CN108473967A - 基因修饰的产乙酸细胞 - Google Patents
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Abstract
提供了能够从碳源生产至少一种高级醇的产乙酸微生物细胞,其中所述产乙酸微生物细胞被基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的至少一种酶,即E8,即丁酰‑CoA:乙酸CoA转移酶(cat3)。也提供了所述细胞用于生产高级醇的方法和用途。
Description
发明领域
本发明涉及用于从碳源生产高级醇的重组细胞。具体地,所述细胞是产乙酸微生物。本发明也涉及在所述重组产乙酸细胞存在下从碳源生产至少一种高级醇的方法。
发明背景
丁醇和高级醇具有几种用途,包括用作燃料。例如,丁醇在未来可以代替汽油,因为这两种燃料的能量含量几乎相同。此外,与乙醇相比,丁醇作为替代燃料具有几种其它优异的特性。这些包括,丁醇具有较高的能量含量,丁醇与乙醇或汽油相比较少“挥发”,且丁醇与乙醇相比易于运输。由于这些原因和更多原因,已经存在丁醇和/或相关高级醇的现有潜在市场。丁醇和其它高级醇也被用作工业溶剂。高级醇也用于香水和化妆品工业中。例如,己醇通常用于香水工业中。
目前,丁醇和其它高级醇主要从石油制造。这些化合物是通过裂化汽油或石油而获得,这是对环境有害的。另外,由于这些起始材料的成本将与石油价格关联(未来石油价格预期上涨),因此与石油价格的上涨相关,丁醇和其它高级醇的价格可能也将上涨。
在历史上(1900年代-1950年代),生物丁醇在发酵过程中从玉米和糖蜜制造,所述发酵过程还产生丙酮和乙醇,并且通常与某些生产丁醇的细菌诸如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)一起被称为ABE(丙酮、丁醇、乙醇)发酵。这种方法最近再次获得流行,在绿色能源中重新产生兴趣。然而,“玉米淀粉丁醇生产”过程需要大量的耗能步骤,包括农业玉米-作物栽培、玉米-谷物收获、玉米-谷物淀粉加工和淀粉至糖至丁醇发酵。“玉米淀粉丁醇生产”过程也可能消耗几乎与其产物丁醇的能量值一样多的能量。
Alfol®醇方法是一种用于使用有机铝催化剂从乙烯生产高级醇的方法。该反应产生直长链伯醇(C2-C28)。该方法使用铝催化剂来使乙烯寡聚化并使所得烷基被氧化。然而,这种方法产生了广谱的醇,并且维持分布模式。这种恒定的模式限制了生产者只生产需求量最大或具有最高经济价值的特定醇范围的能力。另外,反应中所需的气体必须非常干净,并且需要有独特的气体组成来成功地进行反应。
WO2009100434也描述了从碳水化合物生产丁醇和己醇的间接方法。该方法包括同型产乙酸发酵(homoacetogenic fermentation)以产生乙酸中间体,其然后化学转化为乙醇。然后将乙醇和乙酸中间体的剩余部分用作产酸发酵中的底物以产生丁酸和己酸中间体,然后将其化学转化为丁醇和己醇。然而,该方法使用昂贵原材料碳水化合物,并且具有两个额外的处理步骤,即酯的形成和酯的化学氢化,这使得该方法不仅更长,而且导致沿途有用材料的损失。
Perez, J.M., 2012公开了在合成气存在的情况下使用杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)将短链羧酸转化成其相应的醇的方法。然而,必须添加短链羧酸作为转化为相应高级醇的底物。
因此,目前可用的高级醇生产方法具有在气态底物向发酵培养液的质量转移中的限制,较低生产率,和较低终产物浓度,导致产品纯化的较高能量成本。
因此,除了纯基于石油或基于玉米的来源之外,还希望找到更可持续的原材料作为经由生物技术手段生产丁醇和其它高级醇的起始材料,所述生物技术手段也对环境引起较小的损害。具体地,需要从可持续的原材料简单且有效地一锅式(one-pot)生物技术生产丁醇和其它高级醇。
发明描述
本发明提供了已基因修饰以从简单碳源生产至少一种高级醇的细胞。具体地,所述细胞可以能够将CO和/或CO2转化为至少一种高级醇。即,所述细胞可以被基因修饰从而以相对于野生型细胞更高的表达水平表达丁酰-CoA:乙酸CoA转移酶(cat3) (E8,)。这是有利的,因为可以使用单个细胞来从非基于石油的来源生产高级醇。另外,使用重组细胞使得生产高级醇的方法更有效。
根据本发明的一个方面,提供了能够从碳源生产至少一种高级醇的产乙酸微生物细胞,其中所述产乙酸微生物细胞被基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的至少一种酶,即 E8,即丁酰-CoA: 乙酸CoA转移酶(cat3)。
如本文中与细胞或微生物结合使用的短语“野生型”可以表示具有野生中天然观察到的形式的基因组组成的细胞。该术语可以适用于完整细胞和单独的基因两者。因此,术语“野生型”还可以包括已在其它方面(即,关于一个或多个基因)、但不与感兴趣的基因相关进行了基因修饰的细胞。因此,术语“野生型”不包括此类细胞或此类基因:其中已经使用重组方法通过人工至少部分改变了基因序列。因此,根据本发明的任何方面的野生型细胞可以指就完整基因组和/或特定基因而言没有基因突变的细胞。因此,在一个实例中,关于酶E8的野生型细胞可以指细胞中具有酶E8的天然/未改变表达的细胞。关于酶E2、E3、E4、E5、E6、E7、E9、E10、E11、E12等的野生型细胞可以相同方式解释,并且可以指细胞中分别具有酶E2、E3、E4、E5、E6、E7、E9、E10、E11、E12等的天然/未改变表达的细胞。
技术人员将能够使用本领域已知的任何方法来基因修饰细胞或微生物。根据本发明的任何方面,基因修饰的细胞可以被基因修饰,使得在规定的时间间隔内,在2小时内,特别是在8小时或24小时内,其形成的高级醇为野生型细胞的至少2倍,尤其至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10000倍。产物形成的增加可以通过例如在相同条件(相同细胞密度、相同营养培养基、相同培养条件)下在合适的营养培养基中将根据本发明的任何方面的细胞和野生型细胞各自分开地培养指定的时间间隔,并然后测定营养培养基中目标产物(高级醇,如丁醇)的量来确定。
基因修饰的细胞或微生物可以与野生型细胞或微生物在基因上不同。根据本发明的任何方面的基因修饰的微生物与野生型微生物之间的基因差异可以是在基因修饰的微生物中存在可能在野生型微生物中不存在的完整基因、氨基酸、核苷酸等。在一个实例中,根据本发明的任何方面的基因修饰的微生物可包含使微生物能够生产高级醇的酶。相对于本发明的基因修饰的微生物的野生型微生物可以不具有使得基因修饰的微生物能够生产至少一种高级醇的酶或不具有可检测到的使得基因修饰的微生物能够生产至少一种高级醇的酶的活性。如本文所用,术语‘基因修饰的微生物’可以与术语‘基因修饰的细胞’互换使用。根据本发明的任何方面的基因修饰在微生物的细胞上进行。
根据本领域已知的任何方法基因转化根据本发明的任何方面的细胞。具体地,可以根据WO/2009/077461中公开的方法生产细胞。
如本文所用的短语‘基因修饰的细胞与其野生型相比具有增加的酶活性’是指各自酶的活性增加到至少2倍,特别是至少10倍,更特别是至少100倍,还更特别是至少1000倍,且甚至更特别是至少10000倍。
如本文所用的短语‘增加的酶活性’应理解为增加的细胞内活性。根本上,通过增加编码酶的一个或多个基因序列的拷贝数、使用强启动子或利用编码具有增加的活性的相应酶的基因或等位基因并任选地通过组合这些措施可以实现酶活性的增加。用于根据本发明的方法中的基因修饰的细胞例如通过用含有所需基因、该基因的等位基因或其部分的载体和使得基因可以表达的载体转化、转导、接合或这些方法的组合来生产。异源表达特别通过将基因或等位基因整合到细胞的染色体或染色体外复制载体中来实现。例如,相对于野生型细胞,酶(例如酶E8)的表达增加的细胞可以指以下细胞,其可以包含:
-异源酶E8的表达,
-表达酶E8的基因拷贝数的增加,
-使用异源启动子的酶E8的表达,或
-其组合。
本领域技术人员可以能够使用本领域已知的方法测量这些酶的每一种的活性。根据本发明任何方面的酶或基因的表达可以在凝胶中检测,所述检测借助一维和二维蛋白凝胶分离和随后使用合适的评估软件进行的蛋白浓度的视觉识别。当酶活性的增加唯一地基于所考虑的基因的表达增加时,可以通过比较野生型和基因修饰的细胞之间的一维或二维蛋白分离,以简单的方式确定酶活性增加的量化。在棒状菌中制备蛋白凝胶,以及鉴定蛋白的常规方法,是Hermann等(Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001))描述的程序。也可以通过以下来分析蛋白浓度:使用对要检测的蛋白具有特异性的抗体的蛋白印迹杂交(Sambrook等, Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) ,随后是使用用于测定浓度的合适软件的视觉评估(Lohaus和Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39;Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647)。可以用DNA条带移位分析(也称作凝胶阻滞)(Wilson等 (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155)来测量DNA结合蛋白的活性。可以通过多种广泛描述的报道基因测定方法(Sambrook等,Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989)来检测DNA结合蛋白对其它基因的表达的影响。可以通过多种已经描述过的方法(Donahue等 (2000) Journal of Bacteriology182 (19): 5624-5627; Ray等 (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284;Freedberg等 (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823)检测细胞内酶活性。如果在下文中没有详细描述用于测定特定酶的活性的具体方法,可以用Hermann等,Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus等, Biospektrum 5 32-39 (1998),Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) 和Wilson等 Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155 (2001)中描述的方法进行酶活性增加的测定,以及酶活性减少的测定。
如本文所用术语“产乙酸菌”指能够进行Wood-Ljungdahl途径并因此能够将CO、CO2和/或氢气转化成乙酸的微生物。这些微生物包括以其野生型形式不具有Wood-Ljungdahl途径,但由于基因修饰已获得此性状的微生物。这些微生物包括但不限于大肠杆菌细胞。这些微生物还可以称为一氧化碳营养菌。目前,产乙酸菌的21个不同的属是现有技术已知的(Drake等, 2006),并且这些还可以包括一些梭菌(Drake & Kusel, 2005)。这些细菌能够使用二氧化碳或一氧化碳作为碳源并用氢气作为能量源(Wood,1991)。此外,醇、醛、羧酸以及很多己糖也可以用作碳源(Drake等, 2004)。导致形成乙酸的还原途径称为乙酰-CoA或Wood-Ljungdahl途径。
具体地,产乙酸菌可选自潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium notera)(ATCC 35199)、长醋丝菌(Acetonema longum) (DSM 6540)、甲醇醋酸杆菌(Acetobacterium carbinolicum)(DSM 2925)、苹果酸醋酸杆菌(Acetobacterium malicum) (DSM 4132)、醋酸杆菌属第446号物种(Acetobacterium species no. 446)(Morinaga 等, 1990, J. Biotechnol., Vol. 14, p. 187-194)、威氏醋酸杆菌(Acetobacterium wieringae)(DSM 1911)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii) (DSM 1030)、Alkalibaculum bacchi(DSM 22112)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus) (DSM 4304)、Blautia producta (DSM 2950, 之前的产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus), 之前的Peptostreptococcus productus)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum) (DSM 3468)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum) (DSM 1496)、产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum) (DSM 10061、DSM 19630和DSM 23693)、Clostridium carboxidivorans(DSM 15243)、Clostridium coskatii(ATCC编号 PTA-10522)、Clostridium drakei(ATCC BA-623)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum) (DSM 92)、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum) (DSM 1288)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) (DSM 13528)、杨氏梭菌C-01 (ATCC 55988)、杨氏梭菌ERI-2 (ATCC 55380)、杨氏梭菌O-52 (ATCC 55989)、马犹姆贝梭菌(Clostridium mayombei) (DSM 6539)、Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182)、Clostridium neopropionicum sp、Clostridium ragsdalei (DSM 15248)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes) (DSM 757)、梭菌属物种ATCC 29797 (Schmidt 等, 1986, Chem. Eng. Commun., Vol. 45, p. 61-73)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii) (DSM 6115)、热苯脱硫肠状菌thermosyntrophicum亚种(Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum) (DSM 14055)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum) (DSM 20543)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)C2A (DSM 2834)、穆尔氏菌属物种HUC22-1(Moorella sp. HUC22-1) (Sakai 等, 2004, Biotechnol. Let., Vol. 29, p. 1607-1612)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica) (DSM 521, 之前的Clostridium thermoaceticum)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica) (DSM 1974)、Oxobacter pfennigii (DSM 322)、Sporomusa aerivorans (DSM 13326)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata )(DSM 2662)、Sporomusa silvacetica (DSM 10669)、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides) (DSM 2875)、白蚁鼠孢菌(Sporomusa termitida) (DSM 4440)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui) (DSM 2030, 之前的凯伍产醋菌(Acetogenium kivui)。
具体地,根据本发明的任何方面使用的产乙酸微生物细胞可以选自杨氏梭菌和Clostridium autothenogenum。在一个实例中,合适的细菌可以是杨氏梭菌。具体地,选自杨氏梭菌PETC、杨氏梭菌ERI2、杨氏梭菌COL和杨氏梭菌O-52的菌株可以用于合成气到己酸的转化。这些菌株例如描述于WO 98/00558、WO 00/68407、ATCC 49587、ATCC 55988 和ATCC55989。在另一个实例中,产乙酸菌选择的细菌可以是Clostridium autothenogenum。
酶E8,即丁酰-CoA: 乙酸CoA转移酶(cat3)(其表达相对于野生型细胞在根据本发明任何方面的细胞中增加)催化以下反应及其它反应:
乙酸 + 丁酰-CoA ---> 乙酰-CoA + 丁酸 (CoA-转移酶).
该酶在根据本发明的任何方面的产乙酸细胞中特别有利,因为它具有广泛的底物特异性(Stadtman ER (1953). J Biol Chem 203:501–512和Stadtman ER (1953) Fed Proc12:692–693.)并且能够催化酰基CoA的转化以形成至少一种脂肪酸(Seedorf等, (2007)PNAS. 105 (6):2128-2133)。由于酶E8的存在,在根据本发明的任何方面的产乙酸细胞的存在下,从包含CO 和/或CO2的碳源生产至少一种酸可以成为可能。所述酸可以经由乙酸生产(其中乙酸可以用作CoA受体)而从碳源生产。这因此可允许根据本发明的任何方面的细胞在脂肪酸生产中更高效和有效。
在大多数产乙酸细胞中,丁酸可能不是天然生产的。可以将丁酸的生产引入产乙酸细胞中,这是通过基因修饰细胞,使其能够从至少一种包含CO 和/或CO2的碳源生产丁酸。在一个实例中,已经能够生产丁酸的产乙酸细胞可以用于本发明的方面中以引入酶E8,从而使得细胞能够从包含CO 和/或CO2的碳源生产至少一种脂肪酸。例如,Clostridium carboxidivorans可以是这样的细胞。
在一个实例中,根据本发明的任何方面的细胞可以被基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的至少一种另外的酶,所述另外的酶选自E1至E7 和E9至E11,其中E1是醇脱氢酶(adh),E2是乙醛脱氢酶(ald),E3是乙酰乙酰-CoA硫解酶(thl),E4是3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd),E5是3-羟基丁酰-CoA脱水酶(crt),E6是丁酰-CoA脱氢酶(bcd),E7是电子转移黄素蛋白亚基(etf),E9是乙酸激酶(ack),E11是转氢酶,且E12是反式-2-烯酰-CoA还原酶(TER)或巴豆酰-CoA还原酶(ccr)。所述细胞也可以包含相对于野生型细胞增加表达的E10,即磷酸转乙酰酶(pta)。
具体地,酶E1和E2的活性可以使用至少在Hillmer P., 1972, Lurz R., 1979中教导的测定法测量;酶E2的活性也可以使用Smith L.T., 1980中教导的测定法测量;酶E3和E4的活性可以使用至少在Sliwkowski M.X., 1984中教导的测定法测量;E4的活性也可以使用Madan, V.K., 1972中教导的测定法测量;E5的活性也可以使用Bartsch, R.G., 1961中教导的测定法测量;酶E6和E7的活性可以使用在Li, F., 2008中教导的测定法测量;E7的活性也可以使用Chowdhury, 2013中教导的测定法测量;E8的活性可以使用Stadman, 1953中教导的测定法测量。在另一实例中,E8的活性可以使用Barker, H. A., 1955. MethodsEnzymol. 1:599–600中教导的测定法测量;E9的活性可以使用Winzer, K., 1997中教导的测定法测量;E10的活性可以使用Smith L.T., 1976中教导的测定法测量;并且E11的活性可以使用Wang S, 2010中教导的测定法测量。E12可以使用Inui等 (1984) Eur. J.Biochem.142, 121–126和/或Seubert等 (1968) Biochim. Biophys. Acta 164, 498–517和/或Hoffmeister, M. (2005), J. Biol. Chem., 280 (6), 4329–4338中教导的TER活性测定法测量。
技术人员可以使用本领域已知的这些方法和其它方法来证实相对于野生型细胞的酶表达和/或活性增加。
在一个实例中,根据本发明任何方面的细胞可以被基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的所有以下酶:E3乙酰乙酰-CoA硫解酶(thl)、E4 3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd)、E5 3-羟基丁酰-CoA脱水酶(crt)和E6丁酰-CoA脱氢酶(bcd)。在另一实例中,E7电子转移黄素蛋白亚基(etf)的表达相对于野生型细胞也可以是增加的。根据本发明任何方面的细胞因此可以具有相对于野生型细胞增加表达的酶E3-E6和E8。在另一实例中,根据本发明任何方面的细胞可以具有相对于野生型细胞增加表达的酶E3-E8。
在另一实例中,根据本发明任何方面的细胞可以被基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的以下酶:E3,即乙酰乙酰-CoA硫解酶(thl)、E4,即3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd)、E5,即 3-羟基丁酰-CoA脱水酶(crt)、E6,即丁酰-CoA脱氢酶(bcd)和E8。在一个实例中,E3可包含SEQ ID NO:2的序列,E4可包含SEQ ID NO:3的序列,E5可包含SEQ ID NO:4的序列,E6可包含SEQ ID NO:5的序列。
在另一实例中,根据本发明任何方面的细胞可以被基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的以下酶:E3,即乙酰乙酰-CoA硫解酶(thl)、E4,即3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd)、E5,即 3-羟基丁酰-CoA脱水酶(crt)和E8。在一个实例中,E3可包含SEQ ID NO:2的序列,E4可包含SEQ ID NO:3的序列,E5可包含SEQ ID NO:4的序列,且E6可包含SEQ ID NO:5的序列。
在另一实例中,根据本发明任何方面的细胞可以被进一步基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的酶E1,即醇脱氢酶(adh)和酶E12,即反式-2-烯酰-CoA还原酶或巴豆酰-CoA还原酶(TER)。具体地,E1可以是来自丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌的丁酸-脱氢酶。更具体地,来自丙酮丁醇梭菌的丁醇-脱氢酶可以包含SEQ OD NO:18的序列,并且来自大肠杆菌的丁醇-脱氢酶可以包含SEQ ID NO:19的序列。更具体地,细胞中的酶E12可以选自SEQ IDNOs: 14、15 和16。
细胞也可以包含E7电子转移黄素蛋白亚基(etf)。更具体地,E7可以是来自丙酮丁醇梭菌的etfB和etfA。甚至更具体地,E7可以包含SEQ ID NOs:10和11的序列。
在一个实例中,根据本发明任何方面的细胞可以被进一步基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的酶E6,即丁酸-脱氢酶。具体地,E6可来自克氏梭菌(C. kluyveri)和/或可以包含SEQ ID NO:7的序列。细胞也可以包含相对于野生型细胞增加表达的电子-转移蛋白 (E7)。具体地,E7可以包含SEQ ID NOs: 12和13的序列。细胞也可以包含相对于野生型细胞增加表达的反式-2-烯酰-CoA还原酶(TER) (E12)。具体地,TER可以来自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、小眼虫(Euglena gracilis)或秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)。甚至更具体地,E12可以是选自SEQ ID NOs: 14、15 和16的TER。在另一实例中,E12可以是巴豆酰-CoA还原酶(ccr)。具体地,ccr可以来自山丘链霉菌(Streptomyces collinus)。更具体地,酶E12可以是包含SEQ ID NO: 17的序列的ccr。
在一个另外的实例中,根据本发明任何方面的细胞可以被进一步基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的酶E6,即丁酸-脱氢酶。具体地,E6可来自克氏梭菌和/或可以包含SEQ ID NO:5的序列。细胞也可以包含相对于野生型细胞增加表达的电子-转移蛋白(E7)。具体地,E7可以包含SEQ ID NOs: 8和9的序列。细胞也可以包含相对于野生型细胞增加表达的磷酸转乙酰酶(pta)启动子和/或终止子。
具体地,根据本发明任何方面的细胞可以包含相对于野生型细胞增加表达的以下酶:E3E8、E4E8、E5E8、E6E8、E7E8、E3E4E8、E3E5E8、E3E6E8、E3E7E8、E4E5E8、E4E6E8、E4E7E8、E5E6E8、E5E7E8、E3E4E5E8、E3E4E6E8、E3E4E7E8、E4E5E6E8、E4E5E7E8、E5E6E7E8、E3E4E5E6E8、E3E4E5E7E8、E4E5E6E7E8、E3E4E5E6E7E8、E3E8E12、E4E8E12、E5E8E12、E6E8E12、E7E8E12、E3E4E8E12、E3E5E8E12、E3E6E8E12、E3E7E8E12、E4E5E8E12、E4E6E8E12、E4E7E8E12、E5E6E8E12、E5E7E8E12、E3E4E5E8E12、E3E4E6E8E12、E3E4E7E8E12、E4E5E6E8E12、E4E5E7E8E12、E5E6E7E8E12、E3E4E5E6E8E12、E3E4E5E7E8E12、E4E5E6E7E8E12、E3E4E5E6E7E8E12、E3E8E1、E4E8E1、E5E8E1、E6E8E1、E7E8E1、E3E4E8E1、E3E5E8E1、E3E6E8E1、E3E7E8E1、E4E5E8E1、E4E6E8E1、E4E7E8E1、E5E6E8E1、E5E7E8E1、E3E4E5E8E1、E3E4E6E8E1、E3E4E7E8E1、E4E5E6E8E1、E4E5E7E8E1、E5E6E7E8E1、E3E4E5E6E8E1、E3E4E5E7E8E1、E4E5E6E7E8E1、E3E4E5E6E7E8E1、E3E8E12E1、E4E8E12E1、E5E8E12E1、E6E8E12E1、E7E8E12E1、E3E4E8E12E1、E3E5E8E12E1、E3E6E8E12E1、E3E7E8E12E1、E4E5E8E12E1、E4E6E8E12E1、E4E7E8E12E1、E5E6E8E12E1、E5E7E8E12E1、E3E4E5E8E12E1、E3E4E6E8E12E1、E3E4E7E8E12E1、E4E5E6E8E12E1、E4E5E7E8E12E1、E5E6E7E8E12E1、E3E4E5E6E8E12E1、E3E4E5E7E8E12E1、E4E5E6E7E8E12E1、E3E4E5E6E7E8E12E1、x等等。
具体地,E8可以选自丁酰-CoA:乙酸CoA 转移酶、琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶、4-羟基丁酰-CoA: 辅酶A转移酶,等等。更具体地,E8可以包含与选自以下的多肽的至少50%的序列同一性:CKL_3595、CKL_3016、CKL_3018,等等。更具体地,E8可以包含与选自以下的多肽具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98或100%序列同一性的多肽:CKL_3595、CKL_3016和CKL_3018。E8可以包含与SEQ ID NO: 1具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 % 序列同一性的氨基酸序列。具体地,E8可以来自克氏梭菌或Clostridium carboxidivorans。更具体地,E8可以来自克氏梭菌。甚至更具体地,E8可以来自克氏梭菌菌株ATCC 8527。
具体地,E1可以选自醇脱氢酶1、醇脱氢酶2、醇脱氢酶3、醇脱氢酶B及其组合。更具体地,E1可以包含与选自以下的多肽的至少50%的序列同一性:CKL_1075、CKL_1077、CKL_1078、CKL_1067、CKL_2967、CKL_2978、CKL_3000、CKL_3425和CKL_2065。甚至更具体地,E1可以包含与选自以下的多肽具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98或100%序列同一性的多肽:CKL_1075、CKL_1077、CKL_1078和CKL_1067。E1可以包含与SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 19具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或100 % 序列同一性的氨基酸序列。具体地,E1可以选自丙酮丁醇梭菌和大肠杆菌。
具体地,E2可以选自乙醛脱氢酶1、醇脱氢酶2及其组合。具体地,E2可以包含与选自以下的多肽的至少50%的序列同一性:CKL_1074、CKL_1076,等等。 更具体地,E2可以包含与选自以下的多肽具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98或100%序列同一性的多肽:CKL_1074和CKL_1076。
E3可以选自乙酰乙酰-CoA硫解酶A1、乙酰乙酰-CoA硫解酶A2、乙酰乙酰-CoA硫解酶A3及其组合。具体地,E3可以包含与选自以下的多肽的至少50%的序列同一性:CKL_3696、CKL_3697、CKL_3698,等等。更具体地,E3可以包含与选自以下的多肽具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98或100%序列同一性的多肽:CKL_3696、CKL_3697和CKL_3698。更具体地,E3可以包含与SEQ ID NO: 2具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或100% 序列同一性的氨基酸序列。具体地,E3可以来自丙酮丁醇梭菌。
E4可以是3-羟基丁酰-CoA脱氢酶1、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶2,等等。具体地,E4可以包含与多肽CKL_0458、CKL_2795等等的至少50%的序列同一性。更具体地,E4可以包含与多肽CKL_0458或CKL_2795具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98或100%序列同一性的多肽。更具体地,E4可以包含与SEQ ID NO: 3具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 % 序列同一性的氨基酸序列。具体地,E4可以来自克氏梭菌。
E5可以是3-羟基丁酰-CoA脱水酶1、3-羟基丁酰-CoA脱水酶2及其组合。具体地,E5可以包含与选自以下的多肽的至少50%的序列同一性:CKL_0454、CKL_2527,等等。更具体地,E5可以包含与选自以下的多肽具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98或100%序列同一性的多肽:CKL_0454和CKL_2527。更具体地,E5可以包含与SEQ ID NO: 4具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或100 % 序列同一性的氨基酸序列。具体地,E5可以来自克氏梭菌。
E6可以选自丁酰-CoA脱氢酶1、丁酰-CoA脱氢酶2,等等。具体地,E6可以包含与选自以下的多肽的至少50%的序列同一性:CKL_0455、CKL_0633,等等。更具体地,E6可以包含与选自以下的多肽具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98或100%序列同一性的多肽:CKL_0455和CKL_0633。更具体地,E6可以包含与SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6 或SEQ IDNO: 7具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或100 % 序列同一性的氨基酸序列。具体地,E6可以选自克氏梭菌和丙酮丁醇梭菌。
E7可以选自电子转移黄素蛋白α亚基1、电子转移黄素蛋白α亚基2、电子转移黄素蛋白β亚基1和电子转移黄素蛋白β亚基2。具体地,E7可以包含与选自以下的多肽的至少50%的序列同一性:CKL_3516、CKL_3517、CKL_0456、CKL_0457,等等。更具体地,E7可以包含与选自以下的多肽具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98或100%序列同一性的多肽:CKL_3516、CKL_3517、CKL_0456和CKL_0457。更具体地,E7可以包含与SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO: 13具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或100 % 序列同一性的氨基酸序列。具体地,E7可以选自克氏梭菌和丙酮丁醇梭菌。
E9可以是乙酸激酶A (ack A)。具体地,E9可以包含与CKL_1391等等的多肽序列的至少50%的序列同一性。更具体地,E9可以包含与CKL_1391的多肽具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98或100%的序列同一性的多肽。
E10可以是磷酸转乙酰酶(pta)。具体地,E10可以包含与CKL_1390等等的多肽序列的至少50%的序列同一性。更具体地,E10可以包含与CKL_1390的多肽具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98或100%的序列同一性的多肽。具体地,E10可以选自丙酮丁醇梭菌。
E11可以是转氢酶。具体地,E11可以是Hatefi, Y., (1977) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 74 (3). 846-850和/或Anderlund M. (1999), Appl Environ Microbiol., 65(6): 2333–2340中公开的转氢酶。
E12可以包含与SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO: 17具有50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或100 % 序列同一性的氨基酸序列。具体地,E12可以选自齿垢密螺旋体、小眼虫、秀丽隐杆线虫和山丘链霉菌。
在整个本申请中,除非相反规定,否则任何数据库代码是指可从NCBI数据库,更具体地是2014年6月12日的在线版本获得的序列,并且如果此序列是核苷酸序列,则包含通过翻译前者获得的多肽序列。
根据本发明的另一个方面,提供了生产高级醇的方法,所述方法包括
-使根据本发明的任何方面的重组微生物细胞与包含碳源的培养基接触。
如本文所用的术语“接触”是指引起根据本发明的任何方面的细胞与包含碳源的培养基之间的直接接触。例如,细胞和包含碳源的培养基可以处于不同的隔室中。具体地,碳源可以处于气态并添加到包含根据本发明的任何方面的细胞的培养基中。
如本文所用的术语“乙酸”指乙酸和其盐两者,这是不可避免地产生的,因为如本领域已知的,由于微生物在含水环境中工作,并且在存在的盐和酸之间总是存在平衡。
如本文所用的术语“约”指在20%内的变化。具体地,如本文所用的术语“约”指给定测量值或值的+/- 20%,更具体+/- 10%,甚至更具体+/- 5%。
除非另有说明,所有百分比(%)都是体积百分比。
根据本发明的任何方面使用的碳源可以是本领域已知的任何碳源。具体地,碳源可以选自碳水化合物如,例如,葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素。在一个实例中,烃如甲烷、氨基酸如L-谷氨酸或L-缬氨酸,或有机酸如,例如,乙酸可以用作碳源。这些物质可以单独或作为混合物使用。特别优选的是使用碳水化合物,具体是单糖、寡糖或多糖(如美国专利号601,494和美国专利号6,136,576中描述的),或C5-糖,或甘油。在一个实例中,碳源可以包括二氧化碳和/或一氧化碳。本领域技术人员将理解存在很多可能的来源,用于提供作为碳源的CO和/或CO2。可以看出,实践中,作为根据本发明任何方面的碳源,可以使用任何气体或任何气体混合物,其能够为微生物提供足量的碳,以便可以从CO和/或CO2的来源形成乙酸和/或乙醇。
通常,对于根据本发明任何方面的混合培养物,碳源包含至少50体积%,至少70体积%,特别是至少90体积%的CO和/或CO2,其中体积百分比-%涉及在混合培养物中第一微生物可用的所有碳源。在一个实例中,碳源可以是包含5 - 25体积%的CO、25 -35体积%的CO2和50 - 65氢气的气体混合物。在另一个实例中,碳源可以是包含22体积%的CO、6体积%的CO2和44 %氢气的气体混合物。在一个另外的实例中,碳源可以是包含33体积%的CO2和67 %氢气的气体混合物。在一个具体实例中,碳源可以是包含25体积%的CO、25体积%的CO2和50%氢气的气体混合物。在根据本发明的任何方面的混合培养物中,可以提供碳材料来源。气体形式的碳源的实例包括废气如合成气、烟道气和酵母发酵或梭菌发酵产生的炼油厂气。这些废气从含纤维素材料的气化或煤的气化形成。在一个实例中,这些废气可以不一定作为其它方法的副产物产生,而是可以专门生产,用于与根据本发明任何方面的混合培养物一起使用。
根据本发明的任何方面,碳源可以是合成气。合成气可以例如作为煤的气化的副产物产生。因此,根据本发明任何方面的混合培养物的微生物可以能够将作为废品的物质转化成有价值的资源。在另一实例中,合成气可以是广泛可获得的、低成本的农业原材料的气化的副产物,用于与本发明的混合培养物一起使用,以生产至少一种高级醇。
存在很多可以转化成合成气的原材料的实例,因为几乎所有形式的植物都可以用于此目的。具体地,原材料选自多年生草如芒草、玉米残渣、加工废料如锯末,等等。
通常,合成气可以在干燥的生物质的气化装置中获得,主要是通过热解、部分氧化和蒸汽重整,其中合成气的主要产物是CO、H2和CO2。合成气还可以是CO2电解的产物。本领域技术人员将会理解进行CO2的电解以产生包含所需量的CO的合成气的合适条件。
通常,从气化方法获得的一部分合成气首先被加工以优化产品产量并避免形成焦油。合成气中不希望的焦油和CO的裂化可以使用石灰和/或白云石进行。这些方法详细描述于例如Reed,1981。
来源的混合物可以被用作碳源。
根据本发明的任何方面,可以与碳源一起提供还原剂例如氢气。具体地,当提供和/或使用C和/或CO2时,可以提供此氢气。在一个实例中,氢气是根据本发明的任何方面存在的合成气的部分。在另一个实例中,当合成气中的氢气不足以用于本发明的方法时,可以提供额外的氢气。
本文使用的‘高级醇’是指含4至12个碳原子,具体地,4至10个碳原子,4至8个碳原子,6至10个碳原子,并且可以有些粘稠或油性,并且具有较重的水果气味的醇。更具体地,‘高级醇’可以包含以下式I,并且具有4至10个碳原子
式I
R= H, CH3,
n=1- 6
高级醇可以包括但不限于己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇,等等。更具体地,高级醇可以选自1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-辛醇、1-戊醇、1-庚醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇、4-甲基-1-戊醇、5-甲基-1-己醇、6-甲基-1-庚醇以及它们的组合。
本领域技术人员将理解进行根据本发明任何方面的方法所必须的其它条件。具体地,容器(例如,发酵罐)中的条件可以取决于所使用的第一和第二微生物而变化。适合微生物的最佳功能的条件的变化在技术人员的知识范围内。
在一个实例中,根据本发明任何方面的方法可以在具有5至8、5.5至7的pH的含水培养基中进行。压力可以在1和10 bar之间。
具体地,所述含水培养基可以包含碳源,所述碳源包含CO和/或CO2。更具体地,包含CO和/或CO2的碳源在连续气流中提供到含水培养基。甚至更具体地,所述连续气流包含合成气。在一个实例中,气体是相同流(flow/stream)的部分。在另一个实例中,每种气体是提供到含水培养基的分开的流(flow/stream)。这些气体可以例如使用在含水培养基中打开的分开的喷嘴、玻璃料过滤器板(frit)、在将气体提供入含水培养基的管内的膜等来分开。
根据本发明的另一个方面,提供了根据本发明的任何方面的细胞用于生产高级醇的用途。
在根据本发明的任何方面的反应混合物中,可以存在氧气。因此,根据本发明任何方面的微生物可以是需氧生长。具体地,可以在连续气流中将氧气提供到根据本发明任何方面的含水培养基中。更具体地,气流中的O2浓度可以是以少于气体总量的1体积%存在于气流中。具体地,氧气可以是以下列的浓度范围存在:0.000005至2体积%,0.00005至2体积%的范围、0.0005至2体积%、0.005至2体积%、0.05至2体积%、0.00005至1.5体积%、0.0005至1.5体积%、0.005至1.5体积%、0.05至1.5体积%、0.5至1.5体积%、0.00005至1体积%、0.0005至1体积%、0.005至1体积%、0.05至1体积%、0.5至1体积%、0.55至1体积%、0.60至1体积%、特别是0.60至1.5体积%、0.65至1体积%和0.70至1体积%的范围。具体地,当气相/流中的O2比例是相对气流中气体体积约0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2体积%时,产乙酸微生物是特别合适的。本领域技术人员将能够使用本领域已知的任一种方法测量气流中的氧气体积浓度。具体地,可以使用本领域已知的任何方法测量氧气体积。在一个实例中,可以通过来自PreSens Precision Sensing GmbH的微量氧浸渍探针( traceoxygen dipping probe)测量氧气的气相浓度。可以通过荧光猝灭测量氧气浓度,其中猝灭程度与气相中氧分压相关。甚至更具体地,当通过具有少于总气体的1体积%的氧气浓度(以提供给反应混合物的气流中气体的总体积的约0.015体积%)的气流提供氧气时,根据本发明任何方面的第一和第二微生物能够在含水培养基中最佳地工作。
根据本发明任何方面的含水培养基可以包含氧气。氧气可以通过本领域已知的任何方法溶解在培养基中。具体地,氧气可以是以0.5mg/L存在。具体地,含水培养基中游离氧的溶解浓度可以至少是0.01mg/L。在另一个实例中,溶解氧可以是约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L。具体地,溶解氧浓度可以是0.01-0.5mg/L、0.01-0.4mg/L、0.01-0.3mg/L、0.01-0.1mg/L。具体地,氧气可以在连续气流中提供到含水培养基。更具体地,含水培养基可以包含氧气和碳源,所述碳源包含CO和/或CO2。更具体地,氧气和包含CO和/或CO2的碳源在连续气流中提供到含水培养基。甚至更具体地,所述连续气流包含合成气和氧气。在一个实例中,两种气体都是相同流(flow/stream)的一部分。在另一个实例中,每种气体是提供到含水培养基的分开的流(flow/stream)。这些气体可以例如使用在含水培养基中打开的分开的喷嘴、玻璃料过滤器板、在将气体提供入含水培养基的管内的膜等来分开。氧气可以是游离氧。根据本发明的任何方面,“包含游离氧的反应混合物”是指包含O2形式的元素氧的反应混合物。O2可以是反应混合物中的溶解氧。具体地,溶解氧可以是≥ 5ppm (0.000005体积%; 5x10-6)的浓度。本领域技术人员可以能够使用本领域已知的任何方法测量溶解氧的浓度。在一个实例中,溶解氧可以通过氧浸渍入探针(来自PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Germany的PSt6型)测量。
在根据本发明任何方面的一个实例中,碳源是合成气并且碳源可以在提供到含水培养基中之前与氧气掺合。此掺合步骤可以改进反应中的效率和高级醇的生产。本发明的方法的总体效率、醇生产率和/或总体碳捕获可以取决于连续气流中的CO2、CO、H2和O2的化学计量。所应用的连续气流可以是组合物O2、CO2和H2的。具体地,在连续气流中,O2的浓度范围可以在0.000005至1体积%内,CO/CO2 约10–50体积%,具体是33体积%,并且H2会在44%至84体积%内,具体是64至66.04体积%。更具体地,连续气流中的气体浓度可以是0.15体积%的O2,32体积%的CO/CO2和64体积%的H2。在另一个实例中,连续气流还可以包含惰性气体如N2,最多至50体积%的N2浓度。
本领域技术人员将理解,可能有必要以相关的间隔监测流的组成和流速。可以通过改变组分流的比例来实现流的组成的控制,以实现目标或所需组成。可以通过本领域已知的任何方法监测掺合流的组成和流速。在一个实例中,系统适合于连续监测至少两种流的流速和组成,并将它们组合以产生最佳组成的连续气流中的单一的掺合底物流,和用于将优化的底物流传递到根据本发明任何方面的混合培养物中的手段。
附图简述
图1是载体pSOS95。
实施例
以上描述了优选实施方案,如本领域技术人员将理解的,在不背离权利要求的范围的情况下,所述优选实施方案可以在设计、构造或操作方面进行变化或修改。例如,这些变化意欲被权利要求的范围所涵盖。
实施例中的所有序列都是连接在一起的基因的序列,并且不包括实际的载体pSOS95主链序列。
实施例1
用于形成丁醇的基因修饰的产乙酸细菌的产生
● 载体pATh-LEM-04和pATh-LEM-14
从相应的基因组扩增以下基因:来自丙酮丁醇梭菌 ATTC 824的硫解酶 (thl_Ca)(SEQ ID NO:28)、来自克氏梭菌的羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd1_Ck) (SEQ ID NO: 29)、来自克氏梭菌的巴豆酸酶(crt1_Ck) (SEQ ID NO:30)和来自克氏梭菌的丁酰-CoA脱氢酶(bcd1_Ck) (SEQ ID NO:31),并且通过使用KasI和BamHI插入到载体pEmpty中。该质粒(pEmpty)是基于质粒主链pSOS95(图1)。为了使用pSOS95,将其用BamHI和KasI消化。这除去了操纵子ctfA-ctfB-adc,但留下了thl启动子和adc的不依赖于rho的终止子。携带指定的基因的新产生的载体称作pATh-LEM-02 (SEQ ID NO:51是指在pATh-LEM-02中连接在一起的基因的序列,其不带有实际载体的序列)。
在第二个克隆步骤中,用EcoRI和KasI消化载体pATh-LEM-02,并且从基因组DNA扩增来自克氏梭菌的CoA-转移酶(cat3_Ck) (SEQ ID NO:26),并且整合到载体中。新设计的载体命名为pATh-LEM-04。为了创建载体pATh-LEM-14,用KasI和BspEI消化载体pATH-LEM-04。通过使用SEQ ID NOs: 46和47的寡核苷酸,从克氏梭菌的基因组DNA扩增基因etfBA。
通过使用SEQ ID NOs: 48和49的寡核苷酸,从pATh-LEM-04扩增cat3的片段。得到的片段具有SEQ ID NO:52的序列。然后使用PCR将cat3和etfBA的两个片段融合,所述PCR采用SEQ ID NO: 50 和49的引物。然后将cat3和etfBA的该融合插入片段添加到KasI 和BspEI打开的载体pATH-LEM-04。得到的载体称作pATH-LEM-14(SEQ ID NO:20是融合在一起的靶基因的序列,该序列能够容易地插入载体中)。
● 载体pATh-Syn4-03和pATh-LEM-23
为了产生称作pATh-Syn4-03的载体,首先形成具有SEQ ID NO:53的盒。该盒包含以下基因:来自丙酮丁醇梭菌 ATTC 824的硫解酶 (thl_Ca) (SEQ ID NO:28)、来自克氏梭菌的羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd1_Ck) (SEQ ID NO: 29)和来自克氏梭菌的巴豆酸酶(crt1_Ck)(SEQ ID NO:30)。然后通过使用KasI和BamHI将具有SEQ ID NO:53的盒插入载体pEmpty中。
该质粒(pEmpty)是基于质粒主链pSOS95(图1)。为了使用pSOS95,将其用BamHI和KasI消化。这除去了操纵子ctfA-ctfB-adc,但留下了thl启动子和adc的不依赖于rho的终止子。在第二个步骤中,通过用SbfI和BamHI消化载体,从载体除去thl启动子。合成pta启动子片段 (SEQ ID NO: 25 (Ueki等 (2014) mBio. 585): 1636-14),连接到BamHI/SbfI消化的载体中。新产生的携带指定的基因和pta启动子的载体称作pATh-Syn4-14。
用KasI和EcoRI打开载体pATh-Syn4-14,并且与SEQ ID NO:54连接,SEQ ID NO:54是从来自克氏梭菌的CoA-转移酶合成的。产生的载体命名为pATh-LEM-23 (SEQ ID NO:21)。
● 载体pATh-LEM-15、pATh-LEM-16、pATh-LEM-24、pATh-LEM-25、pATh-LEM-26
合成包含来自丙酮丁醇梭菌 ATTC 824的硫解酶 (thl_Ca) (SEQ ID NO:29)、来自克氏梭菌的羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd1_Ck) (SEQ ID NO: 29)和来自克氏梭菌的巴豆酸酶(crt1_Ck) (SEQ ID NO:30)的盒,并且通过使用KasI和BamHI插入到载体pEmpty中。该质粒(pEmpty)是基于质粒主链pSOS95(图1)。为了使用pSOS95,将其用BamHI和KasI消化。这除去了操纵子ctfA-ctfB-adc,但留下了thl启动子和adc的不依赖于rho的终止子。新产生的携带指定的基因的载体称作pATh-Syn4-03。
用KasI打开载体pATh-Syn4-03,并且通过体外克隆连接包含来自丙酮丁醇梭菌的丁酸-脱氢酶(bcd_Ca) (SEQ ID NO:34)、来自丙酮丁醇梭菌的电子转移蛋白 (etfBA_Ca)(SEQ ID NOs: 35和36)和来自克氏梭菌的CoA-转移酶(cat3_Ck) (SEQ ID NO:26)的盒。新构建的载体命名为pATh-LEM-15 (SEQ ID NO:55)。
用KasI/EcoRI打开载体pATh-Syn4-03,并且与包含来自克氏梭菌的丁酸-脱氢酶(bcd1_Ck) (SEQ ID NO:5)、来自克氏梭菌的电子转移蛋白(etfBA1_Ck) (SEQ ID NOs:8和9) 和来自克氏梭菌的CoA-转移酶(cat3_Ck) (SEQ ID NO:1)的盒(SEQ ID NO:56,不含载体的完整序列)连接。新构建的载体命名为pATh-LEM-16。
用KasI和EcoRI打开载体pATh-Syn4-03。合成来自克氏梭菌的CoA-转移酶的DNA片段(SEQ ID NO:57)并且连接到制备的载体中。产生的载体命名为pATh-LEM-24 (SEQ IDNO:22)。
为了产生载体pATh-LEM-25,用AsiSI和EcoRI打开质粒pATh-Syn4-24。合成包含来自丙酮丁醇梭菌的丁醇脱氢酶B (bdhB_Ca)的DNA片段 (SEQ ID NO:44),并且连接到制备的载体中。产生的载体命名为pATh-LEM-25 (SEQ ID NO:23)。
为了产生载体pATh-LEM-26,用AsiSI和AscI打开质粒pATh-Syn4-25 (SEQ ID NO:23) 。扩增针对杨氏梭菌进行了密码子优化的来自大肠杆菌的丁醇脱氢酶(YghD_E(coCl))(SEQ ID NO:58),与核糖体结合位点融合,并且连接到制备的载体中。产生的载体命名为pATh-LEM-26 (SEQ ID NO:24)。
● 载体pATh-LEM-17、pATh-LEM-18、pATh-LEM-19、pATh-LEM-20、pATh-LEM-21
用KasI和NotI打开载体 pATh-LEM-16。连接包含来自克氏梭菌的丁酸-脱氢酶2(bcd2_Ck) (SEQ ID NO:37)和来自克氏梭菌的电子转移蛋白2(etfBA2_Ck) (SEQ ID NOs: 39和38)的SEQ ID NO: 59的DNA片段。新构建的载体命名为pATh-LEM-17。
为了创建pATh-LEM-18,用 KasI和NotI打开载体pATh-LEM-16。连接包含来自齿垢密螺旋体的密码子优化的反式-2-烯酰-CoA还原酶(TER_Td(coCl))的DNA片段(SEQ ID NO:41)。新构建的载体命名为 pATh-LEM-18。
为了创建pATh-LEM-19,用Not和AarI打开载体pATh-LEM-16。连接包含来自小眼虫的密码子优化的反式-2-烯酰-CoA还原酶 (TER_Eg(coCl))的DNA片段(SEQ ID NO:40)。新构建的载体命名为 pATh-LEM-19。
用AarI和NotI打开载体 pATh-LEM-16。连接包含来自秀丽隐杆线虫的密码子优化的反式-2-烯酰-CoA还原酶 (TER_Ce(coCl))的DNA片段(SEQ ID NO:42)。新构建的载体命名为 pATh-LEM-20。
用FseI和NotI打开载体 pATh-LEM-16。连接包含来自山丘链霉菌的密码子优化的巴豆酰-CoA还原酶 (Ccr_Sc(coCl))的合成DNA片段(SEQ ID NO:43)。新构建的载体命名为pATh-LEM-21。
● 载体pATh-LEM-22
DNA片段(SEQ ID NO: 60)包含来自克氏梭菌的丁酰-CoA脱氢酶(bcd1_Ck) (SEQ IDNO:31)、来自克氏梭菌的电子转移蛋白(etfBA1_Ck) (SEQ ID NOs:32和33)、来自克氏梭菌的CoA-转移酶(cat3_Ck) (SEQ ID NO:26)和转录元件(pta-启动子和终止子)。用 EcoRI /XhoI打开亲本载体pATh-Syn4-03,并且将DNA片段 (SEQ ID NO: 60)连接到其中以产生载体pATh-LEM-22。
产乙酸菌的转化:
按照Leang等 (2013) Applied and Environmental Microbiology 79(4): 1102-1109中公开的,进行杨氏梭菌DSMZ 13528和产乙醇梭菌DSMZ 10061的转化。
实施例2
基因修饰的菌株在H
2
、CO
2
和CO的混合物上的发酵显示酸和高级醇形成
对于以下菌株的细胞培养,5 mL的培养物将在500 ml含有100 mg/L红霉素的LM33-培养基中厌氧生长:
杨氏梭菌 pATh-LEM-04
杨氏梭菌 pATh-LEM-14
杨氏梭菌 pATh-LEM-15
杨氏梭菌 pATh-LEM-16
杨氏梭菌 pATh-LEM-17
杨氏梭菌 pATh-LEM-18
杨氏梭菌 pATh-LEM-19
杨氏梭菌 pATh-LEM-20
杨氏梭菌 pATh-LEM-21
杨氏梭菌 pATh-LEM-22
杨氏梭菌 pATh-LEM-23
杨氏梭菌 pATh-LEM-24
杨氏梭菌 pATh-LEM-25
杨氏梭菌 pATh-LEM-26
杨氏梭菌 pEmpty
产乙醇梭菌pATh-LEM-04
产乙醇梭菌pATh-LEM-14
产乙醇梭菌pATh-LEM-15
产乙醇梭菌pATh-LEM-16
产乙醇梭菌pATh-LEM-17
产乙醇梭菌pATh-LEM-18
产乙醇梭菌pATh-LEM-19
产乙醇梭菌pATh-LEM-20
产乙醇梭菌pATh-LEM-21
产乙醇梭菌pATh-LEM-22
产乙醇梭菌pATh-LEM-23
产乙醇梭菌pATh-LEM-24
产乙醇梭菌pATh-LEM-25
产乙醇梭菌pATh-LEM-26
产乙醇梭菌pEmpty。
在pH 5.5如下表1-3制备LM 33培养基。除半胱氨酸盐酸盐外的所有成分在dH2O中混合到1L的总体积。通过加热到沸点并使溶液在恒定氮气流下冷却到室温,使该溶液无氧。一旦冷却,加入半胱氨酸盐酸盐 (0,5 g/L),并且将溶液的pH调节到5.5;在整个实验中保持无氧。
表1. 实施例1中使用的培养基成分 (LM-33)。
表2. LS06-微量元素溶液。
表3 LS03-维生素溶液。
在37℃, 150 rpm和3 L/h的通气下,在敞开式水浴振荡器中,用大致由H2、CO2和CO组成的(composed of around H2, CO2 and CO)预先混合的气体混合物在1L玻璃瓶中双份进行培养70小时。气体将通过具有10微米孔径的过滤器进入培养基,该过滤器将安装在反应器的中间,在通气管上。当取样时,将取出每5ml样品用于测定OD600 nm、pH和产物范围。产物浓度的测定将通过半定量1H-NMR光谱学进行。作为内部定量标准,将使用三甲基甲硅烷基丙酸钠。与阴性对照杨氏梭菌pEmpty和产乙醇梭菌pEmpty形成对照,修饰的菌株将产生丁酸、丁醇、己酸、己醇、辛酸和辛醇。
实施例3
材料和方法
在以下实施例中,培养基因修饰的杨氏梭菌或产乙醇梭菌,以便生产丁醇和/或前体3-羟基丁酸和/或丁酸。使用含有5 g/L果糖的复合培养基,其由以下组成:1 g/L NH4Cl, 0.1g/L KCl, 0.2 g/L MgSO4 x 7 H2O, 0.8 g/L NaCl, 0.1 g/L KH2PO4, 20 mg/L CaCl2 x 2H2O, 20 g/L MES, 1 g/L酵母提取物, 0.4 g/L L-半胱氨酸盐酸盐, 0.4 g/L Na2S x 9H2O, 20 mg/L次氮基三乙酸, 10 mg/L MnSO4 x H2O, 8 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 6 H2O, 2mg/L CoCl2 x 6 H2O, 2 mg/L ZnSO4 x 7 H2O, 0.2 mg/L CuCl2 x 2 H2O, 0.2 mg/LNa2MoO4 x 2 H2O, 0.2 mg/L NiCl2 x 6 H2O, 0.2 mg/L Na2SeO4, 0.2 mg/L Na2WO4 x 2H2O, 20 µg/L生物素, 20 µg/L叶酸, 100 µg/L盐酸吡哆醇, 50 µg/L盐酸硫胺素x H2O,50 µg/L核黄素, 50 µg/L烟酸, 50 µg/L泛酸钙, 1 µg/L维生素B12, 50 µg/L对氨基苯甲酸, 50 µg/L硫辛酸。
在250 mL血清瓶中在50 mL培养基中进行异养培养。在37℃和150 min-1的振荡速度下在来自New Brunswick Scientific的敞开式水浴Innova 3100中连续振荡所述血清瓶。
用在Hungate管中在上文所述培养基中生长的5 mL细胞悬浮液接种实验。在实验过程中,取出 5 mL的样品用于测定OD600、pH和产物浓度。后者通过定量1H-NMR-光谱学进行测定。
结果和讨论:
实施例3a
基因修饰的杨氏梭菌pATh-LEM-14的培养
在上文描述的条件下异养培养如实施例1和2所示的基因修饰的杨氏梭菌 pATh-LEM-14。
接种后,在56.6小时后细胞生长到1.82的最大光密度。除了天然产物乙酸和乙醇,在56.6小时后,测量到了59 mg/L的最大丁醇浓度。生产了丁酸,最高达200 mg/L的浓度。结果显示在表4中。
表4.杨氏梭菌 pATh-LEM-14发酵的结果(n.d. = 未检测)。
实施例3b
基因修饰的杨氏梭菌pATh-LEM-23的培养
在上文描述的条件下异养培养基因修饰的杨氏梭菌 pATh-LEM-23。接种后,在113.6小时后细胞生长到1.21的最大光密度。除了天然产物乙酸和乙醇,在113.6小时后,测量到了8mg/L的最大丁醇浓度。生产了3-羟基丁酸和丁酸,分别最高达230 mg/L和15 mg/L的浓度。结果显示在表6中。
表5.杨氏梭菌 pATh-LEM-23发酵的结果(n.d. = 未检测)。
实施例3c
基因修饰的杨氏梭菌pATh-LEM-24的培养
在上文描述的条件下异养培养基因修饰的杨氏梭菌 pATh-LEM-24。接种后,在113.6小时后细胞生长到1.92的最大光密度。除了天然产物乙酸和乙醇,在113.6小时后,测量到了7mg/L的最大丁醇浓度。生产了3-羟基丁酸和丁酸,分别最高达170 mg/L和12 mg/L的浓度。结果显示在表7中。
表6.杨氏梭菌 pATh-LEM-24发酵的结果(n.d. = 未检测)。
实施例3d
基因修饰的杨氏梭菌pATh-LEM-25的培养
在上文描述的条件下异养培养基因修饰的杨氏梭菌 pATh-LEM-25。接种后,在117.4小时后细胞生长到1.52的最大光密度。除了天然产物乙酸和乙醇,没有检测到丁醇。在51.1小时后,丁酸具有13 mg/L的峰值,但是此后再次消耗。生产了前体3-羟基丁酸,最高达73 mg/L的浓度。结果显示在表8中。
表7.杨氏梭菌 pATh-LEM-25发酵的结果(n.d. = 未检测)。
实施例3e
基因修饰的产乙醇梭菌pATh-LEM-23的培养
在此实施例中,在上文描述的条件下异养培养基因修饰的产乙醇梭菌pATh-LEM-23。
接种后,在117.4小时后细胞生长到0.98的最大光密度。除了天然产物乙酸和乙醇,没有检测到丁醇。在51.1小时后,前体丁酸具有6 mg/L的峰值,但是此后再次消耗。生产了前体3-羟基丁酸,最高达140 mg/L的浓度。结果显示在表9中。
表8.产乙醇梭菌 pATh-LEM-23发酵的结果(n.d. = 未检测)。
实施例3f
野生型杨氏梭菌DSM 13528(野生型)的培养
在上文描述的条件下异养培养杨氏梭菌的野生型 (DSM 13528) 。接种后,细胞开始生长至68.5小时后的1.20的最大光密度。在68.5小时后仅仅测量了天然产物乙酸和乙醇,分别达到1197 mg/L和乙醇的最大浓度。
表9.杨氏梭菌野生型发酵的结果(n.d. = 未检测)。
Claims (15)
1.能够从碳源生产至少一种高级醇的产乙酸微生物细胞,其中所述产乙酸微生物细胞被基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的至少一种酶,即 E8,即丁酰-CoA: 乙酸CoA转移酶(cat3),并且其中所述高级醇包含以下式I并具有4至10个碳原子
式I
R= H, CH3,
n=1- 6。
2.根据权利要求1的细胞,其中所述细胞被基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的至少一种另外的酶,所述另外的酶选自E1至E7和E9至E11,其中E1是醇脱氢酶(adh),E2是乙醛脱氢酶(ald),E3是乙酰乙酰-CoA硫解酶(thl),E4是3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd),E5是3-羟基丁酰-CoA脱水酶(crt),E6是丁酰-CoA脱氢酶(bcd),E7是电子转移黄素蛋白亚基(etf),E9是乙酸激酶(ack),E11是转氢酶,且E12是反式-2-烯酰-CoA还原酶或巴豆酰-CoA还原酶。
3.根据权利要求1或2的细胞,其中E8包含与SEQ ID NO: 1的60 %序列同一性。
4.根据前述权利要求的任一项的细胞,其中E8来自克氏梭菌(Clostridium kluyveri)。
5.根据前述权利要求的任一项的细胞,其中所述细胞被基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的以下酶:E3,即乙酰乙酰-CoA硫解酶(thl)、E4,即3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd)、E5,即3-羟基丁酰-CoA脱水酶(crt)和E6,即丁酰-CoA脱氢酶(bcd)。
6.根据权利要求1-4的任一项的细胞,其中所述细胞被基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的以下酶:E3,即乙酰乙酰-CoA硫解酶(thl)、E4,即3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd)和E5,即3-羟基丁酰-CoA脱水酶(crt)。
7.根据权利要求1-4的任一项的细胞,其中所述细胞被基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的以下酶:E3,即乙酰乙酰-CoA硫解酶(thl)、E4,即3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd)、E5,即3-羟基丁酰-CoA脱水酶(crt)、E6,即丁酰-CoA脱氢酶(bcd)和E7,即电子转移黄素蛋白亚基(etf)。
8.根据权利要求5-7的任一项的细胞,其中所述细胞被进一步基因修饰以包含相对于其野生型细胞增加表达的至少一种酶,所述酶选自E1,即醇脱氢酶(adh)和酶E12,即反式-2-烯酰-CoA还原酶或巴豆酰-CoA还原酶。
9.根据权利要求2-8的任一项的细胞,其中所述酶
- E1选自丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)和大肠杆菌(E. coli)和/或E1包含与SEQID NO: 18或SEQ ID NO: 19的60 %序列同一性;
- E3来自丙酮丁醇梭菌和/或E3包含与SEQ ID NO: 2的60 %序列同一性;
- E4 来自克氏梭菌和/或E4包含与SEQ ID NO: 3的60 %序列同一性;
- E5来自克氏梭菌和/或E5包含与SEQ ID NO: 4的60 %序列同一性;
- E6选自克氏梭菌和丙酮丁醇梭菌和/或E6包含与选自SEQ ID NOs: 5- 7的至少一个氨基酸序列的60 %序列同一性;
- E7选自克氏梭菌和丙酮丁醇梭菌,和/或E7包含与选自SEQ ID NOs: 8- 13的氨基酸序列的60 %序列同一性;
- E12选自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、小眼虫(Euglena gracilis)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和山丘链霉菌(Streptomyces collinus)和/或E12包含与选自SEQ ID NO: 15- 17的氨基酸序列的60 %序列同一性。
10.根据前述权利要求的任一项的细胞,其中所述产乙酸微生物细胞选自潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium notera) (ATCC 35199)、长醋丝菌(Acetonema longum) (DSM 6540)、甲醇醋酸杆菌(Acetobacterium carbinolicum) (DSM 2925)、苹果酸醋酸杆菌(Acetobacterium malicum) (DSM 4132)、醋酸杆菌属第446号物种(Acetobacterium species no. 446)、威氏醋酸杆菌(Acetobacterium wieringae) (DSM 1911)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii) (DSM 1030)、Alkalibaculum bacchi (DSM 22112)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus) (DSM 4304)、Blautia producta (DSM 2950)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum) (DSM 3468)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum) (DSM 1496)、产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum) (DSM 10061、DSM 19630和DSM 23693)、Clostridium carboxidivorans (DSM 15243)、Clostridium coskatii (ATCC编号 PTA-10522)、Clostridium drakei (ATCC BA-623)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum) (DSM 92)、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)(DSM 1288)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii) (DSM 13528)、杨氏梭菌C-01 (ATCC 55988)、杨氏梭菌ERI-2 (ATCC 55380)、杨氏梭菌O-52(ATCC 55989)、马犹姆贝梭菌(Clostridium mayombei) (DSM 6539)、Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182)、Clostridium neopropionicum sp、Clostridium ragsdalei (DSM 15248)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes) (DSM 757)、梭菌属物种ATCC 29797、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii) (DSM 6115)、热苯脱硫肠状菌thermosyntrophicum亚种(Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum) (DSM 14055)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum) (DSM 20543)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans) C2A (DSM 2834)、穆尔氏菌属物种(Moorella sp.) HUC22-1、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica) (DSM 521)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica) (DSM 1974)、Oxobacter pfennigii (DSM 322)、Sporomusa aerivorans (DSM 13326)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata) (DSM 2662)、Sporomusa silvacetica (DSM 10669)、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides) (DSM 2875)、白蚁鼠孢菌(Sporomusa termitida) (DSM 4440)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui )(DSM 2030)。
11.根据前述权利要求的任一项的细胞,其中所述产乙酸微生物细胞是杨氏梭菌或产乙醇梭菌。
12.根据前述权利要求的任一项的细胞,其中所述高级醇选自1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-辛醇、1-戊醇、1-庚醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇、4-甲基-1-戊醇、5-甲基-1-己醇、6-甲基-1-庚醇以及它们的组合。
13.生产至少一种高级醇的方法,该方法包括
- 使根据权利要求1-12的任一项的重组微生物细胞与包含碳源的培养基接触。
14.根据权利要求13的方法,其中所述碳源包含CO和/或CO2。
15.根据权利要求1-12的任一项的细胞用于生产至少一种高级醇的用途。
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