CN109689876A

CN109689876A - 在需氧条件下生产醇以及使用油醇萃取产物的方法

Info

Publication number: CN109689876A
Application number: CN201780057267.6A
Authority: CN
Inventors: A.赫克; T.哈斯; S.贝克
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2016-07-27
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2019-04-26
Also published as: JP2019525761A; WO2018019847A1; EP3491141A1; WO2018019841A1; US20190169654A1

Abstract

本发明涉及从碳源生产至少一种醇的方法，该方法包括：(a)在需氧条件下在含水培养基中生产醇；和(b)通过以下步骤从所述含水培养基萃取来自步骤(a)的醇：(bi)使所述含水培养基中的醇与至少一种萃取介质接触足以将所述醇从所述含水培养基萃取到所述萃取介质中的时间，(bii)使具有萃取的醇的所述萃取介质与所述含水培养基分离,其中所述萃取介质包含：‑油醇；或‑聚丙二醇和烷烃，其中所述醇包含至少3个碳原子。

Description

在需氧条件下生产醇以及使用油醇萃取产物的方法

发明领域

本发明涉及在需氧条件下从碳源生产醇(包括高级醇)的生物技术方法。特别地，所述方法涉及在氧气的存在下在水溶液中至少一种醇的生物技术生产和从所述水溶液萃取醇的手段。

发明背景

生产醇特别是乙醇的生物技术方法是本领域众所周知的。特别地，在各种碳源上使用产乙酸菌来生产乙醇和/或乙酸是众所周知的。然而，在大部分情况下，生产乙醇仅能在不存在氧气的情况下成功进行。这一现象至少被Brioukhanov, 2006, Imlay, 2006, Lan,2013等所证实，其中显示产乙酸菌在需氧条件下无法成功生产乙醇。因此，在本领域已知的目前方法中，含氧气的碳底物，诸如来自钢铁厂的废气首先处理以去除氧气，随后将它们引入产乙酸细胞以进行乙醇和/或乙酸生产。氧气分离步骤使得该处理花费更高且耗时。此外，在该分离步骤过程中可能存在原材料的一些损失。

因此，本领域存在对氧气存在下生产乙醇和/或乙酸的手段的需要。乙醇可随后用作用于生产高级碳化合物诸如醇、酸等的原材料。

例如，丁醇和高级醇具有几种用途，包括用作燃料。例如，丁醇在未来可以代替汽油，因为这两种燃料的能量含量几乎相同。此外，与乙醇相比，丁醇作为替代燃料具有几种其它优异的特性。这些包括，丁醇具有较高的能量含量，丁醇与乙醇或汽油相比较少“挥发”，且丁醇与乙醇相比易于运输。由于这些原因和更多原因，已经存在丁醇和/或相关高级醇的现有潜在市场。丁醇和其它高级醇也被用作工业溶剂。

类似地，丙醇是制药工业中使用的、用于树脂和纤维素酯以及其它化合物的溶剂。这种溶剂（其更好地称为异丙醇或2-丙醇）广泛用于印刷油墨上和印刷工业中。1-丙醇在自然界中通过多种微生物分解有机材料而产生，并且可以在植物和杂醇油中发现。1-丙醇也可以由石油化学衍生的乙烯生产，这是通过与一氧化碳和氢气反应以得到丙醛，其然后被氢化。它也是甲醇制造的副产物，并且可以直接由丙烷生产或由丙烯醛生产。丙醇还有另外的其它潜在用途。

所有这些醇目前都是通过裂化汽油或石油来生产的，这对环境有害。此外，商业上生产的这些醇中的大多数是通过常规程序如蒸馏提取的。使用这些常规手段蒸馏醇可能需要比提取的醇的输出能量容量更多的能量输入。

因此，需要基于石油的醇生产方法的环境友好且基于生物的有效替代方法和提取这些基于生物的醇的节能途径。

发明描述

本发明提供了在需氧条件下从碳源生产至少一种醇的生物技术手段。碳源可包括二氧化碳和/或一氧化碳。特别地，该方法包括至少两个部分。一部分涉及在含水培养基中从碳源形成醇，并且另一部分涉及从含水培养基中萃取醇。

在本发明的一个方面，提供了从碳源生产至少一种醇的方法，该方法包括：

(a)在需氧条件下在含水培养基中生产醇；和

(b)通过以下步骤从所述含水培养基萃取来自步骤(a)的醇：

(bi)使所述含水培养基中的醇与至少一种萃取介质接触足以将所述醇从所述含水培养基萃取到所述萃取介质中的时间，

(bii)使具有萃取的醇的所述萃取介质与所述含水培养基分离

其中所述萃取介质包含：

-油醇；或

-聚丙二醇和烷烃

其中所述醇包含至少3个碳原子。

根据本发明的任何方面的方法可以是从碳源生产至少一种分离的醇的需氧方法。分离的醇可以指可以从已经生产了醇的培养基中分离的至少一种醇。在一个实例中，醇可以在含水培养基（例如发酵培养基，在此由特定细胞从碳源生产醇）中生产。分离的醇可以指从含水培养基中萃取的醇。特别地，萃取步骤允许从含水培养基中分离过量的水，从而导致形成含有萃取的醇的混合物。

萃取介质(extracting medium)也可以称为“萃取介质（extraction medium）”。萃取介质可用于从含水培养基（其中最初生产醇）中萃取/分离根据本发明的任何方法生产的醇。在萃取步骤结束时，可以除去来自含水培养基的过量水，从而得到含有萃取的醇的萃取介质。萃取介质可以包含化合物的组合，该组合可以得到从含水培养基中萃取醇的有效手段。特别地，萃取介质可包含：(i)至少一种包含至少5-18个碳原子的烃，和(ii)至少一种聚氧化烯聚合物。根据本发明的任何方面的萃取介质可以有效地将发酵醇萃取到烃-聚氧化烯聚合物萃取介质中。特别地，包含烃-聚氧化烯聚合物的混合物中的烃可以是至少一种烷烃。更特别地，烷烃可包含至少5个碳原子。聚丙二醇和至少一种烷烃的混合物的这种萃取介质可以认为适合于根据本发明的任何方面的方法，因为所述混合物在氧气存在下在萃取期望的醇方面有效地起作用。特别地，可以认为聚丙二醇和至少一种烷烃的混合物比作为萃取介质的油醇更好地起作用，因为油醇中的双键可以被认为对氧气的存在是敏感的。

甚至更特别地，烷烃可包含至少5-18个碳原子。在一个实例中，烷烃可选自戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷和十八烷。在一个进一步的实例中，萃取介质可包含聚丙二醇和十六烷的混合物。

更特别地，聚丙二醇和十六烷的混合物可包含约50、55、60、65、70、75、80％ w/w的聚丙二醇和50、45、40、35、30、25、20% w/w的十六烷。甚至更特别地，聚丙二醇和十六烷的混合物可包含70% w/w 的聚丙二醇和约30% w/w的十六烷。

在根据本发明的任何方面的步骤(bi)中，含水培养基中的醇可以与萃取介质接触足以将醇从含水培养基萃取到萃取介质中的时间。技术人员可以能够确定基本上所有的醇被萃取到萃取介质中所需的时间量。所需时间可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。在一些实例中，所需时间可依赖于可萃取的醇的量。特别地，将醇从含水培养基萃取到萃取介质中所需的时间可以是约3分钟。

所用的萃取介质与要萃取的醇的量的比例可以根据萃取进行的速度而变化。在一个实例中，萃取介质的量等于包含醇的含水培养基的量。在使萃取介质与含水培养基接触的步骤之后，使用本领域已知的任何手段分离两相（水相和有机相）。在一个实例中，可以使用分液漏斗分离两相。

在一个实例中，其中醇可以是丙醇，步骤(a)包括

(ai)使碳源与反应混合物接触，所述反应混合物包含

- 处于指数生长期的第一产乙酸微生物；

- 游离氧；和

- 处于静止期的第二产乙酸微生物

其中所述第一和第二产乙酸微生物能够将碳源转化为乙酸和/或乙醇;

(aii)在含水培养基中使来自(ai)的乙酸和/或乙醇与能够将乙酸和/或乙醇转化为丙醇的第三微生物接触。

在另一实例中，醇可以是至少一种高级醇，并且步骤(a)包括

(a1)使碳源与反应混合物接触，所述反应混合物包含

- 处于指数生长期的第一产乙酸微生物；

- 游离氧；和

- 处于静止期的第二产乙酸微生物

(a2)使来自步骤(a1)的乙酸和/或乙醇与第四微生物接触，所述第四微生物能够进行乙醇羧酸发酵途径，并且转化来自(a1)的乙酸和/或乙醇以形成酸；

(a3)使来自(a2)的酸与步骤 (a1)的反应混合物接触

其中所述第一和/或第二产乙酸微生物能够在含水培养基中将所述酸转化为相应的高级醇。

所述能够将乙酸和/或乙醇转化为丙醇和丙酸的第三微生物可以指可以能够进行丙醇的发酵生产的任何微生物。这种第三微生物可以是产丙酸和/或丙醇微生物(propionogen)。产丙酸和/或丙醇微生物是产C3微生物。特别地，产丙酸和/或丙醇微生物是指可以能够将合成气中间体如乙醇和乙酸转化为丙酸和丙醇的任何微生物。术语“产丙酸和/或丙醇微生物”或“产C3微生物”是指当与底物接触时将底物转化为丙醇的微生物。这些微生物可以在细胞内和/或细胞外生产合适的酶。这些产丙醇微生物可以能够利用丙醇发酵的起始材料(其可以是废料)。例如，衍生自合成气的乙醇和/或乙酸可用于丙醇生产。这是特别有利的，因为可以利用原本被认为是废物的起始材料。这也使得能够去除废物，其因此减少环境污染。在一个实例中，根据本发明的任何方面的产丙酸和/或丙醇微生物可以使用至少甲基丙二酰-琥珀酸途径或乳酸-丙烯酸途径从乙酸和/或乙醇生产丙醇。

特别地，根据本发明的任何方面使用的产丙酸和/或丙醇微生物可以选自新丙酸梭菌（Clostridium neopropionicum）、丙酸梭菌（Clostridium propionicum）、丙酸暗杆菌（Pelobacter propionicus）、丙酸脱硫叶菌（Desulfobulbus propionicus）、沃氏互营杆菌（Syntrophobacter wolinii）、普氏互营杆菌（Syntrophobacter pfennigii）、Syntrophobacter fumaroxidans、Syntrophobacter sulfatireducens、Smithella propionica、热苯脱硫肠状菌thermosyntrophicum亚种（Desulfotomaculum thermobenzoicum subspecies thermosyntrophicum）、Pelotomaculum thermopropionicum和Pelotomaculum schinkii。更特别地，所述产丙酸和/或丙醇微生物可以是新丙酸梭菌。

在一个实例中，第三微生物可以是可进行基因修饰的任何真核或原核微生物。更特别地，第三微生物可以是选自下组的菌株：埃希氏菌属物种（Escherichia sp.）、欧文氏菌属物种（Erwinia sp.）、沙雷氏菌属物种（Serratia sp.）、普罗威登斯菌属物种（Providencia sp.）、棒杆菌属物种（Corynebacteria sp.）、假单胞菌属物种（Pseudomonas sp.）、钩端螺旋体属物种（Leptospira sp.）、沙门氏菌属物种（Salmonellar sp.）、短杆菌属物种（Brevibacteria sp.）、生丝单胞菌属物种（Hypomononas sp.）、色杆菌属物种（Chromobacterium sp.）、诺卡氏菌属物种（Norcardia sp.）、真菌和酵母。甚至更特别地，第三微生物可以选自埃希氏菌属物种。例如，根据本发明的任何方面的第三微生物可以是大肠杆菌（Escherichia coli）。第三微生物可以是基因修饰的生物，其包含相对于野生型细胞增加表达的丙酸辅酶A转移酶 (AJ276553) (E₁)、乳酰辅酶A脱水酶(JN244651-3) (E₂)和丙烯酰辅酶A还原酶 (JN244654-6) (E₃)。Kandasamy V. (2013)公开了如此生产遗传生物的方法。 Kandasamy V.还公开了测量酶E₁, E₂和E₃的表达以测定这些酶中的任何一种是否相对于野生型细胞具有增加的表达的手段。

在一个实例中，在能够进行乙醇-羧酸发酵途径的第四微生物存在下，乙醇和/或乙酸可以转化为相应的高级酸。至少在Seedorf, H.等, 2008中详细描述了乙醇-羧酸发酵途径。特别地，第四生物可以选自克氏梭菌（Clostridium kluyveri）、C. carboxidivorans等。这些第四微生物包括这样的微生物：其在野生型形式不具有乙醇-羧酸发酵途径，但由于基因修饰的结果而获得了这种性状。特别地，第四微生物可以是克氏梭菌。

在另一实例中，第四微生物可以是表达至少一种选自E₄至E₁₄的酶的野生型生物，其中E₄是醇脱氢酶(adh)，E₅是乙醛脱氢酶(ald)，E₆是乙酰乙酰辅酶A硫解酶(thl)，E₇是3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶(hbd)，E₈是3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(crt)，E₉是丁酰辅酶A脱氢酶(bcd)，E₁₀是电子转移黄素蛋白亚基(etf)，E₁₁是辅酶A转移酶 (cat)，E₁₂是乙酸激酶(ack)，E₁₃是磷酸转乙酰酶 (pta)，并且E₁₄是转氢酶。特别地，根据本发明的任何方面的野生型第四微生物可以至少表达E₅、E₆和E₇。甚至更特别地，根据本发明的任何方面的野生型第四微生物可以至少表达E₇。

在另一实例中，根据本发明的任何方面的第四微生物可以是基因修饰的生物，其具有相对于野生型微生物增加表达的至少一种选自E₄至E₁₄的酶，其中E₄是醇脱氢酶(adh)，E₅是乙醛脱氢酶(ald)，E₆是乙酰乙酰辅酶A硫解酶(thl)，E₇是3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶(hbd)，E₈是3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(crt)，E₉是丁酰辅酶A脱氢酶(bcd)，E₁₀是电子转移黄素蛋白亚基(etf)，E₁₁是辅酶A转移酶 (cat)，E₁₂是乙酸激酶(ack)，E₁₃是磷酸转乙酰酶(pta)，并且E₁₄是转氢酶。特别地，根据本发明的任何方面的基因修饰的第四微生物可以至少表达E₅、E₆和E₇。甚至更特别地，根据本发明的任何方面的基因修饰的第四微生物可以至少表达E₇。酶E₄至E₁₄可以分离自克氏梭菌。技术人员可以能够使用本领域已知的方法测量这些酶中的每一种的活性。特别地，可以使用至少Hillmer P., 1972, Lurz R., 1979中教导的测定来测量酶E₄和E₅的活性；也可以使用Smith L.T., 1980中教导的测定来测量酶E₅的活性；可以使用至少Sliwkowski M.X., 1984中教导的测定来测量酶E₆和E₇的活性；也可以使用Madan, V.K., 1972中教导的测定来测量E₇的活性；也可以使用Bartsch, R.G.,1961中教导的测定来测量E₈的活性；可以使用Li, F., 2008中教导的测定来测量酶E₉和E₁₀的活性；也可以使用Chowdhury, 2013中教导的测定来测量E₁₀的活性；可以使用Stadman,1953中教导的测定来测量E₁₁的活性；可以使用Winzer, K., 1997中教导的测定来测量E₁₂的活性；可以使用Smith L.T., 1976中教导的测定来测量E₁₃的活性；并且可以使用Wang S,2010中教导的测定来测量E₁₄的活性。

如本文所用的术语“乙酸(acetate)”指乙酸和其盐两者，这是不可避免地产生的，因为如本领域已知的，由于微生物在含水环境中工作，并且在存在的盐和酸之间总是存在平衡。

特别地，处于指数期后的第二产乙酸微生物可处于细胞的稳定期。处于对数期的产乙酸细胞允许含水培养基中的任何其它产乙酸细胞在氧气存在下生产乙酸和/或乙醇。处于对数期的产乙酸细胞的浓度可以在反应混合物中保持。因此，在反应中的任何时间点，反应混合物包含处于对数期的产乙酸细胞和处于另一生长期（例如处于稳定期）的产乙酸细胞。

技术人员将理解微生物的不同生长期和测量它们并鉴定它们的方法。特别地，分批培养中的大多数微生物可发现于至少四个不同的生长期；即它们是：延滞期（A）、对数期或指数期（B）、稳定期（C）和死亡期（D）。对数期可以进一步分为早对数期和中至晚对数/指数期。稳定期还可以进一步区分为早稳定期和稳定期。例如，Cotter, J.L., 2009,Najafpour.G., 2006, Younesi, H., 2005和Köpke, M., 2009公开了产乙酸菌的不同生长期。特别地，可以使用至少Shuler ML, 1992和Fuchs G., 2007中教导的方法来测量细胞的生长期。

延滞期是将细胞接种入新鲜培养基后紧接着的时期，群体暂时保持不变。尽管不存在明显的细胞分裂，但细胞可以在体积或质量上增长，合成酶、蛋白、RNA等，并增加代谢活性。延滞期的长度可依赖于广泛的因素，包括接种物的大小；从转移中的物理损伤或冲击中恢复所需的时间；合成必需的辅酶或分裂因子所需的时间；和合成新的（可诱导的）酶所需的时间，所述酶对于代谢培养基中存在的底物是必需的。

生长的指数（对数）期是平衡生长的模式，其中所有细胞通过二分裂规则地分裂，并以几何级数生长。依赖于生长培养基的组成和温育条件，细胞以恒定速率分裂。细菌培养物的指数生长速率表示为世代时间，也称为细菌群体的倍增时间。世代时间（G）定义为每代（n＝代数）的时间（t）。因此，G=t/n为从其推导世代时间的计算的公式。指数期可以分为（i）早对数期和（ii）中至晚对数/指数期。技术人员可以容易地鉴定何时微生物特别是产乙酸菌进入对数期。例如，计算产乙酸菌的生长速率以确定它们是否处于对数期的方法可以使用至少Henstra A.M., 2007中教导的方法来完成。特别地，根据本发明的任何方面的处于指数生长期的微生物可包括处于早对数期以及中至晚对数/指数期的细胞。

稳定期是这样的时期：其中指数生长结束，因为指数生长无法在分批培养（例如，封闭系统诸如试管或烧瓶）中永远持续。群体生长受限于三个因素之一：1.可用营养物的耗尽；2.抑制性代谢物或终产物的积累；3.空间的耗尽，在这种情况下称为“生物空间”的缺乏。在稳定期过程中，如果计数活细胞，则无法确定是否一些细胞死亡且相等数目的细胞正在分裂，或者细胞群体仅仅是已停止生长和分裂。稳定期，如同延滞期，不必须是静止阶段。生产次级代谢物诸如抗生素的细菌在生长周期的稳定期过程中这样做（次级代谢物定义为生长活跃期后产生的代谢物）。

稳定期后是死亡期。在死亡期，活细胞的数目呈几何（指数）减少，基本上是对数期过程中生长的逆转。

在一个实例中，在根据本发明的任何方面的反应混合物中存在O₂的情况下，第一产乙酸菌可以处于指数生长期且其它产乙酸菌可处于产乙酸微生物的生命周期的任何其它生长期。特别地，根据本发明的任何方面，反应混合物中的产乙酸菌可以包含处于指数生长期的一种产乙酸菌和处于稳定期的另一种产乙酸菌。在存在氧气且不存在处于指数生长的产乙酸菌的情况下，处于稳定期的产乙酸菌可能不能生产乙酸和/或乙醇。这一现象至少被Brioukhanov, 2006, Imlay, 2006, Lan, 2013等所证实。因此，发明人令人惊奇地发现在处于指数生长的产乙酸菌的存在下，处于任何生长期的产乙酸菌可以需氧呼吸并以多于或等于当反应混合物不存在氧气时生产的量来生产乙酸和/或乙醇。在一个实例中，处于指数生长期的产乙酸菌可以能够从反应混合物除去游离氧，为处于任何生长期的产乙酸菌提供合适的环境（无游离氧）以代谢碳底物从而生产乙酸和/或乙醇。

在另一实例中，含水培养基在碳源存在下可以已经包含处于任何生长期，特别是处于稳定期的产乙酸菌。在该实例中，在供应至含水培养基的碳源中或含水培养基自身中可以存在氧气。在氧气存在下，产乙酸菌可以是无活性的并且在添加处于指数生长期的产乙酸菌之前不产生乙酸和/或乙醇。在这一实例中，处于指数生长期的产乙酸菌可以添加至含水培养基中。在含水培养基中已发现的无活性的产乙酸菌可以随后被活化并可以开始生产乙酸和/或乙醇。

在一个进一步的实例中，处于任何生长期的产乙酸菌可以首先与处于指数生长期的产乙酸菌并随后与添加的碳源和/或氧气混合。

根据本发明的任何方面，在氧气存在下生长的处于指数生长期的微生物可以导致微生物在氧气存在下获得适应以生长和代谢。特别地，微生物可以能够从微生物周围的环境中除去氧气。这种新获得的适应允许处于指数生长期的产乙酸菌去除氧气环境并因此从碳源生产乙酸和乙醇。特别地，具有新获得的适应的产乙酸菌允许细菌将碳源转化为乙酸和/或乙醇。

在一个实例中，根据本发明的任何方面的反应混合物中的产乙酸菌可以包含细胞的组合：处于对数期的细胞和处于稳定期的细胞。在根据本发明的任何方面的方法中，处于对数期的产乙酸细胞可以包含选自0.01至2 h^-1、0.01至1 h^-1、0.05至1 h^-1、0.05至2 h^-1、0.05至0.5 h^-1等的生长速率。在一个实例中，反应混合物中对数期产乙酸细胞的细胞的OD₆₀₀可以选自由0.001至2、0.01至2、0.1至1、0.1至0.5 等组成的范围。技术人员将能够使用本领域已知的任何方法来测量OD₆₀₀并测定反应混合物中的和/或待添加至反应混合物中的细胞的生长速率。例如，可以使用Koch (1994)。特别地，细菌生长可以使用不同方法来测定和监测。最常用的之一是浊度测量，其依赖于悬浮液中细菌的光密度（OD）并使用分光光度计。OD可以使用UV分光计在600 nm处测量。

为保持反应混合物中第一和第二产乙酸菌的浓度，技术人员可以能够在固定时间点萃取样品来测量OD₆₀₀、pH、氧气浓度和形成的乙醇和/或高级醇的浓度。技术人员然后将能够添加一种或多种必需组分以保持反应混合物中第一和第二产乙酸菌的浓度并确保对于生产乙醇和/或乙酸保持最佳环境。

如本文所用术语“产乙酸菌”指能够进行Wood-Ljungdahl途径并因此能够将CO、CO₂和/或氢气转化成乙酸的微生物。这些微生物包括以其野生型形式不具有Wood-Ljungdahl途径，但由于基因修饰已获得此性状的微生物。这些微生物包括但不限于大肠杆菌细胞。这些微生物还可以称为一氧化碳营养菌。目前，产乙酸菌的21个不同的属是现有技术已知的(Drake等, 2006)，并且这些还可以包括一些梭菌(Drake & Kusel, 2005)。这些细菌能够使用二氧化碳或一氧化碳作为碳源并用氢气作为能量源（Wood，1991）。此外，醇、醛、羧酸以及很多己糖也可以用作碳源(Drake等, 2004)。导致形成乙酸的还原途径称为乙酰辅酶A或Wood-Ljungdahl途径。

特别地，产乙酸菌可选自潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium notera)(ATCC 35199)、长醋丝菌(Acetonema longum) (DSM 6540)、甲醇醋酸杆菌(Acetobacterium carbinolicum)(DSM 2925)、苹果酸醋酸杆菌(Acetobacterium malicum) (DSM 4132)、醋酸杆菌属第446号物种(Acetobacterium species no. 446)(Morinaga 等, 1990, J. Biotechnol., Vol. 14, p. 187-194)、威氏醋酸杆菌(Acetobacterium wieringae)(DSM 1911)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii) (DSM 1030)、Alkalibaculum bacchi(DSM 22112)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus) (DSM 4304)、Blautia producta (DSM 2950, 之前的产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus), 之前的产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus))、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum) (DSM 3468)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum) (DSM 1496)、产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum) (DSM 10061、DSM 19630和DSM 23693)、Clostridium carboxidivorans(DSM 15243)、Clostridium coskatii(ATCC编号 PTA- 10522)、Clostridium drakei(ATCC BA-623)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum) (DSM 92)、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum) (DSM 1288)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) (DSM 13528)、杨氏梭菌C-01 (ATCC 55988)、杨氏梭菌ERI-2 (ATCC 55380)、杨氏梭菌O-52 (ATCC 55989)、马犹姆贝梭菌(Clostridium mayombei) (DSM 6539)、Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182)、Clostridium ragsdalei (DSM 15248)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes) (DSM 757)、梭菌属物种ATCC 29797 (Schmidt 等, 1986, Chem. Eng. Commun., Vol. 45, p. 61-73)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii) (DSM 6115)、热苯脱硫肠状菌thermosyntrophicum亚种(Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum) (DSM 14055)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum) (DSM 20543)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)C2A (DSM 2834)、穆尔氏菌属物种HUC22-1(Moorella sp. HUC22-1) (Sakai 等, 2004)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica) (DSM 521, 之前的Clostridium thermoaceticum)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica) (DSM 1974)、Oxobacter pfennigii (DSM 322)、Sporomusa aerivorans (DSM 13326)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata )(DSM 2662)、Sporomusa silvacetica (DSM 10669)、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides) (DSM 2875)、白蚁鼠孢菌(Sporomusa termitida) (DSM 4440)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)(DSM 2030, 之前的凯伍产醋菌(Acetogenium kivui)。更特别地，可以使用Clostridium carboxidivorans的菌株ATCC BAA-624。甚至更特别地，可以使用例如描述于U.S. 2007/0275447和U.S. 2008/0057554的Clostridium carboxidivorans的标记为“P7”和“P11”的细菌菌株。

另一特别合适的细菌可以是杨氏梭菌。特别地，选自杨氏梭菌PETC、杨氏梭菌ERI2、杨氏梭菌COL和杨氏梭菌O-52的菌株可以用于合成气到己酸的转化。这些菌株例如描述于WO 98/00558、WO 00/68407、ATCC 49587、ATCC 55988 和ATCC 55989。根据本发明的任何方面使用的第一和第二产乙酸菌可以是相同或不同的细菌。例如，在一种反应混合物中，第一产乙酸菌可以是处于对数期的杨氏梭菌且第二产乙酸菌可以是处于稳定期的杨氏梭菌。在另一实例中，在反应混合物中，第一产乙酸菌可以是处于对数期的杨氏梭菌且第二产乙酸菌可以是处于稳定期的Clostridium carboxidivorans。

在根据本发明的任何方面的反应混合物中，可以存在氧气（即，使用需氧条件）。有利的是将O₂ 掺入反应混合物中和/或供应于反应混合物的气流中，因为大多数废气（包括合成气）包含少量或大量的氧气。在使用合成气作为碳源用于生产高级醇之前除去该氧气是困难且昂贵的。根据本发明的任何方面的方法允许生产至少一种高级醇而无需首先从碳源除去任何微量的氧气。这允许节约时间和金钱。

更特别地，气流中的O₂浓度可以是以少于气体总量的1体积%存在于气流中。特别地，氧气可以是以下列的浓度范围存在于气流的气相中和/或培养基中：0.000005至2体积%，0.00005至2体积%的范围、0.0005至2体积%、0.005至2体积%、0.05至2体积%、0.00005至1.5体积%、0.0005至1.5体积%、0.005至1.5体积%、0.05至1.5体积%、0.5至1.5体积%、0.00005至1体积%、0.0005至1体积%、0.005至1体积%、0.05至1体积%、0.5至1体积%、0.55至1体积%、0.60至1体积%、特别是0.60至1.5体积%、0.65至1体积%和0.70至1体积%的范围。特别地，当气相/流中的O₂比例是相对气流中气体体积约0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2体积%时，产乙酸微生物是特别合适的。技术人员将能够使用本领域已知的任一种方法测量气流中的氧气体积浓度。特别地，可以使用本领域已知的任何方法测量氧气体积。在一个实例中，可以通过来自PreSens Precision Sensing GmbH的微量氧浸渍探针（ trace oxygen dipping probe）测量氧气的气相浓度。可以通过荧光猝灭测量氧气浓度，其中猝灭程度与气相中的氧分压相关。甚至更特别地，当通过具有少于总气体的1体积%的氧气浓度（以提供给反应混合物的气流中气体的总体积的约0.015体积%）的气流提供氧气时，根据本发明任何方面的第一和第二微生物能够在含水培养基中最佳地工作。

根据本发明的任何方面，需氧条件（其中在反应混合物中将碳源转化为乙醇和/或乙酸）是指反应混合物周围的气体。气体可以包含总气体的至少1体积％的氧气和包括碳源诸如CO、CO₂等的其它气体。

根据本发明任何方面的含水培养基可以包含氧气。氧气可以通过本领域已知的任何方法溶解在培养基中。具体地，在不存在细胞的情况下，氧气可以是以0.5mg/L存在。具体地，含水培养基中游离氧的溶解浓度可以至少是0.01mg/L。在另一个实例中，溶解氧可以是约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L。具体地，溶解氧浓度可以是0.01-0.5mg/L、0.01-0.4mg/L、0.01-0.3mg/L、0.01-0.1mg/L。具体地，氧气可以在连续气流中提供到含水培养基。更具体地，含水培养基可以包含氧气和碳源，所述碳源包含CO和/或CO₂。更具体地，氧气和包含CO和/或CO₂的碳源在连续气流中提供到含水培养基。甚至更具体地，所述连续气流包含合成气和氧气。在一个实例中，两种气体都是相同流(flow/stream)的一部分。在另一个实例中，每种气体是提供到含水培养基的分开的流(flow/stream)。这些气体可以例如使用在含水培养基中打开的分开的喷嘴、玻璃料过滤器板、在将气体提供入含水培养基的管内的膜等来分开。氧气可以是游离氧。根据本发明的任何方面，“包含游离氧的反应混合物”是指包含O₂形式的元素氧的反应混合物。O₂可以是反应混合物中的溶解氧。具体地，溶解氧可以是≥ 5ppm (0.000005体积%; 5x10^-6)的浓度。本领域技术人员可以能够使用本领域已知的任何方法测量溶解氧的浓度。在一个实例中，溶解氧可以通过氧浸渍探针（来自PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, 德国的PSt6型）测量。

根据本发明任何方面的方法的步骤(aii)涉及使来自步骤(ai)的乙酸和/或乙醇与能够将乙酸和/或乙醇转化为丙醇的第三微生物接触。特别地，可以对第三微生物进行基因修饰以包含相对于野生型细胞增加表达的酶，所述酶是进行甲基丙二酰-琥珀酸途径或乳酸 -丙烯酸途径以从乙酸和/或乙醇生产丙醇所必需的。

根据本发明的任何方面，第一、第二、第三和/或第四微生物可以是基因修饰的微生物。基因修饰的细胞或微生物可以与野生型细胞或微生物在基因上不同。根据本发明的任何方面的基因修饰的微生物与野生型微生物之间的基因差异可以是在基因修饰的微生物中存在可能在野生型微生物中不存在的完整基因、氨基酸、核苷酸等。在一个实例中，根据本发明的任何方面的基因修饰的微生物可包含使微生物能够生产丙醇和/或丙酸的微生物的酶。相对于根据本发明的任何方面的基因修饰的微生物，野生型微生物可以不具有使得基因修饰的微生物能够生产丙醇和/或丙酸的酶或不具有可检测到的使得基因修饰的微生物能够生产丙醇和/或丙酸的酶的活性。如本文所用，术语‘基因修饰的微生物’可以与术语‘基因修饰的细胞’互换使用。根据本发明的任何方面的基因修饰在微生物的细胞上进行。

如本文中与细胞或微生物结合使用的短语“野生型”可以表示具有野生中天然观察到的形式的基因组组成的细胞。该术语可以适用于完整细胞和单独的基因两者。因此，术语“野生型”还可以包括已在其它方面(即，关于一个或多个基因)、但不与感兴趣的基因相关进行了基因修饰的细胞。因此，术语“野生型”不包括此类细胞：其中已经使用重组方法通过人工至少部分改变了感兴趣的特定基因的基因序列。因此，根据本发明的任何方面的野生型细胞是指关于完整基因组和/或特定基因没有基因突变的细胞。因此，在一个实例中，关于酶E₁的野生型细胞可以指细胞中具有酶E₁的天然/未改变表达的细胞。关于酶E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈、E₉、E₁₀、E₁₁、E₁₂、E₁₃、E₁₄等的野生型细胞可以用相同方式解释，并且可以指细胞中分别具有酶E₂、E₃、E₄、E₅、E₆、E₇、E₈、E₉、E₁₀、E₁₁、E₁₂、E₁₃、E₁₄等的天然/未改变表达的细胞。

技术人员将能够使用本领域已知的任何方法来基因修饰细胞或微生物。根据本发明的任何方面，基因修饰的细胞可以被基因修饰，使得在规定的时间间隔内，在2小时内，特别是在8小时或24小时内，其形成的丙醇和/或丙酸为野生型细胞的至少2倍，尤其至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10000倍。产物形成的增加可以通过例如在合适的营养培养基中在相同条件（相同细胞密度、相同营养培养基、相同培养条件）下将根据本发明的任何方面的细胞和野生型细胞各自分开地培养指定的时间间隔，并然后测定营养培养基中目标产物（具有至少3个碳的醇）的量来测定。

术语“第二微生物”或“第三微生物”或“第四微生物”是指与根据本发明的任何方面的“第一微生物”不同的微生物。该数目不是指根据本发明的任何方面的方法中可以涉及的生物的数目。例如，在根据本发明的任何方面的生产高级醇的方法中，涉及“第一微生物”、“第二微生物”和“第四微生物”。根据本发明的任何方面的生产高级醇的方法中可能没有“第三微生物”涉及。因此，使用数字来指代微生物，可以用于区分根据本发明的任何方面所涉及的不同微生物，而不是指所涉及的生物的数目。例如，在根据本发明的任何方面的方法中使用“第四微生物”并不意味着在该方法中有四种生物，而是在该方法中可以存在特定的第四微生物。

在一个实例中，在丙醇是根据本发明的任何方面生产的醇的情况下，第一、第二和第三微生物可以在氧气存在下存在于一个发酵罐中。然后可以将产物，即包含丙醇的含水培养基转移到另一个容器中，以使用萃取介质进行(b)萃取。

在一个进一步的实例中，在丙醇是根据本发明的任何方面生产的醇的情况下，第一、第二和第三微生物可以在氧气存在下存在于一个发酵罐中。然后可以从含有细胞的培养基中直接萃取产物，即含水培养基中的丙醇。然后可以将细胞再循环用于生产丙醇。

在一个实例中，在丙醇是根据本发明的任何方面生产的醇的情况下，第一和第二微生物可以存在于第一发酵罐中并且第三微生物可存在于第二发酵罐中。在发酵罐1中，第一和第二微生物与碳源接触以生产乙酸和/或乙醇。乙醇和/或乙酸可以随后与发酵罐2中的第三微生物接触以生产丙醇。可以产生循环，其中发酵罐1中生产的乙酸和/或乙醇可以定期进料至发酵罐2中，发酵罐2中的乙酸和/或乙醇可以转化为丙醇。可以将氧气添加到发酵罐2中，以使得第三微生物能够将乙酸转化为丙醇。

类似地，在发酵罐1中，第一和第二微生物可以与包含CO的碳源接触以生产乙酸和/或乙醇。乙醇和/或乙酸可以随后与发酵罐2中的第三微生物接触以生产丙醇。可以产生循环，其中发酵罐1中生产的乙酸和/或乙醇可以定期进料至发酵罐2中，发酵罐2中的乙酸和/或乙醇可以转化为丙醇。进料到发酵罐1中的CO可以与乙酸和/或乙醇一起转移到发酵罐2中。两个发酵罐之间可以不需要特殊的萃取方法。

在一个实例中，在根据本发明的任何方面生产高级醇的情况下，第一、第二和第四微生物可以存在于第一发酵罐中。在发酵罐中，第一和第二微生物首先与碳源接触以生产乙酸和/或乙醇。然后乙醇和/或乙酸与同一发酵罐中的第四微生物接触以生产至少一种酸。酸然后接触第一和第二微生物，然后当它再次接触第一和第二微生物时生产至少一种相应的高级醇。可以不需要特殊的萃取方法，因为已经令人惊讶地发现第四微生物在CO存在下将乙酸和/或乙醇转化为至少一种酸。

在一个进一步的实例中，在根据本发明的任何方面生产高级醇的情况下，第一和第二微生物可以存在于第一发酵罐中，并且第四微生物存在于第二发酵罐中。在发酵罐1中，第一和第二微生物与碳源接触以生产乙酸和/或乙醇。乙醇和/或乙酸可以随后与发酵罐2中的第四微生物接触以生产至少一种酸。然后可以将酸进料回到发酵罐1中以生产至少一种高级醇。可以产生循环，其中发酵罐1中生产的乙酸和/或乙醇可以定期进料至发酵罐2中，发酵罐2中的乙酸和/或乙醇可以转化为至少一种酸，并且发酵罐2中的酸进料回到发酵罐1中。类似地，在发酵罐1中，第一和第二微生物可以与包含CO的碳源接触以生产乙酸和/或乙醇。乙醇和/或乙酸可以随后与发酵罐2中的第四微生物接触以生产至少一种酸。然后可以任选萃取酸，并且进料回到发酵罐1中以将酸转化为期望的高级醇。可以产生循环，其中发酵罐1中生产的乙酸和/或乙醇可以定期进料至发酵罐2中，发酵罐2中的乙酸和/或乙醇可以转化为至少一种酸，并且发酵罐2中的酸进料回到发酵罐1中。进料到发酵罐1中的CO可以与乙酸和/或乙醇一起转移至发酵罐2中。可以不需要特殊的萃取方法，因为已令人惊讶地发现第四微生物在CO存在下将乙酸和/或乙醇转化为至少一种酸。

在又一个实例中，在根据本发明的任何方面生产高级醇的情况下，培养基在发酵罐1和2之间循环。因此，发酵罐1中生产的乙醇和/或乙酸可以进料至发酵罐2中且发酵罐2中生产的酸可以进料回到发酵罐1中。在循环培养基的过程中，来自发酵罐1的CO可以引入发酵罐2中。另外，发酵罐2中生产的酸可以因此重新引入发酵罐1中。发酵罐2中的第四微生物可以能够在从发酵罐1循环至发酵罐2中的CO存在下继续从乙酸和乙醇生产酸。发酵罐1和2中积累的高级醇可随后通过本领域已知的方法萃取。

在一个进一步的实例中，可以存在三个容器来进行根据本发明的任何方面的方法。第一和第二微生物可以存在于第一发酵罐中，第四微生物在第二发酵罐中，且第三发酵罐中具有第一和第二微生物。在发酵罐1中，第一和第二微生物与碳源接触以生产乙酸和/或乙醇。乙醇和/或乙酸可以随后与发酵罐2中的第四微生物接触以生产至少一种酸。该酸可随后进料至发酵罐3以生产至少一种高级醇。

在从碳源生产酸和/或高级醇中，可以使用细菌的组合。可以存在多于一种产乙酸菌与一种或多种第四微生物的组合。在另一实例中，可以存在多于一种类型的产乙酸菌和仅一种类型的第四微生物。在又一实例中，可以存在多于一种第四微生物与仅一种产乙酸菌的组合。

如本文所用的短语‘基因修饰的细胞与其野生型相比具有增加的酶活性’是指各自酶的活性增加到至少2倍，特别是至少10倍，更特别是至少100倍，还更特别是至少1000倍，且甚至更特别是至少10000倍。

如本文所用的短语“增加的酶活性”应理解为增加的细胞内活性。根本上，通过增加编码酶的一个或多个基因序列的拷贝数、使用强启动子或利用编码具有增加的活性的相应酶的基因或等位基因并任选地通过组合这些措施可以实现酶活性的增加。用于根据本发明的方法中的基因修饰的细胞例如通过用含有所需基因、该基因的等位基因或其部分的载体和使得基因可以表达的载体转化、转导、接合或这些方法的组合来生产。异源表达特别通过将基因或等位基因整合到细胞的染色体或染色体外复制载体中来实现。类似地，降低的酶活性是指降低的细胞内活性。在一个实例中，根据本发明的任何方面的酶的增加的表达相对于野生型细胞中的酶的表达可以多5、10、15、20、25、30、25、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或100%。类似地，根据本发明的任何方面的酶的降低的表达相对于野生型细胞中的酶的表达可以少5、10、15、20、25、30、25、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%。

要使用的培养基必须适合于特定菌株的要求。用于各种微生物的培养基的描述在"Manual of Methods for General Bacteriology"中给出。

除非另有说明，所有百分比（%）都是质量百分比。

关于包含二氧化碳和/或一氧化碳的底物的来源，技术人员将理解存在很多可能的来源，用于提供作为碳源的CO和/或CO₂。可见，在实践中，作为本发明的碳源，可以使用能够为微生物供应足量的碳的任何气体或任何气体混合物，使得乙酸和/或乙醇可以从CO和/或CO₂的来源的形成。

通常，对于本发明的细胞，碳源包含至少50重量％、至少70重量％、特别是至少90重量％的CO和/或CO₂，其中重量百分比-％涉及根据本发明的任何方面的细胞可用的所有碳源。可以提供碳材料来源。

气体形式的碳来源的实例包括废气诸如合成气、烟道气和酵母发酵或梭菌发酵产生的炼油厂气(petroleum refinery gas)。这些废气从含纤维素的材料的气化或煤气化形成。在一个实例中，这些废气可以不一定作为其它方法的副产物产生但可以特别产生以与本发明的混合的培养物一起使用。

根据本发明的任何方面，碳源可以是合成气。合成气可以例如作为煤气化的副产物产生。因此，根据本发明的任何方面的微生物可以能够将作为废产物的物质转化为有价值的资源。

在另一实例中，合成气可以是广泛可得的、低成本的农业原材料气化的副产物，以与本发明的混合的培养物一起使用来生产取代和未取代的有机化合物。

存在很多可以转化成合成气的原材料的实例，因为几乎所有形式的植物都可以用于此目的。特别地，原材料选自多年生草如芒草、玉米残渣、加工废料如锯末，等等。

通常，合成气可以在干燥的生物质的气化装置中获得，主要是通过热解、部分氧化和蒸汽重整，其中合成气的主要产物是CO、H₂和CO₂。合成气还可以是CO₂电解的产物。本领域技术人员将会理解进行CO₂的电解以产生包含期望量的CO的合成气的合适条件。

通常，从气化方法获得的一部分合成气首先被加工以优化产品产量并避免形成焦油。合成气中不希望的焦油和CO的裂化可以使用石灰和/或白云石进行。这些方法详细描述于例如Reed，1981。

来源的混合物可以被用作碳源。

根据本发明的任何方面，可以与碳源一起提供还原剂例如氢气。特别地，当提供和/或使用C和/或CO₂时，可以提供此氢气。在一个实例中，氢气是根据本发明的任何方面存在的合成气的部分。在另一个实例中，当合成气中的氢气不足以用于本发明的方法时，可以提供额外的氢气。

技术人员将理解进行根据本发明任何方面的方法所必需的其它条件。特别地，容器（例如，发酵罐）中的条件可以依赖于所使用的第一、第二和第三微生物而变化。适合微生物的最佳功能的条件的变化在技术人员的知识范围内。

在一个实例中，根据本发明任何方面的方法可以在具有5至8、5.5至7的pH的含水培养基中进行。压力可以在1和10巴之间。如本文所用的术语“接触”是指引起步骤（a）中根据本发明的任何方面的细胞与包含碳源的培养基之间的直接接触和/或步骤（b）中第三微生物与来自步骤（a）的乙酸和/或乙醇之间的直接接触。例如，在步骤（a）中，细胞和包含碳源的培养基可以处于不同的隔室中。特别地，根据本发明的任何方面，碳源可以处于气态并添加到包含细胞的培养基中。

特别地，含水培养基可以包含用于待进行的步骤（a）的细胞和包含CO和/或CO₂的碳源。更特别地，包含CO和/或CO₂的碳源在连续的气流中提供给包含细胞的含水培养基。甚至更特别地，连续气流包含合成气。这些气体可以例如使用在含水培养基中打开的喷嘴、玻璃料过滤器板(frit)、在将气体提供入含水培养基的管内的膜等来提供。

本发明方法的总效率、醇生产率和/或总碳捕获可以依赖于连续气流中CO₂、CO和H₂的化学计量。所应用的连续气流可以具有CO₂和H₂的组成。特别地，在连续气流中，CO₂的浓度范围可以是约10-50重量％，特别是3重量％，并且H₂将在44重量％-84重量％，特别是64重量％至66.04重量％的范围内。在另一个实例中，连续气流也可以包含惰性气体如N₂，最高达50重量％的N₂浓度。

如本文所用的术语‘约’是指在20％以内的变化。特别地，如本文所用的术语‘约’是指给定测量值或数值的+/-20％，更特别地，+/-10％，甚至更特别地，+/-5％。

技术人员将理解，可能有必要以相关的间隔监测流的组成和流速。可以通过改变组分流的比例来实现流的组成的控制，以实现目标或所需组成。可以通过本领域已知的任何手段监测掺合流的组成和流速。在一个实例中，系统适合于连续监测至少两个流的流速和组成，并将它们组合以产生最佳组成的连续气流中的单一的掺合底物流，和用于将优化的底物流传递到发酵罐中的手段。

将CO₂和/或CO转化为乙酸和/或乙醇，特别是乙酸的微生物，以及用于进行该代谢反应的合适程序和处理条件在本领域中是众所周知的。例如在WO9800558、WO2000014052和WO2010115054中描述了此类处理。

术语“水溶液”或“培养基”包括任何包含水，主要是水作为溶剂的溶液，所述溶液可用于将根据本发明任何方面的细胞至少暂时地保持在代谢活性和/或存活状态，并且包含（如果这是必要的）任何额外基质。本领域技术人员熟悉许多水溶液(通常称为培养基)的制备，所述水溶液可用于保持本发明的细胞，例如在大肠杆菌的情况下为LB培养基，在杨氏梭菌的情况下可以使用ATCC 1754-培养基。与复杂培养基相比，有利的是使用基本培养基作为水溶液，所述基本培养基即具有合理简单组成的培养基，其仅包含对于使细胞保持在代谢活性和/或存活状态必不可少的最小盐和营养物组，以避免不想要的副产物不必要地污染产物。例如，M9培养基可用作基本培养基。将细胞与碳源一起温育足够长时间以生产期望的产物。例如至少1、2、4、5、10或20小时。选择的温度必须使得根据本发明的任何方面的细胞保持催化能力和/或代谢活性，例如，10至42℃，优选30至40℃，特别地，32至38℃（如果细胞是杨氏梭菌细胞）。

特别地，在氧气存在下，根据本发明的任何方面的反应混合物（即第一微生物－处于对数期的产乙酸生物、第二微生物－处于稳定期的产乙酸生物、碳源的混合物）可以在任何已知的生物反应器或发酵罐中用来进行本发明的任何方面。反应混合物可以进一步包含第四微生物以导致在发酵罐中生产高级醇。在另一实例中，反应混合物可以进一步包含第三微生物，以导致在发酵罐中生产丙醇。

本文使用的‘高级醇’是指含4至10个碳原子，并且可以有些粘稠或油性，并且具有较重的水果气味的醇。高级醇可以包括但不限于丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇等。更特别地，高级醇可以选自1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-辛醇、1-戊醇、1-庚醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇、4-甲基-1-戊醇、5-甲基-1-己醇、6-甲基-1-庚醇以及它们的组合。

根据本发明的任何方面，‘相应的高级醇’是指具有与酸(由其形成相应的高级醇)的碳原子数相同的碳原子数的醇。例如，丁酸可以转化为相应的醇－丁醇；己酸可以转化为相应的醇－己醇；庚酸可以转化为相应的醇－庚醇；辛酸可以转化为相应的醇－辛醇；壬酸可以转化为相应的醇－壬醇；癸酸可以转化为相应的醇－癸醇等等。

实施例

以上描述了优选实施方案，如本领域技术人员将理解的，在不背离权利要求的范围的情况下，所述优选实施方案可以在设计、构造或操作方面进行变化或修改。例如，这些变化意欲被权利要求的范围所涵盖。

实施例1

在确定成分培养基中在氢气和二氧化碳上共培养杨氏梭菌和克氏梭菌以生产丁醇

杨氏梭菌作为第一生物在确定成分培养基中自养培养以生产乙酸和乙醇。给定时间后，克氏梭菌作为第二生物随后接种在同一反应器中用于将乙酸和乙醇转化为丁酸和己酸。随后，杨氏梭菌然后将丁酸转化为丁醇。

使用确定成分培养基用于两种微生物的共培养，所述培养基由以下组成：

2 g/L (NH₄)₂HPO₄, 0.2 g/L NaCl, 0.15 g/l KCl, 1 g/l KOH, 0.5 g/L MgCl₂ x 6H₂O, 0.2 g/L CaCl₂ x 2 H₂O, 15 mg/L FeCl₂ x 4 H₂O, 0.4 g/L L-盐酸半胱氨酸, 0.4g/L Na₂S x 9 H₂O, 3 mg/L硼酸, 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O, 1 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.3mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0.3 mg/L MnSO₄ x H₂O, 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 0.1 mg/LCuCl₂ x 2 H₂O, 0.1 mg/L Na₂SeO₃, 106 µg/L生物素, 5 µg/L叶酸, 2.5 µg/L盐酸吡哆醇, 266 µg/L 盐酸硫胺素 x H₂O,

12.5 µg/L核黄素, 12.5 µg/L烟酸, 413 µg/L泛酸钙,

12.5 µg/L维生素B12, 12.5 µg/L对氨基苯甲酸, 15 µg/L硫辛酸。

自养培养在500 mL血清瓶中在250 mL确定成分培养基中进行，所述血清瓶用由67% H₂和33% CO₂组成的合成气以1 L/h的速率持续通气。通过具有10 µm的孔径的微气泡分散器(microbubble disperser)将气体引入液相中。血清瓶在来自New BrunswickScientific的开放式水浴Innova 3100中在37 ℃和150 min^-1的振荡速率下持续振荡。通过持续加入KOH的厌氧储备溶液（40 g/L）将pH保持在pH 5.0 – 6.5的范围。

在实验开始时，将杨氏梭菌以0.1的OD₆₀₀用自养生长的细胞接种。因此，杨氏梭菌在具有500 mL复合培养基的1L血清瓶中在用由67% H₂和33% CO₂组成的合成气以3 L/h的速率持续通气下生长于复合培养基中。使用由以下组成的复合培养基：1 g/L NH₄Cl, 0.1 g/L KCl, 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O, 0.8 g/L NaCl, 0.1 g/L KH₂PO₄, 20 mg/L CaCl₂ x 2H₂O, 20 g/L MES, 1 g/L酵母提取物, 0.4 g/L L-盐酸半胱氨酸, 0.4 g/L Na₂S x 9H₂O, 20 mg/L次氮基三乙酸, 10 mg/L MnSO₄ x H₂O, 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O, 2mg/L CoCl₂ x 6 H₂O, 2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O, 0.2 mg/LNa₂MoO₄ x 2 H₂O, 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 0.2 mg/L Na₂SeO₄, 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2H₂O, 20 µg/L生物素, 20 µg/L叶酸, 100 µg/L盐酸吡哆醇, 50 µg/L 盐酸硫胺素 x H₂O,50 µg/L核黄素, 50 µg/L烟酸, 50 µg/L泛酸钙, 1 µg/L 维生素B12, 50 µg/L对氨基苯甲酸, 50 µg/L硫辛酸。通过具有10 µm的孔径的微气泡分散器将气体引入液相中。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放式水浴Innova 3100中在37 ℃和150 min^-1的振荡速率下持续振荡。在具有0.67的OD₆₀₀和4.69的pH的晚对数期通过厌氧离心(4500 min^-1,4300 g, 20℃, 10 min)收获细胞。弃去上清液并将沉淀重悬于10 mL上述确定成分培养基中。该细胞悬浮液随后用于接种共培养实验。

与此平行，使克氏梭菌异养生长于500 mL血清瓶中的200 mL复合培养基中乙酸和乙醇上。使用由以下组成的复合培养基：0.25 g/L NH₄Cl, 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O, 0.31g/L K₂HPO₄, 0.23 g/L KH₂PO₄, 2.5 g/L NaHCO₃,

1 g/L酵母提取物, 10 g/L乙酸钾, 20 g/l乙醇, 0.25 g/L L-盐酸半胱氨酸, 1.5mg/L FeCl₂ x

4 H₂O, 70 µg/L ZnCl₂ x 7 H₂O, 100 µg/L MnCl₂ x 4 H₂O, 6 µg/L硼酸, 190 µg/LCoCl₂ x

6 H₂O, 2 µg/L CuCl₂ x 6 H₂O, 24 µg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 36 µg/L Na₂MoO₄ x 2H₂O, 3 µg/L Na₂SeOO₃ x 5 H₂O, 4 µg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O, 100 µg/L 维生素B12, 80 µg/L对氨基苯甲酸, 20 µg/L生物素, 200 µg/L烟酸, 100 µg/L泛酸钙, 300 µg/L盐酸吡哆醇, 200 µg/L盐酸硫胺素 x H₂O。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放式水浴Innova 3100中在37 ℃和100 min^-1的振荡速率下持续振荡。在具有0.81的OD₆₀₀和5.96的pH的晚对数期通过厌氧离心(4500 min^-1, 4300 g, 20℃, 10 min)收获细胞。弃去上清液并将沉淀重悬浮于10 mL上述确定成分培养基中。运行实验96小时后，随后将该细胞悬浮液用于以0.2的OD₆₀₀接种共培养实验。

在实验过程中，取5 mL样品用于测定OD₆₀₀、pH和产物浓度。后者通过定量¹H-NMR-光谱法来测定。

接种杨氏梭菌后，细胞开始生长并持续生产乙酸。伴随乙酸的生产，乙醇以相比于乙酸生产较低的速率生产。96小时后，然后将克氏梭菌接种入反应器中，在以下实验中测量乙醇浓度的降低。然后在实验的随后113小时中测量丁酸（最大1163 mg/L）和己酸（最大136mg/L）的同时生产。与通过克氏梭菌生产丁酸平行，杨氏梭菌将丁酸转化为丁醇至实验结束时20 mg/L丁醇的最大浓度。

实施例2

在复合培养基中用含CO的气体共培养杨氏梭菌和克氏梭菌以生产丁醇和己醇

杨氏梭菌作为第一生物在复合培养基中自养培养以生产乙酸和乙醇。给定时间后，克氏梭菌作为第二生物随后接种在同一反应器中用于将乙酸和乙醇转化为丁酸和己酸。随后，杨氏梭菌然后将丁酸转化为丁醇并且将己酸转化为己醇。

使用由以下组成的复合培养基用于共培养两种微生物：1 g/L NH₄Cl, 0.1 g/LKCl, 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O, 0.8 g/L NaCl, 0.1 g/L KH₂PO₄, 20 mg/L CaCl₂ x 2H₂O, 20 g/L MES, 1 g/L酵母萃取物, 0.4 g/L L-盐酸半胱氨酸, 0.4 g/L Na₂S x 9H₂O, 20 mg/L次氮基三乙酸, 10 mg/L MnSO₄ x H₂O, 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O, 2mg/L CoCl₂ x 6 H₂O, 2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O, 0.2 mg/LNa₂MoO₄ x 2 H₂O, 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 0.2 mg/L Na₂SeO₄, 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2H₂O, 20 µg/L生物素, 20 µg/L叶酸, 100 µg/L盐酸吡哆醇, 50 µg/L 盐酸硫胺素 x H₂O,50 µg/L核黄素, 50 µg/L烟酸, 50 µg/L泛酸钙, 1 µg/L 维生素B12, 50 µg/L对氨基苯甲酸, 50 µg/L硫辛酸。

自养培养在1 L血清瓶中在500 mL复合培养基中进行，所述血清瓶用由5 % H₂、25% CO₂、25 % CO和45% N₂组成的合成气以~12 L/h (≥0.5ppm)的速率持续通气。通过具有10µm的孔径的微气泡分散器将气体引入液相中。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放式水浴Innova 3100中在37 ℃和120 min^-1的振荡速率下持续振荡。在该实验过程中不控制pH。

在实验开始时，将杨氏梭菌以0.1的OD₆₀₀用自养生长的细胞接种。因此，杨氏梭菌在具有500 mL复合培养基的1L血清瓶中在用由67% H₂和33% CO₂组成的合成气以3 L/h的速率持续通气下生长于上述复合培养基中。通过具有10 µm的孔径的微气泡分散器将气体引入液相中。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放式水浴Innova 3100中在37 ℃和150 min^-1的振荡速率下持续振荡。具有0.51的OD₆₀₀和5.04的pH 的晚对数期通过厌氧离心(4500 min^-1, 4300 g, 20℃, 10 min)收获细胞。弃去上清液并将沉淀重悬浮于10 mL上述确定成分培养基中。该细胞悬浮液随后用于接种共培养实验。

6 H₂O, 2 µg/L CuCl₂ x 6 H₂O, 24 µg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 36 µg/L Na₂MoO₄ x 2H₂O, 3 µg/L Na₂SeOO₃ x 5 H₂O, 4 µg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O, 100 µg/L 维生素B12, 80 µg/L对氨基苯甲酸, 20 µg/L生物素, 200 µg/L烟酸, 100 µg/L泛酸钙, 300 µg/L盐酸吡哆醇, 200 µg/L盐酸硫胺素 x H₂O。血清瓶在来自New Brunswick Scientific的开放式水浴Innova 3100中在37 ℃和100 min^-1的振荡速率下持续振荡。在具有0.54的OD₆₀₀和6.60的pH的晚对数期通过厌氧离心(4500 min^-1, 4300 g, 20℃, 10 min)收获细胞。弃去上清液并将沉淀重悬浮于10 mL上述确定成分培养基中。运行实验240小时后，随后将该细胞悬浮液用于接种共培养实验。

接种杨氏梭菌后，细胞开始生长并持续生产乙酸至71小时后~3 g/L的浓度并生产乙醇至71小时后~0.5 g/L的浓度。在实验的随后时间过程中，乙酸在240小时后完全转化为乙醇直至4.8 g/L的浓度。在240小时的处理时间时，将克氏梭菌随后接种入反应器。由于该生物除乙醇外还需要乙酸作为底物，因此接种克氏梭菌的同时，将大约3 g/L的乙酸（以乙酸钠的形式）厌氧加入反应器。在实验的随后时间过程中，测量丁酸和己酸的生产直至各自1.6 g/L的浓度。与通过克氏梭菌生产丁酸和己酸平行，杨氏梭菌将丁酸转化为丁醇至690mg/L丁醇的最大浓度并将己酸转化为己醇至1478 mg/L己醇的最大浓度。

实施例3

在具有氧气的合成气上产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）的生长以及乙酸和乙醇生产

为了将氢气和二氧化碳生物转化为乙酸和乙醇，在具有氧气的合成气上培养同型产乙酸菌（homoacetogenic bacterium）产乙醇梭菌。所有培养步骤都在厌氧条件下在耐压玻璃瓶中进行，所述耐压玻璃瓶可以用丁基橡胶塞气密封闭。

对于预培养，用5 mL产乙醇梭菌的冷冻低温原液接种具有额外400 mg/L L-半胱氨酸-盐酸盐和400 mg/L Na₂S x 9 H₂O的500ml培养基(ATCC1754-培养基：pH = 6.0；20 g/L MES；1 g/L酵母提取物，0.8 g/L NaCl；1 g/L NH₄Cl；0.1 g/L KCl；0.1 g/L KH₂PO₄；0.2g/L MgSO₄ x 7 H₂O；0.02 g/L CaCl₂ x 2 H₂O；20 mg/L次氮基三乙酸；10 mg/L MnSO₄ xH₂O；8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O；2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O；2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O；0.2mg/L CuCl₂ x 2 H₂O；0.2 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O；0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O；0.2 mg/LNa₂SeO₄；0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O；20 µg/L d-生物素；20 µg/L叶酸；100 µg/L盐酸吡哆醇；50 µg/L盐酸硫胺素 x H₂O；50 µg/L核黄素；50 µg/L烟酸；50 µg/L泛酸钙；1 µg/L维生素B₁₂；50 µg/L对氨基苯甲酸盐；50 µg/L硫辛酸；约67.5 mg/L NaOH)。在1L耐压玻璃瓶中，在37℃、100 rpm和使用具有67% H₂、33% CO₂的预混合气体的3 L/h的通气速率下，在敞开式水浴振荡器中进行化能无机自养培养72小时。气体通过安装在反应器中心的孔径为10μm的喷雾器排入培养基。在没有pH控制的情况下进行培养。

预培养后，将细胞悬浮液离心(10分钟，4200 rpm)，并将沉淀重悬浮于新鲜培养基。对于主培养，将0.1的OD_600nm所必需的量的来自预培养的细胞转移在500 mL具有额外400mg/L L-半胱氨酸-盐酸盐的培养基中。在1 L耐压玻璃瓶中在37℃、150 rpm下和使用具有66.95% H₂、33% CO₂、0.05%O₂的预混合气体的1 L/h的通气速率下在敞开式水浴振荡器中进行化能自养培养41小时。气体通过安装在反应器中心的孔径为10μm的喷雾器排入培养基。在没有pH控制的情况下进行培养。在培养过程中，取几份5 mL样品以测定OD_600nm、pH和产物形成。产物浓度的测定通过半定量¹H-NMR光谱法进行。作为内部定量标准品，使用三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)。培养基中的溶解氧也通过氧浸渍探针(具有Oxy4Trace的PSt6,Presens, Germany)在线测量。

在培养期过程中，通过OD_600nm在41小时中从0.08增加至0.76观察到细胞生长，其与µ = 0.054 h ^-1的生长速率相关。乙酸的浓度从37 mg/L增加至6600 mg/L，并且乙醇的浓度从4 mg/L增加至120 mg/L。在整个培养期中，溶解氧浓度为0.00 mg/L。

在具有相同参数(培养基组成、体积、瓶、气体、通气速率、温度、振荡频率)的类似技术设置、但培养基中没有细胞的情况下，测量到溶解氧浓度为0.01 mg/L。

实施例4

在具有0.15%氧气的合成气上杨氏梭菌的生长和乙酸生产

为了将氢气和二氧化碳生物转化为乙酸，在具有氧气的合成气上培养同型产乙酸菌杨氏梭菌。所有培养步骤都在厌氧条件下在耐压玻璃瓶中进行，所述耐压玻璃瓶可以用丁基橡胶塞气密封闭。

对于预培养，用5 mL杨氏梭菌的冷冻低温原液接种具有额外400 mg/L L-半胱氨酸-盐酸盐和400 mg/L Na₂S x 9 H₂O的500 ml培养基（ATCC1754培养基: pH 6.0; 20 g/LMES; 1 g/L酵母提取物, 0.8 g/L NaCl, 1 g/L NH₄Cl, 0.1 g/L KCl, 0.1 g/L KH₂PO₄,0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O; 0.02 g/L CaCl₂ × 2H₂O; 20 mg/L次氮基三乙酸；10 mg/LMnSO₄ x H₂O; 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O; 2 mg/L ZnSO₄ x7 H₂O; 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O; 0.2 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O;0.2 mg/L Na₂SeO₄; 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 µg/L d-生物素, 20 µg/L 叶酸, 100µg/L盐酸吡哆醇; 50 µg/L 盐酸硫胺素 x H₂O; 50 µg/L 核黄素; 50 µg/L烟酸, 50 µg/L 泛酸钙; 1 µg/L 维生素B₁₂ ; 50 µg/L 对氨基苯甲酸盐; 50 µg/L 硫辛酸, 约67.5mg/L NaOH）。在1L耐压玻璃瓶中，在37℃、100 rpm和使用具有67% H₂、33% CO₂的预混合气体的3 L/h的通气速率下，在敞开式水浴振荡器中进行化能无机自养培养72小时。气体通过安装在反应器中心的孔径为10μm的喷雾器排入培养基。在没有pH控制的情况下进行培养。

预培养后，将细胞悬浮液离心(10分钟, 4200 rpm)，并将沉淀用10 ml培养基洗涤并再次离心。对于主培养，将0.1的OD_600nm所必需的量的来自预培养的洗涤的细胞转移在200mL具有额外400 mg/L L-半胱氨酸-盐酸盐的培养基中。在250 mL耐压玻璃瓶中在37℃、150rpm和使用具有66.85% H₂、33% CO₂、0.15%O₂的预混合气体的1 L/h通气速率下在敞开式水浴振荡器中进行化能自养培养47小时。气体通过安装在反应器中心的孔径为10μm的喷雾器排入培养基。在没有pH控制的情况下进行培养。在培养期间，取几份5 mL样品以测定OD_600nm、pH和产物形成。产物浓度的测定通过半定量¹H-NMR光谱法进行。作为内部定量标准品，使用三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)。培养基中的溶解氧也通过氧浸渍探针(具有Oxy4Trace的PSt6, Presens, Germany)在线测量。

在培养期过程中，通过OD_600nm从0.10增加至0.45观察到细胞生长，其与µ = 0.032h ^-1的生长速率相关。乙酸的浓度从7 mg/L增加至2347 mg/L，并且乙醇的浓度从2 mg/L增加至319 mg/L。在整个培养期中，溶解氧浓度为0.00 mg/L。

在具有相同参数(培养基组成、体积、瓶、气体、通气速率、温度、振荡频率)的类似技术设置、但培养基中没有细胞的情况下，测量到溶解氧浓度为0.03 mg/L。

实施例5

用产乙醇梭菌和新丙酸梭菌在具有氧气的合成气上生产丙酸和丙醇

对于生物转化氢气和二氧化碳为丙酸和丙醇，在共培养期中，在合成气上与新丙酸梭菌组合培养同型产乙酸菌产乙醇梭菌。所有培养步骤都在厌氧或微需氧条件下在耐压玻璃瓶中进行，所述耐压玻璃瓶可以用丁基橡胶塞气密封闭。

对于产乙醇梭菌的培养，用5 mL冷冻低温原液接种具有额外400 mg/L L-半胱氨酸-盐酸盐和400 mg/L Na₂S x 9 H₂O的500 ml培养基（ATCC1754培养基: pH = 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物, 0.8 g/L NaCl; 1 g/L NH₄Cl; 0.1 g/L KCl; 0.1 g/LKH₂PO₄; 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O; 0.02 g/L CaCl₂ x 2 H₂O; 20 mg/L次氮基三乙酸; 10mg/L MnSO₄ x H₂O; 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O; 2 mg/LZnSO₄ x 7 H₂O; 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O; 0.2 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0.2 mg/L NiCl₂x 6 H₂O; 0.2 mg/L Na₂SeO₄; 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 µg/L d-生物素, 20 µg/L叶酸, 100 µg/L盐酸吡哆醇; 50 µg/L 盐酸硫胺素 x H₂O; 50 µg/L 核黄素; 50 µg/L烟酸, 50 µg/L 泛酸钙; 1 µg/L 维生素B₁₂ ; 50 µg/L 对氨基苯甲酸盐; 50 µg/L 硫辛酸,约67.5 mg/L NaOH）。在1L耐压玻璃瓶中，在37℃、100 rpm和使用具有67% H₂、33% CO₂的预混合气体的3 L/h的通气速率下，在敞开式水浴振荡器中进行化能无机自养培养64小时，直到OD_600nm为0.36。气体通过安装在反应器中心的孔径为10μm的喷雾器排入培养基。然后离心细胞悬浮液，用新鲜的ATCC1754培养基洗涤，并且再次离心。

对于产乙醇梭菌的主培养，用来自第一次预培养的洗涤的细胞接种具有额外400mg/L L-半胱氨酸-盐酸盐和400 mg/L Na₂S x 9 H₂O的500 ml ATCC1754培养基至OD_600nm为0.1。在37℃、100 rpm和使用具有66,85% H₂、33% CO₂、0,15% O₂的预混合气体的1 L/h的通气速率下，在敞开式水浴振荡器中进行化能无机自养培养51小时，直到OD_600nm为0.19且pH为5.7。气体通过安装在反应器中心的孔径为10μm的喷雾器排入培养基。

对于新丙酸梭菌的第一次预培养，用5ml冷冻低温培养物接种250 ml瓶中的2 x100 ml DSMZ318培养基(pH 7.4; 0.61 g/l NaCl, 0.047 g/l MgCl₂, 0.30 g/l KH₂PO₄,1.00 g/l NH₄Cl, 0.081 g/l CaCl₂ x 2 H₂O, 0.5 g/l酵母提取物, 0.5 g/l BBL胰胨(Trypticase Peptone), 4 g/L KHCO₃, 1.026 g/L乙醇, 0.5 mg/l刃天青, 128 mg/L次氮基三乙酸, 135 mg/L FeCl₃ x 6 H₂O, 1 mg/L MnCl₂ x 4 H₂O, 0.24 mg/L CoCl₂ x 6H₂O, 1 mg/L ZnCl₂, 0.25 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O, 0.1 mg/L H₃BO₃, 0.24 mg/L Na₂MoO₄ x2 H₂O, 1.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 0.26 mg/L Na₂SeO₃ x 5 H₂O, 0.02 mg/L生物素, 0.02mg/L叶酸, 0.1 mg/L盐酸吡哆醇, 0.05 mg/L盐酸硫胺素 x H₂O, 0.05 mg/L核黄素,0.05 mg/L烟酸, 0.05 mg/L D-泛酸钙, 1 µg/L维生素B12, 0.05 mg/L对氨基苯甲酸盐,0.05 mg/L 硫辛酸, 0.25 g/L盐酸半胱氨酸xH₂O)，并且用具有67% H₂, 33% CO₂的预混合气体吹洗至0.8巴的过压。在敞开式水浴振荡器中在30℃和100 rpm下将培养物温育19小时，直到OD_600nm >0.14。

对于新丙酸梭菌的第二次预培养，用来自第一次预培养的离心的细胞接种500 ml瓶中的5 x 200 ml 新鲜DSMZ318培养基至OD_600nm 为0.02，并且用具有67% H₂, 33% CO₂的预混合气体吹洗至0.8巴的过压。在敞开式水浴振荡器中在30℃和100 rpm下将这种生长中的培养物温育24小时，直到OD_600nm >0.26。然后离心细胞悬浮液，用新鲜ATCC1754洗涤并再次离心。

对于共培养培养，将0.2的OD_600nm所必需的量的来自新丙酸梭菌的第二次预培养的洗涤的细胞添加到培养51小时后的连续通气的产乙醇梭菌主培养物中。在敞开式水浴振荡器中在37℃、100 rpm和使用66,85% H₂、33% CO₂、0,15% O₂的预混合气体的1 L/h通气速率下在1L耐压玻璃瓶中进行培养，持续另外41小时。开始时，用140 g/l KOH将pH设置为6.7，然后在没有pH控制下进行共培养。

在培养过程中，取几份5 mL样品以测定OD_600nm、pH和产物形成。产物浓度的测定通过LCMS和半定量¹H-NMR光谱法进行。作为内部定量标准品，使用三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)。

在共培养期过程中，乙酸的浓度从0.79 g/L增加至1.83 g/L，丙酸的浓度从0.00g/L增加至0.23 g/L，丙醇的浓度从0增加至19 mg/L，丁酸的浓度从0增加至14 mg/L，并且甲酸的浓度从32 mg/L增加至335 mg/L。在此时间中，乙醇的浓度从47 mg/L降低至25 mg/L。

实施例6

用产乙醇梭菌和新丙酸梭菌从合成气生产和处理丙醇

对于生物转化氢气和二氧化碳为丙醇，在合成气上培养同型产乙酸菌产乙醇梭菌，并带有使用新丙酸梭菌的后续培养步骤。所有培养步骤都在厌氧条件下在耐压玻璃瓶中进行，所述耐压玻璃瓶可以用丁基橡胶塞气密封闭。此后，在两次分开的萃取中用聚丙二醇和十六烷(70/30% w/w)的混合物或油醇萃取产物。

对于产乙醇梭菌的培养，用5 mL冷冻低温原液接种具有额外400 mg/L L-半胱氨酸-盐酸盐和400 mg/L Na₂S x 9 H₂O的500 ml培养基（ATCC1754培养基: pH = 6.0; 20 g/L MES; 1 g/L酵母提取物, 0.8 g/L NaCl; 1 g/L NH₄Cl; 0.1 g/L KCl; 0.1 g/LKH₂PO₄; 0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O; 0.02 g/L CaCl₂ x 2 H₂O; 20 mg/L次氮基三乙酸; 10mg/L MnSO₄ x H₂O; 8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O; 2 mg/LZnSO₄ x 7 H₂O; 0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O; 0.2 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0.2 mg/L NiCl₂x 6 H₂O; 0.2 mg/L Na₂SeO₄; 0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 µg/L d-生物素, 20 µg/L叶酸, 100 µg/L盐酸吡哆醇; 50 µg/L 盐酸硫胺素 x H₂O; 50 µg/L 核黄素; 50 µg/L烟酸, 50 µg/L 泛酸钙; 1 µg/L 维生素B₁₂ ; 50 µg/L 对氨基苯甲酸盐; 50 µg/L 硫辛酸,约67.5 mg/L NaOH）。在1L耐压玻璃瓶中，在37℃、100 rpm和使用具有67% H₂和33% CO₂的预混合气体的3 L/h的通气速率下，在敞开式水浴振荡器中进行化能无机自养培养73小时，直到OD_600nm为0.39。气体通过安装在反应器中心的孔径为10μm的喷雾器排入培养基。然后离心细胞悬浮液。

对于产乙醇梭菌的主培养，用来自第一次预培养的细胞接种500 ml LM33矿物质培养基 (pH = 5.8, 1.3 g/L KOH, 0.5 g/L MgCl₂, 0.21 g/L NaCl, 0.135 g/L CaCl₂ X2H₂O, 2.65 g/L NaH₂PO₄X 2H₂O, 0.5 g/L KCl, 2.5 g/L NH₄Cl, 15 mg/L次氮基三乙酸,30 mg/L MgSO₄ x 7 H₂O, 5 mg/L MnSO₄ x H₂O, 1 mg/L FeSO₄ x 7 H₂O, 8 mg/L Fe(SO₄)₂(NH₄)₂ x 6 H₂O, 2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O, 2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O, 200 µg/L CuCl₂ x 2H₂O, 200 µg/L KAl(SO₄)₂ x 12 H₂O, 3 mg/L H₃BO₃, 300 µg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 200 µg/L Na₂SeO₃, 200 µg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 200 µg/L Na₂WO₄ x 6 H₂O, 200 µg/L d-生物素, 200 µg/L叶酸, 100 µg/L盐酸吡哆醇, 500 µg/L盐酸硫胺素; 500 µg/L核黄素; 500µg/L烟酸; 500 µg/L泛酸钙; 500 µg/L维生素B₁₂; 500 µg/L 对氨基苯甲酸盐; 500 µg/L硫辛酸, 10 mg/L FeCl₃, 用具有67% H₂和33% CO₂的预混合气体通气30分钟，具有额外500 mg/L L-半胱氨酸-盐酸盐)至OD_600nm为 0.17。在37℃、150 rpm（自动pH控制在pH5.5）和使用具有67% H₂、33% CO₂的预混合气体的1 L/h的通气速率下，在敞开式水浴振荡器中进行化能无机自养培养187小时。气体通过安装在反应器中心的孔径为10μm的喷雾器排入培养基。培养后无菌过滤培养基以用于下一步。

在187小时过程中，生产了4.6 g/L乙醇和14.6 g/L乙酸。

对于新丙酸梭菌的第一次预培养，用5ml冷冻低温培养物接种250 ml瓶中的100ml DSMZ318培养基(pH 6.7; 0.61 g/l NaCl, 0.047 g/l MgCl₂, 0.30 g/l KH₂PO₄, 1.00g/l NH₄Cl, 0.081 g/l CaCl₂ x 2 H₂O, 0.5 g/l酵母提取物, 0.5 g/l BBL胰胨(Trypticase Peptone), 4 g/L KHCO₃, 1.026 g/L乙醇, 0.5 mg/l刃天青, 128 mg/L次氮基三乙酸, 135 mg/L FeCl₃ x 6 H₂O, 1 mg/L MnCl₂ x 4 H₂O, 0.24 mg/L CoCl₂ x 6H₂O, 1 mg/L ZnCl₂, 0.25 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O, 0.1 mg/L H₃BO₃, 0.24 mg/L Na₂MoO₄ x2 H₂O, 1.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O, 0.26 mg/L Na₂SeO₃ x 5 H₂O, 0.02 mg/L生物素, 0.02mg/L叶酸, 0.1 mg/L盐酸吡哆醇, 0.05 mg/L盐酸硫胺素 x H₂O, 0.05 mg/L核黄素,0.05 mg/L烟酸, 0.05 mg/L D-泛酸钙, 1 µg/L维生素B12, 0.05 mg/L对氨基苯甲酸盐,0.05 mg/L 硫辛酸, 0.25 g/L盐酸半胱氨酸xH₂O)，并且用具有67% H₂, 33% CO₂的预混合气体吹洗至0.8巴的过压。在敞开式水浴振荡器中在30℃和100 rpm下将培养物温育20小时，直到OD_600nm >0.12。然后离心细胞悬浮液。

对于新丙酸梭菌的第二次预培养，用来自第一次预培养的离心的细胞接种500 mL瓶中的200 mL新鲜DSMZ318培养基至OD_600nm 为0.03，并且用具有67% H₂, 33% CO₂的预混合气体吹洗至0.8巴的过压。在敞开式水浴振荡器中在30℃和100 rpm下将这种生长中的培养物温育25小时，直到OD_600nm >0.2。然后离心细胞悬浮液。

对于主培养，首先用氮气并且然后用具有67% H₂、33% CO₂的预混合气体吹洗来自产乙醇梭菌的主培养的150 mL无菌过滤的培养基至0.8巴的过压。加入0.25 g / L L-半胱氨酸-盐酸盐，并且用NaOH将pH设置为6.8。将0.1的OD_600nm所必需的来自新丙酸梭菌的第二次预培养的细胞的一半加入培养基中。在敞开式水浴振荡器中在30℃、100 rpm（用NaOH自动pH控制在pH 6.8）在500 mL耐压玻璃瓶中进行培养，持续另外88小时。

在培养时间中，消耗了2g / L乙醇，并且生产了2g / L丙酸和49mg / L丙醇。

在两次培养过程中，取几份5 mL样品以测定OD_600nm、pH和产物形成。产物浓度的测定通过HPLC和NMR光谱法进行。

为了萃取丙醇，在具有萃取剂的分液漏斗中在厌氧条件下在30℃将具有新丙酸梭菌的主培养物的两个50 mL样品振荡3分钟，并且然后用分液漏斗分离两相。作为萃取剂，将50 mL油醇(MS-295), 85 %, Abcr GmbH)或70 % w/w聚丙二醇(MS-346, 含有130-190 ppmAldrich)和30 % w/w 十六烷((MS-303), 99 %, Sigma)的混合物用作两种不同的萃取剂。

在两种情况下，丙醇完全萃取到有机相中。

实施例7

丁醇的萃取

为了萃取丁醇，使用两种分开的萃取介质：（1）油醇和（2）聚丙二醇和十六烷（70/30％w/ w）的混合物。

对于使用70％w/w聚丙二醇和30％w/w十六烷的萃取，将50g具有0.522g/kg的丁醇溶液在具有46g萃取介质的分液漏斗中在环境温度（20-25℃）下振荡2分钟。分离两相，并且测定水相中的丁醇浓度。

萃取后，水相中的丁醇浓度降低至0.251 g/kg。通过质量平衡计算的分配系数是1.17。

对于用油醇萃取，将4.81g具有5.97g/kg的丁醇溶液在具有2.02g萃取剂的离心管中在环境温度（20-25℃）下振荡30分钟。分离两相，并且测定水相中的浓度。

萃取后，水相中的丁醇浓度降低至2.40 g/kg。通过质量平衡计算的分配系数是2.97。

Claims

1.从碳源生产至少一种醇的方法，该方法包括：

(a)在需氧条件下在含水培养基中生产醇；和

(b)通过以下步骤从所述含水培养基萃取来自步骤(a)的醇：

(bii)使具有萃取的醇的所述萃取介质与所述含水培养基分离

其中所述萃取介质包含油醇，

所述醇包含至少3个碳原子，并且

所述碳源包含CO和/或CO₂。

2.根据权利要求1的方法，其中所述醇是丙醇并且(a)包括

(ai)使所述碳源与反应混合物接触，所述反应混合物包含

- 处于指数生长期的第一产乙酸微生物；

- 游离氧；和

- 处于静止期的第二产乙酸微生物

3.根据权利要求1或2的任一项的方法，其中所述醇是至少一种高级醇，并且(a)包括

(a1)使碳源与反应混合物接触，所述反应混合物包含

- 处于指数生长期的第一产乙酸微生物；

- 游离氧；和

- 处于静止期的第二产乙酸微生物

(a3)使来自(a2)的酸与步骤 (a1)的反应混合物接触

其中所述第一和/或第二产乙酸微生物能够在含水培养基中将所述酸转化为相应的高级醇，并且

其中所述高级醇含有4至10个碳原子。

4.根据权利要求2或3的任一项的方法，其中所述第一和第二微生物选自产乙醇梭菌DSMZ 19630（Clostridium autothenogenum DSMZ 19630）、Clostridium ragsdahlei ATCC no. BAA-622、产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）、穆尔氏菌属物种HUC22-1（Moorella sp HUC22-1）、热醋穆尔氏菌（Moorella thermoaceticum）、热自养穆尔氏菌（Moorella thermoautotrophica）、产生瘤胃球菌（Rumicoccus productus）、厌氧醋菌属（Acetoanaerobum）、Oxobacter pfennigii、巴氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina barkeri）、Methanosarcina acetivorans、氧化碳嗜热菌属（Carboxydothermus）、库氏脱硫肠状菌（Desulfotomaculum kutznetsovii）、火球菌属（Pyrococcus）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、食甲基丁酸杆菌ATCC 33266（Butyribacterium methylotrophicum ATCC 33266）、蚁酸醋酸梭菌（Clostridium formicoaceticum）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrukii）、产丙酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidoproprionici）、栖树丙酸螺菌（Proprionispera arboris）、产琥珀酸厌氧螺菌（Anaerobierspirillum succiniproducens）、Bacterioides amylophilus、 Becterioides ruminicola、凯伍热厌氧气菌（Thermoanaerobacter kivui）、伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodii）、潮湿厌氧气醋菌（Acetoanaerobium notera）、醋酸梭菌（Clostridium aceticum）、食甲基丁酸杆菌（Butyribacterium methylotrophicum）、热醋穆尔氏菌（Moorella thermoacetica）、粘液真杆菌（ Eubacterium limosum）、产生消化链球菌（Peptostreptococcus productus）、杨氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）、梭菌属ATCC 29797（Clostridium ATCC 29797）和Clostridium carboxidivorans。

5.根据权利要求2-4的任一项的方法，其中所述处于指数生长期的第一产乙酸微生物具有0.01至2 h^-1的生长速率。

6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述需氧条件是气相中氧气浓度为0.000005 – 1体积%的结果。

7.根据权利要求2-6的任一项的方法，其中所述第三微生物是产丙酸和/或丙醇微生物。

8.根据权利要求7的方法，其中所述第三微生物是基因修饰的生物，其包含相对于野生型细胞增加表达的丙酸辅酶A转移酶(E₁)、乳酰辅酶A脱水酶(E₂)和丙烯酰辅酶A还原酶(E₃)。

9.根据权利要求7或8的任一项的方法，其中所述第三微生物是新丙酸梭菌（Clostridium neopropionicum）。

10.根据权利要求2-9的任一项的方法，其中所述第一和第二微生物是产乙醇梭菌，并且所述第三微生物是新丙酸梭菌。

11.根据权利要求3-10的任一项的方法，其中所述第四微生物选自克氏梭菌（Clostridium kluyveri）和C.Carboxidivorans。

12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中(a)和(b)在单个发酵罐中进行。

13.根据权利要求3-12的任一项的方法，其中所述高级醇选自1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-辛醇、1-戊醇、1-庚醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇、4-甲基-1-戊醇、5-甲基-1-己醇、6-甲基-1-庚醇以及它们的组合。