MX2010013182A - Metodo para producir butanol mediante el uso de fermentacion extractiva de dos fases. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para producir butanol a partir de por lo menos una fuente de carbono fermentable y que resuelve los problemas de toxicidad, lo que produce un aumento del título efectivo, la velocidad efectiva y el rendimiento efectivo de la producción de butanol por fermentación al usar un hospedero microbiano recombinante, en donde el butanol se extrae en agentes extractantes orgánicos específicos durante la fermentación.

Description

D0 PARA PRODUCIR BUTANOL MEDIANTE EL USO DE FERM EXTRACTIVA DE DOS FASES CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al campo mbustibles . Más específicamente, la inven ere a un método para producir butanol por ferm biana, en donde el producto de butanol se rem acción en un agente extractante orgánico inmis durante la fermentación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El butanol es una sustancia química industrial im iene una variedad de aplicaciones, tales como el vo para combustibles, como sustancia química us ía prima en la industria de plásticos y com os para producir butanol por fermentación, por eje so ABE, que es el proceso fermentativo que pro a de acetona, 1-butanol y etanol . La fermentac er acetona-butanol-etanol (ABE) por Cí butylicum es una de las fe mentaciones industri uas que se conocen; como también lo son las rut responsables de la producción de estos solve cción de 1-butanol por el proceso ABE está limitad o tóxico del 1-butanol sobre Clostridium acetobutyl escrito que los métodos de fermentación extractiva usan agentes extractantes orgánicos específicos qu os para la bacteria aumentan la producción de 1-bu ntación al usar Clostridium acetobutylicum (Roffler chnol. Bioeng. 31:135-143, 1988; Roffler et al., B eering 2:1-12, 1987; y Evans et al., Appl. biol. 54:1662-1667, 1988). ol parece estar limitada por los umbrales de toxi ol para el microorganismo hospedero usado ntación. Los métodos de fermentación extractiva no ados a la producción de butanoles mediante el uso bianas recombinantes .

La presente invención satisface la necesidad m iormente y proporciona un método para producir b r de por lo menos una fuente de carbono fermentab íve los problemas de toxicidad, lo que produce u título efectivo, la velocidad efectiva y el re ivo de la producción de butanol por fermentación a dero microbiano recombinante, en donde el butanol agentes extractantes orgánicos específicos dur ntación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN consiste de alcoholes grasos de C12 a C22 grasos de C12 a C22, ásteres de ácidos gras a C22i aldehidos grasos de C12 a C22 t y me éstos y, opcionalmente, (ii) un segund extractante orgánico inmiscible e seleccionado del grupo que consiste de grasos de C12 a C22 t ácidos grasos de C ésteres de ácidos grasos de Ci2 a C22/ grasos de C12 a C22 , y mezclas de éstos, pa una mezcla bifásica que comprende una fase una fase orgánica que contiene butanol; c) separar la fase orgánica que contiene buta fase acuosa; y d) recuperar el butanol de la fase orgá contiene butanol para producir butanol recu vención proporciona un método para la produ ésteres de ácidos grasos de C12 a C22, grasos de Ci2 a C22, y mezclas de éstos, en medio de fermentación bifásico compr aproximadamente 3 % a aproximadamente volumen del agente extractante orgánico i en agua, durante el tiempo suficiente para la extracción del butanol en el agente ex orgánico y formar una fase orgánica que butanol ; c) separar la fase orgánica que contiene buta fase acuosa; y d) recuperar el butanol de la fase orgá contiene butanol para producir butanol recu Una modalidad de la invención proporciona un métod cción de butanol; el método comprende las etapas de a) proporcionar un microorganismo gené seleccionado del grupo que consiste de grasos de Ci2 a C22, ácidos grasos de Ci ésteres de ácidos grasos de C12 a C22, grasos de C12 a C22/ y mezclas de é opcionalmente, (ii) un segundo agente ex orgánico inmiscible en agua seleccionado d que consiste de alcoholes grasos de C1 ácidos grasos de Ci2 a C22, ésteres de ácid de C12 a C22/ aldehidos grasos de C12 a C22/ de éstos, para formar una mezcla bifá comprende una fase acuosa y una fase orgá contiene butanol; d) separar la fase orgánica que contiene buta fase acuosa; y e) recuperar el butanol de la fase orgá contiene butanol . c) cambiar las condiciones por co microaerobias o anaerobias para estim producción de butanol en el medio de ferme formar un medio de fermentación que butanol ; d) poner en contacto el medio de fermenta contiene butanol con i) por lo menos u agente extractante orgánico inmiscible seleccionado del grupo que consiste de grasos de Ci2 a C22/ ácidos grasos de C ásteres de ácidos grasos de C12 a C22, grasos de C12 a C22 i Y mezclas de opcionalmente, (ii) un segundo agente ex orgánico inmiscible en agua seleccionado que consiste de alcoholes grasos de Ci ácidos grasos de C12 a C22/ esteres de ácid oducción de butanol; el método comprende las etapas a) proporcionar un medio de fermentación que butanol, agua, y un microorganismo gené modificado que produce butanol a partir de de fermentación que comprende por lo m fuente de carbono fermentable; b) poner en contacto el medio de fermenta medio de una corriente de agente extrac corrientes paralelas o en contracorrient por lo menos un primer agente extractante inmiscible en agua seleccionado del g consiste de alcoholes grasos de C12 a C22 grasos de C12 a C22 l esteres de ácidos gras a C22 f aldehidos grasos de C12 a C22 f y me éstos y, opcionalmente, (ii) un segund extractante orgánico inmiscible e contiene butanol para producir butanol recu Los métodos de fermentación extractiva de la rcionan butanol, que incluye todos los isóme ol, que es conocido por tener un contenido e ar al de la gasolina y puede combinarse con stible fósil. Se prefiere el butanol como combu vo para combustibles, ya que produce solo C02 y una ña o nula de S0X o N(¾ cuando se quema en un r stión interna estándar. Adicionalmente, el butanol sivo que el etanol, el aditivo para combustibles rencia hasta la fecha.

Además de su utilidad como biocombustible o adit stibles, el butanol producido con los métodos nte invención tiene el potencial de impactar s emas de distribución de hidrógeno en la industria células de combustible. Hoy en día, las cél BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una gráfica que mues entración de isobutanol en el medio de fermenta r , la fase acuosa) durante una fermentación hol oleílico como agente extractante org rción con gas (¦) , tal como se describe en el durante una fermentación que usa solo desor (·) , tal como se describe en el Ejemplo 7. La esenta los datos generados al usar una Escheric binante que produce isobutanol.

La Figura 2 es una gráfica que muestra la concent tanol en el medio de fermentación (es decir, a) durante una fermentación que usa alcohol oleíl e extractante orgánico y desorción con gas, (¦) ta ibe en el Ejemplo 8, y durante una fermentación desorción con gas (·) , tal como se describe en el os de la invención en la que el primer agente ex cible en agua y el segundo agente extractante cible en agua se agregan por separado a un recip ntación en el que el medio de fermentación cto con el agente extractante.

La Figura 5 ilustra esquemáticamente una modalida os de la invención en la que el primer agente ex cible en agua y el segundo agente extractante cible en agua se agregan por separado a recipi ntación diferentes para que el medio de fermentaci ntacto con el agente extractante .

La Figura 6 ilustra esquemáticamente una modalida os de la invención en la que la extracción del pr ce corriente abajo del termentador y el prime ctante inmiscible en agua y el segundo agente ex nal inmiscible en agua se combinan en un recipie La Figura 8 ilustra esquemáticamente una modalida os de la invención en la que la extracción del pr ce corriente abajo del fermentador y el prime ctante inmiscible en agua y el segundo agente ex nal inmiscible en agua se agregan por sepa ientes diferentes para que el medio de fermentaci ntacto con el agente extractante .

La Figura 9 ilustra esquemáticamente una modalida os de la invención en la que la extracción del pr ce en por lo menos un fermentador por lotes por me de corrientes paralelas de un agente extractan inferior, o cerca de ésta, de una masa de fer llenar el fermentador con agente extractante q del fermentador en un punto de la parte sup no a éste, del fermentador.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS 1 en de los números de identificación de secuencia y proteínas ipción Sec . con núm. de Sec. co ident . : ide Ácido nucleico Pép de Klebsiella pneumoniae 1 olactatq sintasa) de E. coli (acetohidroxiácido 3 toisomerasa) de E. coli (acetohidroxiácido 5 dratasa) de Lactococcus lactis (ácido a- 7 descarboxilasa de cadena icada) , optimizado por codones e butanol deshidrogenasa (sadB) 9 mobacter xylosoxidans de Bacillus subtilis 32 olactato sintasa) lvC-Z4B8 ( ARI) 36 de S. cerevisiae 40 Las secs. con núms . de ident . : 11-22 son las secue ótidos de los cebadores usados para construir la richia coli recotnbinante que se describe más ade esente en los ejemplos de la sección de Métodos ge La sec . con núm. de ident. : 23 es la secue ótidos del gen pflB de la cepa de Escherichia 55.

La sec. con núm. de ident.: 24 es la secue ótidos del gen ldhA de la cepa de Escherichia c 55.

La sec. con núm. de ident.: 25 es la secue eótidos del gen adhE de la cepa de Escherichia c 55.

La sec. con núm. de ident. : 26 es la secue eótidos del gen frdA de la cepa de Escherichia c 55.

La sec. con núm. de ident . ótidos de pLH475-Z4B8.

La sec. con núm. de ident. ótidos del promotor de CUPl.

La sec. con núm. de ident. ótidos del terminador de CYC1 La sec. con núm. de ident. ótidos del promotor de ILV5.

La sec. con núm. de ident. eótidos del terminador de ILV5 La sec. con núm. de ident. eótidos del promotor de FBAl.

La sec. con núm. de ident. eótidos de pLH468.

La sec. con núm. de ident. eótidos de pNY8.

La sec. con núm. de ident . : 53 es la .secue ótidos del terminador de ADH1.

La sec. con núm. de ident.: 56 es la secue ótidos de pRS423 FBA ilvD(Strep).

La sec. con núm. de ident.: 57 es la secue ótidos del terminador de FBA.

La sec. con núm. de ident. : 60 es la secue eótidos del segmento GPM-sadB-ADHt .

La sec. con núm. de ident. : 61 es la secue ótidos de pUC19-URA3r.

La sec. con núm. de ident.: 72 es la secue eótidos del segmento ilvD-FBAlt.

La sec. con núm. de ident.: 84 es la secue eótidos de la plantilla de ADN URA3r2.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION resencia de oxígeno.

Como se usa en la presente descripción el iciones microaerobias" significa condició imiento con niveles bajos de oxígeno (es dec jo de los niveles normales de oxígeno atmosféric Como se usa en la presente descripción el iciones anaerobias" significa condiciones de cre sencia de oxígeno.

Como se usa en la presente descripción el términ arbono fermentable" se refiere a una fuente de Z de ser metabolizada por los microorganismos desc resente descripción. Las fuentes de carbono fer adas incluyen, pero no se limitan a, monosacárido glucosa o fructosa; disacáridos, tales como l rosa; oligosacáridos ; polisacáridos , tales como a losa; un sustrato de carbono; y mezclas de éstos. intética del butanol" se refiere a una ruta en producir 1-butanol, 2-butanol o isobutanol.

Como se usa en la presente descripción el térmi intética del 1-butanol" se refiere a una ruta en producir 1-butanol a partir de acetil coe til CoA) .

Como se usa en la presente descripción el térmi intética del 2-butanol" se refiere a una ruta en producir 2-butanol a partir de piruvato.

Como se usa en la presente descripción el térmi intética del isobutanol" se refiere a u ática para producir isobutanol a partir de piru Como se usa en la presente descripción el térmi " se refiere a un ácido carboxílico que tiene un tica larga (es decir, de Cu a C22) , saturada o ins Como se usa en la presente descripción el término dad de butanol en el medio de fermentació dad de butanol recuperada del agente ext ico y de la fase gaseosa si se usó desorción con Como se usa en la presente descripción el s mínimos" se refiere a los medios de crecimi enen los nutrientes mínimos posibles p miento, en general, sin la presencia de aminoác mínimo contiene, típicamente, una fuente de ntable y diversas sales, que pueden varia organismos y condiciones de crecimiento; esta rcionan, generalmente, elementos esenciales ta sio, nitrógeno, fósforo y azufre, para permiti organismo sintetice proteínas y ácidos nucleicos Como se usa en la presente descripción el término idos" se refiere a medios de crecimiento que dades conocidas de todos los ingredientes, por Como se usa en la presente descripción el térm fiere a la fase acuosa.

Como se usa en la presente descripción el térmi fiere a la fase orgánica.

Como se usa en la presente descripción el térmi fiere a isopropil ß-D-tiogalactopiranosido .

Como se usa en la presente descripción el término re al volumen de un gas por volumen del medio por Como se usa en la presente descripción el térmi fiere a la American Type Culture Collection, Manas El término "vol" significa volumen.

El término "rpm" significa revoluciones por minut El término "s" significa segundo (s).

El término "min" significa minuto (s) .

El término "h" significa hora(s) .

El término "µ?" significa microlitro (s) .

El término "g/g" significa gramo por gramo.

El término "g/1" significa gramos por litro.

El término "yg/nil" significa microgramo por milil El término "mg/1" significa miligramo por litro El término "mmol/min/mg" significa milimol po iligramo .

El término "g/l/h" significa gramos por litro por El término "HPLC" significa cromatografía presión, por sus siglas en inglés.

El término "CG" significa cromatografía de gas. organismos genéticamente modificados Los hospederos microbianos para la produc ol pueden seleccionarse de bacterias, cianoba os filamentosos y levaduras. El hospedero mi eado debe ser tolerante al producto de butanol p que el rendimiento no esté limitado por la t ía de los estudios sobre la comparación de to lcohol en bacterias sugieren que el butanol o que el etanol (de Cavalho et al., Microsc. Re 15-22 (2004) y Kabelitz et al., FEMS Microbio 223-227 (2003)). Tomas et al. (J\ Bacteriol. 1 (2004)) describen que el rendimiento de 1 te la fermentación en Clostridium acetobutylic r limitado por la toxicidad del butanol. El cipal del 1-butanol sobre Clostridium acetobuty lteración de las funciones de la membrana (He Appl. Environ. Microbiol. 50:1238-1243 (1985)).

Los hospederos microbianos seleccionados cción de butanol deben ser tolerantes al bu poder convertir carbohidratos en butanol al biosintética introducida que se describe más a criterios para la selección de hospederos mic de la velocidad de crecimiento (IC50) cuando se n medio mínimo. Los valores IC50 pueden determin os conocidos en la técnica. Por ejemplo, los m interés pueden cultivarse en presencia de idades de butanol y se controla la veloc imiento al determinar la densidad óp nanómetros . El tiempo de duplicación puede calc ir de la parte logarítmica de la curva de creci se como una medida de la velocidad de crecimi entración de butanol que produce 50 % de inhibi imiento puede determinarse a partir de una grá entaje de inhibición de crecimiento con entración de butanol. De preferencia, la cepa h tener un valor IC50 para butanol ma ximadamente 0.5 %. Más adecuada es una cepa h un valor IC50 para butanol mayor que aproxim cial para la producción de cualquier microo binante . Los modos de tecnología de transier s que pueden usarse incluyen la electrop gación, transducción o transformación natural. amplia variedad de plásmidos conjugativos del h rcadores de resistencia a fármacos. Los vect ación usados con un organismo se adaptan al o edero en función de la naturaleza de los marca stencia a antibióticos que pueden actuar edero .

El hospedero microbiano también puede manipulars de inactivar rutas competitivas para el flujo de nte la inactivación de varios genes. Esto req nibilidad de transposones o vectores de in sómica para dirigir la inactivación. Adem deros de producción que son sensibles a la mu obacter, Corynebacterium, Brevibacterium, ida, Hansenula y Saccharomyces. Los hosped rencia incluyen: Escherichia coli, Alc ophus, Bacillus licheniformis, Paenibacillus m ococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Lacto tarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gall rococcus faecalis, Pediococcus pentosaceus, Ped ilactici , Bacillus subtilis y Saccharomyces cere Los microorganismos mencionados anteriormente icarse genéticamente para convertir fuentes de ntables en butanol, específicamente, 1 -butanol, 2 obutanol, mediante el uso de métodos conocido ea. Los microorganismos especialmente adecuados richia Lactobacillus ySaccharomyces, en donde E. tarum y S. cerevisiae son de especial pref onalmente, el microorganismo puede ser una cepa t contener una ruta biosintética de 1 -butan cir 1-butanol, según lo descrito por Donaldson e patente O 2007/041269, incorporada en la ipción como referencia. Por ejemplo, el microo modificarse genéticamente para expresar u intética de 1-butanol que comprende el siguiente lizado enzimáticamente para conversiones de produ acetil CoA en acetoacetil-CoA; acetoacetil-CoA en 3 -hidroxibutiril -CoA; 3 -hidroxibutiril-CoA en crotonil -CoA; crotonil-CoA en butiril-CoA; butiril -CoA en butiraldehído; y butiraldehído en 1-butanol.

Los microorganismos también pueden mod icamente para expresar una ruta biosintética de 2 producir 2-butanol, según lo descrito por Dona b) alfa acetolactato en acetoína; c) acetoína en 2 , 3 -butanodiol ; d) 2 , 3 -butanediol en 2-butanona; y e) 2-butanona en 2-butanol.

Los microorganismos también pueden mod icamente para expresar una ruta biosintét itanol para producir isobutanol, según lo desc dson et al. en la publicación de solicitud de pa Estados Unidos núm. 2007/0092957 y la patente 050671, ambas incorporadas en la presente des referencia. Por ejemplo, el microorganism icarse genéticamente para contener una ruta bios isobutanol que comprende el siguiente sustrato ca áticamente para conversiones de productos: a) piruvato en acetolactato; b) acetolactato en 2 , 3 -dihidroxiisovalerato ; tanol: pflB, dado como sec . con núm. de ident.: ica para la piruvato formato liasa) , IdhA, dado c núm. de ident.: 24, (que codifica para la drogenasa) , adhE, dado como sec. con núm. de ide codifica para la alcohol deshidrogenasa) , y por en que comprende el operón frdABCD (que codifica ato reductasa) , específicamente, frdA, dado como de ident.: 26, frdB, dado como sec. con núm. de frdC, dado como sec. con núm. de ident.: 28, y fr sec. con núm. de ident.: 29.

La cepa de Escherichia coli puede comprender: biosintética de isobutanol que codifica p ientes genes: budB (dado como sec. con núm. de de Klebsiella pneumoniae que codifica olactato sintasa (se da como sec. con núm. de ilvC (dado como sec. con núm. de ident.: 3) de butanol deshidrogenasa (se da como sec . con . : 10); y (b) supresiones de los siguientes gen . con núm. de ident . : 23), IdhA (sec. con . : 24) adhE (sec. con núm. de ident.: 25), y fr núm. de ident.: 27). Las enzimas codificadas S de la ruta biosintética del isobutanol catal rato para producir las conversiones que co ato en isobutanol, tal como se describió anteri CÍficamente , la acetolactato sintasa catal rsión de piruvato en acetolactato, la acetohidr toisomerasa cataliza la conversión de acetola ihidroxiisovalerato, la acetohidroxiácido desh liza la conversión de 2 , 3 -dihidroxiisovalerat isovalerato, la cetoácido descarboxilasa de ficada cataliza la conversión de -cetoisoval tiraldehído, y la butanol deshidrogenasa cat con núm. de ident . : 40) que codifica hidroxiácido reductoisomerasa (KARI; sec. con . : 41) y/o un mutante de KARI, tal como el codifi lvC-Z4B8 (sec. con núm. de ident.: 36; sec. con .: 37 de la proteína), ilvD de Streptococcus muta úm. de ident.: 58) que codifica para la acetohidr dratasa (sec. con núm. de ident.: 59), kivD de lis (sec. con núm. de ident.: 43) que codifica cido descarboxilasa de cadena ramificada (sec. con . : 44), y sadB de Achromobacter xylosoxidans ( de ident. : 9) que codifica para una butanol deshid con núm. de ident.: 10). Las enzimas codificadas de la ruta biosintética del isobutanol cata ato para producir conversiones que convierten pi tanol , tal como se describe en la presente .

Una cepa de levaduras preferida que expresa roducción de isobutanol.

Esta cepa de Saecharomyees cerevisiae reco e construirse con métodos conocidos en la técn se ilustra en los ejemplos de la sección rales más adelante en la presente. es extractantes orgánicos Los agentes extractantes útiles en los métodos d a presente son solventes orgánicos inmiscibles agentes extractantes orgánicos adecuados deben criterios de un solvente ideal para una ferm ctiva comercial de dos fases para la produ eración de butanol . Específicamente, el actante debe ser (i) no tóxico para los microor ctores de butanol, tales como, por ejemplo, Esc , actobacillus plantarum y . Sacch visiaegenéticamente modificados, (ii) ser práct 2 ¾ C22/ aldehidos grasos de Ci2 a C22/ Y mezclas d se usa en la presente descripción el término "me " abarca tanto las mezclas dentro de los miembr como las mezclas entre estos miembros de gru lo, mezclas dentro de los alcoholes grasos de C mbién mezclas entre los alcoholes grasos de C12 s grasos de C12 a C22/ por ejemplo.

En algunas instancias, los agentes extractan n longitudes de cadena de menos de 12 carbonos pu diciales para el microorganismo y, por consi diciales para el proceso de producción de but de una ruta biosintética . En el caso de u ctante de 11 carbonos, el efecto sobre un microo derá de las condiciones, pero puede ser perjudi aso que un alcohol graso de Cu, ácido graso de r de un ácido graso de C12l un aldehido de Cu y me rílico (núm. de CAS 112-92-5) , 1-undecanol (núm. 2-5) , ácido oleico (núm. de CAS 112-80-1) , ácido . de CAS 143-07-7), ácido mirístico (núm. de CAS. cido esteárico (núm. de CAS 57-11-4) , miristato d . de CAS. 124-10-7), oleato de metilo (núm. de CAS undecanal (núm. de CAS 112-44-7) , aldehido láuri AS 112-54-9) , 2-metilundecanal (núm. de CAS 110-las de éstos. Estos agentes extractantes orgánic nibles comercialmente a través de diversos prov ejemplo, Sigma-Aldrich (St. Louis, O) , en s, muchos de los cuales pueden ser adecuados par na fermentación extractiva para producir o r ol. Los grados técnicos contienen una me estos que incluyen el componente deseado y com s de cadena más larga y más corta. Por eje ol oleílico de grado técnico comercialmente di idad, el punto de ebullición y la viscosidad. os para producir butano! mediante el uso de ferm activa de dos fases El microorganismo puede cultivarse en un m entación adecuado en un termentador adecua ucir butanol . Puede usarse cualquier fe uado, que incluye un termentador de tanque agi entador de elevación por aire, un termentador de rbujas, o cualquier combinación de éstos. Los ma todos para el mantenimiento y crecimiento de obianos son muy conocidos para los experimentad ica de la ciencia de la fermentación o obiología (véase, por ejemplo, Bailey et al., Bio neering Fundamentáis, segunda edición, McGraw H 1986) . Se debe tener en cuenta el medio de ferm piado, el pH, la temperatura y los requisitos cto de levadura o peptona, y por lo menos una f no fermentable; medios mínimos; y medios defini es de carbono fermentable adecuadas incluyen, pe an a, monosacáridos, tales como glucosa o f áridos, tales como lactosa o sacarosa; oligosa acáridos, tales como almidón o celulosa; un sus no; y mezclas de éstos. Además de la fuente de iada, el medio de fermentación puede contener un itrógeno adecuada, tal como una sal de amonio, levadura o peptona, minerales, sales, cof iones tampón y otros componentes conocidos p imentados en la técnica (Bailey et al. más arri iciones adecuadas para la fermentación ex den del microorganismo específico empleado y po minadas fácilmente por una persona experimenta ica a través de experimentación de rutina. ste de Escherichia coli, Lactobacillus plan aromyces cerevisiae . La primera etapa del pro en contacto el medio de fermentación con u ctante orgánico inmiscible en agua, iormente, para formar una mezcla bifásica que c fase acuosa y una fase orgánica que contiene r en contacto" significa que el medio de ferm en contacto físico con el agente extractante org uier momento durante el proceso de fermentación, idad, el medio de fermentación también comprende fase orgánica que contiene butanol puede contener El agente extractante orgánico puede entrar en el medio de fermentación al comienzo de la ferm formar un medio de fermentación b nativamente, el agente extractante orgánico pued ontacto con el medio de fermentación después de ica, tales como una cromatografía de gas atografía líquida de alto rendimiento.

La fermentación puede realizarse en con ias durante un tiempo suficiente para que el ee un nivel de crecimiento preseleccionado, rminado por medición de la densidad óptica. e agregar un inductor para inducir la expresió biosintética del butanol en el microo ficado y cambiar las condiciones de fermentac iciones microaerobias o anaerobias para estin ucción de butanol, según se describe detallada jemplo 6 más adelante en la presente descrip te extractante se agrega después del camb iciones por condiciones microaerobias o anaerobi Después de poner en contacto el medio de ferm el agente extractante orgánico, el producto de se describe más adelante. El volumen del ctante orgánico es de aproximadamente imadamente 60 % del volumen de trabajo del ferme La etapa siguiente consiste en separar la fase contiene butanol de la fase acuosa mediante el os conocidos en la técnica que incluyen, per an a, sifoneo, decantación, centrifugación, med de un sedimentador que decanta por acción de la g ión de fases asistida por membrana, y simil eración del butanol de la fase orgánica que ol puede hacerse con métodos conocidos en la téc yen, pero no se limitan a, destilación, adsor as, separación por tamices moleculares, pervapor lares. Específicamente, puede usarse la destilac erar el butanol de la fase orgánica que contiene La desorción con gas puede usarse concurrentement Cualquier resto de butanol en el medio de ferm és de haber completado la fermentación erarse por extracción continuada mediante el u e extractante orgánico nuevo o re rnativamente , el butanol puede recuperarse del entación mediante el uso de métodos conocido ica, tales como destilación, destilación azeo acción líquido-líquido, adsorción, desorción c oración por membrana, pervaporación, y similares.

Los métodos de fermentación extractiva de dos fase rse a cabo en un modo continuo en un fermentador do. En este modo, la mezcla del medio de fermentac e extractante orgánico que contiene butanol se eli ntador. Las dos fases se separan con métodos cono écnica que incluyen, pero no se limitan a, tación, centrifugación, mediante el uso de un sedi agente extractante fresco para reemplazar el ctante que se eliminó. Este modo de operación e varias ventajas. Dado que el producto se nuamente del reactor, se requiere un menor vo e extractante orgánico, lo que posibilita un mayor edio de fermentación que se usará. Esto da como mientos de producción más altos. El volumen de ctante orgánico puede ser de aproximadamente imadamente 50 % del volumen de trabajo del ferment a aproximadamente 20 % del volumen de trab ntador; o de 3 % a aproximadamente 10 % del vo jo del fermentador. Es conveniente usar la menor le de agente extractante en el fermentador para olumen de la fase acuosa y, por consiguiente, la lulas en el fermentador. El proceso puede realiza totalmente continuo, en el que el agente extrac iben ejemplos, por ejemplo, en la patente de los s núm. 4,865,973 de Kollerup et al.

También puede usarse el modo de ferm ntinua o por lotes. La fermentación por lotes, conocida en la técnica, es un sistema cerrado e mposición del medio de fermentación se fija al la fermentación y no está sometida a alte iciales durante el proceso. En este modo, se a ntador un volumen de agente extractante orgánic limina durante el proceso. Aunque este modo e que los modos continuo o completamente itos anteriormente, se requiere un volumen m e extractante orgánico para minimizar la conce producto inhibitorio de butanol en el m ntación. Por consiguiente, el volumen del m ntación es menor y la cantidad de producto prod ntado es una variante del sistema por lotes está e los nutrientes, por ejemplo, la glucosa, se ag mentos durante la fermentación. La cantida idad de adición del nutriente pueden determin imentación de rutina. Por ejemplo, puede supervi ntración de nutrientes críticos en el m ntación durante la fermentación. Alternativame n controlar los factores que se miden más fác ejemplo, el pH, oxígeno disuelto y la presión pa residuales, tales como el dióxido de carbono. stos parámetros medidos, puede determinarse la v adición de nutrientes. La cantidad de solvente en este modo es la misma que la usada en el descrito anteriormente.

La extracción del producto puede hacerse corrien termentador en lugar de hacerlo in si tu. En e hacerse con o sin la eliminación de las cél de fermentación. Las células pueden elimina de fermentación con métodos conocidos en la téc yen, pero no se limitan a, filtración o centrif és de la separación del medio de fermentación de ctante por los métodos descritos anteriormente, fermentación puede reciclarse en el ferm charse o tratarse para la eliminación de c cto de butanol restante. De manera similar, las adas también pueden reciclarse en el fermentador. tratamiento para recuperar el producto de but te extractante puede reciclarse para usarse en el extracción. Alternativamente, puede usarse un actante nuevo. En este modo, el solvente no está i fermentador, por ello, la toxicidad del solven lema mucho menor. Si las células se separan del ntación bifásico. El medio de fermentación ende una fase acuosa y un agente extractante cible en agua, tal como se describió anteriorm el medio de fermentación bifásico compr imadamente 3 % a aproximadamente 60 % en vol e extractante orgánico. El microorganismo varse en el medio de fermentación bifásico por u íente para extraer butanol en el agente extra r una fase orgánica que contiene butanol .· En el el medio de fermentación también comprende et orgánica que contiene butanol puede contener és, la fase orgánica que contiene butanol se sepa acuosa, tal como se describió anteri riormente, el butanol se recupera de la fase orgá ene butanol, tal como se describió anteriormente. Puede producirse isobutanol por fermentación ex a presente tiene un título efectivo mayor que del medio de fermentación. Alternativame ol producido con los métodos descritos tiene u tivo de por lo menos 25 g por litro del m entación. Alternativamente, el butanol producido dos descritos en la presente tiene un título efe lo menos 30 g por litro del medio de ferme rnativamente, el butanol producido con los ritos en la presente tiene un título efectivo d s 37 g por litro del medio de fermentación.

Sin estar limitados por la teoría, se cree lo más alto del butanol obtenido con el mé entación extractiva descrito en la presente se e, a la eliminación del producto tóxico de but o de fermentación, lo que mantiene la concentra jo de la concentración tóxica para el microorgan ialmente de alcohol oleílico pueden proporcionar ados en los procesos descritos en la presente.

Con referencia ahora a la Figura 3, se mues sentación esquemática de una modalidad de proce cir y recuperar butanol mediante el uso de fer ctiva in situ. Una corriente acuosa 10 de por lo rr e de carbono fermentable se introduce en un fe ue contiene por lo menos un microorganismo (no se icamente modificado para convertir por lo menos u arbono fermentable en butanol. Una corriente de e extractante inmiscible en agua 12 y una corri do agente extractante opcional inmiscible en ag ducen en un recipiente 16, en el que los ctantes se combinan para formar el agente extract corriente del agente extractante 18 se introduc ntador 20, en virtud de lo cual se produce el cir y recuperar butanol al usar fermentación ex itu. Una corriente acuosa 10 de por lo menos un arbono fermentable se introduce en un ferment contiene por lo menos un microorganismo (no se i ticamente modificado para convertir por lo me te de carbono fermentable en butanol . Una corri er agente extractante inmiscible en agua 12 iente del segundo agente extractante opcional in gua 14 se introducen por separado en el ferment irtud de lo cual se produce el contacto entre ermentación y el agente extractante para for 1a bifásica que comprende una fase acuosa y ica que contiene butanol. Una corriente rende ambas fases, la fase acuosa y la fase orgá oduce en un recipiente 38, en el que se re ración de las fases acuosa y orgánica para prod ol . Una corriente del primer agente ext cible en agua 12 se introduce en el fermentado orriente 22 que comprende una mezcla del primer contenido del termentador 20 se introduce en un ntador 24. Una corriente del segundo agente ext nal inmiscible en agua 14 se introduce en el ntador 24, en virtud de lo cual se produce el el medio de fermentación y el agente extracta r una mezcla bifásica que comprende una fase fase orgánica que contiene butanol. Una corrient ende ambas fases, la fase acuosa y la fase orgá duce en un recipiente 38, en el que se rea ración de las fases acuosa y orgánica para prod orgánica que contiene butanol 40 y una fase acuo Con referencia ahora a la Figura 6, se mues esentación esquemática de una modalidad de proce cible en agua 114 se introducen en un recipie i que se combinan los agentes extractantes inm gua para formar el agente extractante 118. Por orción, que se muestra como corriente 122, del ntación en el termentador 120 se introduce íente 124. Una corriente del agente extracta ién se introduce en el recipiente 124, en virt se produce el contacto entre el medio de fermen gente extractante para formar una mezcla bifá ende una fase acuosa y una fase orgánica que ol. Una corriente 126 que comprende ambas fa acuosa y la fase orgánica, se introduce íente 138, en el que se realiza la separación S acuosa y orgánica para producir una fase orgá iene butanol 140 y una fase acuosa 142.

Con referencia ahora a la Figura 7, se mues cible en agua 112 y una corriente del segund ctante opcional inmiscible en agua 114 se introd ado en un recipiente 124, en el cual los ctantes inmiscibles en agua se combinan para f e extractante 118. Por lo menos una porción, ra como corriente 122, del medio de fermentaci ntador 120 también se introduce en el recipiente d de lo cual se produce el contacto entre el ntación y el agente extractante para formar un ica que comprende una fase acuosa y una fase contiene butanol . Una corriente 126 que compren , la fase acuosa y la fase orgánica, se introdu iente 138, en el que se realiza la separación acuosa y orgánica para producir una fase orgá iene butanol 140 y una fase acuosa 142.

Con referencia ahora a la Figura 8, se mues se introduce en un recipiente 128, y por lo m ión, que se muestra como corriente 122, del ntación en el termentador 120 también se introdu íente 128. Una corriente 130 que comprende un primer agente extractante inmiscible en agü enido del termentador 120 se introduce en un íente 132. Una corriente del segundo agente ext onal inmiscible en agua 114 se introduce en el píente 132, en virtud de lo cual se produce el e el medio de fermentación y el agente extracta ar una mezcla bifásica que comprende una fase fase orgánica que contiene butanol . Una corriente rende ambas fases, la fase acuosa y la fase orgá oduce en un recipiente 138 , en el que se re ración de las fases orgánica y acuosa para prod orgánica que contiene butanol 140 y una fase acu En todavía otra modalidad, también es posible extracción líquido- líquido en un modo flex ientes paralelas o, alternativamente, en contrac justifica la diferencia en los perfiles de opera s cuando se usa una serie de termentadores por l escenario, los termentadores se llenan con entable que proporciona por lo menos una fu ono fermentable y un microorganismo de manera c después del otro, durante el tiempo que la pla uncionamiento. Con referencia a la Figura 9, c entador F100 se llena con la masa de fermenta oorganismo, éstos se alimentan en el Fermentado o en el Fermentador F102 para después v entarse en el Fermentador F100 en un circuito c ualquiera de los termentadores, la fermentación la presentación conjunta de la masa de fermenta La extracción adaptable a corrientes paralelas l de fermentación en el supuesto de que el ferment ona con el título más alto de la fase del caldo pu rriente de solvente extractor más rica en concentr ol, y el termentador que funciona con el título a fase del caldo se beneficiará con la corr nte extractor más pobre en concentración de buta lo, con referencia nuevamente a la Figura 9, co so en que el Fermentador F100 está al comienz ntación y funciona con un título relativamente ol en la fase del caldo (B) , el Fermentador F101 edio de una fermentación y funciona con un ivamente moderado de butanol en la fase del cal ntador F102 está casi al final de una fermen ona con un título relativamente alto de butanol e caldo. En este caso, el solvente extractor nte en la corriente . La corriente de solvente proc al se elimina la mayor parte de butanol puede re stema como solvente extractor pobre en butanol y nte que se alimenta en el Fermentador F100 anterio Como las fermentaciones continúan de manera o n reubicarse las válvulas del distribuidor del ctor para alimentar el solvente extractor d nido en el fermentador que funciona con el título tanol en la fase del caldo. Por ejemplo, en el sup (a) el Fermentador F102 completa su fermentació gado y la fermentación comienza nuevamente, ntador F100 está en la mitad de su fermentación y n título moderado de butanol en la fase del caldo, ntador F101 está casi al final de su fermen ona con un título relativamente más alto de butan del caldo. En este escenario, el solvente extra IOS más altos de butanol en la fase del caldo. a temperatura puede posibilitar una tolerancia títulos más altos de butanol en la fase del cald LOS La presente invención se define más detallada és de los siguientes ejemplos. Debe entenderse estos ejemplos señalan las modalidades preferid ción, se aportan a manera de ejemplo únicament ripción precedente y de estos ejemplos, aquel riencia en la técnica pueden determin Cterísticas esenciales de esta invención tarse del espíritu ni del alcance de ella, ducir diversos cambios y modificaciones de la i adaptarla a los diversos usos y condiciones .

Todos los solventes (esto es, agentes extracta os Generales onstrucción de la cepa recombinante NGCI-031 de scherichia coli Una cepa de Escherichia coli recombinan rende una ruta biosintética del isobut esiones de los siguientes genes: pflB (sec. c dent . : 23, que codifica para la piruvato a) , ldhA (sec. con núm. de ident.: 24, que la lactato deshidrogenasa), adhE (sec. con t . : 25, que codifica para la alcohol deshidro dB (sec. con núm. de ident.: 27, que codif nidad de la fumarato reductasa) , se construyó describe a continuación. Los genes de 1 intética del isobutanol fueron jbudB de Kl moniae (dado como sec. con núm. de ident. : 1) , erichia coli (dado como sec. con núm. de ide onstrucción de una cepa de Escherichia coli reco ue tiene supresiones de los genespflB, IdhA, adh Se usó la colección de Keio de cepas de E. coli Mol. Syst . Biol., 2:1-11, 2006) para la producci de E. coli que tiene las supresiones génicas prev ue se hace referencia en la presente como la ce con cuatro inactivaciones génicas. La colección de genoteca de inactivaciones de genes únicos cread de E. coli BW25113 con el método de Datsenko enko, K. A. & Wanner, B. L., Proc. Nati. Aca os Unidos, 97 6640-6645, 2000) . En la colección, mido se reemplazó con un marcador, para k ueado por FRT removible por recombinasa Flp. La ce con cuatro inactivaciones génicas se construyó al dor de resistencia a la kanamicina para inactivaci epa donante de Keio por transducción de Pl a JW0886: el marcador para kanamicina se en el gen pflB - , JW4114: el marcador para kanamicina se en el gen frdB JW1375: el marcador para kanamicina se en el gen ldhA JW1228: el marcador para kanamicina se en el gen adhE las transducciones de PlVir se llevaron a cabo rito por Miller con algunas modificaciones (Mi 992. A Short Course in Bacterial Genetics. Col or Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y) . Bre preparar un lisado transductor, las células de te se cultivaron toda una noche en medio d ani (LB) a 37 °C con vibración. El cultivo de e de estas células se subcultivó en medio una placa con agar y LB y se incubó a 37 °C. ente se raspó la capa de agar blando en un ífuga. La superficie de la placa se lavó con me gregó al tubo de la centrífuga con algunas g y después se agitó vigorosamente el tubo lador vórtex. Después de la centrifugación a 4 te 10 minutos, se recolectó el sobrenada enía el lisado de Plvir* Para la transducción, la cepa receptora se te toda la noche en 1-2 mi de medio LB a 3 ción. Los cultivos se granularon por centrifug microcentrífuga (Eppendorf) a 10,000 rpm durante ratura ambiente. Los gránulos de célu pendieron en un volumen igual de solución tamp M MgS04/ 0.005 M CaCl2) , se vertieron en t otas de 0.1 mi y se agregó 0.01 mi del lisado arón durante toda la noche a 37 °C. Se seleccion ductantes por PCR de colonias con cebadores crom íficos flanqueantes de la región corriente ente arriba de la inserción del marcador para kan Se eliminó del cromosoma el marcador para kanam formar la cepa resistente a la kanamicina con el (Cherepanov, P. P. y Wackernagel, W. , Gene, 15 y después se distribuyó sobre placas con med ilina (100 g/ml) y se incubó a 30 °C. El plásmi ene la recombinasa FLP de la levadura bajo el con tor ? PR. La expresión de este promotor está co l represor sensible a la temperatura cI857 que r lásmido. El origen de replicación de pCP20 ta ble a la temperatura. Las colonias resistent ilina se sembraron en estrías sobre placas con me y se incubaron a 42 °C. La temperatura de incuba a HotStarTaq Master Mix (Qiagen, Valencia, CA; ogo 71805-3) de conformidad con el protoc cante. En 25 µ? de la mezcla de reacción Master nía 0.2 µ? de cada cebador para PCR específ soma, se agregó una pequeña cantidad de una col ficación se llevó a cabo en un termociclador o 9700 de GeneAmp (PE Applied Biosystems, Fost Las condiciones típicas de la PCR de colonias fu entes: 15 min a 95 °C; 30 ciclos de 95 °C duran ratura de hibridación en el intervalo de 50-58 °C , cebadores extendidos a 72 °C con un tiempo de e proximadamente 1 min/kb de ADN; y luego 10 min do de una retención a 4 °C. Los tamaños de los p a PCR se determinaron por electroforesis en ración con estándares de pesos moleculares conoci Para transformaciones se prepararon or transformar. Las células y el ADN se transfi as enfriadas y electroporadas en un pulsad r II de Bio-Rad de conformidad con las instr abricante (Bio-Rad Laboratories, Inc Hercules, C La cepa J 0886 (ApflB::kan) se transformó con el y se distribuyó en placas con LB que contenían 1 mpicilina a 30 °C. Se seleccionaron los transf tentes a la ampicilina, se sembraron en estrí s con LB y se cultivaron a 42 °C. Las colonias olocaron en parches sobre placas con medios se ampicilina y kanamicina y placas con medio ías sensibles a la kanamicina y sensibles a la ar eleccionaron por PCR de colonias con los cebado (sec. con núm. de ident . : 11) y pflB CkDn (sec. ent . : 12) . Una alícuota de 10 µ? de la mezcla de a PCR se analizó por electroforesis en gel. Se ob ias que produjeron el producto esperado de imadamente 1.6 kb se hicieron electrocompetent se describió anteriormente, y se transformaron c la eliminación del marcador, tal como se d iormente. Los transformantes se distribuyeron placas con LB que contenían 100 g/ml de ampi , después se seleccionaron los transformantes res ampicilina, se sembraron en estrías sobre placas ivaron a 42 °C. Las colonias aisladas se colo es sobre las placas con medios selectivos para am amicina y en placas con LB. Las colonias sensib icina y sensibles a la ampicilina se seleccion con los cebadores frdB CkUp (sec. con núm. de ide dB CkDn (sec. con núm. de ident . : 14) . Se ob cto esperado de PCR de aproximadamente 0.4 irmar la eliminación del marcador y crear la cepa eliminación del marcador, tal como se d iormente. Los transformantes se distribuyeron e LB que contenían 100 g/ml de ampieilina a 30 ° formantes resistentes a la ampicilina se semb as sobre placas con LB y se cultivaron a 42 ías aisladas se colocaron en parches sobre las pi s selectivos para ampicilina y kanamicina y en pí Las colonias sensibles a la kanamicina y sensib ilina se seleccionaron por PCR con los cebado (sec. con núm. de ident.: 15) y ldhA CkDn (sec. dent . : 16) para un producto de 0.3 kb. Los cí jeron el producto esperado de PCR de aproxim b confirmaron la eliminación del marcador y er de triple inactivación génica designada como la inactivaciones génicas" (ApfIB frdB ldhA) .

La "cepa de tres inactivaciones génicas" se trans ilina a 30 °C. Los transformantes resistente ilina se sembraron en estrías sobre placas con varon a 42 °C. Las colonias aisladas se distribu és sobre placas con medios selectivos para ampi icina y sobre placas con LB. Las colonias sensib nicina y sensibles a la ampicilina se seleccion con los cebadores adhE CkUp (sec. con núm. de ide hE CkDn (sec. con núm. de ident . : 18). Los cí jeron el producto esperado de PCR de aproxim b se denominaron la "cepa de cuatro inacti as" (ApflB frdB IdhA adhE) .

Introducción del conjunto de genes que codifican uta biosintética del isobutanol en la cepa de E. on cuatro inactivaciones génicas.

Se construyó el plásmido pTrc99A: : budB-ilvC- il como se describe en los Ejemplos 9-14 de la pub codifica para la cetoácido descarboxilasa de ficada de Lactococcus lactis (sec. con núm. de El gen sadB de Ac romoJbacter xylosoxidans que butanol deshidrogenasa (sec. con núm. de ident. lonó en el plásmido pTrc99A: :budB-ilvC-ilvD-ki se describe a continuación.

Un fragmento de ADN que codifica una idrogenasa (ADN: sec. con núm. de ident.: 9; de ident. : 10 de la proteína) de Achro soxidans (descrita en la solicitud de patente cop e propiedad mancomunada de los Estados Unid 48291) se amplificó del ADN genómico de A, xylo ondiciones estándar. El ADN se preparó mediante e estuche Gentra Puregene (Gentra Systems, eapolis, MN; número de catálogo D-5500A) de con el protocolo recomendado para organismos gram ne r pTrc99a (Amann et al . , Gene 69: 301- 315, és se realizó la digestión de pCR4Blunt : : s , liberando el fragmento de sadB, que se unió 9a digerido con EcoRI para generar pTrc99a::sa ido se transformó en células Mach 1 de E. co formante resultante se denominó Machl/pTrc99a : : minó que la actividad enzimática expresada del stas ' células fue de 3.5 mmol/min/mg de prot ctos libres de células cuando se analizó medi e isobutiraldehído como estándar.

Luego, el gen sadB se subclono en pTrc99A: .budB-il de la siguiente manera. La región codificante de ficó a partir de pTrc99a : : sadB con los cebador con núm. de ident . : 21) y N696A (sec. con núm. de mediante el uso de la ADN polimerasa de alta f on (New England Biolabs, Beverly, MA) . La amplific clonación. El producto de PCR de 1.1 kb se dig y Xbal (New England Biolabs, Beverly, MA) y se el mediante el uso de un estuche de extracción ick (Qiagen Inc., Valencia, CA) . El fragmento pu ió con pTrc99A: :budB- ilvC-ilvD-kivD, que se había las mismas enzimas de restricción, al usar T4 AD England Biolabs, Beverly, MA) . La mezcla de ó a 16 °C durante toda la noche y luego se trans as competentes de E. coli Mach 1™ (Invit o rmidad con el protocolo del fabricante. Los transf btuvieron después del cultivo en medio agar c g/ml de ampicilina. El ADN plasmídico formantes se preparó con el estuche QIAprep Spin en Inc., Valencia, CA) de conformidad con los p fabricante. El plásmido resultante se 9A: :budB-ilvC-ilvD-kivD-sadB . Las Construcción de la cepa de levaduras NGI-049 NGI-049 es una cepa de Saccharomyces cerevis ción- inactivación de los genes endógenos PDC1, y que contiene los vectores de expresión pLH47 8. Los genes PDC1, PDC5 y PDC6 codifican l zimas principales de la piruvato descarboxilasa. sa genes que codifican enzimas para una ruta bios sobutanol que están integrados o en plásmidos.

Vector de expresión pLH475-Z4B8 El plásmidopLH475-Z4B8 (sec. con núm. de ident . ruyó para expresión de ALS y KARI en levadu ido pLH475-Z4B8 es un vector pHR81 (núm. de ) que contiene los siguientes genes quiméricos: 1) el promotor de CUP1 (sec. con núm. de 31), región codificante del gen acetolactato sintasa de Bacillus 39) , región codificante de KARI cerevisiae (ILV5; sec . con núm. de ide sec . con núm. de ident . : 41 de la pro terminador de CYC1.

La región codificante de Pf5. IlvC-Z4B8 es una s codifica KARI derivada de Pseudomonas fluoresce contiene mutaciones, lo que se describe en la s atente copendiente y de propiedad mancomunada os Unidos núm. 12/337736, que se incorpora nte descripción como referencia. La PfS.IlvC-fica KARI (sec. con núm. de ident.: 37) ti ientes cambios de aminoácidos en comparación con ral de Pseudomonas fluorescens : C33L: la cisteína en la posición 33 cambió a leu R47Y: la arginina en la posición 47 cambió a tir S50A: la serina en la posición 50 cambió a alani accharomyces cerevisiae .

Vector de expresión pLH468 El plásmido pLH468 (sec. con núm. de ident . : ruyó para expresión de DHAD, KivD y HADH en leva Las regiones codificantes para la se^?e? rboxilasa (KivD) y alcohol deshidrogenasa de h IIO (HADH) de B. subtilis se sintetizaron co dose en codones que fueron optimizados para expr aromyces cerevisiae (secs. con núms . de ident.: ctivamente) y se suministraron en los plásmidos .0 y pHadhy-DNA2.0. Las proteínas codificadas . con núms. de ident. : 44 y 46, respectivam ruyeron los vectores de expresión individuales p DH. Para el ensamblaje de pLH467 (pRS426 : : PGP t) , el vector pNY8 (sec. con núm. de ident.: 47, inado pRS426. GPD-ald-GPDt , descrito en la public ent . : 49 y 50) . El fragmento del vector pNY8 dige Sfilse unió con el producto de PCR del promotor ido con AscI y Spel y el fragmento Spel-Sfil que egión codificante de kivD optimizada por codones vector pKivD-DNA2.0. La unión triple generó e 7 (pRS426 : : PGPD1-A:ivDy-GPDlt) . El vector pL icó por mapas de restricción y secuenciación .

El pLH435 (pRS425: :PGPWI-Had y-ADHlt) se derivó de 5 : : GPM-sadB (sec. con núm. de ident . : 51), ibe en la solicitud de patente copendiente y de p munada de los Estados Unidos núm. 61/058970, Ej se incorpora en la presente descripción como ref RS425 ::GPM-sadB es el vector pRS425 (núm. de ) con un gen quimérico que contiene el promotor . con núm. de ident.: 52), la región codificant ol deshidrogenasa de Achromobacter xylosoxidan úms . de ident . : 54 y 55) para generar el vector sadB-Nhel, que se verificó por secuenciac 5 : : PGPMI* sadB-Nhel se digirió con Nhel y Pací para gión codificante de sadB y se unió con el fragmen que contiene la región codificante de HADH optimi es del vector pHadhy-DNA2.0 para crear pLH435.

Para combinar los casetes de expresión de KivD solo vector, el vector de levaduras pRS411 (nú 87474) se digirió con SacI y Notl y se unió entó Sacl-Sall de pLH467 que contiene el case -GPDlt junto con el fragmento Salí-Notl de pL iene el cásete PcpMi-Had y-ADHlt en una reacción le. Esto produjo el vector pRS411 : : GPD1-kivDy-PG 41) , que se verificó con mapeo de restricción.

Para generar un vector de coexpresión para los tr a ruta del isobutanol inferior: ilvD, kivDy y H ye el marcador His (nt 504 a 1163) para sele uras y el marcador de resistencia a la ampici a 7949) para selección en E. coli. La región cod vD (nt 3116 a 4828; sec . con núm. de ident . : 58; de ident.: 59 de la proteína) de Streptococcu (núm. de la ATCC 700610) está entre el promotor rminador de FBA y forma un gen quimérico para ex s, una etiqueta Lumio está fusionada a la icante de ilvD (nt 4829-4849) .

La primera etapa fue linealizar p S423 FBA ilv ién denominado pRS423 -FB (SpeI ) -IlvD (Strep s) -Lumio) con SacI y SacII (con el sitio SacII extremos romos mediante el uso de la T4 ADN polí dar un vector con una longitud total de 9,48 da etapa fue aislar el cásete kivDy-hADHy de pL ? Kpnl (con el sitio Kpnl generado con extrem -URA3r al unir el segmento GPM-sadB-ADHt (sec. ent . : 60) de pRS425 :: GPM-sadB (descrito anteriorm URA3r de pUC19-URA3r. El pUC19-URA3r (sec. con . : 61) contiene el marcador URA3 de pRS426 (nú 77107) flanqueado por secuencias de repetición h pb para permitir la recombinación homologa in v nación del marcador de C7RA3. Los dos segmentos d on por PCR SOE (PCR con método de unión por exte amiento, por sus siglas en inglés) (según lo desc n et al. (1989), Gene 77:61-68) al usar como p ADN plasmídicos de pRS425 :: GPM-sadB y pUC19-URA3 olimerasa Phusion (New England Biolabs Inc., Beve de catálogo F-540S) y los cebadores 114117-11A a (secs. con núms . de ident . : 62, 63, 64 y 65), y 11 117-13B (secs. con núms. de ident.: 66 y 67).

Los cebadores externos para la PCR SOE (1141 formantes se seleccionaron por PCR mediante el cebadores 112590-34G y 112590-34H (secs. con . : 68 y 69), y 112590-34F y 112590-49E (secs. c ent . : 70 y 71) para verificar la integración en DC6 con supresión de la región codificante de dor de URA3r se recicló por cultivo en placas co ticos completos suplementados con 2 % de glucosa °C de conformidad con protocolos estándar. Se liminación del marcador al colocar parches de col lacas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para v usencia de crecimiento. La cepa identificada re el genotipo: BY4700 pdc6 : :VGPM1- sadB-ADHlt .

Construcción del cásete de integración pdcl::PD y supresión de PDC1 : Se preparó un cásete de integración pdcl::PDC t-URA3r al unir el segmento ilvD-FBAlt (sec. con regiones corriente abajo del promotor de PDCl y c de la secuencia codificante de PDCl. El fragment cásete finalizado se transformó en BY4-Oí0™ dc6" : :P , y los transformantes se mantuvieron en medios si etos sin uracilo y suplementados con 2 % de g mediante el uso de técnicas genéticas estándar east Genetics , 2005, Cold Spring Harbor Laborator Spring Harbor, NY, págs. 201-202) . Los transform cionaron por PCR mediante el uso de los cebadores 135 (secs. con núms . de ident.: 77 y 78), y los c 0-49E y 112590-30F (secs. con núms. de ident.: verificar la integración en el locus de PDCl con s a secuencia codificante de PDCl. El marcador de ió por cultivo en placas con medios sintéticos mentados con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C de co protocolos estándar. Se confirmó la eliminac 77107) flanqueado por secuencias de repetición h 00 pb para permitir la recombinación homologa i liminación del marcador de URA3. La PCR se realiz polimerasa Phusion y los cebadores 114117-45A y (secs. con núms . de ident . : 85 y 86), que gene cto de PCR de -2.3 kb. La porción de HIS3 or se derivó de la región 5' corriente arr tor de HIS3 y región 3' corriente abajo de l ficante para que la integración del marcador d zca el reemplazo de la región codificante de cto de PCR se transformó en NYLA67 mediante e icas genéticas estándar (Met ods in Yeast Genétic Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har . 201-202), y se seleccionaron los transform os sintéticos completos sin uracilo y suplement de glucosa a 30 °C. Se seleccionaron transforman 73" tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : :GPMlip-sa : :PDClp-ílvD-FBAlt Ahis3.

Construcción del cásete de integración pclc5::ka supresión de PDC5 : Se amplificó por PCR un cásete pdc5::kanMX4 osómico de la cepa YLR134W (núm. de la ATCC 4034 polimerasa Phusion y los cebadores PDC5 : : K ::KanMXR (secs, con núms . de ident . : 80 y 81), ró un producto de PCR de -2.2 kb. La porción de cebador se derivó de la región 5' corriente ar otor de PDC5 y la región 3' corriente abajo de l ficante para que la integración del marcador d uzca el reemplazo de la región codificante de ucto de PCR se transformó en NYLA73 mediante e icas genéticas estándar {Methods in Yeast G , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Los vectores plasmídicos pLH468 y pLH475-sformaron simultáneamente en la cepa BY4700 pdcS -A Hlt pdcl: : PDClp- ilvD-FBAlt Ahis3 pdc5 ante el uso de técnicas genéticas estándar (Me t Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laborator Spring Harbor, NY) y se mantuvieron en éticos completos sin histidina ni ura ementados con 1 % de etanol a 30 °C. étodo de cromatografía de gas (CG) para la deter e isobutanol Se usó el siguiente método de CG para deter idad de isobutanol de las fases acuosa y orgánic los 1-7 descritos más adelante. El método de CG columna HP-InnoWax (30 m x 0.32 mm de DI, 0. sor de película) de Agilent Technologies (Sant El gas portador fue helio a una velocidad de ? o de 0.5 µ?. Se generaron curvas estándar ca los siguientes compuestos: etanol, isobutanol, a 2 , 3-butanodiol y ( 2S , 3S) -2 , 3 -butanodiol . Tam n estándares analíticos para identificar los ti ción para el isobutiraldehído, ácido isobut ol isoamílico. En estas condiciones, el ti ción del isobutanol fue de aproximadamente 5.33 étodo de HPLC para la determinación de glucosa e sobutanol en la fase acuosa Para los Ejemplos 7 y 8, se determinó el isobutan orgánica con el método de CG descrito anteriormen Ejemplos 7 y 8, se determinaron las concent ae tanol y glucosa en la fase acuosa por HPLC nee Model, Milford, MA o Serie 1100 de Agilen , CA) mediante el uso de una columna para azúcare 1, 8.0 mm x 300 mm, (Showa Denko K. K. , Kanagaw Detector: índice de refracción Temperatura del detector: 40 °C Detección UV: ancho de banda 210 nm, 4 nm Después de la ejecución, las concentraciones ra se determinaron a partir de curvas estándar p e los compuestos. Los tiempos de retención fuero inutos para isobutanol y glucosa, respectivamente ción de solventes El propósito de este ejemplo fue seleccionar ntes orgánicos para usarse en la ferm ctiva de butanoles. Las características del se investigaron fueron la partición de isobutan olvente y una fase acuosa, la tendencia del formar emulsiones en el sistema bifásico concentración final de isobutanol de 10, 30 /1. Estas soluciones acuosas de butanol (12 aron a tubos de ensayo y se agregó 4 mi del se sometería a prueba. Cada solvente se probó d da concentración del isobutanol. Los tubos se i nte 3 horas con mezclado a 30 °C. Después de ese ase acuosa y la fase de solvente de cada raron por centrifugación y se analizaron para de sobutanol con el método de CG descrito anteriorr ección de métodos generales en la presente. Se oeficiente de partición para isobutanol entre c olvente y la fase acuosa, es decir, Kp = [Isobu sobutanol] Aq · Los resultados se resumen en la Tab a 2 icientes de partición para isobutanol Como puede observarse a partir de los dato a, todos los solventes sometidos a prueba tuvi iciente de partición favorable para el isobuta La biocompat ibilidad de cada solvente se d ante el uso de técnicas de matraz vibratorio BY4741 de Saccharomyces cerevisiae obtenid . Los matraces vibratorios con semillas que c mi de medio de extracto de levaduras/peptona/ ) se inocularon con 200 µ? del inoculo de BY4 visiae y se incubaron durante toda la noche vibración a 250 rpm hasta que la DO60O alcanzó proximadamente 0.5. Se retiraron muestras del determinar la D060o con un espectrofotómetr entración de glucosa con una HPLC.

El cultivo de semillas resultante se dividió aces de 125 mi de la manera siguiente. En un tados de densidad óptica 4 itados de la glucosa Solvente Glucosa Glucosa Glucosa Glucosa (g/D (g/D (g/D (g/D Como puede observarse a partir de los result Tablas 3 y 4, la S. cerevisiae cultiv encia de ácido oleico, alcohol oleílico canol exhibió aproximadamente el mismo ?? imiento y utilización de glucosa que el cont ente, lo que indica que estos solvent ompatibles con la cepa de S. cerevisiae som b . Todos los solventes, el ácido octanoico nal, el 1-decanol y el nonanol , inhibie ización de glucosa y el crecimiento de la erevisiae . pio 2 y Ejemplo 3 (COMPARATIVO) imiento de Saccharomyces cerevisiae en prese utanol y alcohol oleílico El propósito de estos ejemplos fue demostrar ienen 600 mi de medio YPD se inocularon c y 1000 µ? del inoculo de BY4741 deSacc a visiae, respectivamente. Los matraces se in nte toda la noche a 30 °C con vibración a a que la. D060o alcanzó un valor de aproxima Se retiraron muestras de cada cultivo rminó la D06oo y la concentración de gluco se describió anteriormente.

En un matraz de 125 mi se agregaron 100 ivo que se derivó del inoculo de 300 µ? (Eje arativo) . En otro matraz de 125 mi se ag i del cultivo y 25 mi de alcohol oleíli r, 25 %vol) (Ejemplo 2) . Los matraces se in °C con vibración a 100 rpm . Se retiraron r determinar la D06oo y la glucosa. Cuando nzó un valor de aproximadamente 0.4, se 5 tados de densidad óptica en presencia y ausencia ol oleílico Tiempo Ejemplo 2 Ejemplo 3 (h) DO600 (Comparativo) DO600 adición de isobutanol) 0.4 0.4 3 0.5 0.6 4 1.3 0.7 5 1.7 0.6 14 3.1 0.6 a 6 entración de glucosa en presencia y ausencia de lico Tiempo Ejemplo 2 Ejemplo 3 s 5 y 6, el isobutanol a una concentración de 3 cia de alcohol oleílico (Ejemplo 3, Comp ió casi completamente la utilización de gluco imiento de la biomasa. Sin embargo, el cultivo f recer y utilizar glucosa en presencia de isob concentración de 30 g/1 cuando se adicionó lico al cultivo. La velocidad de crecimient ización de glucosa del cultivo que contiene isob hol oleílico fueron comparables con las del con enía solo alcohol oleílico. Estos resultados de el alcohol oleílico mitiga la toxicidad del is la cepa estudiada de Saccharomyces cerevisia able esperar que podría usarse alcohol oleíl ar la toxicidad del isobutanol, así como ta s butanoles, para otras cepas de Sacch visiae, que incluyen cepas recombinantes . ces vibratorios que contenían una alta conce sobutanol en presencia de alcohol oleílico (Ej n ausencia de alcohol oleílico (Ejem arativo) .

Tres matraces vibratorios con semillas que c 1 de medio Man-Rogosa-Sharpe (MRS) se inocula 500 y 1000 µ?, respectivamente, del inocul PN0512 de Lactobacillus plantarum (ATCC: P sito biológico efectuado el 12 de julio de 20 solicitud de patente de los Estados Unid 61497) . Los matraces se incubaron durante e a 30 °C con vibración a 250 rpm hasta que o entre 2 y 5. Un matraz de 1 1 que contení edio MRS se inoculó con uno de los matra lias mencionados anteriormente, de una DOgoo = D060o inicial = 0.1 y se cultivó a 30 °C con v vibración a 100 rpm. Se retiraron muestr rminar la D060o Y la glucosa. Cuando la D060o imadamente 1.5, se agregó isobutanol a ambos a una concentración final de 30 g/1 de la fase ercer matraz que contenía 75 mi del cultivo y alcohol oleílico, pero sin la adición de ió de control positivo. Se retiraron muestras matraces en distintos momentos para determinar concentración de glucosa. Los resultados idad óptica y la glucosa se dan en las Tablas ectivamente . a 7 itados de densidad óptica en presencia y ausenci hol oleílico Tiempo Ejemplo 4 Ejemplo 5 (Comparativo) 8 entración de glucosa en presencia y ausencia de lico Como puede observarse a partir de los datos as 7 y 8, el isobutanol a una concentra /1 en ausencia de alcohol oleílico (Eje itados demuestran que el alcohol oleílico mi cidad del isobutanol para la cepa estudi obacillus plantarum . Sería razonable esper ía usarse alcohol oleílico para mitigar la to isobutanol, así como también la de otros but otras cepas de Lactobacíllus plantaru uyen cepas recombinantes . pio 6 ucción de isobutanol por Escherichia coli mbinante mediante el uso de fermentación extr El propósito de este ejemplo fue demost ucción de isobutanol a través de un mbinante de Escherichia coli que contiene u intética de isobutanol mediante el entación extractiva con alcohol oleílico como sición del medio de fermentación Ingrediente Cantidad/L o fosfórico 85 % 0.75 mi o sulfúrico (18 M) 0.30 mi ción con cobalto de Balch - 1000X 1.00 mi posición dada en la Tabla 10) ato monobásico de potasio 1.40 g o cítrico monohidratado 200 g ato de magnesio heptahidratado 200 g ato férrico de amonio 0.33 g uro de calcio dihidratado 0.20 g acto de levadura3 5.00 g espumante 204 0.20 mi ina HCl , 5 g/1 de solución madre 1.00 mi cilina 25 m ml de solución madre 4.00 mi 10 es traza modificados de Balch - 1000X Ingrediente Concentración ( o cítrico monohidratado 40.0 4 · H20 30.0 10.0 4- 7H20 1.0 2· 6H20 1.0 4 · 7H20 1.5 4 · 5H20 0.1 o bórico (H3B03) 0.1 bnato de sodio (NaMo04 · 2H20) 0.1 Los ingredientes 1-10 de la Tabla 9 se adició en la concentración establecida para producir un de 1.5 1 en el fermentador. El contenido del fe idróxido de amonio. Después de la inoculación del ntación estéril con cultivo de semillas (2-10 % ntador se hizo funcionar en condiciones aerobias fijo de oxígeno disuelto (OD) de 30 % y 0.5 wm de por control automático de la velocidad de agitació o se alcanzó la densidad óptica deseada (D060o) (e 10), se indujo el cultivo con la adición de IPTG, 0. sobreexpresar la ruta biosintética del isobutanol después de la inducción, las condiciones de fermen aron por condiciones microaerobias al disminuir la agitador a 200 rpm. El cambio a condiciones micr ó la producción de isobutanol al mismo tiempo que antidad de carbono hacia la producción de b opió, de este modo, la formación de biomasa de la p isobutanol. Se agregó alcohol oleílico (aproxi i) durante la fase de producción de isobutanol par tanol de la fase acuosa del fermentador. Para cuant da de isobutanol debido a la extracción, el gas res ntador se lavó a través de una trampa de agua °C) para condensar el isobutanol, que después se c l método de CG descrito anteriormente en la presen on de Métodos generales. Alternativamente, la corr que salía del fermentador se envió directamen trómetro de masas (Prima dB, Thermo Electron Corp., ara cuantificar la cantidad de isobutanol en la cor Los picos de isobutanol con relaciones de masa a ca se controlaron continuamente para cuantificar la ca tanol en la corriente de gas .

Para la producción de isobutanol, el título efec idad efectiva y el rendimiento efectivo, todos c la pérdida de isobutanol debido a la extracción, 1, 0.40 g/l/h, y 0.33 g/g, respectivamente. Co la toxicidad para el microorganismo. Además, el ico parece tener otro efecto benéfico inesperad cción de isobutanol . Esto también puede ve ración con el Ejemplo 7 (Comparativo) . En ese eje eion con gas usada sola removió continuamente el i edio de fermentación y limitó la concentración de i medio de fermentación a un máximo de aproximada 1, un nivel que es comparable con el observado al nación de extracción con alcohol oleílico y desor (véase la Figura 1) . En ambos ejemplos, la concent tanol estuvo por debajo de los niveles inhibitorio ayor parte de la fermentación. Sin embargo, e ivo, la velocidad efectiva y el rendimiento ficativamente más altos del isobutanol se obtuviero nación de fermentación extractiva con alcohol ol ción con gas (Ejemplo 6) que con desorción con gas La fermentación se realizó tal como se describe en e xcepto que no se adicionó alcohol oleílico al ntación durante la fase de producción de isobutanol. T zaron los siguientes cambios. El cultivo se indujo po PTG cuando la D060o alcanzó un valor de 6, y el ciones microaerobias se realizó tres horas despué ción. Para cuantificar la pérdida de isobutanol deb cción, el gas residual del fermentador se envió direc pectrómetro de masas (espectrómetro de masas Prima d ron Corp., Madison, WI) . Los picos de isobutanol con r asa a carga de 74 ó 42 se controlaron continuame ificar la pérdida de isobutanol debido a la extracción.

Para la producción de isobutanol, el título efec idad efectiva y el rendimiento efectivo, todos correg rdida de isobutanol debido a la extracción, fueron d g/l/h, y 0.22 g/g, respectivamente. Dado que el isob tanol a través de una cepa recombinante de Sacc isiae que contiene una ruta biosintética del i nte el uso de fermentación extractiva con alcohol agente extractante orgánico inmiscible en agua.

La cepa empleada fue la cepa NGCI-049 de Sacc isiae, construida como se describió anteriorment nte en la sección de Métodos generales. Todos los emillas para la preparación del inoculo se nitrogenada para levaduras (YB, por sus siglas e aminoácidos (6.7 g/1) , suplementada con una mezcla p-out") de aminoácidos (1.4 g/1) , leucina (100 ofano (20 mg/1) . Se usó etanol al 1 % (v/v) COT e de carbono para todos los cultivos de semillas. ermentación fue un medio semisintético, cuya compos la Tabla 11. enido a través de BD Diagnostic Systems, Sparks, enida a través de Sigma-Aldrich, St . Louis, MO Los ingredientes 1-4 de la Tabla 11 se adició en la concentración establecida para producir un de 0.54 1 en el fermentador. El conten ntador se esterilizó en un autoclave. Los compo se mezclaron, esterilizaron por filtración y adi ermentador después de que el medio en el auto a. enfriado. El volumen total final del m entación (la fase acuosa) fue de aproximadamente La fermentación se realizó mediante el uso eactor Bio Consolé ADI 1025 (Applikon, Inc, Hol colocado en un autoclave, con un volumen de tr i. La temperatura se mantuvo a 30 °C durante entación y el pH se mantuvo a 5.5 con hidr o. Después de la inoculación del medio de ferm de producción de isobutanol por alimentación de que se mantuviera el exceso de glucosa (> 2 momento durante la fermentación. Dos horas des o de glucosa se agregaron 60 mi de solución na y extracto de levadura (YEP) al 10X esterili ación (YEP 10X = 100 g/l de extracto de lev /l de peptona) . Dos horas después de la adición adicionó alcohol oleílico (aproximadamente te la fase de producción de isobutanol para mi lema de inhibición debido a la acumulación de is ros subproductos en la fase acuosa. Se alimentó % p/p de solución madre) al termentador para íes de glucosa mayores que 2 g/l.

Dado que la producción eficiente de isobutanol iciones microaerobias para permitir el equilibri ión de oxidación-reducción en la ruta biosinté tificar la cantidad de isobutanol en la corriente La glucosa y los ácidos orgánicos en la fase a rolaron por HPLC durante la fermentación. Tambié nalizador de glucosa (YSI, Inc., Yellow Spri controlar rápidamente la glucosa. El isobutan acuosa se cuantificó por HPLC y el isobutano de alcohol oleílico se controló con el métod rito anteriormente en la presente en la sec dos generales después de remover periódicamente s del termentador y separarlas por centrifuga entración de isobutanol en la fase acuosa du entación se muestra en la Figura 2, en do rados sólidos (¦) se refieren a las concentraci pio 8, fermentación que usa alcohol oleílico com actante orgánico y desorción con gas, y los dos (·) se refieren a las concentraciones del E tanbl produce un título efectivo, una v iva y un rendimiento efectivo significativame . El producto de isobutanol, que es tóxico dero, se extrae continuamente en la fase de ico, lo que disminuye concentración en la fase e, de este modo, la toxicidad para el microor s, el alcohol oleílico parece tener otro fico inesperado en la producción de isobutano ién puede verse por comparación con el Ej arativo) . En ese ejemplo la desorción con ga eliminó continuamente el isobutanol del m ntación y limitó la concentración de isobutano de fermentación a un máximo de aproximadament ivel que es comparable al observado cuando se inación de extracción con alcohol oleílico y d gas (véase la Figura 2) . En ambos ejem ?? 9 (Comparativo) ccion de isobutanol por Saccharomyces cerevisiae binante mediante el uso de fermentación sin la a agente extractante El propósito de este ejemplo comparativo fue d sin la adición de alcohol oleílico, la produ tanol se inhibe debido a la toxicidad del produc La fermentación se realizó tal como se describ lo 8, excepto que nó se adicionó alcohol ole de fermentación durante la fase de produc tanol . Para cuantificar la pérdida de isobutano . extracción, el gas residual del termentador otamente a un espectrómetro de masas (Prima dB, tron Corp., Madison, WI). Los picos de isobut ciones de masa a carga de 74 ó 42 se con nuamente para cuantificar la pérdida de is O por debajo de los niveles inhibitorios dur parte de la fermentación (véase la Figura 2) . ío 10 Puede usarse un termentador de 2 1 para real ntación con levadura recombinante para la produ tanol, como en el Ejemplo 8, excepto que se elit ón del alcohol oleílico inicial del lote y se r alcohol oleílico fresco. Este proceso puede ejecu odo continuo, en donde se suministra lentamente ico fresco por goteo y el alcohol oleílico cons e por bombeo para que la cantidad de alcohol ole rmentador permanezca constante durante todo el pr ntación. Esta extracción continua de prod oductos de la fermentación puede aumentar el tí idad y el rendimiento efectivos.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antec ma como propiedad lo contenido en las si indicaciones: 1. Un método para recuperar butanol de un entación, caracterizado porque comprende: a) proporcionar un medio de fermentac comprende butanol, agua, y un microo genéticamente modificado que produce b partir de un medio de fermentación que c por lo menos una fuente de carbono ferme b) poner en contacto el medio de fermenta i) por lo menos un primer agente ext orgánico inmiscible en agua seleccion grupo que consiste de alcoholes grasos bifásica que comprende una fase acuos fase orgánica que contiene butanol; c) separar la fase orgánica que contiene de la fase acuosa; y d) recuperar el butanol de la fase orgá contiene butanol para producir recuperado . 2. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque el butanol es isobutanol. 3. El método de conformidad con la reivindic terizado porque el agente extractante orgá ciona del grupo que consiste de alcohol oleílico, ilico, alcohol cetílico, alcohol laurílico, tílico, alcohol estearílico, l-undecanol, ácido láurico, ácido mirístico, ácido esteárico, miri lo, oleato de metilo, undecanal, aldehido láu desorción con gas, para formar una fase que contiene butanol ; y b) recuperar butanol de la fase gase contiene butanol. 6. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque el butanol recuperado t o efectivo de por lo menos aproximadamente 3 del medio de fermentación . 7. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque el medio de fermentación rende etanol, y la fase orgánica que contiene iene etanol. 8. Un método para la producción de cterizado porque comprende las etapas de: a) proporcionar un microorganismo genét modificado que produce butanol a parti de éstos, en donde el medio de ferm bifásico comprende de aproximadamente aproximadamente 60 % en volumen del extractante orgánico inmiscible en agua, el tiempo suficiente para permitir la ex del butanol en el agente extractante or formar una fase orgánica que contiene but c) separar la fase orgánica que contiene de la fase acuosa; y d) recuperar el butanol de la fase orgán contiene butanol para producir recuperado . 9. El método de conformidad con la reivin racterizado porque además el butanol es isobuta 10. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque el agente extractante org 12. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque una porción del butanol se rrentemente del medio de fermentación por un comprende las etapas de : a) extraer butanol del medio de fermenta desorción con gas, para formar, de es una fase gaseosa que contiene butanol; y b) recuperar butanol de la fase gase contiene butanol. 13. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque el butanol recuperado t io efectivo de por lo menos aproximadamente 3 o de la fase acuosa. 14. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque el medio de fermentación rende etanol, y la fase orgánica que contiene produce el butanol en el medio de ferm para producir un medio de fermentac contiene butanol; poner en contacto el medio de fermenta contiene el butanol con i) por lo menos u agente extractante orgánico inmiscible seleccionado del grupo que consiste de a grasos de Ci2 a C22, ácidos grasos de C ésteres de ácidos grasos de C12 a C22, a grasos de C12 a C22, y mezclas de é opcionalmente , (ii) un segundo agente ext orgánico inmiscible en agua seleccion grupo que consiste de alcoholes grasos C22, ácidos grasos de C12 a C22, ésteres d grasos de Ci2 a C22, aldehidos grasos de y mezclas de éstos, para formar una cterizado porque comprende las etapas de: a) proporcionar un microorganismo genét modificado que produce butanol a parti medio de fermentación que comprende menos una fuente de carbono fermentable; b) cultivar el microorganismo en un m fermentación en condiciones aerobias du tiempo suficiente para alcanzar un n crecimiento preseleccionado c) cambiar las condiciones por con microaerobias o anaerobias para estin producción de butanol en el me fermentación y formar un medio de ferm que contiene butanol; d) poner en contacto el medio de fermenta contiene butanol con i) por lo menos u " grasos de Ci2 a C22/ aldehidos grasos C22/ Y mezclas de éstos para formar un bifásica que comprende una fase acuos fase orgánica que contiene butanol; e) separar la fase orgánica que contiene de la fase acuosa; y f) recuperar el butanol de la fase orgán contiene butanol . 18. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque el butanol es isobutanol. 19. Un método para la producción de cterizado porque comprende las etapas de: a) proporcionar un medio de fermentac comprende butanol, agua, y un microo genéticamente modificado que produce b partir de un medio de fermentad ácidos grasos de C12 a C22/ aldehidos g C12 a C22, y mezclas de éstos y, opcion (ii) un segundo agente extractante inmiscible en agua seleccionado del gr consiste de alcoholes grasos de Ci2 ácidos grasos de C12 a C22/ esteres de grasos de Ci2 a C22/ aldehidos grasos C22, y mezclas de éstos para formar un bifásica que comprende una fase acuos fase orgánica que contiene butanol; c) separar la fase orgánica que contiene de la fase acuosa; y d) recuperar el butanol de la fase orgá contiene butanol para producir recuperado . 20. El método de conformidad con la reivin coccus , Pseudomonas, Bacillus, Lactob rococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Kle ibacillus, Arthrobacter, Corynebacteriu ibacterium. 23. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la levadura se selecci que consiste de Pichia, Candida , Hans aromyces .