CN109477121A

CN109477121A - 丙醇和/或丙酸的生物技术生产

Info

Publication number: CN109477121A
Application number: CN201780046015.3A
Authority: CN
Inventors: T.哈斯; S.贝克; A.黑克尔
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2016-05-27
Filing date: 2017-05-24
Publication date: 2019-03-15
Also published as: WO2017202975A1; EP3464603A1; EP3464603B1; US20200231994A1; ES2786976T3

Abstract

本发明涉及一种生产丙醇和/或丙酸的方法，所述方法包括：(b)使至少一种产C3微生物与二氧化碳和与包含乙醇和乙酸盐的水性介质接触；其中乙酸盐以至少大约1g/L的浓度保持在水性介质中。

Description

丙醇和/或丙酸的生物技术生产

发明领域

本发明涉及用于生产丙醇和/或丙酸的生物技术方法。该方法特别可在乙酸盐和产C3微生物（propionogen）存在下使用乙醇作为原材料。

发明背景

丙醇是在制药工业中用于树脂和纤维素酯等化合物的溶剂。更好地称为异丙醇或异丙基醇的这种溶剂在印刷墨和印刷工业中广泛使用。1-丙醇在自然界中通过有机材料被各种微生物分解来产生，并可在植物和杂醇油中发现。1-丙醇也可由石油化学衍生的乙烯通过与一氧化碳和氢气反应产生丙醛、然后将其氢化来产生。其也是甲醇制造的副产物并可直接由丙烷或由丙烯醛生产。

丙醇具有其它潜在用途。丙醇的重要用途之一在于其容易脱水以产生丙烯，丙烯是世界上最大的化工商品之一。例如，异丙醇（IPA）目前使用丙烯生产。特别地，通过使用石油化学衍生的前体的两种方法之一：(1) 两步（间接）法，在此期间将丙烯氢化，然后使用酸和水水解，或(2) 一步（直接）法，在此期间使用酸催化剂将丙烯氢化。IPA是用于化学工业的更重要溶剂之一。其也是重要的化学中间体。其是清洁剂、消毒剂、室内喷雾剂、清漆和稀释剂、胶粘剂、药品、化妆品和盥洗用品的组分。其也用作萃取剂和脱水剂。IPA也用作汽油添加剂，以溶解燃料管道和燃料箱中的水和冰，由此防止水积聚在燃料管道中并在低温下冻结。

异丙醇和丙烯的全球需求量以每年大约3%的速率持续增长。由于当前生产异丙醇和丙烯的方法主要由石油制造，这些化合物的成本会基于石油的成本。这些化合物也通过裂化汽油或石油获得，这对环境有害。因此，需要对石油基生产方法的环保和生物基替代方案，其是由可再生生物质通过发酵生产IPA。但是，为了可行和在当前的石油化学IPA市场中胜出，用于生产IPA的发酵法必须成本有效。

发明描述

本发明提供在乙酸盐存在下由乙醇生产丙醇、丙酸和/或其衍生物的生物技术手段。特别地，乙酸盐可以以至少1g/L的浓度存在于包含产C3微生物和乙醇的介质中。更特别地，该反应也可以包括加入二氧化碳。

在本发明的一个方面中，提供一种生产丙醇和/或丙酸的方法，所述方法包括步骤

(b) 使至少一种产C3微生物与二氧化碳和与包含乙醇和乙酸盐的水性介质接触；

其中乙酸盐以至少大约1 g/L的浓度保持在该水性介质中。

乙酸盐在包含产C3微生物的水性介质中的存在提高了由乙醇形成丙醇和/或丙酸的选择性。因此，形成较少的副产物，如乳酸盐和/或丁酸盐。因此原材料的浪费较少，以使该丙醇和/或丙酸生产是最成本有效的方法。收率因此可以较高和/或可以在较短时期获得较高收率。此外，可以容易提取所需产物 - 丙醇和/或丙酸，而没有复杂的提纯步骤。这进一步节省成本和时间。

能将乙酸盐和/或乙醇转化成丙醇和/或丙酸的微生物可以是指能够实施丙醇和/或丙酸的发酵生产的任何微生物。这种微生物可以是产C3微生物。产C3微生物是生产C3的微生物。特别地，产C3微生物是指能将合成气中间体，如乙醇和乙酸盐转化成丙酸和丙醇的任何微生物。术语“产C3微生物”或“生产C3的微生物”是指在与底物接触时将底物转化成丙醇和/或丙酸的微生物。这些微生物可在细胞内和/或细胞外产生适当的酶。这些生产丙醇和/或丙酸的微生物能够利用可能是废料的原材料进行丙醇和/或丙酸发酵。例如，合成气和衍生自合成气的乙醇和/或乙酸盐可用于丙醇和/或丙酸生产。这特别有利，因为可利用原本被视为废料的廉价原材料。这也能够除去废料，因此降低环境污染。在一个实例中，根据本发明的任何方面的产C3微生物可至少使用甲基丙二酰-琥珀酸途径或乳酸-丙烯酸途径由乙酸盐和/或醇生产丙酸。

特别地，根据本发明的任何方面使用的产C3微生物可选自丙酸梭菌（Clostridium neopropionicum）、丙酸梭菌（Clostridium propionicum）、丙酸粘土杆菌（Pelobacter propionicus）、丙酸脱硫葱状菌（Desulfobulbus propionicus）、沃氏互营杆菌 （Syntrophobacter wolinii）、Syntrophobacter pfennigii、Syntrophobacter fumaroxidans、Syntrophobacter sulfatireducens、Smithella propionica、热苯脱硫肠 状菌（Desulfotomaculum thermobenzoicum）亚种thermosyntrophicum、Pelotomaculum thermopropionicum和Pelotomaculum schinkii。更特别地，根据本发明的任何方面使用的产C3微生物可以是丙酸梭菌（Clostridium neopropionicum）。

在一个实例中，产C3微生物可以是可基因修饰的任何真核或原核微生物。更特别地，第三微生物可以是选自埃希氏杆菌属（Escherichia sp.）、欧文氏菌属（Erwinia sp.）、沙雷氏菌属（Serratia sp.）、Providencia sp.、棒状杆菌属（Corynebacteria sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、钩端螺旋体属（Leptospira sp.）、沙门氏菌属（Salmonellar sp.）、短杆菌属（Brevibacteria sp.）、Hypomononas sp.、色杆菌属（Chromobacterium sp.）、诺卡氏菌属（Norcardia sp.）、真菌和酵母的菌株。再更特别地，第三微生物可选自埃希氏杆菌属（Escherichia sp.）。例如，根据本发明的任何方面的第三微生物可以是大肠杆 菌（Escherichia coli.）。第三微生物可以是包含相对于野生型细胞提高的丙酸CoA-转移酶(AJ276553) (E₁)、乳酰-CoA脱水酶(JN244651-3) (E₂)和丙烯酰-CoA还原酶(JN244654-6) (E₃)的表达的基因修饰生物体。Kandasamy V. (2013)公开了生产遗传生物体本身的方法。Kandasamy V.也公开了测量酶E₁、E₂和E₃的表达以测定这些酶的任一种是否具有相对于野生型细胞提高的表达的方法。

根据本发明的任何方面，外源生产乙醇和乙酸盐。这意味着根据本发明的任何方面使用的产C3微生物不能自己生产乙醇和/或乙酸盐。特别地，包含产C3微生物的水性介质在产C3微生物开始生产丙醇和/或丙酸之前已包含乙酸盐和/或乙醇。更特别地，乙醇可在碳源，如二氧化碳和/或一氧化碳存在下用作原材料，以通过产C3微生物进一步在乙酸盐存在下生产丙醇和/或丙酸。乙酸盐在丙醇和/或丙酸的生产中可不耗尽。特别地，乙酸盐可用于改进通过产C3微生物生产丙醇和/或丙酸的选择性。因此可保持乙酸盐在反应混合物中的存在，以促进产生丙醇和/或丙酸而非副产物。

不同于等待细胞产生内源性乙酸盐，外源生产的乙酸盐和/或乙醇可在步骤(b)中一开始存在于水性介质中。特别地，本文所用的术语“外源生产的”乙酸盐和/或乙醇是指在接触产C3微生物之前在单独的反应容器中生产或提纯的乙酸盐或乙醇，而非在步骤(a)中，即在步骤(b)之前产生的乙酸盐和/或乙醇。在另一实例中，术语“外源生产的”乙酸盐和/或乙醇包含在步骤(b)中与产C3微生物接触之前由产乙酸菌细胞产生的乙酸盐和/或乙醇。在一个实例中，从反应容器中取出乙酸盐和/或乙醇，然后在第二反应容器中与产C3微生物接触。在另一实例中，产C3微生物和产乙酸细胞在同一反应容器中。乙酸盐和/或乙醇可由与至少一种碳源接触的产乙酸细胞产生。在这种外源性乙酸盐存在下，产C3微生物可将外源生产的乙醇转化成丙醇和/或丙酸。更特别地，外源生产的乙酸盐和/或乙醇在水性介质中的浓度可保持在一开始存在的值或值范围，只要在步骤b)中由产C3微生物催化的反应继续。再更特别地，在水性介质中的乙酸盐和/或乙醇整体被视为外源的，只要该水性介质中存在的总乙酸盐和/或乙醇的多于80，特别是多于90%由外源生产的乙酸盐和/或乙醇形成。

本文所用的术语“乙酸盐”是指乙酸及其盐（CH₃-COO-），其如本领域中已知由于微生物在水性环境中工作而不可避免地产生，并且在存在的盐和酸之间始终存在平衡。分子乙酸与乙酸盐的比率取决于该体系的pH，即在恒定的“乙酸盐”浓度下，pH越低，相对于乙酸盐计的分子乙酸浓度越高。

根据本发明的任何方面的水性介质中的乙酸盐浓度是至关重要的方面。根据本发明的任何方面使用的水性介质中的乙酸盐浓度可保持在所提到的特定浓度下。特别地，水性介质中的乙酸盐浓度可为至少大约1g/L。可在水性介质中保持这一浓度。在一个实例中，乙酸盐浓度可以至少基本保持在上文提到的浓度，例如至少高于0.0g/L和等于或高于大约1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L、5.5g/L、6g/L、6.5g/L、7g/L、7.5g/L、8g/L、8.5g/L、9g/L、9.5g/L、10g/L等等。特别地，水性介质中的乙酸盐浓度可保持在1g/L至10g/L之间。更特别地，水性介质中的乙酸盐浓度保持在1.5g/L至7g/L之间。再更特别地，水性介质中的乙酸盐浓度可保持在大约2g/L。

本文所用的术语“大约”是指在20%内的变化。特别地，本文所用的术语“大约”是指给定量度或值的+/- 20%，更特别+/-10%，再更特别+/- 5%。

技术人员将能够通过本领域中已知的方法使乙酸盐浓度保持在所需水平。特别地，技术人员将定期测量水性介质中的乙酸盐浓度，并相应地通过将更高或更低浓度的乙酸盐添加到该介质中而调节乙酸盐浓度。在一个实例中，可以使用NMR测量乙酸盐。特别地，可以使用半定量¹H-NMR波谱法测量乙酸盐浓度。作为量化内标，可以使用三甲基甲硅烷基丙酸钠（T(M)SP）。在另一实例中，可以使用来自R-Biopharm的酶试剂盒（商品号:10148261035）依据制造商的指示测量乙酸盐的浓度。在一个实例中，可以在与水性介质的连续进料分开的连续流中将乙酸盐添加到水性介质中。在另一实例中，乙酸盐可以是补充的培养基的一部分。特别地，乙酸盐可作为营养进料的一部分或单独地供入水性介质。无论采用哪种途径将乙酸盐供入水性介质，技术人员会理解保持水性介质中的乙酸盐浓度的方法。在一个实例中，可通过每发酵大约20小时补充乙酸盐来保持该介质中的乙酸盐浓度。在另一实例中，可以从培养和/或发酵过程开始每大约5、10、15、20、25、30小时进行该介质中的乙酸盐的补充。在另一实例中，不一定需要补充乙酸盐，因为乙酸盐在生产丙醇和/或丙酸的方法中可能没有用掉。

在一个实例中，水性介质中的乙酸盐浓度可对于反应期的80%而言保持在根据本发明的任何方面使用的任何浓度。在另一实例中，可对于反应时间的50%、55%、60%、65%、70%、75%、85%、90%、95%或100%而言保持乙酸盐浓度。在这方面，“反应时间”是指工艺进行的时期。特别地，反应时间是指从反应开始到反应结束和/或完成，即底物耗尽的时期。在一个实例中，底物可以是乙醇和二氧化碳，并在发酵器中的乙醇耗尽且反应停止且没有将追加的乙醇和二氧化碳供入发酵器时，该反应完成。因此，反应时间是指从发酵开始（即乙醇和二氧化碳在发酵器中在合适的发酵条件中最初与至少一种产C3微生物接触时）到发酵结束（即在发酵器中不再有乙醇和二氧化碳时和/或在发酵器中有另一限制因素阻止反应继续时）的时期。在一个实例中，反应期可以为24小时、42小时、72小时、96小时等等。在另一实例中，反应期可以为90、91、92、93、94、95、97等小时。

在步骤(b)后来自该混合物的乙酸盐可以再循环。特别地，这意味着允许由步骤(b)形成的丙醇和/或丙酸蓄积，然后通过本领域中已知的方法分离。乙酸盐因此可以保持在反应混合物中并再循环。由步骤(b)形成的丙醇和/或丙酸可以分批模式或以连续模式取出。在后一情况下，通过本领域中已知的分离步骤连续取出形成的丙醇和/或丙酸。

本领域技术人员熟悉可用于从包含乙酸盐和/或乙醇的水性介质中分离丙醇和/或丙酸的方法。例如，可以使用疏水有机溶剂、蒸馏等进行提取。技术人员可以容易地通过简单试错法确定提取丙醇和/或丙酸的最合适手段。特别地，该方法可包括Keshav, A.,2009和Galaction, A.-I, 2012中公开的方法。

根据本发明的任何方面的方法可包括用于生产乙醇和/或乙酸盐的在先步骤。乙醇和/或乙酸盐可通过本领域中已知的任何手段生产，以将这两种化合物外源引入至少一种用于生产丙醇和/或丙酸的产C3微生物。特别地，生物技术方法可用于生产乙醇和/或乙酸盐。更特别地，乙醇和/或乙酸盐可通过(a) 使至少一种产乙酸菌与碳源接触来产生。碳源可包含二氧化碳和/或一氧化碳。

特别地，作为包含二氧化碳和/或一氧化碳的底物源，技术人员会理解，存在许多可能的用于提供CO和/或CO₂作为碳源的来源。可以看出，在实践中，作为本发明的碳源，可以使用能为微生物供应足量碳的任何气体或任何气体混合物，以可由CO和/或CO₂源形成乙酸盐和/或乙醇。

通常对本发明的细胞（其是指根据本发明的任何方面的任何微生物）而言，碳源包含至少50重量%、至少70重量%，特别是至少90重量%的CO₂和/或CO，其中按重量%计的百分比相对于可供根据本发明的任何方面的细胞获得的所有碳源计。可以提供碳材料源。

气体形式的碳源的实例包括由酵母发酵或梭菌发酵产生的废气，如合成气、烟道气和石油炼厂气。这些废气由含纤维素的材料的气化或煤的气化形成。在一个实例中，这些废气不一定作为其它工艺的副产物产生，而是可以专门生产以与本发明的混合培养物一起使用。

根据本发明的任何方面，碳源可以是合成气。合成气可以例如作为煤的气化的副产物产生。相应地，根据本发明的任何方面的微生物能将作为废品的物质转化成有价值的资源。

在另一实例中，合成气可以是广泛可得的低成本农业原料的气化副产物，以与本发明的混合培养物一起使用以生产取代和未取代的有机化合物。

可转化成合成气的原料有许多实例，因为几乎所有形式的植物都可用于此用途。特别地，原料选自多年生草，如芒草、玉米残渣，加工废料，如锯屑等。

一般而言，合成气可在干燥生物质的气化装置中主要通过热解、部分氧化和蒸汽重整获得，其中合成气的主要产物是CO、H₂和CO₂。合成气也可能是电解的产物。特别地，合成气可能是CO₂和/或水的电解产物。技术人员会理解进行CO₂和/或水的电解以产生所需量的包含CO和/或H₂的合成气的合适条件。

通常，首先加工获自气化工艺的合成气的一部分，以优化产物收率和避免形成焦油。合成气中的不想要的焦油和CO的裂化可以使用石灰和/或白云石进行。这些方法详细描述在例如Reed, 1981中。

可以使用来源的混合物作为碳源。根据本发明的任何方面，还原剂，例如氢气可与碳源一起供应。特别地，可以在供应和/或使用C和/或CO₂时供应这种氢气。在一个实例中，氢气是根据本发明的任何方面存在的合成气的一部分。在另一实例中，如果合成气中的氢气对本发明的方法而言不足，可以供应附加的氢气。

本文所用的术语“产乙酸菌”是指能够执行Wood-Ljungdahl通路并因此能将CO、CO₂和/或氢气转化成乙酸盐的微生物。这些微生物包括在它们的野生型形式下没有Wood-Ljungdahl通路但由于基因修饰而获得这一性状的微生物。这样的微生物包括但不限于大肠杆菌细胞。这些微生物也可被称作一氧化碳营养菌。目前，21种不同属的产乙酸菌是本领域中已知的（Drake等人, 2006），这些也可包括一些梭菌（Drake & Kusel, 2005）。这些细菌能够与作为能源的氢气一起使用二氧化碳或一氧化碳作为碳源（Wood, 1991）。此外，醇、醛、羧酸以及许多己糖也可用作碳源（Drake等人, 2004）。导致形成乙酸盐的还原通路被称作乙酰基-CoA或Wood-Ljungdahl通路。

特别地，产乙酸菌可选自诺泰拉厌氧醋菌（Acetoanaerobium notera）（ATCC 35199）、长醋丝菌（Acetonema longum）（DSM 6540）、甲醇醋酸杆菌（Acetobacterium carbinolicum）（DSM 2925）、苹果酸醋酸杆菌（Acetobacterium malicum）（DSM 4132）、醋酸 杆菌种no. 446（Morinaga等人, 1990, J. Biotechnol., 第14卷, 第187-194页）、威氏醋 酸杆菌（Acetobacterium wieringae）（DSM 1911）、Acetobacterium woodii（DSM 1030）、 Alkalibaculum bacchi（DSM 22112）、Archaeoglobus fulgidus（DSM 4304）、Blautia producta（DSM 2950，前称Ruminococcus productus，前称产生消化链球菌 （Peptostreptococcus productus））、食甲基丁酸杆菌（Butyribacterium methylotrophicum）（DSM 3468）、醋酸梭菌（Clostridium aceticum）（DSM 1496）、 Clostridium autoethanogenum（DSM 10061、DSM 19630和DSM 23693）、Clostridium carboxidivorans（DSM 15243）、Clostridium coskatii（ATCC no. PTA-10522）、 Clostridium drakei（ATCC BA-623）、蚁酸醋酸梭菌（Clostridium formicoaceticum）（DSM 92）、乙二醇梭菌（Clostridium glycolicum）（DSM 1288）、扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）（DSM 13528）、扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii） C-01（ATCC 55988）、扬 氏梭菌（Clostridium ljungdahlii） ERI-2（ATCC 55380）、扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii） O-52（ATCC 55989）、Clostridium mayombei（DSM 6539）、Clostridium methoxybenzovorans（DSM 12182）、Clostridium ragsdalei（DSM 15248）、Clostridium scatologenes（DSM 757）、梭菌种ATCC 29797（Schmidt等人, 1986, Chem. Eng. Commun., 第45卷, 第61-73页）、Desulfotomaculum kuznetsovii（DSM 6115）、Desulfotomaculum thermobezoicum亚种thermosyntrophicum（DSM 14055）、粘液真杆菌（Eubacterium limosum）（DSM 20543）、噬乙酸甲烷八叠球菌（Methanosarcina acetivorans） C2A（DSM 2834）、穆尔氏菌属（Moorella sp.）HUC22-1（Sakai等人, 2004）、热醋穆尔氏菌属 （Moorella thermoacetica）（DSM 521，前称Clostridium thermoaceticum）、热自养穆尔氏 菌属（Moorella thermoautotrophica）（DSM 1974）、普氏产醋杆菌（Oxobacter pfennigii） （DSM 322）、Sporomusa aerivorans（DSM 13326）、Sporomusa ovata（DSM 2662）、Sporomusa silvacetica（DSM 10669）、Sporomusa sphaeroides（DSM 2875）、Sporomusa termitida （DSM 4440）和凯伍热厌氧菌（Thermoanaerobacter kivui）（DSM 2030，前称凯伍产醋菌 （Acetogenium kivui））。更特别地，可以使用Clostridium carboxidivorans的菌株ATCCBAA-624。再更特别地，可以使用如例如U.S. 2007/0275447和U.S. 2008/0057554中描述的Clostridium carboxidivorans的标作“P7”和“P11”的菌株。

另一特别合适的细菌可以是扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）。特别地，选自扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）PETC、扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）ERI2、扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）COL和扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）O-52的菌株可用于将合成气转化成己酸。这些菌株例如描述在WO 98/00558、WO 00/68407、ATCC49587、ATCC 55988和ATCC 55989中。根据本发明的任何方面使用的第一和第二产乙酸菌可以是相同或不同细菌。例如，在一个反应混合物中，第一产乙酸菌可以是在对数生长期的扬 氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）且第二产乙酸菌可以是在静止期的扬氏梭菌 （Clostridium ljungdahlii）。在另一实例中，在反应混合物中，第一产乙酸菌可以是在对数生长期的扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）且第二产乙酸菌可以是在静止期的Clostridium carboxidivorans。

在根据本发明的任何方面的反应混合物中，可能存在氧气（即，使用需氧条件）。可以有利地在反应混合物和/或供往反应混合物的气流中并入O₂，因为大多数废气，包括合成气包含少量或大量的氧气。在使用合成气作为用于生产高级醇的碳源之前除去这种氧气是困难和昂贵的。根据本发明的任何方面的方法使得能够生产至少一种高级醇而不需要首先从碳源中除去任何痕量氧气。这能够节省时间和金钱。

本文所用的术语“接触”是指在步骤(a)中在根据本发明的任何方面的细胞和包含碳源的介质之间的直接接触、和/或在步骤(b)中在产C3微生物和来自步骤(a)的乙酸盐和/或乙醇之间的直接接触。例如，细胞和包含碳源的介质在步骤(a)中可在不同隔室中。特别地，碳源可为气态并添加到包含根据本发明的任何方面的细胞的介质中。

特别地，该水性介质可包含细胞和含CO和/或CO₂的碳源以进行步骤(a)。更特别地，包含CO和/或CO₂的碳源在连续气流中供往包含细胞的水性介质。再更特别地，该连续气流包含合成气。这些气体可以例如使用通入水性介质的喷嘴、玻璃料（frits）、在向水性介质中供应气体的管道内的膜等供应。

本发明的方法的总效率、醇生产率和/或总碳捕获可依赖于连续气流中的CO₂、CO和H₂的化学计量学。施加的连续气流可由CO₂和H₂组成。特别地，在连续气流中，CO₂的浓度范围可为大约10–50%，特别是3重量%且H₂在44%至84%，特别是64至66.04重量%内。在另一实例中，该连续气流还可包含惰性气体，如N₂，最多50重量%的N₂浓度。

根据本发明的任何方面，产C3微生物和/或产乙酸菌可以是基因修饰微生物。基因修饰的细胞或微生物可在基因方面不同于野生型细胞或微生物。根据本发明的任何方面的基因修饰微生物和野生型微生物之间的基因差异可能是在野生型微生物中不存在的完整基因、氨基酸、核苷酸等存在于基因修饰微生物中。在一个实例中，根据本发明的任何方面的基因修饰微生物可包含能使该微生物产生丙醇和/或丙酸的酶。相对于根据本发明的任何方面的基因修饰微生物的野生型微生物可能没有或没有可检出的能使基因修饰微生物产生丙醇和/或丙酸的酶的活性。本文所用的术语“基因修饰微生物”与术语“基因修饰细胞”可互换使用。可对微生物的细胞进行根据本发明的任何方面的基因修饰。

本文与细胞或微生物一起使用的术语“野生型”可能是指具有如在野生状态下天然所见的形式的基因组构成的细胞。该术语可适用于整个细胞和独立基因两者。术语“野生型”因此不包括其中已人为使用重组法至少部分改变基因序列的此类细胞或此类基因。

技术人员能够使用本领域中已知的用于基因修饰细胞或微生物的任何方法。根据本发明的任何方面，基因修饰细胞可以是基因修饰的，以使得在特定时间间隔内，在2小时内，特别在8小时或24小时内，其形成野生型细胞的至少两倍，尤其至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10000倍的丙醇和/或丙酸。可以例如通过在合适的营养培养基中在相同条件（相同细胞密度、相同营养培养基、相同培养条件）下各自分开培养根据本发明的任何方面的细胞和野生型细胞特定时间间隔、然后测定营养培养基中的目标产物（丙醇和/或丙酸）量来测定产物形成的增加。

本文所用的术语“提高的酶活性”应被理解为提高的细胞内活性。基本上，可以通过增加编码该酶的一个基因序列或多个基因序列的拷贝数、使用强启动子或使用编码具有提高的活性的相应酶的基因或等位基因，和任选通过组合这些措施，实现酶活性的提高。用于根据本发明的方法的基因修饰细胞例如通过用含有所需基因、这种基因的等位基因或其部分的载体和使该基因的表达成为可能的载体转化、转导、缀合或这些方法的组合产生。特别通过基因或等位基因整合在细胞的染色体中或染色体外复制载体，实现异源表达。类似地，降低的酶活性是指降低的细胞内活性。在一个实例中，根据本发明的任何方面的酶的提高的表达可比野生型细胞中的酶表达多5、10、15、20、25、30、25、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%。类似地，根据本发明的任何方面的酶的降低的表达可比野生型细胞中的酶表达少5、10、15、20、25、30、25、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%。

所用培养基必须适合于特定菌株的要求。在"Manual of Methods for GeneralBacteriology"中给出用于各种微生物的培养基的描述。

除非另行规定，所有百分比(%)为质量%。

技术人员会理解进行根据本发明的任何方面的方法所必需的其它条件。特别地，可以根据所用的产乙酸菌和/或产C3微生物改变容器（例如发酵器）中的条件。为适合于微生物的最佳运作而改变条件在技术人员的知识内。

在一个实例中，根据本发明的任何方面的方法可在pH为5至8、5.5至7的水性介质中进行。压力可在1至10巴之间。

技术人员会理解，可能必须监测料流的组成和流速。可以通过改变成分料流的比例，实现料流组成的控制以实现目标或合意的组成。可以通过本领域中已知的任何手段监测料流的组成和流速。在一个实例中，该体系适合于连续监测料流的流速和组成并将它们组合以产生在具有最佳组成的连续气流中的单个共混底物料流，和将该优化的底物料流送往根据本发明的任何方面的细胞的手段。

将CO₂和/或CO转化成乙酸盐和/或乙醇，特别是乙酸盐的微生物以及用于进行这种代谢反应的适当程序和工艺条件是本领域众所周知的。此类方法例如描述在WO9800558、WO2000014052和WO2010115054中。

术语“水溶液”或“培养基”包含可用于使根据本发明的任何方面的细胞至少暂时保持代谢活性和/或存活状态并包含（如果必要）任何附加底物的任何含水溶液（主要以水作为溶剂）。本领域技术人员熟悉可用于保存本发明的细胞的许多水溶液（常称作培养基）的制备，例如在大肠杆菌的情况下可使用LB培养基，在扬氏梭菌（C. ljungdahlii）的情况下可使用ATCC1754培养基。有利地使用基本培养基，即仅含使细胞保持代谢活性和/或存活状态必不可少的盐和营养素的最小集合的合理简单组成的培养基而非复合培养基作为水溶液，以避免产物不必要地被不想要的副产物污染。例如，可以使用M9培养基作为基本培养基。细胞用碳源培养足够久以产生所需产物、3HB及其变体。例如至少1、2、4、5、10或20小时。所选温度必须使得根据本发明的任何方面的细胞保持催化能力和/或代谢活性，在该细胞是扬氏梭菌（C. ljungdahlii）细胞的情况下例如10至42℃，优选30至40℃，特别是32至38℃。

在一个实例中，步骤(a)和(b)可在单个容器中进行。这允许丙醇和/或丙酸蓄积并使用较少培养基，以使该方法更成本有效。由步骤(a)产生的乙醇可用于生产丙醇和/或丙酸，并且由步骤(a)产生的乙酸盐可用于改进该反应的选择性。

在另一实例中，步骤(a)和步骤(b)可在两个不同的容器中进行。在一个实例中，步骤(a)可在发酵器1中进行，其中产乙酸菌与碳源接触以产生乙酸盐和/或乙醇。乙醇和/或乙酸盐可随后在发酵器2中与产C3微生物接触以产生丙醇和/或丙酸。随后可提取丙醇和/或丙酸并将剩余碳底物送回发酵器1。可以建立一个循环，其中在发酵器1中产生的乙酸盐和/或乙醇可定期供入发酵器2，乙醇在发酵器2中可转化成丙醇和/或丙酸并将在发酵器2中未反应的碳源送回发酵器1。

在一个实例中，产乙酸菌可存在于第一发酵器中且产C3微生物存在于第二发酵器中。在发酵器1中，产乙酸菌与碳源接触以产生乙酸盐和/或乙醇。乙醇和/或乙酸盐可随后在发酵器2中与产C3微生物接触以产生至少丙醇和/或丙酸。可以建立一个循环，其中在发酵器1中产生的乙酸盐和/或乙醇可定期供入发酵器2，乙酸盐和/或乙醇在发酵器2中可转化成至少丙醇和/或丙酸。可将氧气添加到发酵器2中以使产C3微生物能将乙酸盐转化成至少一种丙醇和/或丙酸。

类似地，在发酵器1中，产乙酸菌可与包含CO的碳源接触以产生乙酸盐和/或乙醇。乙醇和/或乙酸盐可随后在发酵器2中与产C3微生物接触以产生丙醇和/或丙酸。可以建立一个循环，其中在发酵器1中产生的乙酸盐和/或乙醇可定期供入发酵器2，乙酸盐和/或乙醇在发酵器2中可转化成丙醇和/或丙酸。供入发酵器1的CO可与乙酸盐和/或乙醇一起转移到发酵器2中。在这两个发酵器之间不需要特殊提取方法。

在另一实例中，培养基在发酵器1和2之间再循环。因此，可将在发酵器2中产生的丙醇和/或丙酸送回发酵器1以蓄积根据本发明的任何方面在发酵器中产生的丙醇、丙酸和/或其衍生物。

实施例

上文描述了优选实施方案，其如本领域技术人员理解，可在设计、构造或操作上作出变动或修改而不背离权利要求书的范围。例如，这些变动意在被权利要求书的范围涵盖。

实施例1

在乙酸盐上用丙酸梭菌（Clostridium neopropionicum）生产丙酸和丙醇

为了将乙醇和二氧化碳生物转化成丙酸和丙醇，细菌丙酸梭菌（Clostridium neopropionicum）在含乙醇、乙酸盐的矿物培养基和含二氧化碳的气氛中培养。所有培养步骤在可用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中在厌氧条件下进行。

对于C. neopropionicum的第一次预培养，2 x 100 ml DSMZ318培养基（pH 7.4；0.61 g/l NaCl、0.047 g/l MgCl₂、0.30 g/l KH₂PO₄、1.00 g/l NH₄Cl、0.081 g/l CaCl₂ x2 H₂O、0.5 g/l酵母提取物、0.5 g/l BBL胰酪蛋白胨、4 g/L KHCO₃、1.026 g/L乙醇、0.5mg/l刃天青、128 mg/L次氮基三乙酸、135 mg/L FeCl₃ x 6 H₂O、1 mg/L MnCl₂ x 4 H₂O、0.24 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O、1 mg/L ZnCl₂、0.25 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O、0.1 mg/L H₃BO₃、0.24 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O、1.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O、0.26 mg/L Na₂SeO₃ x 5 H₂O、0.02mg/L生物素、0.02 mg/L叶酸、0.1 mg/L吡哆醇-HCl、0.05 mg/L硫胺素-HCl x H₂O、0.05mg/L核黄素、0.05 mg/L烟酸、0.05 mg/L D-泛酸钙、1 µg/L维生素B12、0.05 mg/L对氨基苯甲酸盐/酯、0.05 mg/L硫辛酸、0.25 g/L半胱氨酸-HCl x H₂O）在250毫升瓶中接种5毫升冷冻的低温培养物（frozen cryoculture）并用含67% H₂、33% CO₂的预混气体吹扫至0.8巴的超压。培养物在开放水浴摇振器中在30℃和100 rpm下培养24小时直至OD_600nm >0.15。

对于C. neopropionicum的第二次预培养，3 x 200毫升新鲜DSMZ318培养基在500毫升瓶中接种来自第一次预培养的离心细胞至0.03的OD_600nm并用含67% H₂、33% CO₂的预混气体吹扫至0.8巴的超压。这一生长的培养物在开放水浴摇振器中在30℃和100 rpm下培养22小时直至OD_600nm >0.23。

对于主培养，将0.2的OD_600nm所需的量的来自C. neopropionicum的第二次预培养的离心细胞与另外1.39 g/L乙酸钠一起添加到200毫升新鲜LM33矿物培养基（pH = 6.8、10g/L乙醇、1 g/L NaOH、0.5 g/L MgCl₂、0.21 g/L NaCl、0.135 g/L CaCl₂ X 2H₂O、2.65 g/LNaH₂PO₄X 2H₂O、0.5 g/L KCl、2.5 g/L NH₄Cl、15 mg/L次氮基三乙酸、30 mg/L MgSO₄ x 7H₂O、5 mg/L MnSO₄ x H₂O、1 mg/L FeSO₄ x 7 H₂O、8 mg/L Fe(SO₄)₂(NH₄)₂ x 6 H₂O、2 mg/LCoCl₂ x 6 H₂O、2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O、200 µg/L CuCl₂ x 2 H₂O、200 µg/L KAl(SO₄)₂ x12 H₂O、3 mg/L H₃BO₃、300 µg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O、200 µg/L Na₂SeO₃、200 µg/L NiCl₂ x 6H₂O、200 µg/L Na₂WO₄ x 6 H₂O、200 µg/L d-生物素、200 µg/L叶酸、100 µg/L吡哆醇-HCl、500 µg/L硫胺素-HCl；500 µg/L核黄素；500 µg/L烟酸；500 µg/L泛酸钙；500 µg/L维生素B₁₂；500 µg/L对氨基苯甲酸盐/酯；500 µg/L硫辛酸、10 mg/L FeCl₃，用含67% H₂和33% CO₂的预混气体充气30分钟）中。该培养在500毫升耐压玻璃瓶中在开放水浴摇振器中在30℃、100 rpm和含67% H₂、33% CO₂的预混气体的0.8巴超压下进行113小时。通过自动添加NaOH溶液（100 g/L）使pH保持在6.8。

在培养过程中，取几个5毫升样品以测定OD_600nm、pH和产物形成。通过半定量¹H-NMR波谱法进行产物浓度的测定。作为量化内标，使用三甲基甲硅烷基丙酸钠（T(M)SP）。

在培养过程中，丙酸盐浓度从0.05 g/L提高到3.20 g/L、丙醇从0.01提高到0.26g/L、丁酸盐从0.01提高到0.33 g/L且乳酸盐从0.00 g/L提高到0.13 g/L。乙醇浓度在此期间从10.1 g/L降至5.2 g/L。丙酸盐/丙醇形成的选择性为大约88.0%。

实施例2

为了将乙醇和二氧化碳生物转化成丙酸和丙醇，细菌丙酸梭菌（Clostridium neopropionicum）在含乙醇、乙酸盐的矿物培养基和含二氧化碳的气氛中培养。所有培养步骤在可用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中在厌氧条件下进行。

对于C. neopropionicum的第一次预培养，2 x 100 ml DSMZ318培养基（pH 7.4；0.61 g/l NaCl、0.047 g/l MgCl₂、0.30 g/l KH₂PO₄、1.00 g/l NH₄Cl、0.081 g/l CaCl₂ x2 H₂O、0.5 g/l酵母提取物、0.5 g/l BBL胰酪蛋白胨、4 g/L KHCO₃、1.026 g/L乙醇、0.5mg/l刃天青、128 mg/L次氮基三乙酸、135 mg/L FeCl₃ x 6 H₂O、1 mg/L MnCl₂ x 4 H₂O、0.24 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O、1 mg/L ZnCl₂、0.25 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O、0.1 mg/L H₃BO₃、0.24 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O、1.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O、0.26 mg/L Na₂SeO₃ x 5 H₂O、0.02mg/L生物素、0.02 mg/L叶酸、0.1 mg/L吡哆醇-HCl、0.05 mg/L硫胺素-HCl x H₂O、0.05mg/L核黄素、0.05 mg/L烟酸、0.05 mg/L D-泛酸钙、1 µg/L维生素B12、0.05 mg/L对氨基苯甲酸盐/酯、0.05 mg/L硫辛酸、0.25 g/L半胱氨酸-HCl x H₂O）在250毫升瓶中接种5毫升冷冻的低温培养物并用含67% H₂、33% CO₂的预混气体吹扫至0.8巴的超压。培养物在开放水浴摇振器中在30℃和100 rpm下培养24小时直至OD_600nm >0.15。

对于主培养，将0.2的OD_600nm所需的量的来自C. neopropionicum的第二次预培养的离心细胞与另外6.95 g/L乙酸钠一起添加到200毫升新鲜LM33矿物培养基（pH = 6.8、10g/L乙醇、1 g/L NaOH、0.5 g/L MgCl₂、0.21 g/L NaCl、0.135 g/L CaCl₂ X 2H₂O、2.65 g/LNaH₂PO₄X 2H₂O、0.5 g/L KCl、2.5 g/L NH₄Cl、15 mg/L次氮基三乙酸、30 mg/L MgSO₄ x 7H₂O、5 mg/L MnSO₄ x H₂O、1 mg/L FeSO₄ x 7 H₂O、8 mg/L Fe(SO₄)₂(NH₄)₂ x 6 H₂O、2 mg/LCoCl₂ x 6 H₂O、2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O、200 µg/L CuCl₂ x 2 H₂O、200 µg/L KAl(SO₄)₂ x12 H₂O、3 mg/L H₃BO₃、300 µg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O、200 µg/L Na₂SeO₃、200 µg/L NiCl₂ x 6H₂O、200 µg/L Na₂WO₄ x 6 H₂O、200 µg/L d-生物素、200 µg/L叶酸、100 µg/L吡哆醇-HCl、500 µg/L硫胺素-HCl；500 µg/L核黄素；500 µg/L烟酸；500 µg/L泛酸钙；500 µg/L维生素B₁₂；500 µg/L对氨基苯甲酸盐/酯；500 µg/L硫辛酸、10 mg/L FeCl₃，用含67% H₂和33% CO₂的预混气体充气30分钟）中。该培养在500毫升耐压玻璃瓶中在开放水浴摇振器中在30℃、100 rpm和含67% H₂、33% CO₂的预混气体的0.8巴超压下进行113小时。通过自动添加NaOH溶液（100 g/L）使pH保持在6.8。

在培养过程中，丙酸盐浓度从0.05 g/L提高到3.35 g/L、丙醇从0.01提高到0.19g/L、丁酸盐从0.00提高到0.19 g/L且乳酸盐从0.00 g/L提高到0.16 g/L。乙醇浓度在此期间从10.0 g/L降至5.4 g/L。丙酸盐/丙醇形成的选择性为大约91.0%。

实施例3

用丙酸梭菌（Clostridium neopropionicum）生产丙酸和丙醇

为了将乙醇和二氧化碳生物转化成丙酸和丙醇，细菌丙酸梭菌（Clostridium neopropionicum）在含乙醇的矿物培养基和含二氧化碳的气氛中培养。所有培养步骤在可用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中在厌氧条件下进行。

对于主培养，将0.2的OD_600nm所需的量的来自C. neopropionicum的第二次预培养的离心细胞添加到200毫升新鲜LM33矿物培养基（pH = 6.8、10 g/L乙醇、1 g/L NaOH、0.5g/L MgCl₂、0.21 g/L NaCl、0.135 g/L CaCl₂ X 2H₂O、2.65 g/L NaH₂PO₄X 2H₂O、0.5 g/LKCl、2.5 g/L NH₄Cl、15 mg/L次氮基三乙酸、30 mg/L MgSO₄ x 7 H₂O、5 mg/L MnSO₄ x H₂O、1 mg/L FeSO₄ x 7 H₂O、8 mg/L Fe(SO₄)₂(NH₄)₂ x 6 H₂O、2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O、2 mg/LZnSO₄ x 7 H₂O、200 µg/L CuCl₂ x 2 H₂O、200 µg/L KAl(SO₄)₂ x 12 H₂O、3 mg/L H₃BO₃、300 µg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O、200 µg/L Na₂SeO₃、200 µg/L NiCl₂ x 6 H₂O、200 µg/L Na₂WO₄x 6 H₂O、200 µg/L d-生物素、200 µg/L叶酸、100 µg/L吡哆醇-HCl、500 µg/L硫胺素-HCl；500 µg/L核黄素；500 µg/L烟酸；500 µg/L泛酸钙；500 µg/L维生素B₁₂；500 µg/L对氨基苯甲酸盐/酯；500 µg/L硫辛酸、10 mg/L FeCl₃，用含67% H₂和33% CO₂的预混气体充气30分钟）中。该培养在500毫升耐压玻璃瓶中在开放水浴摇振器中在30℃、100 rpm和含67% H₂、33% CO₂的预混气体的0.8巴超压下进行113小时。通过自动添加NaOH溶液（100 g/L）使pH保持在6.8。

在培养过程中，丙酸盐浓度从0.05 g/L提高到2.45 g/L、丙醇从0.01提高到0.45g/L、丁酸盐从0.01提高到0.32 g/L且乳酸盐从0.00 g/L提高到0.13 g/L。乙醇浓度在此期间从10.5 g/L降至5.4 g/L。丙酸盐/丙醇形成的选择性为大约86.5%。

实施例4

用丙酸脱硫葱状菌（Desulfobulbus propionicus）生产丙酸盐

为了将乙醇和二氧化碳生物转化成丙酸，细菌丙酸脱硫葱状菌（Desulfobulbus propionicus）在含乙醇的培养基和含二氧化碳的气氛中培养。所有培养步骤在可用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中在厌氧条件下进行。

对于丙酸脱硫葱状菌（Desulfobulbus propionicus）的第一次预培养，50 mlDSMZ194培养基（3 g/L Na₂SO₄；0.2 g/L KH₂PO₄；0.3 g/L NH₄Cl；1 g/L NaCl；0.4 g/LMgCl₂ x 6 H₂O；0.5 g/L KCl；0.15 g/L CaCl₂ x 2 H₂O；0.5 mg/L NaOH；0.003 mg/LNa₂SeO₃ x 5 H₂O；0.004 mg/L Na₂WO₄ x 2 H₂O；1 mg/L刃天青；5 g/L NaHCO₃；1.5 g/L丙酸钠；0.4 g/L Na₂S x 9 H₂O；2.8 mg/L HCl；1.5 mg/L FeCl₂ x 4 H₂O；0.07 mg/L ZnCl₂ x 7H₂O；0.1 mg/L MnCl₂ x 4 H₂O；0.006 mg/L H₃BO₃ ；0.19 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O；0.002 mg/LCuCl₂ x 6 H₂O；0.024 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O；0.036 mg/L Na₂MO₄ x 2 H₂O；0.02 mg/L生物素；0.02 mg/L叶酸；0.1 mg/L吡哆醇-HCl；0.05 mg/L硫胺素-HCl；0.05 mg/L核黄素；0.05mg/L烟酸；0.05 mg/L D-泛酸钙；0,001 mg/L维生素B₁₂；0.05 mg/L对氨基苯甲盐/酯；0.05mg/L硫辛酸）与另外400 mg/L Na₂S和420 mg/L KOH一起用5毫升冷冻的低温储液（cryostock）接种。该培养在250毫升耐压玻璃瓶中在热柜中无摇振地在37℃和含67% N₂和33%CO₂的预混气体的0.8巴超压下进行72小时直至0.18的OD_600nm。

对于第二次预培养，含另外400 mg/L Na₂S和420 mg/L KOH的2 x 100 mlDSMZ194培养基分别用来自第一次预培养的离心细胞接种至分别0.038和0.034的OD_600nm。该培养在2 x 250毫升耐压玻璃瓶中在37℃和含67% N₂和33% CO₂的预混气体的0.8巴超压下进行47小时，一个在热柜中无摇振地进行，另一个在开放水浴摇振器中在100 rpm下进行，分别直至0.2和0.18的OD_600nm。

对于主培养，100 ml ATCC1754培养基（pH = 6.0；20 g/L MES；1 g/L酵母提取物、0.8 g/L NaCl；1 g/L NH₄Cl；0.1 g/L KCl；0.1 g/L KH₂PO₄；0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O；0.02g/L CaCl₂ x 2 H₂O；20 mg/L次氮基三乙酸；10 mg/L MnSO₄ x H₂O；8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂x 6 H₂O；2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O；2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O；0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O；0.2mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O；0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O；0.2 mg/L Na₂SeO₄；0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2H₂O；20 µg/L d-生物素；20 µg/L叶酸；100 µg/L吡哆醇-HCl；50 µg/L硫胺素-HCl x H₂O；50µg/L核黄素；50 µg/L烟酸；50 µg/L泛酸钙；1 µg/L维生素B₁₂；50 µg/L对氨基苯甲酸盐/酯；50 µg/L硫辛酸；大约67.5 mg/L NaOH）与另外400 mg/L L-半胱氨酸盐酸盐、5 mL/L乙醇和5.74 g/L KOH一起用来自这两个第二次预培养的离心细胞接种至0.09的OD_600nm。在pH 7.0下开始培养。

该培养在500毫升耐压玻璃瓶中在开放水浴摇振器中在37℃、100 rpm和含67% N₂和33% CO₂的预混气体的0.8巴超压下进行170小时直至0.07的OD_600nm和pH 6.8。

在主培养过程中，乙酸盐浓度从0.01 g/L提高到0.45 g/L、丙酸盐从0.00 g/L提高到0.3 g/L、且丙醇从0.00 g/L提高到0.16 g/L。乙醇浓度从4.85 g/L降至3.95 g/L。

实施例5

用丙酸梭菌（Clostridium propionicum）生产丙酸盐

为了将乙醇和二氧化碳生物转化成丙酸，细菌丙酸梭菌（Clostridium propionicum）在含乙醇的培养基和含二氧化碳的气氛中培养。所有培养步骤在可用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中在厌氧条件下进行。

对于第一次预培养，含另外400 mg/L L-半胱氨酸盐酸盐的50 ml DSMZ156培养基（3.0 g/L L-丙氨酸；3.0 g/L蛋白胨；4.0 g/L酵母提取物；0.1 g/L MgSO₄ x 7 H₂O；18.0mg/l FeSO₄ x 7 H₂O；5.0毫摩尔/L磷酸盐缓冲盐水pH 7.1；2.5 mL/L饱和硫酸钙溶液；1.0mg/L刃天青；1 g/L NaHCO₃）用5毫升冷冻的低温储液接种。该培养在250毫升耐压玻璃瓶中在开放水浴摇振器中在37℃、100 rpm和含67% N₂和33% CO₂的预混气体的0.8巴超压下进行21小时直至0.64的OD_600nm。

对于第二次预培养，含另外400 mg/L L-半胱氨酸盐酸盐的100 ml DSMZ156培养基用来自第一次预培养的离心细胞接种至0.07的OD_600nm。该培养在250毫升耐压玻璃瓶中在开放水浴摇振器中在37℃、100 rpm和含67% N₂和33% CO₂的预混气体的0.8巴超压下进行47小时直至0.69的OD_600nm。

对于主培养，100 ml ATCC1754培养基（pH = 6.0；20 g/L MES；1 g/L酵母提取物、0.8 g/L NaCl；1 g/L NH₄Cl；0.1 g/L KCl；0.1 g/L KH₂PO₄；0.2 g/L MgSO₄ x 7 H₂O；0.02g/L CaCl₂ x 2 H₂O；20 mg/L次氮基三乙酸；10 mg/L MnSO₄ x H₂O；8 mg/L (NH₄)₂Fe(SO₄)₂x 6 H₂O；2 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O；2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O；0.2 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O；0.2mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O；0.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O；0.2 mg/L Na₂SeO₄；0.2 mg/L Na₂WO₄ x 2H₂O；20 µg/L d-生物素；20 µg/L叶酸；100 µg/L吡哆醇-HCl；50 µg/L硫胺素-HCl x H₂O；50µg/L核黄素；50 µg/L烟酸；50 µg/L泛酸钙；1 µg/L维生素B₁₂；50 µg/L对氨基苯甲酸盐/酯；50 µg/L硫辛酸；大约67.5 mg/L NaOH）与另外400 mg/L L-半胱氨酸盐酸盐、5 mL/L乙醇和2.35 g/L KOH一起用来自第二次预培养的离心细胞接种至0.166的OD_600nm。在pH 6.6下开始培养。

该培养在500毫升耐压玻璃瓶中在开放水浴摇振器中在37℃、100 rpm和含67% N₂和33% CO₂的预混气体的0.8巴超压下进行165小时直至0.21的OD_600nm和pH 6.0。

在主培养过程中，乙酸盐浓度从0.01 g/L提高到1.15 g/L、丙酸盐从0.02 g/L提高到1.05 g/L、丙醇从0.00提高到0.39 g/L且丁酸盐从0提高到110 mg/L。在此期间，乙醇浓度从4.40 g/L降至2.75 g/L且丙氨酸从34 mg/L降至0 mg/L。

实施例6

用丙酸粘土杆菌（Pelobacter propionicus）生产丙酸盐

为了将乙醇和二氧化碳生物转化成丙酸，细菌丙酸粘土杆菌（Pelobacter propionicus）在含乙醇的培养基和含二氧化碳的气氛中培养。所有培养步骤在可用丁基橡胶塞气密封闭的耐压玻璃瓶中在厌氧条件下进行。

对于第一次预培养，50 ml DSMZ295培养基（0.2 g/L KH₂PO₄；0.25 g/L NH₄Cl；1g/L NaCl；0.4 g/L MgCl₂ x 6 H₂O；0.5 g/L KCl；0.15 g/L CaCl₂ x 2 H₂O；2.8 mg/LHCl；1.5 mg/L FeCl₂ x 4 H₂O；0.07 mg/L ZnCl₂ x 7 H₂O；0.1 mg/L MnCl₂ x 4 H₂O；0.006mg/L H₃BO₃；0.19 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O；0.002 mg/L CuCl₂ x 6 H₂O；0.024 mg/L NiCl₂ x6 H₂O；0.036 mg/L Na₂MO₄ x 2 H₂O；1 mg/L刃天青；2.5 g/L NaHCO₃；0.9 g/L 2,3-丁二醇）与另外360 mg/L Na₂S一起用5毫升冷冻的低温储液接种。该培养在250毫升耐压玻璃瓶中在开放水浴摇振器中在30℃、100 rpm和含67% N₂和33% CO₂的预混气体的0.8巴超压下进行69小时直至0.19的OD_600nm和pH 6.2。

对于第二次预培养，含另外360 mg/L Na₂S和420 mg/L KOH的2 x 100 mlDSMZ295培养基用来自第一次预培养的离心细胞接种至分别0.055和0.053的OD_600nm。该培养在2 x 250毫升耐压玻璃瓶中在开放水浴摇振器中在30℃、100 rpm和含67% N₂和33% CO₂的预混气体的0.8巴超压下进行72小时，分别直至0.24的OD_600nm和pH 6.6，和0.23的OD_600nm和pH 6.4。

对于主培养，100 ml改良DSMZ318培养基（pH 7.4；0.61 g/L NaCl、0.047 g/LMgCl₂、0.30 g/L KH₂PO₄、1.00 g/L NH₄Cl、0.081 g/L CaCl₂ x 2 H₂O、0.5 g/L酵母提取物、0.5 g/L BBL胰酪蛋白胨、4 g/L KHCO₃、5 g/L乙醇、0.5 mg/L刃天青、128 mg/L次氮基三乙酸、135 mg/L FeCl₃ x 6 H₂O、1 mg/L MnCl₂ x 4 H₂O、0.24 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O、1 mg/LZnCl₂、0.25 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O、0.1 mg/L H₃BO₃、0.24 mg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O、1.2 mg/LNiCl₂ x 6 H₂O、0.26 mg/L Na₂SeO₃ x 5 H₂O、0.02 mg/L生物素、0.02 mg/L叶酸、0.1 mg/L吡哆醇-HCl、0.05 mg/L硫胺素-HCl x H₂O、0.05 mg/L核黄素、0.05 mg/L烟酸、0.05 mg/LD-泛酸钙、1 µg/L维生素B12、0.05 mg/L对氨基苯甲酸盐/酯、0.05 mg/L硫辛酸）与另外0.4g/L L-半胱氨酸盐酸盐、0.7 g/L KOH和11.2 mg/L HCl一起用来自这两个第二次预培养的离心细胞接种至0.10的OD_600nm。在pH 6.8下开始培养。该培养在500毫升耐压玻璃瓶中在开放水浴摇振器中在30℃、100 rpm和含67% N₂和33% CO₂的预混气体的0.8巴超压下进行162小时直至0.13的OD_600nm和pH 6.5。

在主培养过程中，乙酸盐浓度从0.02 g/L提高到0.45 g/L、丙酸盐从0.02提高到0.27 g/L且丙醇从0.00提高到0.18 g/L。乙醇浓度从4.6 g/L降至4.00 g/L。

实施例7

对于C. neopropionicum的第一次预培养，500 mL DSMZ318培养基（pH 7.4；0.61g/L NaCl；0.047 g/L MgCl₂；0.30 g/L KH₂PO₄；1.00 g/L NH₄Cl；0.081 g/L CaCl₂ x 2H₂O；0.5 g/L酵母提取物；0.5 g/L BBL胰酪蛋白胨；4 g/L KHCO₃；10 g/L乙醇；0.5 mg/L刃天青；128 mg/L次氮基三乙酸；135 mg/L FeCl₃ x 6 H₂O；1 mg/L MnCl₂ x 4 H₂O；0.24 mg/L CoCl₂ x 6 H₂O；1 mg/L ZnCl₂；0.25 mg/L CuCl₂ x 2 H₂O；0.1 mg/L H₃BO₃；0.24 mg/LNa₂MoO₄ x 2 H₂O；1.2 mg/L NiCl₂ x 6 H₂O；0.26 mg/L Na₂SeO₃ x 5 H₂O；0.02 mg/L生物素；0.02 mg/L叶酸；0.1 mg/L吡哆醇-HCl；0.05 mg/L硫胺素-HCl x H₂O；0.05 mg/L核黄素；0.05 mg/L烟酸；0.05 mg/L D-泛酸钙；1 µg/L维生素B₁₂；0.05 mg/L对氨基苯甲酸盐/酯；0.05 mg/L硫辛酸；0.25 g/L半胱氨酸-HCl x H₂O）在1升瓶中接种5毫升冷冻的低温培养物并用含67% H₂、33% CO₂的预混气体吹扫至0.8巴的超压。培养物在开放水浴摇振器中在30℃和100 rpm下培养67小时直至0.17的OD_600nm。

对于C. neopropionicum的第二次预培养，500毫升新鲜DSMZ318培养基在1升瓶中接种来自第一次预培养的离心细胞至0.05的OD_600nm并用含67% H₂、33% CO₂的预混气体吹扫至0.8巴的超压。这一生长的培养物在开放水浴摇振器中在30℃和100 rpm下培养24小时直至0.13的OD_600nm。

对于C. neopropionicum的第三次预培养，2 x 500毫升新鲜DSMZ318培养基在1升瓶中接种来自第二次预培养的离心细胞至0.05的OD_600nm并用含67% H₂、33% CO₂的预混气体吹扫至0.8巴的超压。这些生长的培养物在开放水浴摇振器中在30℃和100 rpm下培养18小时，分别直至0.26和0.25的OD_600nm。

对于C. neopropionicum的第四次预培养，10 x 500毫升新鲜DSMZ318培养基在1升瓶中接种来自第三次预培养的离心细胞至0.03 – 0.04的OD_600nm并用含67% H₂、33% CO₂的预混气体吹扫至0.8巴的超压。这些生长的培养物在开放水浴摇振器中在30℃和100 rpm下培养22小时直至>0.23的OD_600nm。

对于主培养，将0.75的OD_600nm所需的量的来自C. neopropionicum的第四次预培养的离心细胞与另外13.9 g/L乙酸钠一起添加到50毫升新鲜LM33矿物培养基（pH = 6.8、10g/L乙醇；1 g/L NaOH；0.5 g/L MgCl₂；0.21 g/L NaCl；0.135 g/L CaCl₂ X 2H₂O；2.65 g/LNaH₂PO₄X 2 H₂O；0.5 g/L KCl；2.5 g/L NH₄Cl；15 mg/L次氮基三乙酸；30 mg/L MgSO₄ x 7H₂O；5 mg/L MnSO₄ x H₂O；1 mg/L FeSO₄ x 7 H₂O；8 mg/L Fe(SO₄)₂(NH₄)₂ x 6 H₂O；2 mg/LCoCl₂ x 6 H₂O；2 mg/L ZnSO₄ x 7 H₂O；200 µg/L CuCl₂ x 2 H₂O；200 µg/L KAl(SO₄)₂ x12 H₂O；3 mg/L H₃BO₃；300 µg/L Na₂MoO₄ x 2 H₂O；200 µg/L Na₂SeO₃；200 µg/L NiCl₂ x 6H₂O；200 µg/L Na₂WO₄ x 6 H₂O；200 µg/L d-生物素；200 µg/L叶酸；100 µg/L吡哆醇-HCl；500 µg/L硫胺素-HCl；500 µg/L核黄素；500 µg/L烟酸；500 µg/L泛酸钙；500 µg/L维生素B₁₂；500 µg/L对氨基苯甲酸盐/酯；500 µg/L硫辛酸；10 mg/L FeCl₃，用CO₂充气30分钟）中。该培养在250毫升耐压玻璃瓶中在开放水浴摇振器中在30℃、150 rpm和CO₂的0.3巴超压下进行5小时。pH在此期间从7.0降至6.8。OD_600nm从0.75降至0.71。

在培养过程中，取几个5毫升样品以测定OD_600nm、pH和产物形成。通过半定量¹H-NMR波谱法进行产物浓度的测定。作为量化内标，使用三甲基甲硅烷基丙酸钠（T(M)SP)。

在培养过程中，丙酸盐浓度从0.03 g/L提高到0.77 g/L，丙醇从0.01提高到0.02g/L且乳酸盐从0.00 g/L提高到0.08 g/L。没有形成丁酸盐。乙醇浓度在此期间从9.25 g/L降至8.04 g/L。丙酸盐/丙醇形成的选择性为大约92.1%。

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Claims

1.生产丙醇和/或丙酸的方法，所述方法包括：

其中乙酸盐以至少大约1 g/L的浓度保持在所述水性介质中。

2.根据权利要求1的方法，其中外源生产乙醇和乙酸盐。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述产C3微生物选自新丙酸梭菌（Clostridium neopropionicum）、丙酸梭菌（Clostridium propionicum）、丙酸粘土杆菌（Pelobacter propionicus）、丙酸脱硫葱状菌（Desulfobulbus propionicus）、沃氏互营杆菌 （Syntrophobacter wolinii）、普氏互营杆菌（Syntrophobacter pfennigii）、Syntrophobacter fumaroxidans、Syntrophobacter sulfatireducens、Smithella propionica、热苯脱硫肠状菌（Desulfotomaculum thermobenzoicum）亚种thermosyntrophicum、Pelotomaculum thermopropionicum和Pelotomaculum schinkii。

4.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述产C3微生物是新丙酸梭菌（Clostridium neopropionicum）。

5.根据前述权利要求任一项的方法，其中水性介质中的乙酸盐浓度保持在1g/L至10g/L之间。

6.根据前述权利要求任一项的方法，其中水性介质中的乙酸盐浓度保持在1.5g/L至7g/L之间。

7.根据前述权利要求任一项的方法，其中水性介质中的乙酸盐浓度保持在大约2g/L。

8.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述方法包括用于生产乙醇和乙酸盐的步骤(a)，其中步骤(a)包括：

(a) 使至少一种产乙酸菌与碳源接触，其中所述碳源包含二氧化碳和/或一氧化碳。

9.根据权利要求8的方法，其中所述产乙酸菌选自Clostridium autothenogenum DSMZ 19630、Clostridium ragsdahlei ATCC no. BAA-622、Clostridium autoethanogenum、穆 尔氏菌属（Moorella sp.）HUC22-1、热醋穆尔氏菌属（Moorella thermoaceticum）、热自养 穆尔氏菌属（Moorella thermoautotrophica）、产生瘤胃球菌（Rumicoccus productus）、厌 氧醋菌属（Acetoanaerobum）、普氏产醋杆菌（Oxobacter pfennigii）、巴氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina barkeri）、噬乙酸甲烷八叠球菌（Methanosarcina acetivorans）、一氧 化碳噬热菌属（Carboxydothermus）、库氏脱硫肠状菌（Desulfotomaculum kutznetsovii）、热球菌属（Pyrococcus）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、食甲基丁酸杆菌 （Butyribacterium methylotrophicum）ATCC 33266、蚁酸醋酸梭菌（Clostridium formicoaceticum）、Clostridium butyricum、Lactobacillus delbrukii、Propionibacterium acidoproprionici、栖树丙酸螺菌（Proprionispera arboris）、产琥 珀酸厌氧螺菌（Anaerobierspirillum succiniproducens）、Bacterioides amylophilus、Becterioides ruminicola、凯伍热厌氧菌（Thermoanaerobacter kivui）、Acetobacterium woodii、诺泰拉厌氧醋菌（Acetoanaerobium notera）、醋酸梭菌（Clostridium aceticum）、食甲基丁酸杆菌（Butyribacterium methylotrophicum）、热醋穆尔氏菌属（Moorella thermoacetica）、粘液真杆菌（Eubacterium limosum）、产生消化链球菌 （Peptostreptococcus productus）、扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）、Clostridium ATCC 29797和Clostridium carboxidivorans。

10.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(a)和(b)在单个发酵器中进行。

11.乙酸盐用于提高在水性介质中被产C3微生物转化成丙醇和/或丙酸的乙醇的比例的用途，其中乙酸盐以至少大约1 g/L的浓度保持在水性介质中。

12.根据权利要求11的用途，其中所述乙醇和乙酸盐是外源生产的乙醇和乙酸盐。

13.根据权利要求11或12的用途，其中所述产C3微生物选自丙酸梭菌（Clostridium neopropionicum）、丙酸梭菌（Clostridium propionicum）、丙酸粘土杆菌（Pelobacter propionicus）、丙酸脱硫葱状菌（Desulfobulbus propionicus）、沃氏互营杆菌 （Syntrophobacter wolinii）、Syntrophobacter pfennigii、Syntrophobacter fumaroxidans、Syntrophobacter sulfatireducens、Smithella propionica、热苯脱硫肠 状菌（Desulfotomaculum thermobenzoicum）亚种thermosyntrophicum、Pelotomaculum thermopropionicum和Pelotomaculum schinkii。

14.根据权利要求11至13任一项的用途，其中水性介质中的乙酸盐浓度保持在1.5g/L至7g/L之间。

15.根据权利要求11至14任一项的用途，其中水性介质中的乙酸盐浓度保持在大约2g/L。