KR101312107B1 - 미생물 알콜 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미생물 발효법에 의한 알콜의 생산, 특히 CO를 포함하는 기질의 미생물 발효법에 의한 알콜의 생산 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 CO를 포함하는 기질의 존재하에, 대응하는 산으로부터 알콜을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다. 구체적인 실시 상태에 있어서, 산 및 임의로는 알콜을 생성하는 발효 반응은 1종 이상의 산이 알콜로 전환될 수 있도록 교란된다.
Description
본 발명은 미생물 발효에 의한 알콜의 생성, 특히 CO를 포함하는 기질의 미생물 발효에 의한 알콜의 생성에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 대응하는 산으로부터 알콜을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.
알콜은 향수, 제약 및 연료 분야를 포함하는 다양한 산업 분야에서 사용되고 있다. 예컨대, 에탄올 및 부탄올은 전세계에서 가장 신속하게 주요 액체 운송용 연료가 되었다. 이러한 다양한 알콜의 생산 방법은 알려져 있다. 산업용 알콜 생산법은 석유 화학 방법으로부터 유래한 대규모의 합성 방법이다. 그러나, 예컨대, 바이오 연료 등의 알콜을 생산하기 위하여 미생물 발효법도 사용되고 있으며, 이는 점점 더 대중적으로 사용되고 있다.
운송용 바이오 연료는 가솔린에 대한 매력적인 대체제로서, 저농도 혼합물로서 연료 시장에 신속하게 침투하고 있다. 천연 식물 원료로부터 유래한 바이오 연료는 화석 연료 (가령, 가솔린)에서 유래한 것보다 훨씬 친환경적이므로, 연료 연소의 결과로서 대기 중에 방출되는 소위 석탄 이산화탄소 (CO2)의 양을 낮추어준다. 뿐만 아니라, 바이오 연료는 다수의 지역에서 지역적으로 생산될 수 있어서, 수입된 화석 에너지 자원에 대한 의존성을 낮추는 역할을 할 수도 있다. 이러한 바이오 연료로서 사용하기에 적합한 알콜로는 그 중에서도 특히 에탄올, 부탄올 및 2,3-부탄디올이 있다.
에탄올은 전세계적으로 사용되는 주요 수소 풍부 운송용 액체 연료가 되었다. 에탄올의 전세계적 소모량은 2005년에만 122억 갤론으로 추산된다. 에탄올 연료 산업에 대한 전세계 시장은 추후에도 급속히 성장될 것으로 예상되는데, 이는 유럽, 일본 및 미국과 몇개국의 개발 도상국에서의 에탄올의 증가된 이익에 기인한다.
예컨대, 미국에서 에탄올은 E10, 즉 가솔린 중의 10% 에탄올 혼합물을 제조하는데 사용된다. E10 블렌드에서, 에탄올 성분은 산화제로서 작용하여, 연소 효율을 개선함으로써 공기 오염물질의 생성을 감소시킨다. 브라질에서는, 에탄올은 가솔린 중에 배합된 산화제, 또는 그 자체로서의 순수 연료로서 운송용 연료 수요의 약 30%를 충족시키고 있다. 또한, 유럽에서는 온실 가스 (GHG) 방출의 결과를 둘러싸고 있는 환경적 우려로 인하여, 유럽 연합이 그 회원국으로 하여금 수용 가능한 수송 바이오 연료의 소비를 위한 기준을 만들도록 촉구하고 있다.
부탄올은 내부 연소 엔진의 연료로서 사용될 수 있다. 부탄올은 에탄올에 비하여 몇 가지 방식에서 가솔린과 더욱 유사하다. 환경적으로 허용되는 연료의 제조 및 사용에서 이익은 더욱 강화되었는데, 부탄올 생성을 위한 생물학적 방법 (흔히 바이오-부탄올로 부른다)에 대한 이익이 더욱 강화되었다. 부탄올은 슈가 비트, 옥수수, 밀 및 사탕 수수 등의 곡물로부터의 바이오매스의 미생물 발효법에 의하여 생성될 수 있다. 그러나, 이들 탄수화물 공급 원료의 비용은 인류의 식품 또는 동물의 먹이로서의 이들의 가치에 의하여 영향을 받으며, 부탄올 제조를 위한 녹말 또는 수크로스 생성 곡류의 재배가 모든 지역에서 경제적으로 가능한 것은 아니다. 그러므로, 부탄올 연료를 더욱 낮은 비용 및/또는 더욱 풍부한 탄소 급원으로 전환시키기 위한 기술을 개발하는 것이 요구되고 있다.
혐기성 세균, 가령, 클로스트리듐 (Clostridium)속의 세균은 아세틸 CoA 생화학 경로를 통하여 CO, CO2 및 H2로부터 에탄올을 생성하는 것으로 증명되었다. 예컨대, 기체로부터 에탄올을 생성하는 클로스트리듐 룽다리 (Clostridium ljungdahlii)의 다양한 균주가 WO 00/68407, EP 117309, US 특허 5,173,429, 5,593,886, 및 6,368,819, WO 98/00558 및 WO 02/08438에 기재되어 있다. 세균 클로스트리듐 오토에타노게늄 에스피 (Clostridium autoethanogenum sp)는 기체로부터 에탄올을 생성하는 것으로 알려져 있다 (Abrini et al , Archives of Microbiology 161, pp 345-351 (1994)).
그러나, 기체의 미생물 발효법에 의한 에탄올 생성은 일반적으로 아세테이트 및/또는 아세트산의 동시 생성과 관련되어 있다. 사용 가능한 탄소의 일부는 에탄올이 아닌 아세테이트 및/또는 아세트산으로 전환되기 때문에, 이러한 발효법을 사용하는 에탄올 생성의 효율은 덜 바람직할 수 있다. 또한, 아세테이트/아세트산 부산물은 다른 목적으로 사용될 수 있지 않는 한, 이는 폐기의 문제를 야기시킬 수 있다. 아세테이트/아세트산은 미생물에 의하여 메탄으로 전환되어, GHG 방출에 잠재적으로 기여할 수 있다. 부티르산/부티레이트 등의 다른 폐기물도 보통 사용되는 발효법 도중에 생성될 수 있다.
더욱이, 세균 또는 효모를 보통 사용하는 생물학적 발효법은 특정 유기체가 성장하는 기질 (예컨대, 탄수화물 또는 일산화탄소를 포함하는 기체)로부터 생성될 수 있는 1종 또는 2종의 알콜의 생성만으로 한정될 수 있다. 상이한 알콜을 제조하고자 하는 경우에는, 상이한 미생물을 사용할 필요가 있다. 다수의 경우에, 희망하는 알콜을 생성할 수 있는 세균의 급원이 될 수 없다. 그러므로, 저비용 및/또는 유기산 등의 풍부한 탄소 급원을, 에탄올 연료 등의 희망하는 생성물로 전환시키는 기술을 개발할 필요가 있다.
산을 이에 대응하는 알콜로 미생물 전환시키는 방법은 문헌 [US 특허 4,851,344; White and Simon, Arch Microbiol (1992) 158: 81-84; Huber et al, Arch Microbiol (1995) 164: 110-118]에 이미 기재된 바 있다. 그러나, 이들 방법에는 여러 가지 단점이 있다. 예컨대, 이들은 독성이 있거나, 그리고/또는 고비용의 다수의 화학적 매개체의 사용을 요한다. 뿐만 아니라, 이 방법들은 세포 추출물 또는 휴면 상태여서 산에서 알콜로 전환시키기에 앞서 스핀 다운 (spin down)하고 완충액 중에 재현탁 시킬 필요가 있는 분리된 세포를 사용한다. 이들 제조 방법은 노동 집약적이고 산소에 대한 미생물의 노출, 용해 또는 파괴에 대한 위험을 증가시킨다.
본 발명은 이 기술 분야에 공지되어 있는 특정 단점을 극복하거나, 또는 최소한 유용한 선택 사항을 공중에 제공하는 혐기성 세균 발효법을 통하여 유용한 알콜을 생산하는 방법을 제공한다.
폭넓은 관점에서, 본 발명은 일산화탄소 및/또는 수소를 포함하는 기질 상에서 성장 중인 대사적으로 활성인 세균을 사용하여 산을 이에 대응하는 알콜로 전환시키는 방법을 제공한다.
특정 실시 상태에 있어서, 이 방법은
(a) 생물 반응기에서, CO를 포함하는 기질의 존재하에 일산화탄소 영양 세균 균주 1종 이상을 배양하여 1종 이상의 산과, 임의로는 1종 이상의 알콜을 생성시키는 단계와,
(b) 미생물 배양물을 교란시켜서, 1종 이상의 산이 1종 이상의 알콜로 전환되도록 하는 단계를 포함한다.
보통, 상기 (a) 단계에서 생성된 산의 적어도 일부가 상기 (b) 단계에서 알콜로 전환된다. 추가적으로 또는 별법으로서, 추가의 산이 상기 (a) 단계 및/또는 상기 (b) 단계 도중에 생물 반응기에 첨가되어 1종 이상의 알콜로 전환된다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 미생물 배양물을 교란시키는 것은
- 상기 미생물 배양물을 함유하는 액체 영양 배지의 pH를 변화시키는 것과,
- 상기 미생물 배양물을 함유하는 액체 영양 배지의 ORP를 변화시키는 것과,
- 1종 이상의 산을 상기 생물 반응기에 첨가하는 것과,
- 1종 이상의 환원제를 상기 생물 반응기에 첨가하는 것과,
- 상기 미생물 배양물을 함유하는 액체 영양 배지 중의 CO 농도를 변화시키는 것과,
- 상기 생물 반응기 내의 CO 분압을 변화시키는 것 중 어느 하나를 포함하고, 상기 CO를 포함하는 기질은 기체상이다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 CO 농도를 변화시키는 단계는 액체 영양 배지 중의 CO 농도를 1 mmol 이상 증가시키는 것을 포함한다.
또 다른 폭넓은 관점에 있어서, 본 발명은
(a) 일산화탄소를 포함하는 기질의 존재하에, 1종 이상의 세균 균주를 생물 반응기 중에서 배양시키는 단계와,
(b) 1종 이상의 세균 균주가 전환기에 있을 때 상기 생물 반응기에 산을 첨가하여, 상기 산에 대응하는 알콜을 생성하는 단계
를 포함하고, 상기 생성된 알콜은, 상기 산의 부재하에 상기 기질 상에서 성장시, 1종 이상의 세균 균주가 생성할 수 있는 알콜이 아닌 것이 특징인 알콜의 생산 방법을 제공한다.
상기 측면의 특정 실시 상태에 있어서, 상기 방법은 매개체 (mediator)의 부재하에 수행된다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 2종 이상의 산이 생물 반응기에 첨가되어, 2종 이상의 이에 대응하는 알콜을 생성하게 된다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 1종 이상의 세균은 산을 이에 대응하는 알콜로 환원시키는 알데하이드 옥시도-리덕타아제 (AOR) 경로를 사용할 수 있는 세균이다. 적당한 세균으로는, 클로스티리디아 속 (Clostridia ), 무렐리아 속 (Moorella ), 유박테리아 속 (Eubacteria), 아세토박테리아 속 (Acetobacteria), 부티리박테리움 속 (Butyribacterium) 및 데술포박테리움 속 (Desulfobacterium)이 있다. 구체적인 실시 상태에 있어서, 상기 세균은 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )이다.
보통, 상기 산은 모노카르복실산 도는 디카르복실산이다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 산은 아세트산, 프로피온산, n-부티르산, n-펜탄산, n-헥산산 및 벤조산으로부터 선택된다.
특정 실시 상태에 있어서, 생성된 알콜은 에탄올, 1-프로판올, 1-부탄올, 1-펜탄올, 1-헥산올 및 벤질 알콜로부터 선택된다.
또 다른 폭넓은 측면에 있어서, 본 발명은
(a) 일산화탄소를 포함하는 기질의 존재하에, 부탄올 이외의 알콜을 생성하도록 변형시킨 1종 이상의 세균 균주를 생물 반응기 중에서 배양하는 단계와,
(b) 1종 이상의 세균 균주가 부탄올 이외의 알콜을 활발히 생성할 때 생물 반응기 중에 부티레이트를 첨가함으로써 부탄올을 생성시키는 단계
를 포함하는 부탄올의 생산 방법을 제공한다.
다른 폭넓은 측면에 있어서, 본 발명은
(a) 일산화탄소를 포함하는 기질의 존재하에, 에탄올을 생성하도록 변형시킨 1종 이상의 세균 균주를 생물 반응기 중에서 배양시키는 단계와,
(b) 1종 이상의 세균 균주가 활발히 에탄올을 생성할 때에, 생물 반응기에 부티레이트를 첨가함으로써 부탄올을 생성시키는 단계
를 포함하는 부탄올의 생산 방법을 제공한다.
다른 폭넓은 측면에 있어서, 본 발명은
(a) 일산화탄소를 포함하는 기질의 존재하에, 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)을 생물 반응기에서 배양시키는 단계와,
(b) 상기 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)이 전환기에 있을 때 생물 반응기에 산을 첨가하여, 상기 산에 대응하는 알콜을 생성시키는 단계를 포함하고,
상기 생성된 알콜은 상기 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)이 상기 산의 부재하에 상기 기질 상에서 성장시, 생성할 수 있는 알콜이 아닌 것이 특징인 알콜의 생산 방법을 제공한다.
바람직한 폭넓은 측면에 있어서, 본 발명은
(a) 일산화탄소를 포함하는 기질의 존재하에, 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)을 생물 반응기에서 배양시키는 단계와,
(b) 상기 클로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)이 전환기에 있을 때 생물 반응기에 부티레이트를 첨가하여, 부탄올을 생성시키는 단계를 포함하는 부탄올의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 보통 매개체의 부재 하에 수행된다.
특정 실시 상태에 있어서, 본 발명에 기재된 방법에 따라 생물 반응기에 첨가되는 산은 일산화탄소를 포함하는 기질의 미생물 발효에 의하여 생성된다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 세균은 효모 추출물 및/또는 펩톤의 부재하에 액체 매질 중에서 배양된다. 다른 실시 상태에 있어서, 본 명세서에서, 상기 매질은 앞으로 LM23 또는 LM33으로 칭한다.
다른 폭넓은 측면에 있어서, 본 발명은
(a) 제1 생물 반응기에서 기질을 발효시켜 1종 이상의 산을 생성시키는 단계와,
(b) 제2 생물 반응기에서 일산화탄소를 포함하는 기질의 존재하에 1종 이상의 세균 균주를 배양시키는 단계와,
(c) 1종 이상의 세균 균주가 용매를 생성하는 단계 (solventogenic phase)에 있을 때 상기 (a)로부터의 1종 이상의 산을 제2 반응기로 도입하여, 1종 이상의 산에 대응하는 알콜을 생성하는 단계를 포함하고,
상기 생성된 알콜은 상기 산의 부재하에, 상기 기질 상에서 성장시, 1종 이상이 세균이 생성할 수 있는 알콜이 아닌 것이 특징인
1종 이상의 알콜의 생산 방법을 제공한다.
특정 실시 상태에 있어서, 이 방법은 매개체의 부재하에 수행된다.
특정 실시 상태에 있어서, 제2 생물 반응기 중의 1종 이상의 세균 균주는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, CO를 포함하는 기질의 존재하에, 생물 반응기 중에서 산의 혐기성 세균 발효로부터 알콜을 생산하는 방법을 제공한다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 산이 알콜로 전환되는 것을 촉진할 수 있도록 하는 CO 농도로 제공된다.
한 가지 실시 상태에 있어서, CO의 농도는 산에서 알콜로 전환되는 것이 촉진될 수 있도록 하는 충분한 역치 농도 이상이다. 전술한 충분한 역치 농도 이상으로 발효 과정에 제공하는 것은 산의 알콜 전환을 촉진시키면서, 산의 생성을 예방 또는 감소시키고 및/또는 미생물 성장을 예방 또는 감소시킨다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 약 2.5 mmol/L 이상의 발효 매질 중의 CO 농도로 제공된다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 CO 농도는 약 2.75mmol/L 이상이다. 한 가지 실시 상태에 있어서, CO 농도는 약 3 mmol/L 이상이다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 농도는 약 3.5 mmol/L 이상이다.
이 기술 분야의 숙련자는 본 명세서의 기재 사항을 고려하면, 온도 변화 및/또는 오일 등의 용해제 첨가를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌, 발효 매질 중에서 CO의 용해도를 증가시키는 여러 가지 방법이 있다는 것을 잘 알 것이다. 이러한 방법은 발효 매질 중의 특정 CO 농도를 달성하기 위하여 필요한 경우 본 발명의 실시예에 사용될 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, CO를 포함하는 기질은 기체상 기질이고, 발효 매질 중에 용해된 CO의 양은 발효액 중 CO의 분압에 비례한다. 이와 같이, 발효 매질 중의 충분한 역치 농도는 CO 분압을 증가시킴으로서 달성될 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 기체상 기질은 CO 분압이 약 37 psi 이상이도록 제공된다. 다른 실시 상태에 있어서, CO 분압은 약 47 psi 이상이다.
본 발명의 방법에 따르면, 추가의 산이 생물 반응기에 공급되어 알콜로 전환된다.
본 발명의 여러 가지 실시 상태에 있어서, 이 방법은 발효법에 의하여 생성된 1종 이상의 알콜을 포획 및 회수하는 단계도 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 알콜 및/또는 산의 생산 방법이 제공되는데, 이 방법은 생물 반응기에서 제1 기질을 혐기성 발효시켜, 알콜 및/또는 산을 포함하는 1종 이상의 생성물을 생성하는 단계를 포함하고, 여기서 CO를 포함하는 제2 기질을, 아세테이트 등의 산에 비하여 에탄올 등의 알콜의 생성이 증가되도록 하는 희망하는 시점에 첨가하게 된다.
한 가지 실시 상태에 있어서, CO를 포함하는 제2 기질을 첨가하는 것은, 산의 최소한 일부가 알콜로 전환되게 하는데, 다만, 생성된 용해된 CO 농도는 발효를 위한 충분한 역치 농도에 있거나, 그 농도 이상이다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 제1 기질은 CO를 포함한다. 그러나, 이 방법이 이러한 실시 상태로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 일부 실시 상태에 있어서, 제1 기질은 1종 이상의 탄수화물 또는 피루베이트를 포함할 수 있다. 적당한 탄수화물로는 셀룰로스, 셀룰로스 가수분해물, 녹말, 녹말 가수분해물, 글루코스, 프럭토스, 자일로스, 아라비노스, 또는 락토스가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시 상태에 있어서, 상기 탄수화물은 프럭토스 또는 자일로스이다. 다른 실시 상태에 있어서, 상기 제1 기질은 CO2 및/또는 H2, 또는 발효에 의하여 산 및/또는 알콜을 생성하기에 적합한 기타의 성분을 포함할 수 있다.
여러 가지 실시 상태에 있어서, 이 방법은 발효법에 의하여 생성된 1종 이상의 알콜을 포획 및 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서,
(a) 1종 이상의 미생물의 배양물을 함유하는 생물 반응기에 제1 농도로 CO를 포함하는 기질을 제공하는 단계와,
(b) 상기 생물 반응기 중의 배양물을 혐기성 발효시켜, 상기 기질로부터 알콜 및/또는 산을 포함하는 1종 이상의 생성물을 제공하는 단계를 포함하고,
상기 생물 반응기에 제공되는 기질의 농도는 산에 대한 알콜의 생성이 증가될 수 있도록 원하는 시점에 임의로 증가시킬 수 있는 것이 특징인
알콜 및/또는 산의 생산 방법을 제공한다.
여러 가지 실시 상태에 있어서, 상기 기질 농도를 증가시키는 것은, 알콜로 전환되는 산의 적어도 일부를 생성시키고 그리고/또는 기질의 농도는 산의 적어도 일부가 알콜로 전환되는 충분한 역치 이상으로 증가될 수 있다.
여러 가지 실시 상태에 있어서, 이 방법은 발효법에 의하여 생성된 1종 이상의 생성물을 포획 및 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명은
(a) 1종 이상의 미생물의 배양물을 함유하는 생물 반응기 중에서 제1 CO 분압에 있는 CO를 포함하는 기체상 기질을 제공하는 단계와,
(b) 상기 생물 생물 반응기 중의 배양물을 혐기성 발효시켜, 상기 기질로부터 에탄올 및/또는 아세트산을 포함하는 1종 이상의 생성물을 생성시키는 단계를 포함하고,
상기 CO 분압은 아세테이트에 비하여 에탄올의 비율이 증가될 수 있도록 원하는 시점에 임의로는 증가될 수 있는 것이 특징인 알콜 및/또는 산의 생산 방법이 제공된다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 이 방법은 1종 이상의 생성물 농도 및/또는 CO 농도 및/또는 미생물 성장을 모니터링하는 단계를 포함하고, 여기서 원하는 생성물 및/또는 CO 농도에서, CO 분압은 증가될 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, CO 분압은 27 psi 이상으로 증가될 수 있다.
여러 가지 실시 상태에서, CO 분압을 증가시키는 것은 알콜로 전환될 산의 적어도 일부를 생성시키고 그리고/또는 CO 분압은 충분한 역치 이상으로 증가될 수 있는데, 여기서, 상기 산의 적어도 일부는 알콜로 전환된다.
여러 가지 실시 상태에 있어서, 이 방법은 발효법에 의하여 생성된 알콜을 포획 및 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면,
(a) 1종 이상의 미생물의 배양물을 함유하는 생물 반응기 중에 제1 CO 분압에 있는 CO를 포함하는 기체상 기질을 제공하는 단계와,
(b) 상기 생물 반응기 중의 배양물을 혐기성 배양하여, 상기 기질로부터 에탄올 및/또는 아세트산을 포함하는 1종 이상의 생성물을 생성시키는 단계를 포함하고,
상기 CO 분압은 미생물 성장 및/또는 산 생성이 감소되거나 실질적으로 억제되도록 원하는 시점에 증가될 수 있는 것이 특징인 미생물 성장 및/또는 산 생성을 조절하는 방법이 제공된다.
다양한 실시 상태에 있어서, CO 분압을 증가시키는 것은 알콜로 전환되는 산의 적어도 일부를 생성시키고 그리고/또는 CO 분압은 충분한 역치 이상으로 증가될 수 있으며, 여기서, 산의 적어도 일부는 알콜로 전환된다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 미생물 성장 및/또는 산 생성은 CO의 분압이 감소될 때 증가/촉진 (또는 재시작)될 수 있다.
여러 가지 실시 상태에 있어서, 상기 방법은 발효법에 의하여 생성된 알콜을 포획 및 회복하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 관점에 있어서,
(a) 1종 이상의 미생물의 배양물을 함유하는 생물 반응기 중에 제1 CO 분압에 있는 CO를 포함하는 기체상 기질을 제공하는 단계와,
(b) 상기 생물 반응기 중의 배양물을 혐기성 발효시켜, 상기 기질로부터 에탄올 및/또는 아세트산을 포함하는 1종 이상의 생성물을 생성시키는 단계와,
(c) 산의 적어도 일부가 에탄올로 전환될 수 있도록 충분한 역치 이상으로 CO 분압을 증가시키는 단계와,
(d) 미생물 성장 및 산 생성이 촉진될 수 있도록 CO 분압을 역치 이하로 낮추는 임의의 단계를 포함하는, 알콜 생산을 조절하는 방법을 제공한다.
여러 가지 실시 상태에 있어서, 알콜 및 산의 생성 및/또는 미생물 성장은 발효를 통하여 모니터링할 수 있고 그리고/또는 단계 (c) 및 (d)는 적어도 1회 반복된다.
본 발명의 실시 상태는 CO를 포함하는 기체상 기질의 존재하에, 산의 발효에서 특정 용도를 모색한다. 이 기질은 산업적 공정의 부산물로서 얻어지는 기체를 포함할 수 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 이 산업적 공정은 철 금속 생성물 제조, 비철 생성물 제조, 석유 제련 공정, 바이오매스의 기체화, 석탄의 기체화, 전력 생산, 카본 블랙 제조, 암모니아 제조, 메탄올 제조 및 코크 제조로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 기체상 기질은 신가스 (syngas)이다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 기체상 기질은 제강 공장 (steel mill)로부터 얻어진 기체를 포함한다.
CO 함유 기질은 보통 주로 CO로 이루어지는데, 가령, 약 20 내지 약 100 부피%, 40 내지 95 부피%, 40 내지 60 부피%, 45 내지 55 부피%의 CO를 함유한다. 특정 실시 상태에 있어서, 이 기질은 약 25%, 또는 약 30%, 또는 약 35%, 또는 약 40%, 또는 약 45%, 또는 약 50%, 또는 약 55%, 또는 약 60 부피%의 CO를 포함한다. 가령 6% 등의 낮은 농도의 CO를 함유하는 기질도, 특히 H2 및 CO2가 존재하는 경우에는 적합할 수 있다.
여러 가지 실시 상태에 있어서, 발효는 1종 이상의 일산화탄소 영양 세균 균주 배양물을 사용하여 수행한다. 여러 가지 실시 상태에 있어서, 상기 일산화탄소 영양 세균은 클로스티리듐 (Clostridium), 무렐리아 (Moorella), 옥소박테르 (Oxobacter), 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus), 아세토박테리아 (Acetobacteria), 유박테리아 (Eubacteria), 부티리박테리움 (Butyribacterium)으로부터 선택된다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 일산화탄소 영양 세균은 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)이다.
본 발명의 방법은 기질의 존재하에, 특히, 일산화탄소를 함유하는 기체상 기질의 존재하에, 산의 혐기성 발효에 의하여, 에탄올 및/또는 부탄올을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 알콜을 생산하는 데 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 이소프로판올을 포함하나 이에 제한되지는 않는 기타 생성물의 혐기성 또는 호기성 발효에, 호기성 발효에, 그리고, 기체를 함유하는 탄소 이외의 기질의 발효에 적용될 수 있다.
본 발명은 본 출원의 명세서에 개별적으로 또는 집합적으로 기재되었거나 언급된 일부, 요소 및 특징을 포함하며, 상기 일부, 요소 및 특징의 2개 이상의 임의의 또는 모든 조합에서, 특정한 정수가 언급된 것은 본 발명이 관련된 기술 분야에서 균등한 것으로 알려진 것을 언급한 것이고, 이러한 알려진 균등물은 개별적으로 언급된 경우와 같이 본 발명에 포함되는 것으로 간주된다.
본 발명의 이러한 측면들 및 다른 측면들은 모두 신규의 측면들로 간주되며, 다음의 실시예 및 첨부되는 도면을 참고로 하여 제공되는 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1: 세럼 바틀 (serum bottle) 중의 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)에 의하여 부티레이트로부터 부탄올로 전환. 출발 조건: 아세테이트 (4.7 g/l) 및 에탄올 (1.2 g/l) pH 5.5을 생성하는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)의 활성 배양물. 헤드스페이스 (headspace): CO2 중의 95% CO의 25 psig 과압. 종말 조건: pH 6.35, 아세테이트 (4.7 g/l), 에탄올 (3.2 g/l), 헤드스페이스: 14 psig 과압.
도 2: 아세테이트 및 최소한의 에탄올을 생성하는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)의 뱃치 배양물에 대한 포르메이트 첨가의 효과. 포르메이트 용액을 t=0 및 t=30 min (약)에 첨가한 다음에, t= 60 min (약)에도 계속 첨가.
도 3: 약 6g/L/1일 에탄올 및 1g/L/1일 아세테이트를 생성하는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)의 연속 배양에 대한 아세테이트 첨가의 효과. 아세테이트 (15g/L/1일)를 52일부터 계속 첨가하였다.
도 4: 아세테이트 및 에탄올을 생성하는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)을 포함하는 미생물 배양에 대한 pH 변화의 효과. 세포 재사용은 약 2시간 동안 개시한 다음에, pH를 약 t=3 일째에 5.9로 조정하였다. pH 변화 후에, 아세테이트를 소모하고, 에탄올의 생성량이 더 증가되었다.
도 5: 본 발명의 특정 실시 상태에 따르는 성장용 생물 반응기 및 전환용 생물 반응기를 포함하는 반응기.
도 6: 본 발명의 특정 실시 상태에 따르는 다중 성장용 생물 반응기 및 전환용 생물 반응기를 포함하는 반응기.
도 1: 세럼 바틀 (serum bottle) 중의 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)에 의하여 부티레이트로부터 부탄올로 전환. 출발 조건: 아세테이트 (4.7 g/l) 및 에탄올 (1.2 g/l) pH 5.5을 생성하는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)의 활성 배양물. 헤드스페이스 (headspace): CO2 중의 95% CO의 25 psig 과압. 종말 조건: pH 6.35, 아세테이트 (4.7 g/l), 에탄올 (3.2 g/l), 헤드스페이스: 14 psig 과압.
도 2: 아세테이트 및 최소한의 에탄올을 생성하는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)의 뱃치 배양물에 대한 포르메이트 첨가의 효과. 포르메이트 용액을 t=0 및 t=30 min (약)에 첨가한 다음에, t= 60 min (약)에도 계속 첨가.
도 3: 약 6g/L/1일 에탄올 및 1g/L/1일 아세테이트를 생성하는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)의 연속 배양에 대한 아세테이트 첨가의 효과. 아세테이트 (15g/L/1일)를 52일부터 계속 첨가하였다.
도 4: 아세테이트 및 에탄올을 생성하는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)을 포함하는 미생물 배양에 대한 pH 변화의 효과. 세포 재사용은 약 2시간 동안 개시한 다음에, pH를 약 t=3 일째에 5.9로 조정하였다. pH 변화 후에, 아세테이트를 소모하고, 에탄올의 생성량이 더 증가되었다.
도 5: 본 발명의 특정 실시 상태에 따르는 성장용 생물 반응기 및 전환용 생물 반응기를 포함하는 반응기.
도 6: 본 발명의 특정 실시 상태에 따르는 다중 성장용 생물 반응기 및 전환용 생물 반응기를 포함하는 반응기.
이하에는, 본 발명의 상세한 설명을 제공하는데, 여기에는 일반적인 용어로 다양한 실시 상태가 제공된다. 본 발명은 아래의 "실시예"라는 제목 아래 제공된 설명에서 추가로 예시되는데, 이는 본 발명을 뒷받침하는 실험적 데이터와, 본 발명의 측면의 구체적인 실시예와, 본 발명을 실시하는 예시적인 수단을 제공한다.
산과 알콜을 포함하는 생성물은 미생물 배양에 의하여 CO를 포함하는 기질로부터 생성될 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 미생물 배양의 교란은 놀랍게도, 미생물 배양법에 의하여 알콜의 동시 생산과 함께 산을 소모하게 한다. 이 결과는 알콜, 특히 에탄올로 직간접적으로 환원될 발효액 중에 존재하는 산의 적어도 일부 때문인 것으로 생각된다. 이는 발효 반응의 "전환기"로 언급될 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 발효 반응은 미생물 배양물을 교란시킴으로써 미생물 성장이 촉진되고 알콜 및/또는 산이 생성되는 생성기 (또는 성장기)로부터, 전환기로 스위칭될 수 있다.
미생물 배양물의 적어도 일부가 생성기에 있을 수 있으면서, 적어도 일부는 전환기에 있을 수 있는 것으로 인식된다. 그러나, 교란시에는 생성기에 있는 미생물 배양물의 적어도 일부가 전환기로 스위칭되어, 산에 비하여 알콜의 생성이 증가된다. 특정 실시 상태에 있어서, 여기에는 산 전체의 소모 및 알콜의 생성이 있다.
본 발명의 한 가지 실시 상태에 따르면, 에탄올은 CO를 포함하는 기질로부터 아세테이트 및 임의로는 에탄올 등의 생성물을 생성하는 미생물 배양물이 교란될 때 미생물 발효에 의하여 생성된다. CO의 적어도 일부는 교란 후에 산 및/또는 알콜로 전환될 수 있지만, 에탄올의 대부분은 아세트산/아세테이트의 미생물 환원에 의하여 생성된다 ("전환").
CO를 포함하는 기질을 사용하여 알콜 및/또는 산을 동시에 생성하기 위한 발효 반응의 예는 많이 있다. 그러나, 이러한 예에서, 생성 속도는 일반적으로 알콜 (에탄올)보다 산 (즉, 아세트산/아세테이트)이 더 우세하다. 본 발명의 다른 실시 상태에 있어서, 특히 발효 조건은 산 생성보다 알콜 생성 쪽이 더 우세할 수 있다. 이러한 조건 하에서, 발효기에 첨가되는 추가의 산은 미생물 배양에 의하여 이에 대응하는 알콜로 전환될 수 있다. 예컨대, 부티르산 등의 산은 발효 반응으로 첨가되어, 부티레이트 등의 알콜로 전환될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 산에서 알콜로 전환되는 것을 도울 메틸 바이올로겐 (methyl viologen) 등의 매개체를 사용할 필요가 없다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 사실상, 메틸 바이올로겐은 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)의 부탄올 생성에 대하여 좋지 않은 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 이는, 산이 이에 대응하는 알콜로 미생물 전환되는 데 있어서 매개체가 필요하다는 이전의 보고와는 대조되는 것이다.
특정 이론에 구속시키고자 하는 의도는 없지만, 본 발명에 따라 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )에 의하여 산에서 알콜로 전환되는 것은 알데하이드 옥시도-리덕타아제 (AOR)가 관여하는 생화학 경로를 통하여 발생하는 것으로 생각된다. AOR은 비활성화된 카르복실산에서 알데하이드로 환원시킬 수 있는 특유의 텅스텐 함유 효소이다. 알데하이드는 알데하이드 데하이드로게나아제에 의하여 알콜로 추가로 환원될 수 있다. AOR은 용매 생성 경로 (solventogenesis pathway)의 중요한 분지점을 대표한다. 텅스텐 조효소는 효소 활성에 중요한 것으로 나타났다. 이들 효소는 클로스티리듐 (Clostridium ), 데술피토박테리움 (Desulfitobacterium ), 및 피로코커스 (Pyrococcus ) 등의 발효 미생물에서 발견될 수 있다. 가장 특징 분석된 AOR은 게놈의 5개 중 4개가 특징 분석된 피로코커스 퓨리오수스 (Pyrococcus furiosus)에 속한다. 피로코커스 퓨리오수스 (Pyrococcus furiosus )의 첫번째 AOR은 폭넓은 기질 범위를 가지지만, 아미노산으로부터 유래된 알데하이드에 대하여 더 잘 반응한다. 이의 결정 구조상에서, 몰리브도프테린계 텅스텐 결합 자리가 존재함이 나타났다. 두번째 AOR인 글리세르알데하이드-3-포스페이트 페레독신 옥시도리덕타아제 (GFOR)는 단지 글리세르알데하이드-3-포스페이트만을 사용하며, 세번째 AOR인 포름알데하이드 페레독신 옥시도리덕타아제 (FOR)는 1개 내지 3개의 탄소 알데하이드를 선호한다. 네번째 AOR인 WOR5는 폭넓은 기질 범위를 가진다. AOR은 클로스티리듐 포르미코아세티쿰 (Clostridium formicoaceticum) 및 써모아세티쿰 (thermoaceticum)으로부터 정제된다.
클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )은 피로코커스 퓨리오수스 (Pyrococcus furiosus )의 AOR과 ~56%의 상동성을, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )과 ~80%의 상동성을 공유하는 두 개의 추정 (putative) AOR 유전자를 함유한다. AOR 유전자는, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )에 가장 근접하게 서열 분석된 클로스티리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri)에 대비하여 상당히 차이점을 나타내는데, 이는 AOR 유전자를 함유하지 않고 아세틸-CoA를 통하여 알콜을 생성한다. 종합한 결과, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )을 사용하여 또는 AOR 경로를 사용할 수 있는 다른 세균을 사용하여 이에 대응하는 산으로부터 알콜을 생성하는 데 적용될 것으로 예상된다.
그러므로, 가장 넓은 측면에 있어서, 본 발명은 미생물 배양물을 사용하여 산에서 이에 대응하는 알콜로 전환하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 미생물 배양물은 CO 및/또는 H2를 포함하는 기질의 존재하에 산을 알콜로 전환시킨다.
정의
별도로 언급하지 않은 한, 본 발명의 명세서 전반에 사용되는 다음의 용어는 다음의 의미로 정의된다.
본 명세서에서 사용된 "전환기"라는 용어는 세균이 1종 이상의 산을 1종 이상의 알콜로 발효시키는 기간을 일컫는다. 보통은 세균 집단의 적어도 일부가 이러한 전환기에 있게 된다. 그러나, 집단 중의 모든 세균이 활발하게 알콜을 생성할 필요는 없다. 전환기는 발효액 중의 알콜의 양의 존재로 특징 분석된다.
본 명세서에 사용된 미생물 배양물과 관련하여 "교란", "교란하다" 등의 용어는 미생물 배양물에 직간접적으로 영향을 미치는 임의의 변화를 의미한다. 미생물 배양물에 대한 변화로는, pH, CO 농도, ORP 등의 발효 작동 조건을 변화시키는 것, 또는 배양물을 함유하는 액체 영양 배지 조성을 변화시키는 것 등이 있다.
본 명세서에 사용된 "미생물 배양물" 등의 용어는 성장 및/또는 대사물 생성을 촉진하는 데 적합한 영양 배지 상에 그리고/또는 이러한 배지 중에 고정된 적어도 하나의 미생물을 말한다.
본 명세서에 사용된 본 발명의 방법에 의하여 "생성된 알콜"이란, 대응하는 산의 부재하에서, 기질 상에서 성장시, 1종 이상의 세균 균주가 생성할 수 있는 알콜은 아니다. 그러나, 이 방법은 추가의 생성물을 생성할 수 있는 것으로는 이해되어야 한다. 예컨대, 세균이 배양되는 기질로부터 발효시킨 산 또는 알콜이 그것이다. 본 발명의 방법에 의하여 "생성된 알콜"은 "1차 알콜 또는 1차 생성물"을 의미할 수 있으며, 또는 "공동 생성물"로서 추가의 생성물을 의미할 수 있다. "1차" 생성물은 공동 생성물에 비교하여 생성물의 특정 양을 나타내는 데 쓰이는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "산화 환원 매개체" 등의 용어는 가역적인 전자 주게 및/또는 전자 받게로서 작용하는 전자 셔틀을 말하는 것이다. 매개체로는 바이올로겐 염료 (가령, 메틸 바이올로겐), 안트라퀴논 및 기타 퀴논 염료, 트리페닐메탄 염료, 프탈로시아님, 메틴 염료, 피롤 염료, 포르피린 염료, 프테리딘, 프테리돈, 플라빈, 및 2족 VI, VII 및 VIII의 금속 복합체가 있다.
본 발명에 따른 배양물 또는 생물 반응기에 "산"을 첨가한다고 말할 때 "산"이라는 용어의 사용은 모노카르복실산 및 디카르복실산을 포함하여 폭넓게 해석되어야 한다. 또, 산을 첨가하는 것은 균등한 염 및 염과 산의 혼합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 산을 말할 때에는 균등한 염도 말하는 것으로 해석되어야 하고 (예컨대, 부티르산 및 부티레이트), 그 반대도 마찬가지이다. 발효액 중의 산 분자 대 카르복실레이트 분자의 비는 전체 시스템의 pH에 따라 달라진다. 예시적인 산으로는 아세트산, 프로피온산, n-부티르산, n-펜탄산, n-헥산산 및 벤조산이 있다.
"생물 반응기"라는 용어는 1개 이상의 용기 및/또는 타워 또는 파이프 배열로 이루어지는 발효 장치를 말하며, 여기에는 연속 교반 탱크 반응기 [Continuous Stirred Tank Reactor (CSTR)], 고정 셀 반응기 [Immobilized Cell Reactor (ICR)], 트리클 베드 반응기 [Trickle Bed Reactor (TBR)], 버블 컬럼 (Bubble Column), 가스 리프트 발효기 (Gas Lift Fermenter), 막반응기, 가령, 중공 섬유 막 생물 반응기 [Hollow Fibre Membrane Bioreactor (HFMBR)], 고정식 혼합기 (Static Mixer), 또는 기체-액체 접촉에 적합한 기타의 용기 또는 기타 장치가 있다.
후술하는 바와 같이, 일부 실시 상태에 있어서, 생물 반응기는 제1 성장용 반응기와, 제2 발효용 반응기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 생물 반응기 또는 발효 반응에 1종 이상의 탄수화물을 첨가하는 것을 말할 때는, 이는 적당한 이들 반응기 중 어느 하나, 또는 두 가지 반응기에 첨가하는 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"일산화탄소를 포함하는 기질"이라는 용어는 발효용 생물 반응기에 도입될 수 있는 CO를 함유하는 고체상, 액체상 또는 기체상 물질을 포함한다. "일산화탄소를 포함하는 기체상 기질"로는 일산화탄소를 함유하는 임의의 기체가 포함된다. 기체상 기질은 약 15 부피% 내지 약 95 부피% 등의 CO의 실질적인 비율을 함유한다.
"용해된 CO 농도"라는 용어는 부피의 함수로서 발효액/발효 매질 중에 존재하는 CO의 양을 포함한다.
"CO 분압"이라는 용어는 CO와 임의의 추가의 기체를 포함하는 기체상 기질 중에서 CO에 의하여 전체 시스템상에 가해지는 상대적인 압력을 말하는 것이다.
"역치 농도", "충분 역치 농도" 등과 같은 어구는 상이한 발효 조건, 가령 상이한 미생물을 사용하는 것 등의 조건 하에서 다양할 수 있지만 양적으로 정의된다. 이 용어에는 기질로부터 알콜 및/또는 산을 실질적으로 생성하는 것으로부터, 연장된 기간 동안 알콜을 생성하고 산을 소모하는 것으로 미생물이 스위칭되는 농도 또는 농도 범위가 포함된다.
별도로 언급하지 않은 한, 본 발명에 사용된 "발효시키는", "발효법", 또는 "발효 반응" 등의 용어는 미생물에 의한 성장 및/또는 생성물의 생합성을 포함하는 과정의 성장기 및 생성물 생합성을 모두 포함시키고자 하는 것이다.
본 발명의 방법에 따르면, 산과 알콜을 포함하는 생성물은 CO를 포함하는 기질, 예컨대, CO를 포함하는 기체상 기질로부터 미생물 발효에 의하여 생성된다. 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 산과, 임의로는 알콜 등의 생성물을 생성할 수 있는 활발히 성장하고 있는 미생물 배양물은, 미생물 배양물의 적어도 일부가 1종 이상의 산을 소모하고 1종 이상의 이에 대응하는 알콜을 생성할 수 있도록 교란시킬 수 있다. 이는, 알콜, 특히 에탄올로 직간접적으로 환원될 발효액 중에 존재하는 산의 적어도 일부에 기인한 것일 수 있다. 이는 발효 반응의 "전환기"로 언급될 수 있다. 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 발효 반응은, 미생물 성장이 촉진되고 알콜 및/또는 산이 생성되는 실질적으로 생성기로부터, 발효 반응 중에 CO 농도가 증가되는 전환기로 스위칭될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 상태에 있어서, 활발히 성장하고 있는 배양물의 적어도 일부는 알콜을 생성할 수 있고, 이 교란은 1종 이상의 산의 적어도 일부가 1종 이상의 알콜로 전환될 수 있도록 1종 이상의 산을 배양물에 첨가하는 것을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 방법은
(a) 생물 반응기 중에서, 일산화탄소를 포함하는 기질의 존재하에, 1종 이상의 세균을 배양하여 1종 이상의 산과, 임의로는 1종 이상의 알콜을 생성하는 단계와,
(b) 상기 1종 이상의 산이 1종 이상의 알콜로 전환될 수 있도록, 배양된 세균을 교란시키는 단계를 포함한다.
특정 실시 상태에 있어서, (a) 단계 도중 세균에 의하여 생성된 산의 적어도 일부는 (b) 단계 중에 이에 대응하는 알콜로 전환된다. 그러나, 특정 실시 상태에 있어서, 추가의 산을 반응기에 첨가하여, 첨가된 산의 적어도 일부가 (b) 단계에서 알콜로 전환될 수 있도록 할 수 있다. 이러한 실시 상태에 있어서, 생성된 알콜은 산의 부재하에 상기 기질 상에서 성장시, 1종 이상의 세균 균주가 생성할 수 있는 알콜은 아니다. 이 방법은 좋기로는, 매개체의 부재하에 수행된다.
본 발명의 방법의 특정 실시 상태에 있어서,
a) 생물 반응기 중에서, 일산화탄소를 포함하는 기질의 존재하에, 알콜을 생성하는 1종 이상의 세균 균주를 배양하는 단계와,
b) 배양물 중의 적어도 일부가 전환기일 때 배양된 세균에 산을 첨가하여, 알콜을 생성하는 단계를 포함한다.
CO를 포함하는 기질을 사용하여 알콜 및/또는 산을 동시에 생성시키는 발효 방법으로는 여러 가지가 있다. 그러나, 이러한 실시예에서, 생성 속도는 일반적으로 알콜 (에탄올)보다는, 산(즉, 아세트산/아세테이트) 쪽이 우세하다.
생성기에서 전환기로 미생물 배양물을 스위칭하기 위한 적당한 교란법으로는, 발효 배지의 pH 및/또는 ORP를 변화시키는 것과, 발효액 중의 CO 농도를 변화시키는 것(이 기술 분야의 숙련자는, 기체 조성을 변화시키는 것, 기체압을 변화시키는 것, 기체 유속을 변화시키는 것, CSTR에서 교반 속도를 변화시키는 것을 포함하여, 발효법에 따라 이를 달성하는 다양한 방법에 있다는 것을 잘 알고 있다)과, 환원제를 첨가하는 것, 1종 이상의 산을 첨가하는 것이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 미생물 배양물을 교란시키는 것은 다음 중 한 가지 이상을 포함한다.
- 상기 미생물 배양물을 함유하는 액체 영양 배지의 pH를 변화시키는 것과,
- 상기 미생물 배양물을 함유하는 액체 영양 배지의 ORP를 변화시키는 것과,
- 상기 생물 반응기에 1종 이상의 산을 첨가하는 것과,
- 상기 생물 반응기에 1종 이상의 환원제를 첨가하는 것과,
- 상기 미생물 배양물을 함유하는 액체 영양 배지 중의 CO 농도를 변화시키는 것과,
- 상기 생물 반응기 중의 기체상 CO를 포함하는 기질의 CO 분압을 변화시키는 것.
본 발명의 특정 실시 상태에 관하여 집중적으로 설명하고는 있지만, 본 발명은 대응하는 산으로부터 대체적인 알콜의 생산에도 적용할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예시적인 알콜로는 에탄올, 1-프로판올, 1-부탄올, 1-펜탄올, 1-헥산올 및 벤질 알콜이 있다. 예시적인 이에 대응하는 산으로는 각각 아세트산, 프로피온산, n-부티르산, n-펜탄산, n-헥산산 및 벤조산이 있다. 본 발명에 따라 생산될 수 있는 추가의 알콜의 예로는 향수, 약제 및 연료 산업에서 사용되는 것들이 있다.
또한, 본 발명의 방법은 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum) 이외의 세균을 사용하여 수행할 수 있는데, 예컨대, 클로스트리디아 (Clostridia) 속, 무렐리아 (Moorella) 속, 유박테리아 (Eubacteria) 속, 아세토박테리아 (Acetobacteria) 속, 부티리박테리움 (Butyribacterium) 속 및 데술포박테리움 (Desulfobacterium) 속의 세균 종을 사용할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 클로스트리듐 룽다리 ( Clostridium ljungdahlii ), 클로스티리듐 아세티쿰 (Clostridium aceticum ), 클로스티리듐 포르믹아세티쿰 ( Clostridium formicaceticum), 무렐리아 써모아세티카 ( Moorella thermoacetica ), 무렐리아 써 모오토트로피카 ( Moorella thermoautotrophica), 유박테리움 리모숨 ( Eubacterium limosum ), 아세토박테리움 우디 ( Acetobacterium woodii ), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 ( Butyribacterium methylotrophicum), 및 데술포박테리움 오토트로피쿰 ( Desulfobacterium autotrophicum)을 사용할 수 있다.
본 발명의 특정 실시 상태는 1가지 이상의 산업 공정에 의하여 생성되는 기체류를 사용하도록 변형될 수도 있다. 이러한 공정에는 강철 제조 공정, 특히 높은 CO 함량 또는 일정 수준 (즉, 5%) 이상의 CO 함량을 갖는 기체류를 생성하는 공정이 있다. 이러한 실시 상태에 따르면, 일산화탄소 영양 세균은 좋기로는 산 및/또는 알콜, 특히 에탄올 또는 부탄올을 1개 이상의 생물 반응기에서 생산하는 데 사용된다. 이 기술 분야의 숙련자는 본 발명이 내부 연소 엔진을 가지는 차량을 비롯하여, 각종 산업용 및 폐기용 기체류에 적용될 수도 있다는 것을 본 명세서를 숙독하면 알 수 있을 것이다. 또한, 이 기술 분야의 숙련자는 동일한 또는 상이한 미생물을 사용하는 것을 포함하는 다른 발효 반응에 본 발명을 적용할 수 있다는 것을 본 명세서를 숙독하면 알 수 있을 것이다. 그러므로, 본 발명의 범위는 특정 실시 상태 및/또는 개시된 출원으로 제한되는 것이 아니라, 더 넓은 범위로 이해되어야 한다. 예컨대, 기체류의 급원은 제한되지 않으며, 그 외에도 최소한 그 성분을 발효 반응에 공급하는 것이 가능하다. 본 발명은 자동차 배기 가스 및 고용량 CO 함유 산업상 플루 가스 등의 기체상 기질로부터의 전체 탄소 포획 및/또는 에탄올 생산 및 기타 알콜 생산을 개선시키기 위한 구체적인 산업상 이용 가능성을 가진다.
발효
기체상 기질로부터의 에탄올 및 기타 알콜의 생산 방법은 알려져 있다. 예시적인 방법으로는 예컨대, 본 발명에 참조로서 포함되어 있는 WO2007/117157, WO2008/115080, US 6,340,581, US 6,136,577, US 5,593,886, US 5,807,722 및 US 5,821,111에 기재되어 있는 것들이 있다.
다수의 혐기성 세균은 CO에서 n-부탄올 및 에탄올을 비롯한 알콜로의 발효를 수행할 수 있고, 아세트산 등의 산은 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 것으로 알려져 있다. 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 이러한 세균의 예에는 WO 00/68407, EP 117309, 미국 특허 5,173,429, 5,593,886, 및 6,368,819, WO 98/00558 및 WO 02/08438에 기재되어 있는 클로스트리듐 룽다리 (Clostridium ljungdahlii)와, 클로스트리듐 카르복시디보란 (Clostridium carboxydivorans) (Liou et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: pp 2085-2091), 클로스트리듐 라그스달레이 (Clostridium ragsdalei) (WO/2008/028055) 및 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum) (Abrini et al, Archives of Microbiology 161: pp 345-351)을 비롯한 균주 등의 클로스트리듐 (Clostridium) 속의 세균이 있다. 다른 적당한 세균에는 무렐리아 에스피 (Moorella sp) HUC22-1, (Sakai et al, Biotechnology Letters 29: pp 1607-1612)를 비롯한 무렐리아 (Moorella) 속의 세균와, 카르복시도써무스 (Carboxydothermus) 속의 세균(Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G. et al (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260)이 있다. 다른 예에는 무렐리아 써모아세티카 (Moorella thermoacetica), 무렐리아 써모오토트로피카 (Moorella thermoautotrophica), 루미노코커스 프로덕투스 (Ruminococcus productus), 아세토박테리움 우디 (Acetobacterium woodii), 유박테리움 리모숨 (Eubacterium limosum), 부티로박테리움 메틸로트로피쿰 (Butyribacterium methylotrophicum), 옥소박테르 페닝기 (Oxobacter pfennigii), 메타노사르시나 바르케리 (Methanosarcina barkeri), 메타노사르시나 아세티보란스 (Methanosarcina acetivorans), 데술포토마쿨룸 쿠즈네트소비 (Desulfotomaculum kuznetsovii) (Simpa et. al. Critical Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26. Pp41-65)가 있다. 뿐만 아니라, 다른 일산화탄소 영양 혐기성 세균도 이 기술 분야의 숙련자가 이해하는 바와 같이 본 발명에 적용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 2개 이상의 세균의 혼합 배양물에 적용될 수 있다는 것도 이해하여야 한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 예시적인 미생물은 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )이다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )은 기탁 번호 19630으로 독일 미생물 기탁 센터 [German Resource Centre for Biological Material (DSMZ)]에 수탁되어 있는 균주의 특징을 갖는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)이다. 다른 실시 상태에 있어서, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )은 기탁 번호 DSMZ 10061로서 DSMZ에 수탁되어 있는 균주의 특징을 갖는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )이다.
본 발명의 방법에 사용된 세균의 배양은 혐기성 세균을 사용하여 기질을 배양 및 발효시키기 위하여 이 기술 분야에 공지되어 있는 다수의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예시적인 기술은 아래의 "실시예" 단락에 제공한다. 자세히 설명하자면, 이러한 방법들은 일반적으로 발효를 위한 기체상 기질을 사용하는 다음의 문헌에 개괄적으로 기재되어 있다. (i) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recycling, 5; 145-165; (ii) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations. Fuel. 70. 605-614; (iii) K. T. Klasson, et al. (1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J. L. Vega, et al. (1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation: Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Culture. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793; (v) J. L. Vega, et al. (1989). Study of gaseous substrate fermentations: Carbon monoxide conversion to acetate. 1. Batch culture. Biotechnology and Bioengineering. 34. 6. 774-784; (vi) J. L. Vega, et al. (1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160. 전술한 문헌들은 모두 본 발명에 참조로서 포함되어 있다.
발효는 가령 연속 교반 탱크 반응기 (CSTR), 고정 셀 반응기, 가스 리프트 반응기, 버블 컬럼 반응기 (BCR), 막 반응기, 가령, 중공 섬유 막 생물 반응기 (HFMBR), 트리클 베드 반응기 (TBR) 등의 적당한 생물 반응기에서 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 일부 실시 상태에 있어서, 이 생물 반응기는 제1 반응기, 즉 미생물이 배양되는 성장용 반응기와, 제2 반응기, 즉 성장용 반응기로부터의 발효액이 공급되어 발효 생성물 (즉, 에탄올 및 아세테이트) 대부분이 생성되는 발효용 반응기를 포함할 수 있다.
일부 실시 상태에 있어서, 기질이 기체상인 경우, 이는 승압에서 생성기 및/또는 전환기를 수행하기에 적합할 수 있다. 이러한 승압은 몇 가지 이상의 대기로 이루어질 수 있다. 이러한 시스템은 승압을 견디도록 변형된 생물 반응기를 사용하게 될 것이다. 다양한 타입의 생물 반응기가 이러한 승압을 견디도록 변형되며, 이러한 생물 반응기의 예로는 부치 오토클레이브 (Buchi AUTOKLAVTM) 반응기가 있다.
본 발명의 일부 실시 상태에 있어서, 생물 반응기는 제1 반응기, 즉 미생물이 배양되고 임의로는 산이 생성되는 성장용 반응기와, 제2 반응기, 즉 성장용 반응기로부터의 발효액이 공급되고, 모두 그런 것은 아니지만, 추가의 알콜 발효 생성물 (예컨대, 에탄올)이 생성되는 발효용 반응기를 포함할 수 있다. 앞에서도 지적한 바와 같이, 압력형 발효 생물 반응기가 사용될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시 상태에 따르면, 발효 반응을 위한 탄소 급원은 CO를 함유하는 기체상 기질이다. 이 기질은 CO를 함유하는 산업 공정의 부산물로서의 폐기체일 수 있고, 또는 자동차 배기 가스 등의 다른 급원으로부터의 폐기체일 수 있다. 일부 실시 상태에 있어서, 산업 공정은 제강공정 등의 철 금속 생성물 제조, 비철 생성물 제조, 석유 제련 공정, 석탄의 기체화, 전력 생산, 카본 블랙 제조, 암모니아 제조, 메탄올 제조 및 코크 제조로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 이들 실시 상태에 있어서, CO를 함유하는 기질은 대기로 방출되기 전에 편리한 방법을 사용하여 산업 공정으로부터 포획할 수 있다. CO를 함유하는 기질의 조성에 따라서, 이는 발효에 도입하기 전에 먼지 입자 등의 임의의 바람직하지 않은 불순물을 제거하기 위하여 전처리하는 것이 바람직할 수 있다. 예컨대, 기체상 기질을 기지의 방법으로 여과 또는 스크러빙할 수 있다.
별법으로서, CO를 함유하는 기질은 바이오매스의 기체화로부터 유래할 수도 있다. 기체화 방법은 공기 또는 산소의 제한된 공급량 하에서 바이오매스를 불완전 산화시키는 것을 포함한다. 생성된 기체는 보통 주로 CO와 H2를 함유하고, 미량의 CO2, 메탄, 에틸렌 및 에탄을 함유한다. 예컨대, 사탕 수수로부터 설탕, 또는 옥수수 또는 곡물로부터 녹말 등의 음식물의 추출 및 가공 중에 얻는 바이오매스 부산물, 또는 임업에 의하여 생성된 음식물이 아닌 바이오매스를 기체화하여, 본 발명에 사용하기에 적합한 CO를 함유하는 기체를 생성하는 것이 가능하다.
CO를 함유하는 기질은 약 20 내지 약 100 부피%, 40 내지 95 부피%, 40 내지 60 부피%, 45 내지 55 부피%의 CO 등과 같이, CO를 높은 비율로 함유한다. 특정 실시 상태에 있어서, 이 기질은 약 25 부피%, 또는 약 30 부피%, 약 35 부피%, 또는 약 40 부피%, 또는 약 45 부피%, 또는 약 50 부피%, 또는 약 55 부피%, 또는 약 60% 부피%의 CO를 포함한다. H2와 CO2가 모두 존재하는 경우, 더 낮은 농도, 가령, 6%의 CO를 함유하는 기질도 적합할 수 있다.
기질이 수소를 반드시 함유하여야 하는 것은 아니지만, H2의 존재는 본 발명의 방법에 따라 생성물이 형성되는 데 있어서 유해한 것은 아니다. 특정 실시 상태에 있어서, 수소의 존재는 알콜 생산의 전체적인 효율을 개선시킨다. 예컨대, 특정 실시 상태에 있어서, 이 기질은 약 2:1 또는 1:1 또는 1:2 비율의 H2:CO를 포함할 수 있다. 다른 실시 상태에 있어서, 이 기질류는 더 낮은 농도의 H2, 가령 5% 이하, 또는 4% 이하, 또는 3% 이하, 또는 2% 이하, 또는 1% 이하의 H2를 함유할 수 있으며, 또는 실질적으로 수소를 함유하지 않을 수 있다. 기질은 또한 예컨대, 약 1 내지 약 80 부피%, 또는 약 1 내지 약 30 부피%의 CO2를 함유할 수 있다.
보통은, 일산화탄소는 기체 상태로 발효 반응에 첨가될 것이다. 그러나, 본 발명의 방법은 이러한 상태로 기질에 첨가되는 것으로 한정되지 않는다. 예컨대, 일산화탄소는 액체 상태로 제공될 수도 있다. 가령, 액체를 일산화탄소를 함유하는 기체로 포화시키고, 이 액체를 생물 반응기에 넣는다. 이는 표준 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 예시적으로, 미세 버블 발생기 (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October , 2002)를 이러한 목적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 이 생성물은 제1 기질 및 제2 기질의 발효에 의하여 생성된다. 본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 알콜 및/또는 산은 피루베이트 또는 프럭토스나 자일로스 등의 탄수화물과 같은 제1 기질과, CO를 포함하는 기질 등의 제2 기질이 제공될 때 생성된다. 발효가 교란되는 경우, 산 (아세트산/아세테이트)의 적어도 일부는 알콜(에탄올)로 전환된다. 본 발명의 명세서를 숙독한다면, 발효에 적합한 것으로 이 기술 분야에 알려져 있는 탄수화물에는 여러 가지가 있고, 본 발명의 방법에 사용할 수 있는 탄수화물 기질을 발효시키는 데에 사용할 수 있는 여러 가지 타입의 방법이 있다는 것을 잘 알게 될 것이다. 예컨대, 적당한 기질로는, 글루코스 및 프럭토스 등의 단당류, 수크로스 또는 락토스 등의 올리고당류, 셀룰로스 또는 녹말 등의 다당류가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 탄수화물 기질 모두 (및 이의 혼합물)가 본 발명의 여러 가지 실시 상태에 사용하기에 적합하지만, 흔하게 사용될 수 있는 탄수화물 기질로는 글루코스, 프럭토스, 자일로스 및 수크로스 (및 이들의 혼합물)가 있다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 발효 가능한 당은 예컨대, 미국 특허 출원 공개 2007/0031918에 기재된 바와 같이, 전처리 및 당화 과정을 통하여, 셀룰로스성 및 리그노셀룰로스성 바이오매스로부터 얻을 수 있다는 것을, 본 발명의 명세서를 숙독하면 이 기술 분야의 숙련자는 알 수 있다. 바이오매스란 셀룰로스 또는 리그노셀룰로스 재료를 말하는 것이고, 셀룰로스와, 임의로는 추가로 헤미셀룰로스, 리그닌, 녹말, 올리고당 및/또는 단당류를 포함하는 재료를 말한다. 바이오매스로는, 바이오에너지 곡물, 잔여 농산물, 지자체의 고형 폐기물, 산업용 고체 페기물, 종이 제조로부터 나오는 슬러지, 야드 폐기물, 목재 및, 임업 폐기물이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 시판되는 프럭토스 또는 자일로스가 발효를 위한 임의의 탄소 및 에너지 공급원으로서 사용된다.
세균의 성장과, CO에서 생성물로의 발효가 발생을 가능하도록 하기 위하여는, CO를 함유하는 기질 기체 외에도, 적당한 액체 영양 배지가 생물 반응기에 공급될 필요가 있다. 영양 배지는 사용되는 미생물의 성장을 허용하기에 충분한 비타민과 미네랄을 함유하게 된다. 단일 탄소 급원으로서 CO를 사용하는 에탄올의 발효에 적합한 혐기성 매질은 이 기술 분야에 알려져 있다. 예컨대, 적당한 매질은 전술한 미국 특허 5,173,429 및 5,593,886 및 WO 02/08438, WO2007/115157 및 WO2008/115080에 기재되어 있다. 본 발명은 발효 공정에서 미생물의 성장 및/또는 알콜 생산을 지지하는 데 증가된 효율을 가지는 신규의 배지를 제공한다. 이 배지는 이하에서 더욱 자세히 설명하기로 한다.
발효는 희망하는 발효 (예컨대, CO에서 에탄올)가 일어나기 위한 적당한 조건 하에서 수행되는 것이 바람직하다. 고려되어야 할 반응 조건으로는 압력, 온도, 기체 유속, 액체 유속, 배지 pH, 배지 산화 환원 전위, 진탕 속도 (연속 교반 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종량, 액체상 중의 CO가 제한되도록 하는 최대 기체 기질 농도와, 생성물 억제를 피하기 위한 최대 생성물 농도가 있다. 적당한 조건은 WO02/08438, WO07/117157 및 WO08/115080에 기재되어 있다.
최적의 반응 조건은 사용되는 구체적인 미생물에 따라 일부 달라진다. 그러나, 일반적으로, 발효는 대기압보다는 더 높은 압력에서 수행된다. 증가된 압력에서 작동시키는 것은, 기체상으로부터 액체상으로 CO가 전달되는 속도를 상당히 증가시키는데, 이 액체상에서 에탄올의 생성을 위한 탄소 급원으로서 미생물에 의하여 CO가 취해질 수 있다. 이는 곧, 생물 반응기가 대기압이 아닌 승압에서 유지될 때 체류 시간 (공급되는 기체 유속으로 나눈 생물 반응기 중의 액체 부피로서 정의된다)이 감소될 수 있음을 의미한다.
또한, 소정의 CO에서 생성물로 전환되는 속도는, 일부는 기질 체류 시간의 함수이기 때문에, 곧 희망하는 체류 시간을 달성하는 것은 요구되는 생물 반응기의 부피를 설명하게 되는데, 가압 시스템을 사용하는 것은 요구되는 생물 반응기의 부피를 크게 감소시킬 수 있고, 발효 장치에 드는 비용을 결과적으로 감소시키게 된다. 미국 특허 5,593,886에 제공된 실시예에 따르면, 반응기 부피는 반응기 작동 압력 증가에 대하여 비례하여 감소될 수 있는데, 즉, 10 대기압에서 생물 반응기가 작동되면 1 대기압에서 작동되는 부피에 비하여 단지 1/10의 부피가 필요하게 된다.
승압에서 기체에서 에탄올로의 발효를 수행하는 것에 대한 장점은 이미 다른 곳에서 기재된 바 있다. 예컨대, WO 02/08438는 30 psig 및 75 psig의 압력 하에 수행되는 기체에서 에탄올로의 발효를 개시하고 있는데, 이때 에탄올 생성량은 각각 150 g/l/day 및 369 g/l/day이다. 그러나, 유사한 매질 및 유입 기체 조성을 사용하여 대기압에서 수행되는 예시적인 발효법은 하루에, 리터당, 10 내지 20 배 에탄올을 덜 생산하는 것으로 밝혀졌다.
CO를 함유하는 기체상 기질을 도입하는 속도는 액체상 중의 CO의 농도가 제한되는 것을 보장하는 정도인 것이 좋다. 이는 CO를 제한하는 조건의 결과가 에탄올 생성물이 배양에 의하여 소모되는 것일 수 있기 때문이다.
본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 에탄올은 밀폐된 용기에서 시스템을 교란할 때 미생물 발효에 의하여 생성된다. 본 명세서에 제공된 몇 가지 실시예에 있어서, 발효의 pH는 조절하지 않았고, 산에서 알콜로의 전환시, pH는 증가된다. 이러한 실시예에서, pH는 약 6.5까지 증가되고, 전환에 대하여 억제 효과를 가질 수 있는데, 이 기술 분야의 숙련자라면, 본 발명의 방법이 발효 매질의 pH 조절을 포함할 수 있다는 것을 잘 알 것이다.
생성물 회수
본 발명의 방법에 따른 발효법은 희망하는 생성물 (가령 에탄올 및/또는 부탄올) 및/또는 1종 이상의 부산물 (가령 아세테이트 및 부티레이트) 뿐만 아니라, 세균 세포도 포함하는 영양 배지, 발효액을 초래하게 된다.
발효 반응의 생성물은 알려진 방법으로 회수할 수 있다. 예시적인 방법에는 WO07/117157, WO08/115080, US 6,340,581, US 6,136,577, US 5,593,886, US 5,807,722 및 US 5,821,111에 기재된 것이 있다. 그러나, 간단히 예시하자면 에탄올은 분별 증류법 또는 증발법 및 추출 발효법 등의 방법에 의하여 발효액으로부터 회수될 수 있다.
발효액으로부터 에탄올을 증류시키면 에탄올과 물의 공비 혼합물을 생성한다 (즉, 에탄올 95%와 물 5%). 무수 에탄올을 분자체 에탄올 탈수 기술을 사용하여 얻을 수 있는데, 이 기술은 이 기술 분야에 잘 알려져 있다.
추출 발효 절차는 발효 미생물에 낮은 독성의 위험을 제공하는 수혼화성 용매를 사용하여, 희석 발효액으로부터 에탄올을 회수하는 것을 포함한다. 예컨대, 올레일 알콜은 이 타입의 추출 절차에 사용될 수 있는 용매이다. 올레일 알콜을 발효기에 연속 도입하면, 이 용매는 원심분리를 통하여 연속 추출 및 공급되는 발효기의 꼭대기에서 층을 형성하게 된다. 물과 세포는 올레일 알콜로부터 쉽게 분리되어, 발효기로 되돌아가며, 에탄올이 든 용매는 플래쉬 증기화 장치에 공급된다. 대부분의 에탄올이 증기화되어 응축되지만, 올레일 알콜은 휘발성이 아니기 때문에, 발효에 재사용하기 위하여 회수한다.
발효 과정에서 부산물로서 생성되는 아세테이트도 이 기술 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 발효액으로부터 회수할 수 있다.
예컨대, 활성탄 필터를 포함하는 흡착 장치를 사용할 수도 있다. 이 경우에, 미생물 세포를, 적당한 분리 장치를 사용하여 발효액으로부터 먼저 제거하는 것이 좋다. 생성물 회수를 위한 세포 무함유 발효액을 생성시키는 다양한 여과법에 기반한 방법은 이 기술 분야에 알려져 있다. 투과물을 함유하는 세포 무함유 에탄올 및 아세테이트를 활성탄을 함유하는 컬럼에 통과시켜, 아세테이트를 흡착하도록 한다. 염 (아세테이트) 형태가 아닌 산 형태 (아세트산)의 아세테이트가 활성탄에 의하여 더욱 쉽게 흡착된다. 그러므로, 활성탄 컬럼에 통과시키기 전에, 발효액의 pH를 약 3 이하로 낮추어, 아세테이트 대부분을 아세트산 형태로 전환시키는 것이 좋다.
활성탄에 흡착된 아세트산은 이 기술 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 용리시킴으로써 회수할 수 있다. 예컨대, 에탄올을 사용하여 결합된 아세테이트를 용리시킬 수 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 발효법에 의하여 생성된 에탄올 그 자체를 아세테이트를 용리시키기 위하여 사용할 수 있다. 에탄올의 끓는점은 78.8℃이고, 아세트산의 끓는점은 107℃이기 때문에, 에탄올과 아세테이트는 증류법 등의 휘발성에 근거한 방법을 사용하여 서로 쉽게 분리해 낼 수 있다.
발효액으로부터 아세테이트를 회수하기 위한 다른 방법도 역시 이 기술 분야에 알려져 있고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 6,368,819 및 6,753,170은 발효액으로부터 아세트산의 추출을 위하여 사용할 수 있는 용매와, 공용매 시스템을 기재하고 있다. 에탄올의 추출 발효를 위하여 기재된 올레일 알콜계 시스템의 예로서, 미국 특허 6,368,819 및 6,753,170에 기재된 시스템은 아세트산 생성물을 추출하기 위하여 발효된 미생물의 존재 또는 부재시에 발효액과 혼합될 수 있는 수혼화성 용매/공용매를 기재하고 있다. 이어서, 아세트산 생성물을 함유하는 용매/공용매는 증류법에 의하여 발효액으로부터 분리한다. 제2 증류 단계를 용매/공용매 시스템으로부터 아세트산을 정제하기 위하여 사용할 수 있다.
발효 반응의 생성물 (예컨대, 에탄올 및 아세테이트)은 발효용 생물 반응기로부터 발효액의 일부를 제거하는 것과, 발효액으로부터 미생물 세포를 분리하는 것 (편리하게는 여과에 의하여), 그리고 발효액으로부터 동시에 또는 순차적으로 1종 이상의 생성물을 회수하는 것에 의하여 발효액으로부터 회수할 수 있다. 에탄올의 경우, 이는 증류법에 의하여 편리하게 회수될 수 있으며, 아세테이트는 전술한 바와 같은 활성탄 상에서의 흡착에 의하여 회수될 수 있다. 분리된 미생물 세포는 좋기로는 발효용 생물 반응기에 재도입된다. 에탄올 및 아세테이트가 제거된 후 남아있는 세포 무함유 투과물도 역시 좋기로는 발효용 생물 반응기에 재도입된다. 영양분 (가령, 비타민 B)이 세포 무함유 투과물에 첨가되어, 생물 반응기에 재도입되기 전에 영양 배지의 영양분을 보충한다. 또한, 전술한 바와 같이, 활성탄에 아세트산이 흡착되는 것을 증가시키기 위하여, 발효액의 pH를 조정한 경우, 이 pH는 생물 반응기에 재도입 되기에 앞서, 발효용 생물 반응기 중의 발효액의 pH와 유사하게 재조정해야만 한다.
이하, 본 발명을 비제한적인 실시예를 참고로 하여 더욱 자세히 설명하고자 한다.
산에서
알콜로
전환
가장 넓은 측면에 있어서, 본 발명은 미생물 배양물을 사용하여 산을 이에 대응하는 알콜로 전환하는 방법을 제공한다. 특정 실시 상태에 있어서, 미생물 배양물은 CO 및/또는 H2를 포함하는 기질의 존재하에, 산을 알콜로 전환시킨다.
본 발명의 방법에 따르면, 1종 이상의 일산화탄소 영양 세균을 포함하는 미생물 배양물을, 미생물 배양물이 산을 알콜로 전환시킬 수 있도록 교란시킨다. 본 발명의 방법은 1차 기질로서 CO를 활용하여, 1종 이상의 산 및/또는 알콜을 생성하는 미생물 발효 반응 범위에 적용 가능하다. 예컨대, 아세테이트, 부티레이트, 프로피오네이트, 카프로에이트, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 생성시키기 위한 발효법은 본 발명의 방법에 따라 수행할 수 있다. 본 발명의 방법은 수소를 생산하는 데에도 사용할 수 있다. 예컨대, 무렐리아 (Moorella), 클로스트리디아 (Clostridia), 루미노코커스/펩토스트렙토코커스 (Ruminococcus/Peptostreptococcus), 아세토박테리움 (Acetobacterium), 유박테리움 (Eubacterium), 부티리박테리움 (Butyribacterium), 옥소박테르 (Oxobacter), 메타노사르시나 (Methanosarcina) 및 데술포토마쿨룸 (Desulfotomaculum) 속으로부터의 일산화탄소 영양 미생물을 사용한 발효법에 의하여 이들 생성물이 생성될 수 있다.
특정 실시 상태에 있어서, 미생물 배양물은 아세트산 생성 세균을 포함하는데, 이러한 것들로는 CO를 포함하는 기질을 사용하여 아세테이트 및/또는 에탄올을 포함한 생성물을 생성하는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)이 있다. 이러한 실시 상태에 있어서, 미생물 배양물은 발효액 중의 바람직한 조건 하에 성장되어, 성장 및 아세테이트 생성을 촉진할 수 있다. 아세트산 생성 세균의 성장기 (또는 생성기)는 보통 세포 물질의 증가 (바이오매스 축적) 및 아세테이트 생성과 관련이 있으며, 알콜 생성은 거의 또는 전혀 동반되지 않는다. 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 미생물 배양물은, 발효액에 존재하는 산이 이에 대응하는 알콜로 전환될 수 있도록 (예컨대, 아세테이트가 에탄올로 그리고/또는 부티레이트가 부탄올로) 교란된다. 산에서 알콜로 전환되는 것은 전환기로서 언급할 수 있다.
본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 미생물 배양물은 생성기 도중에 배양물에 의하여 생성된 산이 알콜로 전환될 수 있도록, 교란될 수 있다. 추가적으로, 또는 별법으로서, 미생물 배양물은, 생성기 동안에 배양물에 의하여 생성되지 않은 산이 알콜로 전환될 수 있도록, 교란될 수 있다. 예컨대, 미생물 배양물에 의하여 생성되는 것이 아닌 산 (가령, 프로피오네이트, 부티레이트, 발레레이트, 헥사노에이트, 이소발레레이트, 2-메틸부티레이트)을 발효액에 첨가하여 이에 대응하는 알콜로 전환시킬 수 있다.
본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 산은 전환 단계 전에 또는 도중에 발효 반응에 일단 공급 또는 첨가된다. 이 산은 임의로는 희망하는 기간 동안에 단일 뱃치 또는 다중 뱃치 또는 연속적 방식으로 첨가될 수 있다. 생물 반응기에 첨가되는 산의 양은 다양할 수 있다. 그러나, 본 발명의 발명자는 발효액 1 리터당 산을 약 0.1 내지 100 g의 농도로 제공하는 양으로 산을 첨가하는 것을 예상한다. 더욱 구체적으로는, 산은 0.1 내지 50 g/L, 또는 1 내지 20 g/L 범위의 농도를 제공하는 양으로 첨가된다. 세균 배양물에 첨가되는 산의 적당한 양의 다른 예는 아래의 "실시예" 단락에 제공된다.
산은 생물 반응기에 뱃치 방식, 공급 뱃치 방식, 또는 연속 방식으로 첨가될 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 이 산은 공급 뱃치 방식 또는 연속 방식으로 첨가되어, 전술한 범위 내로 생물 반응기 중의 산의 농도를 유지하게 한다.
산은 1종 이상의 기타 성분, 캐리어, 희석제와 산을 함유하는 조성물을 포함하는, 임의의 적당한 형태로 생물 반응기에 첨가될 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 산은 좋기로는 pH 5.5로 완충되는 스톡 솔루션으로서 제조되어, 생물 반응기에 첨가된다.
본 발명에 사용되는 산은 미생물 발효법을 비롯한 임의의 다수의 공지된 방법으로 생성될 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 산은 예컨대 탄수화물 또는 일산화탄소를 포함하는 기질 상에서 미생물 발효에 의하여 생성된다. 좋기로는, 이들은 일산화탄소를 포함하는 기질, 더욱 좋기로는, 일산화탄소를 포함하는 기체상 기질 상에서 미생물 발효에 의하여 생성된다. 산을 생산하는 데 사용되는 세균의 예에는 클로스트리디아 (Clostridia), 무렐리아 (Moorella) 속에 속하는 것들이 있고, 루미노코커스 (Ruminococcus), 유박테리아 (Eubacteria), 부티리박테리움 (Butyribacterium), 옥소박테르 (Oxobacter) 및 아세토박테리아 (Acetobacteria)도 이러한 목적으로 사용된다. 양호한 실시 상태에 있어서, 세균은 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum ), 클로스트리듐 룽다리 (Clostridium ljungdahlii), 클로스티리듐 아세티쿰 ( Clostridium aceticum ), 클로스티리듐 포르믹아세티쿰 ( Clostridium formicaceticum ), 클로스트리듐 테타노모르품 (Clostridium tetanomorphum ), 클로스트리듐 카르복시디보란 ( Clostridium carboxidivorans ), 무렐리아 써모아세티카 ( Moorella thermoacetica ), 무렐리아 써 모오토트로피카 ( Moorella thermoautotrophica ), 루미노코커스 프루덕투스 (Ruminococcus productus ), 유박테리움 리모숨 ( Eubacterium limosum ), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 ( Butyribacterium methylotrophicum ), 및 옥소박테르 페닝기 ( Oxobacter pfennigii) 및 아세토박테리움 우디 ( Acetobacterium woodii )로부터 선택된다. 숙련자라면 본 발명에 사용될 수 있는 산을 생성하는 데 사용되는 추가의 세균을 잘 알 수 있다.
본 발명에 사용하는 산을 생산하기 위한 미생물 발효법은 특히, 본 명세서에 기재된 정보를 가진 이 기술 분야의 숙련자라면 쉽게 알 수 있다. 그러나, 예를 들어 설명하자면, 부티레이트는 문헌 [Grethlein et al, 1991 (Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol 72, No 1, 58-60)]에 기재된 바와 같은 일산화탄소 함유 기체로부터 생성될 수 있다.
본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 이 방법은 미생물 발효 후, 전술한 방법에 따라 이를 이의 대응하는 알콜로 생성시키기 위하여 사용하는 것에 의하여 희망하는 산의 생성과 연결하는 연속 또는 뱃치 공급 방식이다. 이 실시 상태에 있어서, 이 방법은 a) 제1 생물 반응기 중에서 기질 (좋기로는, 일산화탄소를 포함하는 기질, 더욱 좋기로는, 일산화탄소를 포함하는 기체상 기질)을 발효시켜, 1종 이상의 산을 생성시키는 단계와, b) 제2 생물 반응기 중에서 일산화탄소를 포함하는 기질의 존재하에 1종 이상의 세균을 배양시키는 단계와, c) 상기 (a)로부터의 1종 이상의 산을, 1종 이상의 세균 균주가 전환기에 있을 때 제2 생물 반응기에 도입하여, 1종 이상의 산에 대응하는 알콜을 생성하는 단계를 포함한다. 관련 실시 상태에 있어서, 추가의 성장용 반응기는 세균을 제1 및/또는 제2 생물 반응기에 공급할 수 있다.
특정 실시 상태에서, 세균은 일산화탄소를 포함하는 기질의 존재하에 배양되지만, 다른 실시 상태에 있어서, 이 세균은 대체적인 기질, 예컨대, 당 또는 다른 탄수화물을 포함하는 기질 상에서 원하는 밀도로 일단 성장시킬 수 있다. 이어서, 산을 이에 대응하는 알콜로 전환시키기 위한 일산화탄소를 포함하는 기질로 이 세균을 전달할 수 있다. 이 실시 상태는 전술한 바와 같은 2개 반응기 시스템에서 수행할 수 있다.
탄수화물과 CO를 포함하는 기체상 기질 등의 혼합된 기질을 포함하는 발효 반응을 알콜 및/또는 산을 생산하기 위하여 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 이러한 발효 반응의 교란 시에, 산의 최소한 일부가 소모되고, 알콜 생성이 증가된다.
본 발명의 방법에 따르면, 알콜 및/또는 산은 탄수화물 등의 대체적인 기질의 미생물 발효에 의하여 생성될 수도 있다. 소정의 시점에서, 또는 과량의 산이 축적된 시점에서, CO를 생물 반응기에 첨가하고, 발효 반응을 추가로 교란시켜, 산의 적어도 일부가 알콜로 전환되도록 할 수 있다.
본 발명에 사용하는 세균에 의하여 성장 및 전환을 지지하기 위하여는 적당한 영양 배지가 생물 반응기에 공급되어야 할 필요가 있다는 것을 잘 알 것이다. 이 기술 분야의 숙련자는 본 발명에 사용하는 배지를 쉽게 알 수 있다. 그러나, 일반적으로는, 영양 배지는 CO를 포함하는 기질 상에서 세균이 성장되도록 하기에 충분한 비타민, 미네랄 및 금속을 함유할 것이다. 특히, 배지는 산이 이에 대응하는 알콜로 전환되는 데 관여할 수 있는 효소 (예컨대 CODH (CO-데하이드로게나아제) 및 AOR 효소)의 활성을 도울 수 있는 1종 이상의 금속을 포함한다. 본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 영양 배지는 트립톤을 함유하지도 않고 효모 추출물을 함유하지도 않는다. 본 발명에 사용하기에 적합한 혐기성 배지로는 아래의 "실시예" 단락에 후술하는 바와 같은 LM23 및 LM33 배지 제형물이 있다.
성장 및 생성물 형성을 보충하기 위하여 단일 타입의 배지가 사용될 수는 있지만, 본 발명의 방법에는 1종 이상의 배지가 사용되는 것이 좋다. 예컨대, 방법이 별개의 성장용 및 발효용 반응기를 사용하는 경우에, 한 가지 배지는 성장용 반응기에 사용되고, 이 한 가지 배지와 상이한 배지가 발효용 반응기에 사용되는 것이다.
세균을 배양하는 것은 좋기로는 산을 알콜로 전환시키는 것을 허용할 수 있는 적당한 조건 하에 수행된다. 고려되어야 할 반응 조건으로는 압력, 온도, 기체류 속도, 액체 유속, 배지 pH, 배지 산화 환원 전위, 진탕 속도 (연속식 교반 탱크 반응기가 사용된 경우), 접종량, 액체상 중의 CO가 제한되지 않도록 허용하는 최대 기체 기질 농도 및 생성물 억제를 회피하기 위한 최대 생성물 농도가 있다. 예시적인 조건은 후술하는 "실시예" 단락에 제공된다. 최적의 반응 조건은 사용되는 세균와, 생성되는 알콜에 따라 일부 달라진다.
CO 함유 기질의 도입 속도는 액체상 CO 농도가 한정되지 않도록 하는 정도인 것이 좋다. 왜냐하면, CO가 한정된 조건의 결과, 생성물이 배양물에 의하여 소모될 수 있기 때문이다.
본 발명의 명세서를 숙독하면, 이 기술 분야의 숙련자는 각종 발효 조건 및 발효 매개 변수는, 미생물 배양물의 적어도 일부가 생성기에서 전환기로 스위치될 수 있도록 미생물 배양물을 교란시키기 위하여 변형될 수 있음을 잘 알 것이다. 예를 들어, 발효 매개 변수는 산이 미생물 배양물에 의하여 알콜로 전환될 수 있도록 변경된다. 생성기에서 전환기로 미생물 배양물을 스위칭하기 위한 적당한 교란으로는, 발효 배지의 pH 및/또는 ORP를 변화시키는 것과, 발효액 중의 CO 농도를 변화시키는 것 (기체 조성을 변경시키는 것, 기체 압력을 변경시키는 것, 기체 유속을 변경시키는 것, CSTR 중의 교반 속도를 변경시키는 것을 비롯하여 발효법에 따라서 이를 달성하기 위한 다양한 방법이 있다)과, 환원제를 첨가하는 것, 1종 이상의 산을 첨가하는 것이 있다. 이 기술 분야의 숙련자라면 희망하는 교란을 달성하기 위한 적당한 방법을 알 수 있고, 본 발명의 방법에 따라 미생물 배양물을 교란시키기 위한 추가의 방법을 잘 알고 있다. 그러나, 몇 가지 예시적인 방법을 아래의 "실시예" 단락에 설명한다. 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 1종 이상의 산을 발효액에 첨가하는 것은 미생물 배양물의 적어도 일부가 생성기에서 전환기로 스위칭되도록 하기 위한 적당한 교란을 제공한다. 예를 들어, 활발하게 성장하고 있고 아세테이트 및 알콜을 생성하고 있는 미생물 배양물에 아세테이트를 첨가하면, 배양물은 첨가된 아세테이트의 적어도 일부를 에탄올로 전환시킨다.
본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 추가의 아세테이트는 약 15g/L/day의 속도로 알콜 및 아세테이트를 연속 생성하는 발효 반응에 첨가될 수 있다. 결론적으로, 이 배양물은 6~15g/L/day의 속도로 아세테이트를 에탄올로 전환시키게 된다.
다른 한 가지의 실시 상태에 있어서, 발효액 CO 농도를 변화시키거나, 환원제를 첨가하는 등의 한 가지 이상의 다른 교란과 함께 추가의 산을 첨가할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 임의의 적당한 환원제를 사용할 수는 있지만, 예시하자면, 디티온산염 (가령, 디티온산나트륨), 황화물염 (가령, 황화나트륨) 또는 시스테인이 있고, 임의로는 추가의 산을 발효 반응에 첨가하여, 미생물 배양물의 적어도 일부가 생성기에서 전환기로 스위칭될 수 있도록 하여, 산에서 이에 대응하는 알콜로 전환되게 할 수 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 황화나트륨은 주로 아세테이트를 생성하는 발효 반응에 첨가하여, 아세테이트의 적어도 일부가 에탄올로 전환되게 한다. 이 기술 분야의 숙련자는 산에서 알콜로 전환시키기에 충분하게 시스템을 교란시키기 위하여 필요한 환원제의 양을 측정할 수 있다. 그러나, 예시하자면, 환원제는 0.005 mM 내지 10 mM 또는 0.05 mM 내지 1 mM 농도 범위로 첨가할 수 있다. 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 메틸 바이올로겐 등의 산화 환원 매개체를 환원제 외에도 첨가한다. 산화 환원 매개체를 첨가하면 유해 효과가 있으므로, 본 발명의 특정 실시 상태에 따르면, 산에서 알콜로 전환시키는 방법은 좋기로는, 산화 환원 매개체의 부재하에 수행한다.
본 발명의 다른 실시 상태에 있어서, 포르메이트를 발효 반응에 첨가하여 미생물 배양물을 생성기로부터 전환기로 스위칭시킨다. 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 포르메이트 2~5g/L을 미생물 배양물에 첨가하여, 생성기 도중에 생성된 아세테이트를 에탄올로 전환시킬 수 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 포르메이트를 약 3~6g/L/day의 비율로 첨가하여, 배양물에 의하여 생성된 아세테이트의 적어도 일부가 에탄올로 전환되도록 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시 상태에 있어서, 미생물 배양물은 미생물 배양물을 함유하는 배양 배지의 pH 및/또는 ORP (개방 산화 환원 전위)를 변경시킴으로써 교란시켜, 산이 알콜로 전환될 수 있도록 한다. 이 기술 분야의 숙련자는 발효 배지의 pH 및/또는 ORP를 변경시키기 위한 수단 및/또는 방법을 잘 알 것이다. 그러나, 이를 예시하자면, 미생물 배양물을 함유하는 액체 영양 배지의 pH는 산 (가령, 염산, 황산 또는 아세트산) 또는 염기 (가령, 수산화나트륨)을 사용하여 조정할 수 있다. 마찬가지로, ORP는 pH와 함께, 또는 환원제를 첨가함으로써 독립적으로 조정할 수 있다.
특정 실시 상태에 있어서, 액체 영양 배지의 pH는 5.5로 유지되는데, 이는 생성기 도중에 생성된 아세테이트가 에탄올로 전환될 수 있도록 수산화나트륨을 첨가함으로써 5.9로 증가된다. pH를 변화시킬 때, 배지의 산화 환원 전위는 약 -430 에서 -470mV로 감소된다.
본 발명의 다른 실시 상태에 있어서, 생물 반응기 중의 CO 농도를 증가시키는 것은, 생성기에서 전환기로 미생물 배양물의 적어도 일부를 스위칭하게 한다. 특정 실시 상태에 있어서, 미생물 배양물은 CSTR 등의 교반되는 생물 반응기 중의 액체 영양 배지 중에 수립된다. CO의 낮은 용해도 때문에, 높은 세포 밀도 (예컨대, 0.5 ~5g/L)에서, 액체 영양 배지 중의 CO 농도는 용액으로 전달되는 것과 대략 동일한 속도로 미생물 배양물이 CO를 소모함에 따라 0에 가까워지는 것으로 인식된다. 액체 영양 배지 중의 CO 농도는 헨리 (Henry) 법칙에 따라 CO 분압을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 특정 실시 상태에 따르면, 미생물 배양물은 생물 반응기 중의 CO의 분압을 증가시킴으로써 교란된다.
본 발명의 한 가지 실시 상태에 따르면, 에탄올은 발효 배지 중의 CO 농도가 증가될 때 미생물 발효에 의하여 생성된다. CO의 적어도 일부는 전환기 도중 산 및/또는 알콜로 전환되지만, 에탄올 대부분은 아세트산/아세테이트의 미생물 환원에 의하여 생성될 수 있다. 일부의 발효 반응은 상승된 CO 분압에서 작동될 수 있는 것으로 인식된다. 이와 같이, 발효 배지 중의 CO 농도를 증가시키기 위하여, CO 분압을 15 psi 이상, 또는 20 psi 이상, 또는 25 psi 이상, 또는 30 psi 이상, 또는 35 psi 이상, 또는 40 psi 이상 증가시켜, 산을 알콜로 전환시킬 수 있다.
본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 발효액 중의 산의 실질적 부분은 알콜로 전환된다. 본 발명의 일부 실시 상태에 있어서, CO 농도를 증가시키면, 알콜로 전환되는 발효액 중의 적어도 60%의 사용 가능한 산을 생성시킨다. 다른 실시 상태에 있어서, 산의 적어도 70%가 알콜로 전환된다. 다른 실시 상태에 있어서, 산의 적어도 80%가 알콜로 전환된다.
본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, CO 분압은 약 15.9 psia로, 또는 20 psia 이상, 또는 30 psia 이상, 또는 40 psia 이상, 또는 50 psia 이상으로 증가되어, 산이 이에 대응하는 알콜로 전환될 수 있도록 한다. 이러한 실시 상태에 있어서, 헨리 법칙에 따르면, 액체 영양 배지 중의 CO 농도는 1 mmol 이상, 또는 1.2 mmol 이상, 또는 1.4 mmol 이상, 또는 1.6 mmol 이상, 또는 1.8 mmol 이상, 또는 2.2 mmol 이상, 또는 2.6 mmol 이상, 또는 3.2 mmol 이상으로 예상된다.
본 발명의 일부 실시 상태에 있어서, 산은 대략 12 g/L/day 이상, 또는 14 g/L/day 이상, 또는 16 g/L/day 이상, 또는 18 g/L/day 이상, 또는 20 g/L/day 이상, 또는 22 g/L/day 이상, 또는 24 g/L/day 이상의 속도로 교란 후의 기간 동안에 이에 대응하는 알콜로 전환된다 (예컨대, 교란 후 최대 1시간, 또는 최대 2시간, 또는 최대 3시간, 또는 최대 5시간 동안). 특정 실시 상태에 있어서, CO 뿐만 아니라, 수소의 존재하에, 산에서 알콜로 전환되는 속도는 교란 후, 최대 25 g/L/day, 또는 최대 26 g/L/day, 또는 최대 27 g/L/day까지 증가된다. 그러나, 전환율은 시간에 따라 둔화되는데, 일부 실시 상태에서는, 산 (예컨대, 아세테이트)은 발효 반응의 도중에 계속 축적될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 CO의 농도 (또는 분압)가 증가되면, 산 생성 및 미생물 성장을 촉진한다. 그러나, CO 농도 (또는 분압)가 충분 역치 농도 이상으로 증가되면, 산 생성 및/또는 미생물 성장이 실질적으로 억제된다. 따라서, 본 발명의 방법에 따르면, 미생물 성장 및/또는 산 생성이 CO를 첨가함으로써 조절될 수 있다. 따라서, 본 발명은 CO의 미생물 발효에 의하여 알콜 및/또는 산을 포함한 생성물의 생성을 조절하는 수단을 제공하는데, 여기에서, 발효액 중에 과량의 산이 축적되면, CO의 농도는 산의 적어도 일부가 알콜로 전환되기 위한 역치 농도 이상으로 증가될 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명은 산의 혐기성 세균 발효액으로부터 알콜을 생성시키기 위한 방법을 제공한다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 이 방법은 CO를 포함하는 기질, 좋기로는, CO를 포함하는 기체상 기질의 존재하에, 산을 혐기성 발효시키는 단계를 포함하는데, 여기서, CO의 농도는 충분 역치 농도 이상이다.
본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 에탄올은 발효 배지 중의 CO의 농도가 충분 역치 농도 이상일때 아세트산/아세테이트의 미생물 발효에 의하여 생성된다. 한 가지 실시 상태에 있어서, CO를 포함하는 기질은 발효 배지 중의 CO의 농도가 적어도 약 2.5 mmol/L의 역치 농도 이상 이도록 제공된다. 다른 실시 상태에 있어서, CO의 농도는 적어도 약 2.75 mmol/L, 적어도 약 3 mmol/L, 또는 적어도 약 3.5 mmol/L의 역치 농도 이상이다.
본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, CO를 포함하는 기질은 기체상이고, 기체상 기질은 CO의 분압이 약 37 psi 이상 이도록 제공된다. 한 가지 실시 상태에 있어서, CO 분압은 약 47 psi 이상이다.
다른 실시 상태에 있어서, 알콜 및/또는 산의 생산 방법을 제공하는데, 이 방법은 생물 반응기 중에서 제1 기질을 혐기성 발효시켜, 알콜 및/또는 산을 포함하는 1종 이상의 생성물을 생성시키는 단계를 포함하는데, 여기에서, CO를 포함하는 제2 기질이 아세테이트에 대한 에탄올의 생성을 증가시키도록 하는 시점에서 첨가될 수 있다. CO를 포함하는 제2 기질은 CO의 농도가 충분 역치 농도를 초과하도록 제공된다. 이러한 조건 하에서, 산이 소모되어, CO가 실질적으로 전환되지 않을 수 있을 때 알콜 생성이 증가된다.
본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 제1 기질은 CO를 함유한다. 그러나, 이 방법은 이러한 실시 상태로 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 본 발명의 일부 실시 상태에 있어서, 제1 기질은 피루베이트 또는 1종 이상의 탄수화물을 포함할 수 있다. 1종 이상의 탄수화물은, 예컨대, 셀룰로스, 셀룰로스 가수분해물, 녹말, 녹말 가수분해물, 글루코스, 프럭토스, 자일로스, 아라비노스, 또는 락토스일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 탄수화물은 프럭토스 또는 자일로스이다. 별법으로서, 제1 기질은 CO2 및/또는 H2를 포함할 수 있거나, 또는 발효에 의하여 산 및/또는 알콜을 생성하기에 적합한 다른 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시 상태에 있어서, 이는 알콜 및/또는 산의 생산 방법을 제공하는데, 이 방법은
(a) 1종 이상의 미생물의 배양물을 함유하는 생물 반응기 중의 제1 농도의 CO를 포함하는 기질을 제공하는 단계와,
(b) 배양물을 혐기성 발효시켜, 상기 기질로부터 알콜 및/또는 산을 포함하는 1종 이상의 생성물을 생성시키는 단계를 포함하며,
상기 생물 반응기에 제공된 기질의 농도는 산에 비하여 알콜의 생성이 증가될 수 있도록 희망하는 시점에 임의로 증가된다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 발효 배지 중의 CO의 농도가 충분 역치 농도 이하일 수 있도록 (a) 단계에 제공된다. 이러한 시간 동안에, CO 농도는 증가되고, 이 기질은 CO의 농도가 충분 역치 농도 이상일 수 있도록 제공될 수 있다.
본 발명의 추가의 실시 상태에 있어서, 이 방법은
(a) 1종 이상의 미생물의 배양물을 함유하는 생물 반응기 중의 제1 CO 분압으로 CO를 포함하는 기체상 기질을 제공하는 단계와,
(b) 상기 배양물을 혐기성 발효시켜, 상기 기질로부터 에탄올 및/또는 아세트산을 포함하는 1종 이상의 생성물을 생성시키는 단계를 포함하고,
상기 생물 반응기에 제공된 CO의 분압은 아세테이트에 비하여 에탄올의 생성이 증가될 수 있도록 희망하는 시점에 임의로 증가된다.
특정 실시 상태에 있어서, 알콜 및 산의 생성 및/또는 미생물 성장을 발효 과정 중에 모니터링한다. 이러한 조건 하에서는, 발효는 요구되거나, 원하는 바와 같이, 실질적으로 산 생성과 실질적으로 알콜 생성 사이에서 쉽게 변화시킬 수 있다. 다양한 실시 상태에 있어서, 단계 (c) 및 (d)는 알콜 생성을 위한 최적의 조건을 유지하기 위하여 발효 단계 동안에 반복될 수 있다.
제강 공장로부터의 폐기체 등의 CO를 포함하는 산업 폐기 가스도 본 발명의 방법에 따라서 산을 알콜로 전환시키는 데 사용할 수 있다. 더욱이, H2를 포함하는 CO 무함유 기체도 본 발명의 방법에 따라 산을 알콜로 전환시키는 데 사용할 수 있다.
본 발명은 생성기에서 전환기로 스위칭하기 위하여, 또는 그 반대로 스위칭하기 위하여 CO 농도를 변화시킴으로써 생성기와 전환기 사이를 교대시키기 위한 수단을 제공한다. 예를 들어, 이 실시예에서 나타난 바와 같이, 역치 농도 이상으로 CO 농도를 증가시킨 것은 에탄올 생성율 증가와 동시에, 소모되는 발효액 중의 사용 가능한 아세트산의 실질적인 비율을 초래한다. 역치 농도 이하의 CO 농도 이하로 감소시키는 것은, 생성기에 모니터링되는 바와 같은 미생물 성장 및 산 생성을 촉진할 수 있다. 예컨대, 특정 발효 반응은 바람직한 CO 분압에서 작동시킬 수 있고, 산을 포함한 생성물을 생성시킬 수 있다. 적당한 시점에서, 또는 특정 산 농도에서 (가령, 최대 20 g/L, 또는 최대 30 g/L, 또는 최대 40 g/L, 또는 최대 50 g/L), 미생물 배양물은, 산이 알콜로 전환될 수 있도록 교란될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라서, CO 분압은 15 psi 이상, 또는 20 psi 이상, 또는 25 psi 이상, 또는 30 psi 이상, 또는 35 psi 이상, 또는 40 psi 이상 증가되어, 산이 알콜로 전환될 수 있도록 한다. 전환 후, 분압은 15 psi 이상, 또는 20 psi 이상, 또는 25 psi 이상, 또는 30 psi 이상, 또는 35 psi 이상, 또는 40 psi 이상 감소되어, 아세테이트 생성이 재개될 수 있도록 한다. 이 방법은 아세테이트 축적을 방지하고 알콜 농도를 증가시키기 위하여 반복할 수 있다.
다른 실시 상태에 있어서, 미생물 배양물은 교란 후 최대 1시간, 또는 최대 2시간, 또는 최대 3시간, 또는 최대 5시간 동안 산을 알콜로 전환시킬 수 있다. 이어서, 배양물을 높은 CO 분압으로 조정하고, 그리고 /또는 CO 농도가 감소될 수 있도록 CO를 소모함에 따라서, 배양물은 다시 산 생성으로 되돌아올 것이다.
몇 회 주기를 거치는 동안에, 알콜 수준은 증가되는 반면에, 산 수준은 낮은 농도로, 가령, 20 g/L 이하로, 또는 30 g/L 이하로, 또는 40 g/L 이하로 또는 50 g/L 이하로 유지된다.
2개 (또는 그 이상의) 생물 반응기
본 발명의 일부 실시 상태에 있어서, 발효 반응은 미생물이 배양되고 임의로는 산이 생성되는 성장용 (또는 생성용) 반응기와, 성장용 반응기로부터의 발효액이 공급되어 생성된 산 또는 첨가된 산이 알콜로 전환될 수 있도록 교란이 적용되는 전환용 반응기를 포함할 수 있는 시스템 중에서 2개 이상의 단계로 수행될 수 있다. 전술한 바와 같이, 가압 발효 생물 반응기가 사용될 수 있다.
도 5를 참고로 하여 설명하면, 발효기 (100)는 발효 조건이 미생물 바이오매스 축적 또는 성장 및/또는 산 생성을 촉진하도록 변형될 수 있는 성장용 생물 반응기 (1)을 포함한다. 예를 들어, 액체 영양 배지 성분, 영양분 공급 속도, 작동 압력, 작동 pH, 기질 함량 및 농도, 기질 공급 속도, 발효기 교반 속도 (적용되는 경우) 및 세포 밀도 등의 조건을 미생물 성장 및/또는 산 생성을 촉진하도록 조정할 수 있다. 스테디 스테이트 미생물 바이오매스 및 산 생성을 제공하기 위한 예시적인 조건은 아래의 "실시예" 단락에 제공된다.
성장용 생물 반응기 (1)에 제공되는 기질은 전술한 바와 같은 것들로부터 선택될 수 있지만, 특정 실시 상태에 있어서, 기질은 탄수화물 또는 CO를 포함하고, 또는 탄수화물과 CO의 혼합물이다.
액체 영양 배지는 미생물 바이오매스 및/또는 산이 원하는 수준 및/또는 원하는 생성율에 이를 수 있도록 하는 시간 동안에 성장용 생물 반응기 (1) 중에서 실질적으로 유지될 수 있다. 성장용 생물 반응기 중의 미생물 바이오매스 및/또는 산 생성은 이 기술 분야에 공지된 수단을 사용하여 보통의 방법으로 또는 연속적으로 모니터링할 수 있다. 더욱이, 성장용 생물 반응기 중의 조건은 성장 및/또는 산 생성을 위한 실질적으로 최적의 조건을 유지하기 위하여 조정할 수 있다.
이 기술 분야의 숙련자는, 알콜이 성장용 반응기 중의 어떤 조건 하에서 생성될 수 있는지 잘 알고 있다. 그러나, 특정 실시 상태에 있어서, 산은 성장용 생물 반응기 중의 주요 생성물이 될 것이다.
원하는 바이오매스 및/또는 산 수준 또는 속도가 얻어졌을 때의 시간에, 산의 적어도 일부와, 임의로는 미생물 바이오매스의 적어도 일부는 적당한 도관 수단에 의하여 성장용 반응기 (1)에서 전환용 반응기 (2)로 연속적으로 또는 원하는 시점에 통과된다. 예컨대, 성장용 반응기 (1) 중의 원하는 산 농도에서, 가령, 5 g/L 이상, 또는 10 g/L 이상, 또는 20 g/L 이상, 또는 30 g/L 이상, 또는 40 g/L 이상, 또는 50 g/L 이상, 또는 60 g/L 이상, 또는 70 g/L 이상, 또는 80 g/L 이상, 또는 90 g/L 이상 또는 100 g/L 이상의 농도에서, 상기 산과, 임의로는 미생물 바이오매스를 포함하는 액체 영양 배지의 적어도 일부는 생물 반응기 (2)로 통과될 수 있는데, 여기서, 미생물 배양물은 산에서 알콜로 전환될 수 있도록 교란될 수 있다.
성장용 생물 반응기 (1)에 존재하는 액체 영양 배지는 일반적으로 스테디 스테이트 바이오매스 및/또는 산 생성을 위한 적절한 조건을 제공하기 위하여 신선한 액체 영향 배지로 교체해주어야 할 것이다. 성장용 생물 반응기 (1) 중의 산 농도는 특정 미생물의 억제가 발생하는 수준 이하로 유지되어야 한다.
본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, CO를 포함하는 기질은 액체 영양 배지 중의 CO 농도가 약 2.5 mmol/L 이상 또는 약 2.75 mmol/L 이상, 또는 약 3 mmol/L 이상 또는 약 3.5 mmol/L 이상이도록 전환용 생물 반응기 (2)에 제공된다. 특정 실시 상태에 있어서, CO를 포함하는 기질은 기체상이고, CO 분압이 약 27 psi 이상, 또는 약 37 psi 이상, 또는 약 47 psi 이상이도록 제공된다.
전환용 생물 반응기 (2) 중의 산 소모 및/또는 알콜 생성율은 이 기술 분야에 알려져 있는 수단에 의하여 통상적으로 또는 연속적으로 모니터링할 수 있다. 액체 영양 배지가 원하는 알콜 농도, 가령 5 g/L 이상, 또는 10 g/L 이상, 또는 20 g/L 이상, 또는 30 g/L 이상, 또는 40 g/L 이상, 또는 50 g/L 이상, 또는 60 g/L 이상, 또는 70 g/L 이상, 또는 80 g/L 이상, 또는 90 g/L 이상 또는 100 g/L 이상에 도달한 시간에, 상기 알콜을 포함하는 액체 영양 배지 중 일부는 생성물 회수 장치 (3)로 통과될 수 있다. 전환용 생물 반응기 중의 알콜 농도는 알콜 생성을 위하여 사용된 미생물 배양물의 억제가 발생하는 수준 이하로 유지되어야 한다.
본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 성장용 생물 반응기 (1) 중에서 배양되고 성장된 미생물은 전술한 바와 같은 것 등의 일산화탄소 영양 미생물이고, 이 조건은 미생물 성장 및/또는 산 생성을 위하여 최적화된다. 제2 미생물 (이것 또한 일산화탄소 영양 미생물이다)은 전환용 생물 반응기 (2)에 제공되어, 알콜 생성을 위하여 최적화된다. 성장용 및 전환용 생물 반응기 중에 제공된 미생물 배양물은 동일하거나, 상이할 수 있다. 그러나, 특정 실시 상태에 있어서, 생물 반응기에 제공된 미생물은 모두 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)이다.
본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 성장용 생물 반응기 (1)은 세포 재사용 시스템을 포함하는데, 여기에서는 미생물 바이오매스의 적어도 일부가 성장용 생물 반응기에 존재하는 액체 영양 배지로부터 제거되어, 성장용 생물 반응기 (1)에 재도입된다. 이는 성장용 반응기 (1) 중에 바이오매스가 축적되는 것을 촉진한다. 별법으로서는, 미생물 바이오매스는 성장용 반응기에 존재하는 액체 영양 배지로부터 제거되지 않고, 전환용 생물 반응기 (2)로 직접 통과한다.
특정 실시 상태에 있어서, 미생물 배양물은 성장용 반응기 (1)에서 성장하여 산을 생성시킨다. 동일한 미생물 배양물의 적어도 일부가 전환용 반응기 (2)에 연속적으로 또는 간헐적으로, 액체 영양 배지 중의 산과 함께 통과하는데, 여기에서, 전환용 생물 반응기 (2) 중의 조건 (가령, 상승된 CO 농도)은 동일한 미생물 배양물에 의하여 알콜 생성을 촉진한다.
성장용 생물 반응기 (1) 중의 액체 영양 배지의 체류 시간은 바이오매스 축적 및/또는 산 생성을 최적화하도록 조절될 수 있다. 예컨대, 출발시, 바이오매스 축적이 바람직할 수 있고, 성장용 생물 반응기 (1) 내·외부를 통과하는 액체 영양 배지의 유속은 성장용 생물 반응기 (1) 중의 배지의 체류 시간을 증가시켜, 바이오매스 및/또는 산이 희망하는 수준 또는 속도에 있을 수 있도록 하기 위하여 감소될 수 있다.
바이오매스 및/또는 산 생성이 원하는 수준 또는 속도에 도달한 경우, 액체 체류 시간은 성장용 생물 반응기 (1)에서 전환용 생물 반응기 (2)로의 액체 영양 배지의 유속을 증가시킴으로써 감소시킬 수 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 미생물 바이오매스 및/또는 산 수준을 모니터링하고, 체류 시간은 실질적으로 스테디 스테이트 산 농도를 달성하도록 조정될 수 있다. 더욱이, 성장용 반응기 1 중의 이 조건은 5 g/L 이상, 또는 10 g/L 이상, 또는 20 g/L 이상, 또는 30 g/L 이상, 또는 40 g/L 이상, 또는 50 g/L 이상, 또는 60 g/L 이상, 또는 70 g/L 이상, 또는 80 g/L 이상, 또는 90 g/L 이상 또는 100 g/L 이상의 원하는 스테디 스테이트 산 농도를 달성하도록 조정될 수 있다.
액체 영양 배지 중의 액체 체류 시간은 전환용 생물 반응기 (2) 중에서 효율적인 알콜 생성을 수행할 수 있도록 조절될 수 있다. 예컨대, 액체 영양 배지는 일정한 속도로 연속적으로 제공될 수 있으며, 전환용 생물 반응기 (2) 중의 액체 영양 배지의 부피는 희망하는 알콜 전환율을 달성하기 위하여 적합한 체류 시간을 제공하도록 조정될 수 있다. 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 높은 CO 농도에서 알콜 전환기 중에 있는 알콜 생성 속도는 성장 속도 및/또는 산 생성 속도보다 더 빠르다. 이와 같이, 전환용 생물 반응기 (2)는 성장용 생물 반응기 (1)보다 실질적으로 더 작은데, 이는 전환용 생물 반응기 (2) 중의 실질적으로 더 낮은 액체 체류 시간을 유도한다.
본 발명의 명세서를 숙독하면, 이 기술 분야의 숙련자는 각 생물 반응기의 적합한 또는 바람직한 배치를 잘 알게 될 것이지만, 특정 실시 상태에 있어서, 미생물 배양물, 산 및 임의로는 알콜을 포함하는 액체 영양 배지의 적어도 일부는 플러그 플로우 생물 반응기 (plug flow bioreactor)로서 배치된 제2 용기로 통과한다. CO 분압은 산을 통과하는 액체 영양 배지 중 일부가 알콜로 전환될 수 있도록 플러그 플로우 용기에서 증가될 수 있다. 이 기술 분야의 숙련자는 고정식 혼합물 등의 생물 반응기를 통과하는 흐름을 유지하기 위한 적절한 수단을 알고 있다. 더욱이, 생물 반응기는 생물 반응기를 통과하는 요구되는 및/또는 원하는 CO 농도를 유지하기 위하여 추가의 기질 전달 수단을 포함할 수 있다.
다른 실시 상태에 있어서, 생성용 생물 반응기는 1개 이상의 미생물 배양물을 포함하고, 전환용 생물 반응기는 1개 이상의 미생물 배양물을 포함한다. 산 및/또는 알콜을 함유하는 발효액이 생성용 생물 반응기에서 전환용 반응기로, 또한 전환용 생물 반응기에서 생성물 회수기쪽으로 통과할 수 있지만, 각각의 미생물 배양물은 세포 재사용 시스템에 의하여 각 생물 반응기 중에 실질적으로 유지된다. 이러한 실시 상태에 있어서, 생성용 생물 반응기 중의 배양물과, 전환용 생물 반응기 중의 배양물은 산에서 알콜로 전환될 수 있는 것이라면, 상기 미생물 배양물들은 상이할 수 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 전환용 생물 반응기 중의 미생물 배양물은 높아진 CO 분압에서 산을 알콜로 전환시킨다.
특정 실시 상태에 있어서, 다른 발효 방법 및/또는 산업 공정에서 생성된 산이 원하는 경우 전환용 생물 반응기에 첨가되어, 알콜로 전환될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 상태에 있어서, 단일 전환용 생물 반응기를 공급하도록 배치되고, 산과 임의로는 미생물 바이오매스를 포함하는 액체 영양 배지를 함유한 다중 성장용 생물 반응기를 포함하는 발효기가 제공된다. 예컨대, 도 6을 참고로 하면, 발효기 (101)는 제1 및 제2 성장용 생물 반응기 (1a) 및 (1b)를 포함하며, 각각은 산을 생성하도록 배치될 수 있다. 산과 임의로는 성장용 생물 반응기 (1a 및 1b)로부터의 바이오매스를 함유하는 액체 영양 배지는 알콜 생성을 위하여 전환용 생물 반응기 (2)에 공급된다. 별법으로서, 제1 성장용 생물 반응기 (1a)는 신속한 바이오매스 축적을 위하여 배치될 수 있지만 (가령, 긴 액체 체류 시간), 제2 성장용 생물 반응기 (1b)는 최적의 산 생성을 위하여 배치될 수 있다 (가령, 짧은 액체 체류 시간). 각 성장용 생물 반응기 (1a 및 1b)의 액체 체류 시간은 전체 시스템을 통하여 최적의 알콜이 생성될 수 있는 조건을 유지하도록 조정될 수 있다.
다중 성장용 생물 반응기를 포함하는 실시 상태에 있어서, 1개 이상의 성장용 생물 반응기는 알콜 생성에 실질적으로 악영향을 미치지 않고 일정 기간 동안 (가령, 유지를 위하여) 셧다운시킬 수 있다.
실시예
배지 제조:
배지를 다음과 같이 pH 5.5로 제조하였다. 시스테인-HCl을 제외한 모든 성분을 증류수 400 ml에서 혼합하였다. 이 용액을 비등될 때까지 가열함으로써 혐기성으로 만들었고, 이를 CO 95%, CO2 5%로 된 기체의 일정류 하에서 실온으로 냉각시켰다. 일단 냉각되었으면, 시스테인-HCl을 첨가하고, 이 용액의 pH를 5.5로 조정한 다음에, 용액의 부피가 1000 ml가 되도록 하였다. 실험 내내 혐기성이 유지되도록 하였다.
세균:
클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )을 독일 미생물 보관 센터 [German Resource Centre for Biological Material (DSMZ)]로부터 입수하였다. 세균 기탁 번호는 DSMZ 10061이다. 대안적으로는, 사용된 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )은 독일 미생물 보관 센터 (DSMZ)에 기탁 번호 19630으로 수탁된 것이었다.
연속
교반
탱크 반응기 (
CSTR
) 중의 연속 발효 (통상적 장치):
5 리터 들이 생물 반응기에, 전술한 바와 같이 제조한 LM23 또는 LM33 배지 4.9 리터를 넣었다. 기체를 대기압에서 CO 95%, CO2 5%로 교체하고, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum) 배양물 100 ml를 접종하였다. 생물 반응기를 배양 시작시에 200 rpm으로 교반하며 37℃에서 유지하였다. 성장기 동안에, 400 rpm까지 진탕을 증가시켰다. pH를 5.5로 조정하였고, 5 M NaOH를 자동 첨가하여 유지하였다. 신선한 혐기성 배지를 생물 반응기에 꾸준히 첨가하여, 생물 반응기 중의 바이오매스 및 아세테이트의 규정된 수준을 유지하였다.
세럼
바틀
중의 압력 하의
뱃치
발효:
멸균 세럼 바틀을 CO를 함유하는 기체 (조성에 대해서는 실시예 참조)로 3회 세정한 다음에, -5 psi의 진공을 적용하였다. 대기압 하의 바이오매스, 아세테이트 및 에탄올 미량을 함유하는 활성 배양물 50 ml를 연속 생물 반응기로부터 234 ml 들이 세럼 바틀에 직접적으로 전달하였다. 204 ml 헤드스페이스를 요구되는 과압까지CO를 함유하는 기체로 채웠다. 진탕되는 인큐베이터를 사용하였고, 반응 온도는 37℃로 유지하였다.
세포 밀도:
이 실험에서 세포 밀도를 측정하기 위하여, 시료의 흡광도를 600 nm에서 측정하고 (스펙트로포토미터), 공개된 절차에 따라 계산함으로써 건조 중량을 측정하였다. 대사 산물의 양은 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 특징 분석하고, 일부 경우에는 기체 크로마토그래피 (GC)를 사용하여 특징 분석하였다.
HPLC
:
HPLC System Agilent 1100 Series. 이동상: 0.0025N 황산. 유속 및 압력: 0.800 mL/min. 컬럼: Alltech IOA; Catalog # 9648, 150 x 6.5 mm, 입자 크기 5 ㎛. 컬럼 온도: 60℃. 검출기: 굴절률. 검출기 온도: 45℃.
샘플 준비법:
샘플 400㎕와, 0.15M ZnSO4 50 ㎕, 0.15M Ba(OH)2 50 ㎕를 에펜도르프 튜브에 채워 넣었다. 이 튜브를 10분간 12,000 rpm으로, 4℃에서 원심 분리하였다. 상청액 200 ㎕를 HPLC 바이얼에 옮기고, 5 ㎕를 HPLC 장치에 주입하였다.
기체 크로마토그래피:
기체 크로마토그래피 HP 5890 series II는 플레임 이온화 검출기를 사용한다. 모세관 GC 컬럼: EC1000- Alltech EC1000 30 m x 0.25 mm x 0.25 um. 기체 크로마토그래피는 5 ml 세정류와 함께 수소 50 ml/분의 흐름이 있는 스플릿 모드로 작동시켰다 (1:10 스플릿). 컬럼 헤드 압력은 10 PIS이고, 이는 선형 속도 45 cm/초를 생성시켰다. 온도 프로그램은 60℃에서 시작하여, 1분간 유지하고, 215℃까지 분당 30℃씩 올리고 2분간 유지하였다. 주입기 온도는 210℃였고, 검출기 온도는 225℃였다.
샘플 준비법:
샘플 500㎕을 10분간 12,000 rpm으로 4℃에서 원심 분리한다. 상청액 100 ㎕를 물 200㎕와, 내부 표준 스파이킹 용액 100 ㎕ (10 g/L 프로판-1-올, 5 g/L 이소-부티르산, 135 mM 염산)를 함유하는 GC 바이얼에 옮긴다. 이 용액 1 ㎕를 GC 장치에 주입한다.
실시예
1: 유기산에서 이에 대응하는 알콜
로
전환
실시예
1A:
CSTR 중에서
부티르산에서
부탄올로
전환
8리터 들이 반응기에 LM23 배지 7200 ml를 넣고, 121℃에서 30분간 오토클레이빙하였다. 냉각시킨 후, 배지를 N2로 세정하였다. 이 기체를 CO 95%, CO2 5%로 교체하고, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum) 배양물 160 ml를 접종하였다. 생물 반응기를 배양의 시작시에 200 rpm으로 교반하면서 37℃에서 유지하였다. 성장기 동안에, 진탕을 500 rpm으로 증가시켰다. pH를 5.5로 맞추었고, 5 M NaOH를 자동 첨가하여 유지하였다. pH 5.5로 완충되는 부티르산 20 g을 함유하는 n-부티레이트 용액을 활발히 성장하고 있는 배양물에 직접 첨가하였다. 발효액 시료를 부티르산을 첨가한 지 0, 24, 48시간 후에 취하였다 (표 1 참조).
[표 1]
표 1 설명: pH 5.5로 유지되는 생물 반응기 중에서 아세테이트 및 에탄올을 생성하는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)의 배양물 8 리터에 의하여 n-부티레이트 20 g에서 1-부탄올로 전환
실시예
1B: 아세테이트 및
부티레이트에서
이에 대응하는 알콜
로의
전환:
전술한 바와 같이 세럼 바이얼을 준비하였다. 일단 미생물 성장이 수립되면 (생성된 에탄올 소량과 아세테이트와 관련), 다음 화합물을 세럼 바틀 중의 활성 배양물 50 ml에 넣었다: 디티온산나트륨 10 g/l 용액 1 ml, n-부티르산 용액 100 g/l 2 ml (5M 수산화나트륨으로 pH는 5.5로 조정). 기체상을 CO 95%, CO2 5% 혼합물로 된 25 psig 과압으로 교환하였다. 산을 첨가한 후, 시료 1 ml를 취하여 다양한 시점에서 대사 산물의 정량 분석을 하였다 (표 2 참조).
[표 2]
표 2 설명: 0.8 mM 메틸바이올로겐 (MV)의 존재 혹은 부재 하에, pH 5.5에서 세럼 바틀 중의 아세테이트 및 에탄올을 생성하는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)의 배양물에 의한, n-부티레이트에서 1-부탄올로의 전환. 출발 조건: 아세테이트 (4.7 g/l) 및 에탄올 (1.2 g/l) pH 5.5를 생성하는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)의 활성 배양물, 헤드스페이스: CO2 중의 95% CO의 25 psig 과압.
매개체 메틸 바이올로겐의 존재는 n-부티레이트에서 n-부탄올로 전환되는 것을 억제한다 (표 2). 더욱이, 부티르산은 부탄올로 화학량론적으로 전환되었다 (도 1).
이 결과는, 산에서 이에 대응하는 알콜로 미생물 전환하기 위한 이전에 보고된 방법에 비하여, 여러가지 중요한 장점을 가진다는 것을 나타내고 있다. 예를 들어, 첫번째로, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum ) (C.auto)이 표준 발효 조건 하에 생성될 수 있는 것으로 알려져 있지 않은 알콜을 생성하기 위하여 사용될 수 있다는 것을 입증하였다.
세균 세포는 원하는 알콜을 생성하기 위하여 산을 첨가하기 전에 회수할 필요가 없다. 산에서 알콜로 전환되는 것은 배양 배지에서 직접적으로 수행한다. 이는 세포를 취급하는 것을 감소시켜 주고, 원심 분리 및 재현탁으로 인한 세포 손실의 위험과, 산소 오염의 위험을 감소시켜 준다.
전환에는 메틸 바이올로겐 등의 매개체를 사용할 것이 요구되지 않는다. 사실상, 메틸 바이올로겐의 첨가는 산에서 알콜로 전환되는 속도를 억제하거나, 적어도 감소시키는 것으로 증명되었다. 이러한 매개체는 독성인 경우가 있다. 매개체를 사용할 필요를 없애는 것에는, 독성 화합물을 취급하여야 하는 것이 감소되고, 알콜의 생성과 관련한 비용을 감소시킨다는 장점이 있다.
최소한 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )의 경우에는, 세균 세포는 성장기 도중과, 산에서 알콜로 전환되는 시기 동안에 동일한 pH와 온도로 유지될 수 있다 (37℃, pH 5.5). 이는 공정을 간소화하고, 세포가 쇼크를 받을 위험을 낮춘다.
더욱이, 세균이 전환기에 있을 때 산의 첨가와, 세포가 일산화탄소를 계속 소모하여 산을 이에 대응하는 알콜로 전환시키면서 아세테이트와 에탄올 (예컨대)을 생성할 수 있는 능력은, 다수의 유용한 생성물을 동시에 생성할 수 있는 방법을 제공한다.
실시예
1C: 산에서 이에 대응하는 알콜
로
전환시킴
전술한 바와 같이 세럼 바이얼을 준비하였다. 그러나, 산 수용액 5 ml를 빈 바이얼에 첨가하고, pH는 NaOH를 사용하여 5.5로 조정하였다. 디티온산나트륨 ( 10g/L 수용액 0.5 mL) 또는 시스테인 (6.25g/L 수용액 1 mL)를 접종하기 전에 첨가하였다. 각 세럼 바이얼을 95% CO 기체를 사용하여 30 psig로 가압하고, 일정하게 진탕하면서 37℃로 인큐베이팅하였다. 발효액 시료를 72시간째에 취하였다 (표 3 참조).
[표 3]
표 3 설명: 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )에 의한 여러 가지 산에서 이에 대응하는 알콜로의 전환
위에서 보이는 바와 같이, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)은 환원제의 존재하에 여러 가지 산에서 이에 대응하는 알콜로 전환될 수 있다. 다시 한번 말하지만, 이는 전술한 산과 알콜이 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )의 천연 생성된 대사 산물인 것으로 알려져 있지 않기 때문에 특히 중요하다.
실시예
2:
알콜
생성에 대한 환원제 농도의 효과
실시예 2A: 알콜 생성에 대한 디티온산나트륨의 효과
전술한 바와 같이 세럼 바이얼을 준비하였다. 다만, 디티온산나트륨 (10 g/L 수용액)을 접종 전에 첨가하였다. 각 세럼 바이얼을 CO 70%, CO2 15%, N2 14%, H2 1%로 된 기체를 사용하여 30 psig로 가압하고, 일정하게 진탕하며 37℃에서 인큐베이팅하였다. 발효액 시료를 48시간 째에 취하였다 (표 4 참조).
[표 4]
표 4 설명: 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )에 의한 상이한 디티온산나트륨 농도에서 아세테이트에서 에탄올로의 전환
이 결과는 폭넓은 환원제 농도에 걸쳐 산에서 알콜로의 전환이 발생하는 동안을 강조한 것이며, 최적 농도는 약 2 g/L이다.
실시예 2B: 알콜 생성에 대한 황화나트륨 농도의 효과
234 ml 들이 멸균 세럼 바틀을 N2 100% 기체로 세정하고, 전술한 레시피에 따른 배지 (LM33) 50 ml를 첨가한 다음에, 121℃에서 20분간 오토클레이빙하였다. 이 배지를 Cr(II) 용액 (약 0.4 mM)으로 환원시키고, 황화나트륨 수용액을 첨가하였다. 세럼 바틀에 연속 생물 반응기로부터의 활발히 성장하고 있는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum) 배양물 2.5 ml를 접종하였다. 184 ml 헤드스페이스를 CO 70%, H2 1%, CO2 15% 및 N2 14%로 된 기체로 3회 세정하고, -14 psig로 진공처리하여, 배경 N2를 제거한 다음에, 30 psig가 될 때까지 CO 70%, H2 1%, CO2 15%, 및 N2 14%로 된 기체를 채웠다. 이 반응 온도는 37℃로 유지하였다. 시료를 간헐적으로 취하고, 헤드스페이스를 세정한 다음에, 다음 시료로 30 psi까지 재보충하였다 (표 5 참조).
[표 5]
표 5 설명: 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )에 의한 상이한 황화나트륨 농도에서 아세테이트에서 에탄올로의 전환. 주: 다양한 황화나트륨 농도를 가진 세럼 바이얼을 2회 실시하고, 그 평균을 낸 것.
상기 결과는, 아세테이트 농도의 소폭의 증가와 관련된 짧은 지연기가 있었지만, 황화나트륨을 함유하는 각 바이얼 중의 아세테이트는 실험이 진행되는 도중에 알콜로 전환됨을 나타내고 있다.
실시예
3:
CO
분압의
효과
실시예 3A: 알콜 생성에 대한 CO 분압의 효과
전술한 바와 같이 세럼 바이얼을 준비하였다. 각 세럼 바이얼을 CO2 기체 중의 CO 95%를 사용하여 30 또는 40 또는 50 psia로 가압하고, 일정하게 진탕시키면서 37℃에서 인큐베이팅하였다. 발효액 시료는 18시간 째에 취하였다 (표 6 참조).
[표 6]
표 6 설명: 발효 18시간 후, pH 5.5에서 세럼 바틀 중의 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum) 배양물에 의한 CO2 기체 중의 CO 95%를 포함하는 기체상 기질의 대사에 미치는 상이한 헤드스페이스 과압의 영향. 출발 조건: 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)의 연속 배양물, pH 5.5으로서, 아세테이트 3.3 g/l과, 에탄올 0.01 g/l 함유.
30 psi 내지 40 psi에 있는 생물 반응기 병 내에서, 약 2 g/l 아세테이트 및 0.6 g/l 에탄올이 생성되었고, 헤드스페이스 내의 과압 감소는 약 17 psi이었다. 이는 CO의 실질적인 양이 아세테이트 생성에 사용되었음을 말한다.
놀랍게도, 50 psi에서, 약 3 g/l 아세테이트가 소모되었고, 2.6 g/l 에탄올이 생성되었다. 이 결과는, 연장된 기간 동안에 아세테이트에서 알콜로 전환이 일어나는 최적의 역치 CO 분압이 있었음을 나타낸다. CO 농도는 CO 분압에 비례하기 때문에, 이 결과는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)이 산에서 알콜로 전환시키는 충분한 CO 농도 역치를 나타낸다. 그러나, 더 낮은 압력에서 산에서 알콜로 전환될 수도 있지만, CO는 아세테이트 생성을 결핍시키게 된다. 추가로, 특히 CO (또는 H2) 결핍 조건에서는, 배양물은 알콜을 재소모하여 아세테이트를 생성할 수 있다 (실시예 4 참조).
실시예
3B:
알콜
생성에 미치는
CO
분압의
효과
이 결과에 기초하여, 상이한 탄소 급원을 보충한 배지를 채용한 동일한 기체상 기질을 사용하여 유사한 발효를 수행하였다. 전술한 바와 같이 세럼 바이얼을 준비하였다. 각 세럼 바이얼을 CO2 중의 95% CO로 된 기체 혼합물을 사용하여 40 또는 50 psia로 가압하고, 일정하게 진탕시키면서 37℃로 인큐베이팅하였다. 대조군 생물 반응기 (A)에는 보충하지 않았지만, 다른 반응기에는 일부 프럭토스 (B), 자일로스 (C) 또는 피루베이트 (D)를 보충하였다. 이들 반응기를 일정하게 진탕시키면서 37℃에서 인큐베이팅하였다. 대사 산물 및 바이오매스 농도와, 헤드스페이스 과압 및 pH를 발효 시작시, 그리고 발효 후 40시간 후에 측정하였다. 40 psia에서의 결과는 표 7에 나타내었고, 50 psia에서의 결과는 표 8에 나타내었다.
[표 7]
표 7 설명: 발효 40시간 후에, pH 5.5에서 세럼 바틀 중의 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum ) 배양에 의하여, CO2 중의 CO 95%를 포함하는 기체상 기질의 40 psia 과압의 대사. 출발 조건: 희석 속도 = 0.04 h-1에서 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )의 연속 배양, CO2 중의 CO 95%를 포함하는 기체상 기질의 연속류 (과압 없음), 아세테이트 및 에탄올 생산, pH 5.5. 아세테이트, 에탄올, 프럭토스, 자일로스, 피루베이트에 대한 데이터는 리터당 그람의 농도로 표시한다. 바이오매스는 리터당 세포의 건조 중량 (g)으로 나타낸다. 헤드스페이스의 기체의 과압은 psig로 나타낸다.
40 psia에서의 모든 생물 반응기 병에 있어서, 시험된 모든 조건에 대하여, 약 3.5 g/l 아세테이트 및 미량의 에탄올이 생성되었다. 헤드스페이스에서 압력 하강은 약 17 psig이었다. 이는 CO의 실질적인 부분이 아세테이트 생성을 위하여 소모되었음을 나타낸다. pH는 약 0.9 정도 낮아져서 4.6이 되었다. 모든 경우에, 최소한의 미생물 성장이 있었다.
[표 8]
표 8 설명: 발효 40시간 후에, pH 5.5에서 세럼 바틀 중의 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum ) 배양에 의하여, CO2 중의 CO 95%를 포함하는 기체상 기질의 50 psia 과압의 대사. 출발 조건: 희석 속도 = 0.04 h-1에서 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )의 연속 배양, CO2 중의 CO 95%를 포함하는 기체상 기질의 연속류 (과압 없음), 아세테이트 및 에탄올 생산, pH 5.5. 아세테이트, 에탄올, 프럭토스, 자일로스, 피루베이트에 대한 데이터는 리터당 g의 농도로 표시한다. 바이오매스는 리터당 세포의 건조 중량 (g)으로 나타낸다. 헤드스페이스의 기체의 과압은 psig로 나타낸다.
50 psia에서 모든 생물 반응기에 있어서, 시험된 모든 조건에 대하여, 아세테이트 상당량이 소모되었으며, 3 g/l 이상의 에탄올이 생성되었다. 아세테이트 소모와 에탄올 생성 간에는 강한 상관 관계가 있었다. 아세테이트 소모/에탄올 생성은 소모되는 아세테이트 1몰에 대하여, 에탄올 약 1몰이 생성되도록 하는 방식으로 일어난다 (표 9). 그러나, 보충된 탄수화물 (또는 피루베이트)이 실질적으로 소모되며, 광학 밀도로 측정되는 바이오매스 수준이 감소된다. 각 경우에, 헤드스페이스 중의 압력 하강은 10 psi 이하이다. 모든 경우에, pH는 약 0.9 만큼 증가되어, 6.4로 되었다.
[표 9]
표 9 설명: 표 2 및 3에 기재된 결과에 기초하여, 35 psi 과압에서 뱃치 발효에 대한 몰비
소모된 아세테이트/출발시 아세테이트 양에서 (1째줄), 발효액 중 존재하는 아세테이트의 최소한 50%, 그리고 일부 경우 75%가 승압에서 소모된다. 생성된 에탄올/출발시 아세테이트 양에서 (2째줄), 소모된 산의 적어도 60%와 일부 경우에 적어도 80%가 알콜로 치환된다. 생성된 에탄올/소모된 아세테이트 양에서 (3째줄), 발효 과정 중 소모된 아세테이트 양과 생성된 알콜 간에는 강한 상관 관계가 있었다. 40 및 50 psia 헤드스페이스 과압에서 배지 중의 용해된 CO의 이론적 양은 헨리 법칙에 기초하여 표 10에서 계산되어 있다.
[표 10]
표 10 설명: CO2 중의 CO 95%를 포함하는 기체상 기질의 상이한 헤드스페이스 과압에서의 배지 중의 용해된 CO 농도의 계산. 298 K에서 수중 CO에 대한 헨리 상수는 1052.6 L. atm. mol-1이다.
제시된 결과는 CO 기질로부터의 아세테이트 및 바이오매스의 생성으로부터, 아세테이트의 적어도 일부가 에탄올로 전환되는 것으로 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )의 대사가 변화되는 CO 분압 이상이었다는 것을 증명하여 준다. 그러므로, 37 psi 이하의 CO 분압에 대하여, 아세테이트 및 바이오매스는 CO 기체 대사의 주요 생성물이며, pH는 더욱 더 산성으로 변하고, 성장이 더 억제된다. CO 분압이 37 psi 이상인 경우에, 바이오매스 성장 및 아세테이트 생성은 억제되는 것으로 보였고, 아세테이트 소모가 일어났다. 더욱이, 에탄올 생성은 최소량의 CO 소모와 함께 발생한다. 동시에, pH는 6.5에 도달할 때까지 증가하고, 여기에서, 세균은 실질적으로 억제되며, 아세테이트에서 에탄올로의 전환이 중지되는 것으로 보인다. 시험된 농도에서 프럭토스, 자일로스 또는 피루베이트의 눈에 띄는 효과는 없었다.
실시예
3C:
알콜
생성에 미치는
CO
분압의
영향
전술한 바에 따라, 세럼 바이얼을 준비하였다. 각 세럼 바이얼을 표시한 기체를 사용하여 25 psig (40 psia)로 가압하고, 일정하게 진탕시키면서 37℃에서 인큐베이팅하였다. 발효액 시료를 1시간, 3시간 및 5시간 간격으로 취하였다 (표 11 참조).
[표 11]
표 11 설명: 5시간 동안 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)에 의한 여러 가지 CO 분압에서 아세테이트에서 알콜로의 전환
상기 결과는, 산이 알콜로 전환되는 충분 역치 CO 분압은 20 psia 미만인 것을 나타낸다. 단시간의 반응 동안에 (참고: 실시예 3A 내지C), 아세테이트는 모든 시험된 CO 분압에서 실질적으로 화학량론적으로 알콜로 전환되었다. 추가적으로, 20 psia보다 높은 CO 분압이 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)이 산에서 알콜로 전환시키기에 충분한 것이다.
실시예
4: 기체 조성의 효과
실시예
4A: 아세테이트에서 에탄올로
전환시키는
것에 미치는 순수한 기체의 효과
전술한 바와 같이 세럼 바틀을 준비하였다. 각 세럼 바이얼을 표시한 기체를 사용하여 25 psig (40 psia)로 가압하고, 일정하게 진탕시키면서 37℃에서 인큐베이팅하였다. 발효액 시료를 1시간, 3시간 및 5시간째에 취하였다 (표 12 참조).
[표 12]
표 12 설명: 대체적인 기체 조성을 사용하여 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )에 의한 아세테이트에서 에탄올로의 전환
상기 결과는, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )이 산을 알콜로 전환시키기 위하여는 CO 또는 H2 등의 환원 기체가 필요함을 명백히 나타내고 있다. 산에서 알콜로의 대사 경로는 하이드로게나아제 효소를 포함하기 때문에, CO 대신에 수소가 사용될 수 있는 것으로 간주된다. H2는 산에서 알콜로 전환시키기에 적합한 에너지원이지만, 생합성 및/또는 아세테이트 생성에 적합하지는 않으며, 여기에는 탄소 급원 뿐 아니라, 에너지 급원도 필요한 것으로 생각된다.
실시예
4B: 에탄올 생성에 대한 기체 조성의 효과
전술한 바와 같이 세럼 바이얼을 준비하였다. 그러나, 접종하기 전에, 바이얼에 NaOH(aq)로 pH 5.5로 완충되는 부티르산 용액으로 스파이킹하였다. t=0에서 최초 농도는 아세테이트 6.7g/l 및 부티레이트 0.8 g/L이었다 (에탄올 또는 부탄올이 존재하지 않았다). 발효액 시료는 24시간째에 취하였다 (표 13 참조).
[표 13]
표 13 설명: 수소의 존재 및 부재 하에서, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )에 의한 상이한 CO 분압 하에서 산에서 알콜로의 전환
부티르산 및 아세트산 등의 산은 CO/H2 혼합 기질의 존재하에 에탄올 및 부탄올을 비롯한 알콜로 전환될 수 있다. 명백하게는, H2의 부재시, 증가된 CO 분압은 전체 전환율을 개선시킨다. 그러나, H2의 존재, 특히 증가된 분압에서의 H2의 존재는 전체 전환율을 더 개선시킨다.
실시예 4C: 에탄올 생성에 대한 기체 조성의 효과
전술한 바와 같이 세럼 바이얼을 준비하였다. 각 세럼 바이얼을 표시한 기체를 사용하여 35 psig (50 psia)로 가압하고, 일정하게 진탕시키면서 37℃에서 인큐베이팅하였다. 발효액 시료를 18시간 째에 취하였다 (표 14 참조).
[표 14]
표 14 설명: 수소의 존재 및 부재 하에서, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )에 의한 상이한 CO 분압 하에서 아세테이트에서 에탄올로의 전환
클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )의 존재하에 산에서 알콜로 전환시키는 데에 CO 및 H2를 포함하는 혼합 기질을 사용할 수 있다. 흥미롭게도, 실험 기간 동안에, 아세테이트가 소모되는 양보다 더 많은 상당량의 알콜이 생성되었다. 이는 아세테이트가 에탄올로 화학량론적으로 축적될 수는 있지만, 추가의 아세테이트가 축적되고 CO가 완전히 소모되기 전까지 알콜로 전환될 수 있음을 나타낸다.
실시예
4E:
알콜
생성에 대한
CO
및
H
2
분압의
효과
전술한 바와 같이 세럼 바이얼을 준비하였다. 각 세럼 바이얼을 표시한 기체를 사용하여 35 psig (50 psia)로 가압하고, 일정하게 진탕시키면서 37℃에서 인큐베이팅하였다. 발효액 시료를 1.5시간, 3시간, 5시간 및 24시간 째에 취하였다 (표 15 참조).
[표 15]
표 15 설명: 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )에 의한 상이한 CO 및 H2 분압 하에서 아세테이트에서 에탄올로의 전환
이 결과는 H2 양이 높아졌을 때, 산에서 알콜로의 전체 전환율이 개선되었음을 나타낸다. 그러나, 실험 도중에 H2 양이 결핍됨에 따라서, 특히 낮은 H2 양에서 (예컨대, 20%), 에탄올이 아세테이트로 재전환되는 것으로 보인다.
실시예 4F: 제강 공장 폐기 가스 중의 CO 분압의 효과
전술한 바와 같이 세럼 바이얼을 준비하였다. 각 세럼 바이얼을 제강 공장 폐기 가스 (약 CO 53%, CO2 18%, N2 26%, H2 3%)를 사용하여 25 psig (40 psia)로 가압하고, 일정하게 진탕시키면서 37℃에서 인큐베이팅하였다. 발효액 시료를 1시간, 3시간, 5시간 째에 취하였다 (표 16 참조).
[표 16]
표 16 설명: 제강 공장 폐기 가스를 사용하여 다양한 CO 분압에서 아세테이트에서 에탄올로의 전환
산에서 알콜로 전환시키는 데 제강 공장 페기 가스를 사용할 수 있다. 폐기 가스 중의 CO 분압이 증가되면, 산 전환에 대하여 유리한 효과를 나타낸다.
실시예 4G: 에탄올 생성에 대한 CO 2 분압의 효과
전술한 바와 같이 세럼 바이얼을 준비하였다. 각 세럼 바이얼을 표시된 기체를 사용하여 35 psig (50 psia)로 가압하고, 일정하게 진탕시키면서 37℃에서 인큐베이팅하였다. 발효액 시료를 1시간, 3시간, 5시간 째에 취하였다 (표 17 참조).
[표 17]
표 17 설명: 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )에 의한 여러 가지 CO2 분압 하에서 아세테이트에서 에탄올로의 전환
각종 성분을 함유하는 CO를 포함하는 기질을 산에서 알콜로 전환시키는 데에 사용할 수 있다. 그러나, CO2의 증가된 수준은 알콜 생성에 약간 억제 효과를 나타낸다.
실시예
5:
포르메이트
첨가의 효과:
실시예 5A: 뱃치 용기 중의 포르메이트 농도
전술한 바와 같이 세럼 바이얼을 준비하였다. 그러나, 포르메이트 수용액을 빈 바이얼에 첨가하고, NaOH를 사용하여 pH를 5.5로 조정한 다음, 접종하였다. 각 세럼 바이얼을 CO 50%; CO2 12.5%; N2 37.5% 기체를 사용하여 25 psig로 가압하고, 일정하게 진탕시키면서 37℃에서 인큐베이팅하였다. 발효액 시료를 72시간 째에 취하였다 (표 18 참조).
[표 18]
표 18 설명: 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum )을 사용하여 상이한 농도에서 포르메이트 존재하의 아세테이트에서 에탄올로의 전환
포르메이트의 부재하에서, 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum)은 아세테이트와 소량의 알콜을 계속 생산한다. 그러나, 포르메이트가 발효 반응에 첨가되면, 아세테이트는 실질적으로 화학량론적인 양으로 알콜로 전환된다. 전환율은 저농도 포르메이트 (2 g/L)에서 가장 높은데, 이는 더 높은 포르메이트 농도에서는 억제 효과 및/또는 독성 효과를 나타낼 수 있음을 말한다.
실시예
5B:
CSTR
에
포르메이트
첨가:
CSTR 5 리터 중의 혐기성 발효 배지 (전술한 바와 같이 제조) 5 리터에, 5% (v/v) 수준으로 활발히 성장하고 있는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum) 배양물 (DSMZ 19630)을 접종하였다. CO 70, CO2 15%, H2 1%, N2 14%로 된 기체를 부피 유속 60ml/분의 확산 스파저 (sparger)를 통하여 발효 용기 저부에 도입하였다. 발효기의 초기 pH는 5.5로 유지하였다. 미생물 성장 몇 일 후에, 연속 배양물을 유속 2mL/min로, N2로 스파징한 신선한 발효 배지를 CSTR으로 도입하는 펌프에서 스위칭함으로써 수립하였다. 발효 용기 중의 발효액의 정확한 양을 유지하기 위하여 레벨 조절제를 사용하는데, 발효 용기 중의 양이 지나치게 높아졌을 때 자동적으로 스위칭해주고, 그 레벨이 세팅된 수준으로 감소될 때까지 용기 밖으로 배양물을 펌핑하는 수준 프로브 및 펌프를 사용함으로써 세팅하는데, 이는 배양물에 공급될 신선한 배지의 일정한 공급을 가능하게 하여 주고, 활발하게 성장하고 있는 생존한 배양물을 유지하게 하여 준다.
연속 작동 수일 후에, 신선한 배지 공급을 중단하고, 발효기를 뱃치 배열로 되돌렸다. 0시에 (도 2), 포름산 (15 ml)을 첨가하고, NaOH를 첨가함으로써 pH를 5.5로 조정하였다. 약 30분이 지난 후, 발효 배지의 pH는 아세테이트가 배양물에 의하여 소모되고 에탄올이 생성됨에 따라 6으로 증가되었다. 결과적으로, 추가의 포름산 (3 ml)을 첨가하여 pH를 다시 5.5로 낮추었다. 약 t=60분에, pH가 5.5 이상으로 증가되었을 때 반응기로 자동 공급되도록 배치된 공급 펌프를 통하여 포름산을 도입하였다. 포르메이트 공급 펌프를 약 5시간 동안 작동시켰는데, 이 시간은 아세테이트가 배양물에 의하여 소모되어 에탄올이 생성되는 시간이다.
이 결과는, 아세테이트를 연속 생성하는 발효 반응이 시스템의 교란에 의하여, 예컨대, 포르메이트를 첨가하는 것에 의하여, 아세테이트 생산으로부터 아세테이트에서 알콜로의 전환쪽으로 스위칭될 수 있다는 것을 나타내고 있다. 이 전환은 실험 기간 동안에 실질적으로 화학량론적이다.
실시예
6: 추가의 아세테이트 첨가의 효과
CSTR 1L 중의 혐기성 발효 배지 1 L (전술한 바와 같이 제조하되, 다음과 같은 변형을 가함: 낮은 농도의 비타민 용액 [판토텐산 없이 0.4ml/L LS03과, 판토텐산 용액 (40mg/L)의 500ul/L]을 스톡 용액에 첨가하였다)에 5% (v/v) 수준에서 활발히 성장하고 있는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum) 배양물 (DSMZ 19630)으로 접종하였다. CO 35%, H2 60%, CH4 5%로 된 기체의 연속류를 부피 유속 10 ml/분으로 확산 스파저를 통하여 발효 용기 저부에 도입하였다. 발효기의 최초 pH는 5.5로 유지하였다. 미생물 성장 몇 일 후에, 기체 유속은 20 ml/분으로 증가되었고, 진탕은 200rpm에서 500 rpm으로 가속시켰다. 신선한 배지 (전술한 바와 같이 제조하되, 다음과 같은 변형을 가함: 낮은 농도의 비타민 용액 [판토텐산 없이 0.4 ml/L LS03과, 판토텐산 용액 (40mg/L)의 1 ml/L]을 스톡 용액에 첨가하였다)을 도입하면서, 발효기 중에서 일정한 배지 부피를 유지하여 연속 배양물을 만들었다. 신선한 배지의 유속을 몇 주 동안에 6 ml/시간에서 54 ml/시간으로 증가시켰다. 몇 주 연속 작동시킨 후, 기체 공급물 조성을 CO 35% H2 45% CH4 15% CO2 5%로 바꾸고, 몇 주간 작동시켰다. 에탄올 생성율은 약 6g/L/day로 일정하였다. 52일째에, 연속 배양물에 공급된 신선한 배지에 2일간 pH 5.5로 완충되는 아세트산 15 g/L를 공급하였다. 이 기간 동안에, 알콜 생성율은 약 15g/L (53일째- 도 3)에서 12 g/L (54일째)로 증가되었다. 발효기에 도입된 아세테이트의 대부분은 알콜로 전환된 것으로 보인다.
이 결과는, 추가의 산을 첨가함으로써, 알콜을 연속 생성하는 발효 반응에 있어서, 알콜 생성율이 개선될 수 있었다는 것을 나타낸다. 추가의 산 (아세테이트)을 첨가하는 것은 첨가된 산의 실질적 부분이 에탄올 등의 알콜로 전환될 수 있도록 발효 반응을 교란시킨다.
실시예
7:
CO
를 함유하는 기체를 사용하는 에탄올 생성에 대한
pH
의 효과
1리터 들이 CSTR 중의 혐기성 LM33 발효 배지 1 L에 5% (v/v) 수준으로 활발히 성장하고 있는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum) 배양물 (DSMZ 19630)을 접종하였다. CO 70%, CO2 15%, H2 1%, CH4 14%로 된 기체의 연속류를 부피 유속 19 ml/분으로 확산 스파저를 통하여 발효 용기 저부에 도입하였다. 발효기의 최초 pH는 5.5로 세팅하였다. 실험 대부분에 대하여, 배양물의 아세트산 농도는 세포 재사용 및 배지 교환 시스템에 의하여 4 g/L 아래로 유지되었다. 이 세포를 크로스 플로우 멤브레인 비바 200 (cross flow membrane Viva 200)에 통과시키고, 여과물을 수집하고, 세포를 반응 용기에 재도입시켰다. 여과물을 신선한 배지로 교환하여, 반응기 중의 배지 부피가 일정하게 유지되도록 하였다. 3일째에, 세포 재사용 시스템을 끄고, pH는 3일간 약 5.6으로 유지되었으며, ORP는 -400 내지 -430mV에서 변동이 있었는데, 이를 증가시켰다. pH를 약 5.9로 조정하였으며, ORP는 약 -470 mV로 감소되었다.
이 결과는, pH 5.6에서 아세테이트와 에탄올이 동시에 생성되었으며, 아세테이트 과량이 생성되었음을 나타내고 있다. 도 4를 참조하면, 이 발효 단계는 미생물 성장 기간과 관련되어 있다. pH가 증가되었을 때, ORP는 약 -470 mV로 감소되었으며, 알콜 생성 속도는 약 1.2g/L/day로 증가된 반면, 일부 아세테이트는 약 0.2g/L/day의 속도로 소모되었다. 따라서, 미생물 배양은 액체 영양 배지의 pH를 조정함으로써, 아세테이트가 생성되는 생성기로부터 아세테이트가 에탄올로 전환되는 전환기로 스위칭될 수 있다.
본 발명은 과도한 실험을 하지 않고도 본 발명을 실시할 수 있게 하기 위하여, 특정 양호한 실시 상태를 참고하여 설명하였다. 이 기술 분야의 숙련자는 본 발명에는 상세히 기술된 것 이외의 변형 및 변화도 가능하다는 것을 잘 알 것이다. 본 발명은 이러한 변형 및 변화도 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 더욱이, 이 이 문헌을 독자가 이해하기 쉽도록 하기 위하여 제목, 표제 등을 제공하는데, 이것이 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되어서는 아니된다.
전술한 모든 출원, 특허 및 공개의 내용은 모두 참고 문헌으로서 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 포함된 임의의 선행 기술에 대한 내용은 전 세계 어느 나라에서 통용되는 일반적인 지식의 일부로서 인식되거나 추측되는 것이 아니고, 또한 그렇게 받아들여져서는 아니된다.
본 명세서 및 첨부된 특허 청구 범위에서, 별도로 언급하지 않은 한, "포함하다", "포함하는"이라는 등의 용어는 배타적인 의미와는 반대의 뜻을 포함하는 것으로서, 즉 "~을 포함하나, 이에 한정되지는 않는"으로 해석되어야 한다.
Claims (22)
- CO를 포함하는 기질 또는 CO와 H2를 포함하는 기질의 존재 하에 미생물 배양물을 사용하여 산을 이에 대응하는 알코올로 전환시키는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 생물 반응기에서, 상기 기질의 존재하에 1종 이상의 클로스트리듐(Clostridium) 세균 균주를 배양하여, 1종 이상의 산을 생성시키는 단계, 및
(b) 상기 1종 이상의 산 중 적어도 한 가지의 적어도 일부가 그에 대응하는 알코올로 전환되도록, 미생물 배양물의 발효 조건들 중 적어도 한 가지를 조정하는 단계로서, 상기 조정 단계는:
a. 상기 미생물 배양물을 함유하는 액체 영양 배지의 pH를 조정하는 것과,
b. 상기 미생물 배양물을 함유하는 액체 영양 배지의 개방 산화 전위(ORP)를 조정하는 것과,
c. 제2의 산을 상기 생물 반응기에 첨가하는 것과,
d. 1종 이상의 환원제를 상기 생물 반응기에 첨가하는 것과,
e. 상기 미생물 배양물을 함유하는 액체 영양 배지 중의 CO 농도를 조정하는 것과,
f. 상기 생물 반응기 내의 CO 분압을 조정하는 것
중 한 가지 이상에 의하여 수행되는 것인 단계와
(c) 알코올의 적어도 일부를 회수하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제1항에 있어서, 상기 기질 중 H2의 농도는 40 부피% 미만인 것인 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 세균 균주는 독일 미생물 보관 센터 [German Resource Centre for Biological Material (DSMZ)]에 기탁 번호 DSMZ 10061로서 수탁되어 있는 클로스티리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum) 균주인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 1종 이상의 산은 연속적으로 생산되고, 상기 1종 이상의 산은 단계 (b)에서 대응하는 알코올로 연속적으로 전환되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 1종 이상의 알코올이 추가로 생산되며, (a) 단계에서의 산의 생산량은 (a) 단계에서의 알코올의 생산량보다 상대적으로 더 많은 것인 방법.
- 제1항에 있어서, (a) 단계에서 생산되는 산은 아세테이트이고 상기 아세테이트는 (b) 단계에서 에탄올로 전환되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (a)와 단계 (b) 중 적어도 하나의 단계에서 생물 반응기에 산을 추가로 첨가하여 상기 첨가된 산을 대응하는 알코올로 전환시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, (a) 단계는 제1 생물 반응기에서 수행하고 (b) 단계는 제2 생물 반응기에서 수행하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 CO를 포함하는 기질은 CO를 15 부피% 내지 100 부피% 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 조정 단계는 포르메이트, 아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 제2의 산을 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 조정 단계는 디티온산나트륨, 시스테인, 황화나트륨 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 환원제를 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 조정 단계는 액체 영양 배지 중의 CO 농도를 적어도 1 mmol 증가시킴으로써 CO 농도를 조정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 조정 단계는 CO 분압을 적어도 15 psi 증가시킴으로써 CO 분압을 조정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 삭제
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