滤器除菌的10X酵母提取物蛋白胨储备液(10X YEP＝100g/L酵母提取物和200g/L蛋白胨)。加入YEP两小时后，于上述异丁醇生产阶段加入油醇(约300mL)，以减缓异丁醇和其他副产品在水相中的积累所导致的抑制问题。葡萄糖(50重量％储备液)被加入发酵罐中以保持葡萄糖水平高于2g/L。

因异丁醇的有效生产要求微需氧条件以满足所述生物合成途径中的氧化还原平衡，故以0.3vvm的速率持续向所述发酵罐中供给空气。持续通气导致了异丁醇从发酵罐中的水相显著地发生汽提。为了定量因汽提导致的异丁醇损失的量，来自发酵罐的尾气被直接送至一台质谱仪(Prima dB，Thermo Electron Corp.，Madison，WI)并定量所述气流中异丁醇的量。对质荷比为74或42的异丁醇峰进行连续监测，以定量上述气流中异丁醇的量。

上述发酵过程中，利用HPLC对水相中的葡萄糖和有机酸进行了监测。此外还用葡萄糖分析仪(YSI，Inc.，Yellow Springs，OH)对葡萄糖进行了快速监测。周期性地将水相和油醇相从发酵罐中移出并通过离心分离，然后通过HPLC对水相中的异丁醇进行了定量，并利用如上文的一般方法部分所述的GC方法对油醇相中的异丁醇进行了监测。发酵期间水相中的异丁醇浓度显示于图2中，其中实心正方形(■)表示发酵中用油醇作为有机萃取剂同时采用汽提的实施例8中的浓度，而实心圆形(●)表示发酵中单独使用汽提的实施例9(比较)中的浓度。

异丁醇生产的有效滴度、有效速率和有效产量均以因汽提导致的异丁醇损失校正之后，分别为5g/L、0.06g/L/h和0.16g/g。通过将上述结果与不用油醇作为萃取剂所获得的结果(如实施例9中所示，比较如下)相比可以看出，在生产异丁醇的萃取发酵中使用油醇带来了明显更高的有效滴度、有效速率和有效产量。对宿主具有毒性的丁醇产物，被持续萃取至油醇相，降低了其在水相中的浓度，从而减小了其对微生物的毒性。此外，油醇似乎对异丁醇的生产还具有另一预料之外的有益效应。这点通过与实施例9(比较)的比较可以看出。在实施例9中，单独通过汽提从发酵培养基中持续移除异丁醇，使发酵培养基中的异丁醇浓度限制在最高约4g/L，这一水平与用油醇和汽提联合萃取时观察到的水平相当(参见图2)。在这两个实施例中，发酵的大部分过程中异丁醇的浓度均低于抑制性水平。然而，联合使用油醇萃取发酵和汽提时(实施例8)与单独使用汽提时(实施例9)相比，获得了显著更高的有效滴度、有效速率和有效产量，暗示油醇对异丁醇的生产还具有另一预料之外的有益效应。

实施例9(比较)

利用不添加萃取剂的发酵，通过重组的啤酒糖酵母生产异丁醇

除了在异丁醇生产阶段不向发酵培养基中加入油醇之外，发酵的进行如实施例8中所述。为了定量因汽提导致的异丁醇损失的量，来自发酵罐的尾气被直接送至一台质谱仪(Prima dB，Thermo Electron Corp.，Madison，WI)。对质荷比为74或42的异丁醇峰进行连续监测，以定量因汽提导致的异丁醇损失的量。

异丁醇生产的有效滴度、有效速率和有效产量均以因汽提导致的异丁醇损失校正之后，分别为3g/L、0.04g/L/h和0.16g/g。因异丁醇通过汽提被持续地自发酵培养基中移除，发酵期间水相中的异丁醇浓度被限制在最高2-3g/L，并且在发酵的大部分过程中低于抑制性水平(参见图2)。

实施例10

可使用2L发酵罐来进行用重组的酵母生产丁醇的发酵，除首批加入的油醇的一部分被移除并被新鲜的油醇替换之外，其余如实施例8中所述。此过程可以一种连续模式进行，其中新鲜的油醇被缓慢滴入而用过的油醇被泵出，使得发酵罐中油醇的量在整个发酵过程中保持不变。如此对发酵培养基中产物和副产物的连续萃取能提高有效滴度、有效速率和有效产量。

Claims

1.用于从发酵培养基中回收丁醇的方法，所述方法包括：

b)使所述发酵培养基与下列接触：i)至少一种选自下列的第一不能与水混溶的有机萃取剂：C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，以及任选地(ii)选自下列的第二不能与水混溶的有机萃取剂：C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物；

c)将所述含丁醇的有机相从所述水相分离；以及

d)从所述含丁醇的有机相回收丁醇以制得回收的丁醇。

2.根据权利要求1的方法，其中所述丁醇为异丁醇。

3.根据权利要求1的方法，其中所述有机萃取剂选自：油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、十四醇、硬脂醇、1-十一醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、十一醛、月桂醛、2-甲基十一醛、以及它们的混合物。

4.根据权利要求3的方法，其中所述有机萃取剂包含油醇。

5.根据权利要求1的方法，其中所述丁醇的一部分通过包括以下步骤的方法同时从所述发酵培养基中被移除：

a)用气体从所述发酵培养基中汽提丁醇，形成含丁醇的气相；以及

b)从所述含丁醇的气相回收丁醇。

6.根据权利要求1的方法，其中所述回收的丁醇具有每升所述发酵培养基至少约37克的有效滴度。

7.根据权利要求1的方法，其中所述发酵培养基还包含乙醇，并且所述含丁醇的有机相包含乙醇。

8.用于生产丁醇的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供从包含至少一种可发酵的碳源的发酵培养基生产丁醇的经基因修饰的微生物；

b)在包含水相和不能与水混溶的有机萃取剂的双相发酵培养基中使所述微生物生长足以使丁醇被萃取到所述有机萃取剂中以形成含丁醇的有机相的时间，其中所述不能与水混溶的有机萃取剂选自C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，并且其中所述双相发酵培养基包含按体积计约3％至约60％的所述不能与水混溶的有机萃取剂；

c)将所述含丁醇的有机相从所述水相分离；以及

d)从所述含丁醇的有机相回收丁醇以制得回收的丁醇。

9.根据权利要求8的方法，其中所述丁醇为异丁醇。

10.根据权利要求8的方法，其中所述有机萃取剂选自：油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、十四醇、硬脂醇、1-十一醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、十一醛、月桂醛、2-甲基十一醛、以及它们的混合物。

11.根据权利要求8的方法，其中所述有机萃取剂包含油醇。

12.根据权利要求8的方法，其中所述丁醇的一部分通过包括以下步骤的方法同时从所述发酵培养基中被移除：

a)用气体从所述发酵培养基中汽提丁醇，从而形成含丁醇的气相；以及

b)从所述含丁醇的气相回收丁醇。

13.根据权利要求8的方法，其中所述回收的丁醇具有每升所述水相至少约37克的有效滴度。

14.根据权利要求8的方法，其中所述发酵培养基还包含乙醇，并且所述含丁醇的有机相包含乙醇。

15.用于生产丁醇的方法，所述方法包括以下步骤：

b)使上述微生物在发酵培养基中生长，其中上述微生物将所述丁醇产生到所述发酵培养基中以制得含丁醇的发酵培养基；

d)将所述含丁醇的有机相从所述水相分离；以及

e)从所述含丁醇的有机相回收丁醇。

16.根据权利要求15的方法，其中所述丁醇为异丁醇。

17.用于生产丁醇的方法，所述方法包括以下步骤：

b)在有氧条件下，使所述微生物在发酵培养基中生长足以达到预先选定的生长水平的时间；

e)将所述含丁醇的有机相从所述水相分离；以及

f)从所述含丁醇的有机相回收丁醇。

18.根据权利要求17的方法，其中所述丁醇为异丁醇。

19.用于生产丁醇的方法，所述方法包括以下步骤：

b)通过顺流的或逆流的萃取剂流，使所述发酵培养基与下列接触：i)至少一种选自下列的第一不能与水混溶的有机萃取剂：C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，以及任选地(ii)选自下列的第二不能与水混溶的有机萃取剂：C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物；

c)将所述含丁醇的有机相从所述水相分离；以及

d)从所述含丁醇的有机相回收丁醇以制得回收的丁醇。

20.根据权利要求19的方法，其中所述丁醇为异丁醇。

21.根据权利要求1、8、15、17和19中任一项的方法，其中所述经基因修饰的微生物选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。

22.根据权利要求18的方法，其中所述细菌选自发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)、产碱菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(Brevibacterium)。

23.根据权利要求18的方法，其中所述酵母选自毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)和糖酵母属(Saccharomyces)。