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大量製備發酵產物之方法
TWI665299B
Taiwan
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2014
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2014-06-27
2014-06-27
2016-01-01
2019-07-11
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2019-07-11
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本發明係關於一種大量製備發酵產物之方法，更特別地，係關於一種結合液液萃取法與氣提式產物分離法於中得到大量發酵產物之方法。
近年來由於二氧化碳等溫室氣體排放量遽增，導致全球暖化，再加上非再生能源，如石油、煤、天然氣等其蘊藏量日漸枯竭，於是尋求新且潔淨的替代能源以供日後使用，是目前急需重視的一個課題。生質能是目前眾所矚目的新能源，所謂的生質能，即利用生質作物經轉化而得到的電、熱或化學能等可用能源。生質作物係指生物產生的有機物質，如農作物的殘渣、動物牲畜的排泄物、製糖副產物、城市垃圾、工業廢水等。如同風能、太陽能一樣，生質能也是一種可再生能源，更有著提供低硫燃料、可降低空氣污染、廢棄物和家畜排泄物的再利用及降低廢棄物處理的負擔等。除此之外，生質能的技術難題也較少，而它的缺點則為其原料含大量水分、轉化率低再加上缺乏適合栽種植物的土地，導致單位土地面積的生質能密度偏低。
生質燃料即利用玉米、薯類、甘蔗等農作物中的澱粉成分，或者把草及樹的纖維素透過物理、化學、或微生物處理分解為葡萄糖、澱粉等小分子，再經由微生物發酵作用形成如乙醇、丁醇等液態能量來源。此外，水生浮游生物或藻類也是重要的生質能來源。丁醇是目前一個重要的工業化學品，其
可作為塑料行業的原料，在食品及香料工業也可以用來當作萃取劑。丙酮和丁醇可作為溶劑使用和生產的橡膠單體，丁二烯和二甲基丁二烯(Mollah and Stuckey 1993)。其中生質丁醇也可以作為燃料的延伸使用，生質丁醇比其他發酵所生產之燃料具備幾大優勢，與生質酒精比起來，丁醇為四個碳的醇類，碳數是乙醇的兩倍，在能量密度上乙醇在21.1~21.7MJ/L，丁醇則較高為26.9~27.0MJ/L，在相同的體積下，丁醇將比乙醇可以提供更高的熱值。丁醇的Reid蒸氣壓(Reid value，由流體蒸發速率決定)是4.35kPa，比乙醇的18kPa低很多，蒸氣壓越高表示在酷熱的氣候下爆炸的風險值越高，也因此丁醇在高溫氣候下的安全性相對較高。同時丁醇的碳數較多碳鏈較長，極性相對也較低，性質上比乙醇更接近汽油，添加入汽油內時可以得到更好的混合性，做為引擎的燃料或添加劑是較乙醇更為適合。由於極性較低，丁醇中的水分容許存在量將會比乙醇更低，水份量少將可使丁醇對金屬的腐蝕性比乙醇低，也因此對汽車引擎的腐蝕性較低，故生質丁醇在學術界及工業界也日漸受到更多的矚目(Ezeji,Qureshi et al.2007)。
微生物發酵生產丁醇，最早在1861年由Pasteur所發表，後來一些學者陸續研究以厭氧菌生產丁醇，在1912和1914年間，Weizmann於研究合成橡膠的過程中，發現丁醇或異戊醇是重要的化學合成中間物，並於1914年，提出利用C.acetobutylicum菌株進行丙酮-丁醇-乙醇(Acetone-Butanol-Ethanol (ABE)；以下以ABE表示)發酵法(T.and R.1986)。
生質丁醇-利用微生物平台透過發酵程序來生產丁醇，其中最為人熟識的即利用Clostridium之菌種，如C.acetobutylicum或C.beijerinckii進行丙酮(Acetone)、丁醇(Butanol)、乙醇(Ethanol)發酵，以厭氧菌Clostridium
作為菌種生產時，其ABE的產量比例約為3：6：1。在發酵過程中，產丁醇之菌種Clostridial屬嚴格厭氧菌，會利用澱粉或者醣類等碳源生長，當生長至指數生長期間，乙酸和丁酸隨之產生，待有機酸累積到一定程度，會產生代謝路徑上的轉移，此時Clostridium菌種會將乙酸、丁酸及剩餘醣類轉化成丙酮、丁醇此類的二次代謝物，最終丁醇濃度可達到12-18g/L(JONES and WOODS 1986,Ni and Sun 2009)。然而在Clostridium菌種進入溶劑產生期的同時，會伴隨著菌體自身形成孢子體情況的發生，進而停止代謝的行為，有研究指出，C.acetobutylicum ATCC824在經336小時連續培養，其生產溶劑能力大大地退化(Li,Srivastava et al.2011)。加上大型質體pSOL1的流失(此質體帶有生產溶劑的必要基因)，也造成clostridium菌種無法穩定生產丁醇(CORNILLOT,NAIR et al.1997)。此外，當丁醇累積到一定濃度，會對Clostridium菌種之細胞膜產生極化作用，進而抑制菌體生長，影響發酵程序。基於上述原因導致Clostridium菌種累積大量丁醇而使細菌逐漸失去活性，進而使得ABE發酵穩定性不佳。
由於ABE發酵產物多樣並且ABE溶劑最終濃度為20-25克/升，往往需要花費龐大的成本效益才能將最終產物分離純化。因此，ABE的分離純化技術就顯得更為重要，常見的分離技術有吸收(Ennis,Qureshi et al.1987)、氣提(Ennis,Marshall et al.1986,Ezeji,Qureshi et al.2004)、液-液萃取(Shukla,Kang et al.1989,Qureshi and Maddox 1995)、逆滲透(Iii,Iannotti et al.1986)、滲透萃取(Grobben,Eggink et al.1993)以及滲透蒸發技術(Larrayoz and Puigjaner 1987,Friedl,Qureshi et al.1991,Qureshi and Blaschek 1999)等分離方法，ABE發酵整合丁醇分離程序(in situ butanol removal)也普遍被運用，經由分離技術分離出來之丁醇，再以冷凝或蒸餾方式將其純化回收。
進行ABE發酵過程中，最終因丁醇濃度達到12-18g/L，產生嚴重的抑制效應而菌體停止發酵。因此，針對產物抑制效應提出的產物即時移除(in situ product removal)的概念，在發酵過程中結合如氣提等分離方法，將產物分離，藉此降低產物抑制程度，常見的方法有：吸收、液液萃取、滲透蒸發、氣提等方法，這些技術應用於ABE發酵能夠有效減少產物抑制效應，進而提升溶劑產率並增加糖類利用率。其中由於氣提法操作簡單、易放大製程、對細胞沒危害、不會將培養基中的營養成分以及一次代謝產物乙酸和丁酸移出(BM,N et al.1987)。也不用添加其它的材料，在以往的學術探討中也較為被研究(B,CT et al.1986)。其發酵系統為，利用氮氣或發酵過程所排放氣體(二氧化碳和氫氣)當作氣提分離法之氣體來源，當氣泡通過發酵液，透過氣液相接觸，溶劑產物因質傳被氣泡帶出，在藉由通過冷凝管將溶劑產物冷凝下來收集，而氣體則再返回通入反應系統中，藉以帶出更多溶劑。利用氣提法分離丁醇需約14~31MJ/kg的能量(氣提法效果與操作條件有關，如氣體流速、氣泡大小等)，然而這個數值是基於丁醇量約5g/L計算的，有文獻指出，當丁醇量大於8g/L時，經氣提法冷凝下來丁醇可高於150g/L，且最終丁醇產量也可高於640g/L，選擇率也可高於75，相比之下能量消耗可減少約2/3，甚至低於8MJ/kg(Xue,Zhao et al.2012)。如Xue等人，結合批次發酵跟氣提分離法，丁醇產量由原本的批次發酵16.2g/L提升至19.8g/L，而產量分別為0.3gL-1h-1與0.41gL-1h-1(Xue,Zhao et al.2013)。Ezeji等人，則採用批次發酵整合氣提分離、分批饋料結合氣提分離進行發酵和連續式培養整合氣提分離，其丁醇產量與產量各別為(16.4g/L與0.42gL-1h-1)、(151.7g/L與0.76gL-1h-1)和(251.3g/L與0.5gL-1h-1)，均比單獨批次發酵結果(11.9g/L與0.2gL-1h-1)來的佳(Ezeji,Qureshi et al.2003)。而
Lu等人也將細胞固定化與氣提分離整合應用，其批次饋料發酵丁醇產量為59.8g/L，產量為0.35gL-1h-1(Lu,Zhao et al.2012)，在傳統ABE批次發酵中，由於丁醇的毒害基質並無法被完全利用，然而在整合了氣提分離法，由研究結果可看出，將丁醇從發酵液中分離出來，降低丁醇毒害效果，使基質能被有效利用。
但是藉由氣體回收之ABE濃縮產物其濃度約9.1-120g/L，需要進行更進一步純化才能提升濃度，過程繁雜且須花費昂貴成本(Qureshi and Blaschek 2001)。
為了有效解決ABE發酵過程中所產生的最終產物抑制效應，另一種有效的分離方法為液-液萃取分離技術。液-液萃取原理是將非水溶性有機萃取劑與含有待分離液體的溶液混合，待分離液體在萃取劑中的溶解度較原溶液大，因此待分離液體將溶在有機萃取劑中形成分相，再進一步藉由蒸餾分離；評估萃取劑的好壞是根據分佈係數(partition coefficient)來界定。由於ABE發酵過程中產物抑制效應又以丁醇來的最為嚴重，因此具有高丁醇分佈係數的萃取劑較為適合使用於ABE發酵中，另外萃取劑的添加必須不會對菌體生長造成影響，也不會萃取出基質等營養物質，這些都是評估是否為一合適萃取劑的必要條件。目前常用的萃取劑有油醇、葵醇、聚丙二醇以及生物柴油等(相關研究數據整理請見表三)。其中油醇的萃取效果很好，其丁醇分佈係數高達3.30(ISHIZAKI,MICHIWAKI et al.1999)，QURESHI N等利用油醇為萃取劑，與填充床反應器相結合使ABE生產速率和產率分別達到4.0g/L*hr、0.33g/g(QURESHI and MADDOX 1995)。ISHIZAKI A等研究了以生物柴油CPOE為萃取劑，葡萄糖的利用率、ABE總產量、發酵產率分別從62%、21.2g/L、0.38g/g分別提高至83%、29.8g/L、0.40g/g(ISHIZAKI,MICHIWAKI et al.1999)。
對於傳統液-液萃取技術而言，發酵過程中為了有效萃取及降低發酵液中產物濃度，往往需要加入大量萃取劑進行萃取來達到目的，一般常見用於ABE發酵萃取劑，如油醇(oleyl alcohol)(M.Taya and KOBAYASHI 1985,Davison and Thompson 1993,Qureshi and Maddox 1995)、聚丙二醇(polypropylene glycol)(Barton and Daugulis 1992)以及正葵醇(decanol)(Evans and Wang 1988)，由於本身價格相對昂貴難以用在工業規模上，並且需要額外的分離過程才能將萃取相中的ABE溶劑分離，過程繁複不符合發酵成本；另外常見的萃取劑如生物柴油(CPOE)、甲基化脂肪酸(MFAs)(Ladish 1991)以及甲基化葵花籽油(Grobben,Eggink et al.1993)，其本身相對於油醇價格較便宜，萃取劑也可以直接當作燃料使用不需要額外將ABE溶劑分離，但是由於丁醇的分配係數偏低，為了有效減緩產物抑制效應往往需要加入大量萃取劑，造成單位體積生產效率偏低。基於種種以上原因，如何有效提升萃取劑使用效能並能降低發酵成本，變成一門重要課題。
然而，上述之先前技術中，美國專利案US 4510242、US20110097773、US8569552，以及世界智慧財產權組織專利公開案WO 2011003962等雖已揭示可利用液-液萃取或氣提應用於ABE發酵之方式來收集丁醇等發酵產物，但是其皆利用較複雜的方式，以致於需耗費較多成本及能量，且產能較差。換言之，當前需要一個單純且節省步驟的發酵程序，除了耗費較少的成本外，亦在短時間內可得到較多發酵產物的方式。
一般而言，利用丁醇生產菌種進行丙酮(Acetone)、丁醇(Butanol)、乙醇(Ethanol)發酵(後文統稱為：ABE發酵)，是生產生質丁醇
最主要的方法，然而隨著發酵程序的進行，丁醇量會慢慢累積，當丁醇濃度達一定程度，及會開始抑制菌體對外界營養物質的吸收及破壞細胞膜上ATPase的活性，危害菌體生長，影響發酵程序，導致丁醇產率相當低。為克服丁醇毒害效果，本發明將兩種減低丁醇毒害效應之發酵策略(液-液萃取和氣提式產物分離法)予以結合，結合兩種發酵策略希望可以達到一加一大於二的效能，能夠有效提升ABE產量、產率、生產速率以及原料(例如：葡萄糖)利用率，並且整合液-液萃取以及氣提(gas stripping)分離程序，利用氮氣直接對有機相進行氣提，可以大幅提升氣提所冷凝之ABE產物濃度及選擇率。
緣此，本發明提供一種大量製備發酵產物之方法，在此發明中將液-液萃取以及氣提分離程序視需求加以整合於一發酵槽中，亦可移出發酵槽至別的空間中進行，以達到簡便又能大量產出發酵產物的方法。
於是，本發明提供一種大量製備發酵產物之方法，其可包含下列步驟：(a)將一原料以發酵製程處理；(b)加入一萃取劑加入發酵製程中將經發酵之原料分為一有機相及一水相，並添加一氣體至有機相；以及(c)收集該發酵產物；其中，該有機相與該水相之體積比為1：0.1~1：10，較佳為1：0.25-1：8，更佳為1：1-1：5。
較佳地，發酵所利用之原料為碳源混合物，較佳為糖類。
較佳地，產物主要為丙酮、丁醇、乙醇或其組合。
較佳地，氣體為氮氣、二氧化碳、氫氣或其組合，較佳為氮氣。
較佳地，萃取劑係非水溶性。
較佳地，萃取劑為油醇、葵醇、聚丙二醇、生物柴油、甲基化脂肪酸、甲基化葵花籽油或其組合，較佳為油醇。
其中，(c)步驟係設置冷凝系統以冷凝收集發酵產物。
較佳地，(a)步驟與(b)步驟可選擇性地視需要於同一空間或是不同的空間中進行。
本發明一個或一個以上實施例的細節將於所附圖式和以下描述中予以闡述。根據這些描述和圖式和申請專利範圍，將可容易地瞭解本發明的其他特徵、目的和優勢。由於本發明在於強調以簡便的方式將液-液萃取以及氣提分離程序加以整合於一發酵程序中，同時，為了讓本發明之上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明。
101‧‧‧流速計
102‧‧‧萃取相
103‧‧‧菌液相
104‧‧‧發酵槽
105‧‧‧冷凝系統
本發明將參照附圖由後文的詳細敘述使得本發明更加容易理解，其中：第一圖為本發明將液-液萃取以及氣提產物整合應用於ABE發酵；(a)將萃取及氣提與ABE發酵於同一槽體中進行、(b)將發酵後之液相流體移至別的空間進行萃取及氣提之流程圖；第二圖為葡萄糖濃度及光學密度(O.D600)對發酵時間之曲線圖；其中(□)為葡萄糖濃度；(◇)為光學密度(O.D600)；第三圖為菌液相中發酵代謝產物濃度對時間關係之曲線圖；其中(◇)為乙酸濃度；(○)為丁酸濃度；(□)為丙酮濃度；(△)為乙醇濃度；(×)為丁醇濃度；第四圖為葡萄糖濃度及光學密度(O.D600)對發酵時間之曲線圖，其中(□)為葡萄糖濃度；(◇)為光學密度(O.D600)；第五圖為菌液相中發酵代謝產物濃度對時間關係之曲線圖，其中(◇)為乙酸濃度；(○)為丁酸濃度；(□)為丙酮濃度；(△)為乙醇濃度；(×)為丁醇濃度；
第六圖為萃取相中發酵代謝產物濃度對時間關係之曲線圖，其中(◇)為乙酸濃度；(○)為丁酸濃度；(□)為丙酮濃度；(△)為乙醇濃度；(×)為丁醇濃度；第七圖為葡萄糖濃度及光學密度(O.D600)對發酵時間之曲線圖，其中(□)為葡萄糖濃度；(◇)為光學密度(O.D600)；虛線為開始氣提時間，直到發酵結束；第八圖為菌液相中發酵代謝產物濃度對時間關係之曲線圖，其中(◇)為乙酸濃度；(○)為丁酸濃度；(□)為丙酮濃度；(△)為乙醇濃度；(×)為丁醇濃度；虛線為開始氣提時間，直到發酵結束；第九圖為萃取相中發酵代謝產物濃度對時間關係之曲線圖，其中(◇)為乙酸濃度；(○)為丁酸濃度；(□)為丙酮濃度；(△)為乙醇濃度；(×)為丁醇濃度；虛線為開始氣提時間，直到發酵結束；第十圖為不同氣提時段下的溶劑去除速率以及ABE的選擇率之柱狀比較圖；第十一圖為氣提反應之溶質(丁醇與丁酸)濃度與氣提時間之曲線比較圖；第十二圖為氣提反應之溶質(丁醇與丁酸)濃度與氣提時間所得到的氣提常數比較圖；第十三圖為為光學密度(O.D600)對發酵時間之曲線圖，即為使用C.acetobutylicum ATCC824菌種發酵的生長概況；其中(◇)為實驗一(無進行萃取以及氣提)；(×)為實驗二(進行萃取而無氣提)；(△)為實驗三(整合萃取以及氣提分離)；
第十四圖為葡萄糖濃度對發酵時間之曲線圖，其中(◇)為實驗一(無進行萃取以及氣提)；(×)為實驗二(進行萃取而無氣提)；(△)為實驗三(整合萃取以及氣提分離)；以及第十五圖為菌種C.acetobutylicum ATCC824發酵的丁醇濃度變化；其中(a)為菌液相丁醇濃度變化，(b)為萃取相丁醇濃度變化，(c)為總丁醇濃度變化，其中(◇)為實驗一(無進行萃取以及氣提)；(×)為實驗二(進行萃取而無氣提)；(△)為實驗三(整合萃取以及氣提分離)。
本發明之優點及特徵以及達到其方法將參照例示性實施例及附圖進行更詳細地描述而更容易理解。然而，本發明可以不同形式來實現且不應該被理解僅限於此處所陳述的實施例。相反地，對所屬技術領域具有通常知識者而言，所提供的此些實施例將使本揭露更加透徹與全面且完整地傳達本發明的範疇，且本發明將僅為所附加的申請專利範圍所定義。在圖中，成分或元件的尺寸及相對尺寸為了清晰易懂而以誇示方法表示。整篇說明書中，相同的元件符號指的是相同的元件。如本文中所使用的，術語”及/或”包含任何及所有一或多相關所列物件的組合。
除非另外定義，所有使用於本文的術語(包含科技及科學術語)具有與本發明所屬該領域的技術人士一般所理解相同的意思。將更可理解的是，例如於一般所使用的字典所定義的那些術語應被理解為具有與相關領域的內容一致的意思，且除非明顯地定義於本文，將不以過度理想化或過度正式的意思理解。
以下將配合圖式詳細敘述例示實施例。然而，這些實施例可以包含於不同的形式中，且不應被解釋為用以限制本發明之申請專利範圍。這些實
施例之提供使得本發明之揭露完整與明暸，熟知此技術之人將能經由該些實施例了解本發明之範疇。
本發明提供一種大量製備發酵產物之方法，在此發明中將液-液萃取以及氣提分離程序加以整合於一發酵程序中，結合兩種發酵策略希望可以達到一加一大於二的效能，能夠有效提升ABE產量、產率、生產速率以及原料(例如：葡萄糖)的利用率。
於是，本發明提供一種大量製備發酵產物之方法，其可包含下列步驟：(a)將一原料以發酵製程處理；(b)將一萃取劑加入發酵製程中將經發酵之原料分為一有機相及一水相，並添加一氣體至有機相；以及(c)收集該發酵產物；其中，該有機相與該水相之體積比為1：0.1~1：10，較佳為1：0.25-1：8，更佳為1：1-1：5。
批次發酵，是最常應用在各種發酵產品上的策略，其方式為在一個密閉系統中進行發酵，培養期間，系統中無任何物質與外界交換(及無物流進出)，故汙染機率極低。相對的，由於工作體積固定，當發酵過程中丁醇累積到一定濃度，會抑制菌體生長而影響發酵程序，因此一般發酵原料，例如：葡萄糖，往往只能受限於60克/升的消耗量。本發明藉由發酵產物分離技術可以減緩丁醇抑制效應，並且搭配孢子培養(spore culture)的培養方式，讓C.acetobutylicum具有較高基質容忍度，能在125克/升的原料，例如：葡萄糖，環境下生長並有效將基質轉換成發酵產物。產物移除技術(Product removal Technology)，其在發酵的同時整合分離系統，將發酵液中的丁醇抽取出，降低丁醇對於發酵產物的抑制程度，進而增加發酵產物單位時間的產量。但相較於其它方法，氣提法具相對較低的丁醇選擇率，且須大量的熱能來處理一併被移出的水，也就是說，更來的耗能。因此，為了能夠提升氣提法分離使用效能，在發酵同時，更額外添加小量的萃取劑。在發酵液過程中添加萃取劑，油醇具
有相當高的丁醇分配係數(partition coefficient)，因此在萃取相中具有相當高的丁醇濃度，此時直接對油醇進行氣提能夠冷凝收集到更高濃度的丁醇，並且可以大幅降低氣提過程中所移出的水，也能夠因此改善丁醇選擇率。
對於液-液萃取技術而言，發酵過程中為了有效萃取及降低發酵液中產物濃度，往往需要加入大量萃取劑進行萃取來達到目的，但一般常見用於ABE發酵萃取劑，如丁醇等。其本身價格相對昂貴，難以用在工業規模上，且不符合發酵成本，並且在使用大量萃取劑的前提下，造成單位體積生產效率偏低，基於以上原因，如何有效減少萃取劑體積變成一重要課題。而本發明所使用之批次ABE發酵整合液-液萃取以及氣提分離程序，相對於單純液-液萃取分離技術，能夠有效降低萃取劑使用量也能有效增加丁醇產率，同時間又能降低發酵成本，便是本發明與單純僅液相萃取技術的不同之處。
實驗方法
I.實驗材料
本發明欲探討利用整合式液-液萃取以及氣提產物移除程序克服丁醇之抑制效應，進而提高ABE產量，同時間也獲得初步純化之ABE產物，本實驗之實驗示意圖如第一圖所示。
II.菌體濃度測量
其中，本實驗所使用之菌株為Clostridium acetobutylicum ATCC824，原料可為葡萄糖等習知糖類。此外，有關菌體濃度，係以UV-Vis分光光度計(Spectrophotometer)(GENESYS 10S,Thermo Scientific,USA)在波長600nm下，測光學密度(Optical density,O.D.)。
III.還原醣定量
本研究還原醣濃度是以DNS法測定(MILLER 1959)，其原理為利用反應試劑中的3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid)於鹼性溶液下與還
原醣共熱反應後，被還原成紅棕色胺基化合物(3-amino-5-nitrosalicylic acid)，其產物則可利用分光光度計於波長550nm，測量樣本與DNS試劑反應後之吸光值。DNS反應試劑依還原醣濃度由低至高，其顏色變化會由黃色轉換至紅棕色，濃度愈高，顏色愈深，相對的，吸光值也愈高，配合濃度檢量線換算，即可得知樣品中還原醣的濃度。
其步驟為將發酵液以13,300r.p.m，5min離心，取其上清液與反應試劑以等量體積混合，再放置100℃水浴進行反應(避光)10分鐘，反應後待冷卻約10分鐘，再以分光光度計測其波長550nm之吸光值。
IV.發酵產物定量分析
發酵過程中，液-液萃取所生產之溶劑產物，本發明係以氣相層析儀進行定量分析。
菌液相(又稱水相、萃餘相)：分析步驟為，將發酵液以13,300r.p.m，5分鐘離心，取之上清液，以0.2μm針頭式過濾器過濾，再透過自動注射器(Hewlett Packard 7673)注入樣品於氣相層析儀(Hewlett Packard HP 5890 Series II)來量測其溶劑產物的濃度。氣相層析儀中毛細管柱為DP-FFAP(30m x 0.32mm x 0.25μm)，起始溫度為50℃，維持2分鐘，後以30℃/min升溫至100℃，維持2分鐘，最後再以20℃/min升溫至150℃，維持2分鐘；注射孔(Injector)和火焰離子偵測器(FID)溫度均為225℃，分流比為10；載送氣體(Carrier gas)為氮氣；注射樣品量為1μL。
萃取相(又稱有機相、油醇相)：分析步驟為，將有機溶液以13,300r.p.m，5min離心，取其上清液，以0.2μm針頭式過濾器過濾，再透過自動注射器注入樣品於氣相層析儀來量測其溶劑產物的濃度。氣相層析儀中毛細管柱，起始溫度為50℃，維持2分鐘，後以30℃/min升溫至100℃，維持2分鐘，最後再以20℃/min升溫至230℃，維持10分鐘；注射孔(Injector)和火焰離子偵測器(FID)
溫度分別為260和280℃，分流比為10；載送氣體(Carrier gas)為氮氣；注射樣品量為1μL。
V.氣提法分離之產物定量分析
經氣提法分離出來之液相產物係以氣相層析儀進行定量分析，其分析條件均與上述菌液相之分析方式相同。
VI.厭氧培養環境製備
將裝有培養基之培養瓶，以氮氣沖提瓶頂空間約10-15分鐘，蓋上橡膠塞，再以鋁蓋將瓶口封死，確保厭氧環境的形成，之後再以121℃、壓力1.2kg/cm2濕熱滅菌20分鐘，滅菌完，待冷卻至室溫供後續培養使用。
本實驗丁醇生產菌種C.acetobutylicum ATCC824所使用之活化培養基(Reinforce Clostridium Medium；RCM)和發酵培養基(Luris broth；LB-s)以及(Reinforce Clostridium Medium-s；RCM-s)為所屬領域通常知識者慣用之培養基，故其成分已為所屬領域通常知識者所認知，在此並不贅述。
VII.菌種活化
將丁醇生產菌種C.acetobutylicum ATCC824自以內生孢子型態保存之種菌，於操作台中以5(V/V)%植入以RCM為液態培養基的厭氧培養瓶中，再放置80℃水浴進行2分鐘熱休克(Heat Shock)，接著以冷水緩緩沖洗瓶壁降溫，待冷卻至室溫，放入37℃，150r.p.m震盪培養箱中，進行活化24小時。
VIII.菌種保存
將活化成功之丁醇生產菌種C.acetobutylicum ATCC824以3(V/V)%植菌量植入LB-s液態培養基中，進行48-72小時的厭氧培養，待放置兩星期使菌種完全形成內生孢子，即可以孢子型態保存於室溫。
IX.ABE發酵整合液-液萃取以及氣提分離程序製備
配置工作體積300毫升之RCM發酵培養基於厭氧批次瓶中，並添加萃取劑，例如：油醇(oleyl alcohol,80-85%)75-125毫升，較佳為100毫升，得到有機相與水相體積比1：3之溶液，以氮氣充提管頂空間約10-15分鐘。其中，萃取劑包含油醇、葵醇、聚丙二醇、生物柴油、甲基化脂肪酸、甲基化葵花籽油或其組合，較佳為油醇；其中，萃取劑係非水溶性。接著配置原料，例如：葡萄糖溶液於批次厭氧瓶中，並以氮氣、二氧化碳、氫氣、鈍氣或其組合，較佳為氮氣充提管頂空間約10-15分鐘。將RCM培養基與葡萄糖溶液以121℃，濕熱滅菌20分鐘。配製鹽類溶液，並以0.2μm過濾器過濾滅菌至無菌厭氧試管中。
於無菌操作台中，將發酵培養基各成分以針筒方式添加之。將事先經24小時活化培養之C.acetobutylicum ATCC824以3%(V/V)植菌量植入。放置37℃，150r.p.m旋轉振盪器(rotary shaker)中，進行發酵培養。當發酵時間達48小時，以氮氣使用0.5升/分鐘之流率氣提萃取相，並於下游端串聯連接冷凝系統，使用液態氮冷凝收集氣提產物，分別於60、72、84以及96小時更換冷凝系統，記錄分析產物。
其中，本實施例之發酵程序與液-液萃取整合氣提之分離程序可於同一空間或不同的空間中進行，其係如第一(b)圖所示，其餘條件皆可相同或視情況些微調整。
以下將以實驗例與比較例進行測試，且測試結果如第二圖~第十三圖所示。
實施例
本實驗主要探討為利用批次ABE發酵整合液-液萃取以及氣提分離程序，來提升ABE產量與達到最佳產物分離效果。本研究主要分三組ABE發酵實驗進行，分別為：批次ABE發酵系統、結合液-液萃取之發酵系統以及整合液-液萃取以及氣提分離技術之發酵系統。以單純批次ABE發酵作為對照組來比較有無進行產物分離程序對發酵之影響；而結合液-液萃取之發酵系統，可以預期將有效減緩產物抑制效應，在發酵效能上具明顯提升；ABE發酵整合液-液萃
取以及氣提分離系統針對ABE發酵結合液-液萃取系統進行調整，ABE發酵整合液-液萃取以及氣提分離技術，相較於單獨的液-液萃取或者氣提分離技術，皆能改善原本發酵策略不足之處，在達到相同發酵產能的情況下，大幅降低發酵成本。以下實驗僅為例示性，其並非意欲限制本發明之範圍。
實驗1
批次ABE發酵
進行批次ABE發酵使用RCM-s培養基，起始葡萄糖濃度為125克/升，其培養條件為37℃以及150rpm，發酵過程中沒有結合液-液萃取或者氣提分離系統(此即為對照組)。如第二圖及第三圖所示，當達到約72小時的發酵時間時，O.D值達到9.61，而葡萄糖消耗量達59.7克/升，總葡萄糖利用率達47.8%。發酵最終產物ABE濃度分別為8.7，2.0以及12.5克/升，總溶劑產量為23.2克/升，ABE生產速率為0.29g/L*hr，ABE產率為0.35g/g。由於發酵液中丁醇濃度達到12.5克/升產生嚴重的丁醇抑制效應，而無法繼續消耗葡萄糖，此時菌體體停止生長發酵結束。因此，如果能夠有效去除丁醇抑制效應，將可以提升ABE產量、生產速率、產率以及葡萄糖利用率。
實驗2
ABE發酵與液-液萃取分離系統之結合
進行ABE發酵使用RCM-s培養基，一開始葡萄糖濃度為125克/升，其培養條件為37℃以及100r.p.m。發酵過程中結合液-液萃取分離系統，使用經高溫滅菌100毫升之80-85%油醇作為萃取劑，於發酵0小時添加至300毫升培養基中，油醇與培養基之體積比為1：3。由第四圖至第六圖可知，當發酵達到96小時，葡萄糖消耗量為96.2克/升且總葡萄糖利用率達84.3%，發酵液中ABE濃度分別為7.5、8.7以及3.5克/升，而萃取相中ABE濃度分別為3.0、39.9以及0.8
克/升。根據本實驗數據，得知ABE分配係數分別為0.4、4.6以及0.2。其總ABE濃度分別為8.6，3.8以及22.0克/升，總溶劑產量為34.3克/升。
相對於實驗1之ABE發酵實驗，ABE發酵結合液-液萃取分離系統，由於油醇(萃取劑)的添加，使發酵液中丁醇濃度由12.5克/升降低至8.7克/升，有效減緩丁醇抑制效應，進而葡萄糖利用率增加76%，並且可有效提升ABE生產速率至0.36g/L*hr，ABE產率至0.36g/g。
實驗3
ABE發酵與液-液萃取以及氣提分離系統之整合
實驗3使用125克/升葡萄糖濃度作為碳源，使用發酵條件為發酵溫度37℃以及轉速100r.p.m，發酵過程中整合液相萃取以及氣提分離技術。使用經高溫滅菌100毫升之80-85%油醇作為萃取劑，於發酵0小時添加至總工作體積為300毫升之發酵液中，油醇/菌液其體積比為1：3。當發酵時間達48小時，使用氮氣作為乘載氣體，以0.5升/分鐘之體積流率直接氣提萃取相，並於下游端串聯連接冷凝系統，使用液態氮冷凝收集氣提產物，分別於60、72、84以及96小時更換冷凝系統，記錄分析產物。
由第七圖可知，產物(丁醇)已不再抑制ABE發酵反應，故葡萄糖利用率較第二圖與第四圖來得更高，且OD.600值亦較第二圖及第四圖更高；由此可知，ABE發酵與液-液萃取以及氣提分離系統之整合的發酵產能及效率遠較僅ABE發酵以及僅將ABE發酵與液-液萃取分離系統結合來得好。由第八圖至第九圖可知，虛線為開始氣提的時間，氣提分離程序之後，乙酸及丁酸皆快速地轉換為乙醇及丁醇。而第十圖為不同時段(小時)下的丁醇及ABE去除速率以及ABE的選擇率。
實驗4
將氣提分離程序與萃取程序放置於不同的槽中進行反應
第十一圖為進行萃取反應之後，將菌液相移至另一槽中進行氣提反應之溶質(丁醇與丁酸)濃度與氣提時間之曲線比較圖。由本圖可知，丁醇之溶質濃度隨著氣提時間而大幅地減少，甚至可約在氣提程序進行45-50小時後有機相中已幾乎沒有丁醇的存在。由此可知在萃取時利用丁醇選擇率較高之油醇，使得氣提反應後可得到大量的丁醇產物。
第十二圖為進行萃取反應之後，將菌液相移至另一槽中進行氣提反應之溶質(丁醇與丁酸)濃度與氣提時間所得到的氣提常數比較圖。由本圖明顯可知，丁醇之氣提常數遠遠地高於丁酸，因此將氣提分離程序獨立於一槽中，仍可高效率地得到產物丁醇。
結果與討論
由第十三圖至第十五圖可知，將實驗1至實驗3比較之後可看出，無論是OD.600值、葡萄糖利用率、甚至是丁醇產量之比較，均可看出本發明將ABE發酵與液-液萃取以及氣提分離系統之整合以達到其特殊之效果。
總的來說，利用Clostridium acetobutylicum ATCC824菌株進行批次ABE發酵並且整合液-液萃取以及氣提分離技術，能夠有效提升ABE產量與達到最佳產物分離效果。批次ABE發酵，總溶劑ABE總產量(titer)為23.2克/升，產量(productivity)為0.29gL-1h-1，產率(yield)為0.35g/g-Glucose。當發酵達到72小時，由於發酵液中丁醇濃度達到12.5克/升產生嚴重的丁醇抑制效應，而無法繼續消耗葡萄糖。此時葡萄糖消耗量達59.7克/升，總葡萄糖利用率只達47.8%，菌體停止生長發酵結束。
因此，進行ABE發酵結合即時產物移除(in situ product removal)系統，能夠有效去除丁醇抑制效應，將可以提升ABE產量、生產速率、產率以及葡萄糖利用率。由ABE發酵結合液-液萃取系統，其結果ABE總產量(titer)34.30gL-1、產率(yield)0.36g/g-Glucose和生產速率(productivity)0.36gL-1h-1，
結果與批次ABE發酵相比均具明顯提升。而批次ABE發酵整合液-液萃取以及氣提分離實驗，可達到ABE總產量(titer)43.93gL-1、產率(yield)0.37g/g-Glucose和生產速率(productivity)0.46gL-1h-1，結果相比ABE發酵整合液-液萃取以及氣提分離程序其ABE產量、產率以及生產速率均明顯提升。以氣提法分離ABE之效益，透過氣提法直接利用氮氣對萃取相(油醇)進行氣提，經由冷凝收集，所得到氣提冷凝ABE濃度可以達150-200gL-1，相較於其他研究其冷凝ABE濃度為20-120gL-1具明顯提升效果，而ABE選擇率(以菌液相為基準)也可以提升至23-55。進行ABE發酵整合液-液萃取以及氣提分離技術能夠有效降低萃取劑使用量也能有效增加丁醇產率，同時間又能降低發酵成本，能發酵更具競爭力。
綜上所述，本發明之大量製備發酵產物的方法，具備下述優點：1.本發明其中之一的功能是將ABE發酵與液-液萃取以及氣提分離系統之整合係於同一發酵槽中反應，優點在於經油醇萃取之丁醇可直接由氮氣氣提分離，可節省反應時間及步驟，且僅需要少量的萃取劑即可達到效果，且丁醇選擇率可變得更高，並可提高發酵產率及表現；2.本發明利用ABE發酵與液-液萃取以及氣提分離系統之整合，產物丁醇抑制ABE發酵製程的程度可達到最低，致使發酵原料(例如：葡萄糖)利用率可達到最高，且O.D600值亦可達到最高；3.本發明亦可將ABE發酵與液-液萃取整合氣提分離系統於不同的槽中進行反應，相較於先前技術，其優點在於發酵之產率及表現可大幅地提高。
其它實施態樣
所有揭露於本發明書之特徵係可使用任何方式結合。本說明書所揭露之特徵可使用相同、相等或相似目的的特徵取代。因此，除了特別陳述強調處之外，本說明書所揭露之特徵係為一系列相等或相似特徵中的一個實施例。
此外，依據本說明書揭露之內容，熟悉本技術領域者係可輕易依據本發明之基本特徵，在不脫離本發明之精神與範圍內，針對不同使用方法與情況作適當改變與修飾，因此，其它實施態樣亦包含於申請專利範圍中。
Claims (7)
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- 一種大量製備ABE發酵產物之方法，其包含下列步驟：(a)將一包含碳源混合物之原料以一發酵製程處理；(b)將一非水溶性之萃取劑加入該發酵製程中將經發酵之原料分為一有機相及一水相，並添加一氣體至該有機相；以及(c)收集該發酵產物，該發酵產物包含丙酮、丁醇、乙醇或其組合；其中，該萃取劑與該培養基之體積比為1：0.1~1：10。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該氣體包含氮氣。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該萃取劑為油醇。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該(c)步驟係設置一冷凝系統以冷凝收集該發酵產物。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該(a)步驟與該(b)步驟係於同一空間中進行。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該(a)步驟與該(b)步驟係於不同的空間中進行。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該發酵係一批次發酵製程或一連續式發酵製程。