PT2250274E

PT2250274E - Processo de produção de álcool microbiano

Info

Publication number: PT2250274E
Application number: PT97204259T
Authority: PT
Inventors: Sean Dennis Simpson; Christophe Collet; Phuong Loan Tran; Bakir Al-Sinawi; Richard Llewellyn Sydney Forster; Matthew James Rowe; Gary Chan; Kelly Marie Mahar; Jennifer Mon Yee Fung
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Priority date: 2008-03-12
Filing date: 2009-02-18
Publication date: 2015-08-20
Also published as: EP2250274B1; AU2009224112B2; US20110059499A1; CN101998997A; EP2250274A4; JP2011512869A; US8119378B2; KR101312107B1; AU2009224112B9; ZA201006146B; HK1150631A1; KR20130084704A; BRPI0909334B1; ES2536786T3; EP2250274A1; CA2718219C; AU2009224112A1; NZ587563A; EA201071067A1; WO2009113878A1

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ÁLCOOL MICROBIANO

CAMPO A presente invenção refere-se à produção de álcoois a partir de seus ácidos correspondentes por fermentação microbiana, por fermentação microbiana de substratos compreendendo CO.

ANTECEDENTES

Os álcoois são de uso em muitas indústrias, incluindo as indústrias de perfumes, farmacêuticos e combustíveis. Etanol e butanol, por exemplo, estão rapidamente a tornar-se os principais combustíveis para o transporte de líquidos em todo o mundo. Os processos para a produção de vários álcoois são conhecidos. Produção de álcool industrial é em grande parte sintética, derivada de processos petroquímicos. No entanto, a fermentação microbiana também pode ser usada para produzir os álcoois, por exemplo -biocombustíveis, e está a tornar-se cada vez mais popular.

Os biocombustíveis para transporte são substitutos atraentes para a gasolina e estão a penetrar rapidamente mercados de combustíveis como misturas de baixa concentração. Biocombustíveis derivados a partir de fontes de plantas naturais, são mais sustentável ambientalmente do que os derivados de recursos (fósseis como a gasolina), a sua utilização e que permitam uma redução nos níveis de chamada dióxido de carbono fóssil (CO2) , o gás que é libertado para a atmosfera como um resultado da combustão do combustível. Além disso, os biocombustíveis podem ser produzidos localmente em muitas regiões geográficas, e podem agir para reduzir a dependência de recursos energéticos fósseis importados. Álcoois adequados para serem utilizados como biocombustiveis incluem o etanol, o butanol e 2,3-butanodiol, entre outros. 0 etanol está rapidamente se tornando um dos principais combustíveis para o transporte líquido rico em hidrogénio em todo o mundo. 0 consumo mundial de etanol em 2005 foi estimado em 12,2 bilhões de litros. O mercado global para a indústria de etanol combustível também tem sido previsto para continuar a crescer acentuadamente no futuro, devido a um aumento do interesse em etanol na Europa, Japão, EUA e vários países em desenvolvimento.

Por exemplo, nos EUA, o etanol é usada para produzir E10, uma mistura de 10% de etanol na gasolina. Na mistura de E10, o componente de etanol atua como um agente de oxigenação, melhorando a eficiência da combustão e reduzir a produção de poluentes atmosféricos. No Brasil, satisfaz etanol aproximadamente 30% da demanda de combustível para transporte, tanto como um agente oxigenante misturado na gasolina, ou como combustível puro em seu próprio direito. Além disso, na Europa, as preocupações ambientais em torno das consequências da Green House Gas (GHG) ter sido o estímulo para a União Europeia a criar nações-membros uma meta do mandato para o consumo de biocombustiveis de transporte sustentáveis. O butanol pode também ser utilizado como um combustível num motor de combustão interna. É de várias maneiras mais semelhantes a gasolina que é para etanol. À medida que o interesse na produção e aplicação de combustíveis ambientalmente sustentáveis reforçou o interesse em processos biológicos para produzir butanol (muitas vezes referido como bio-butanol) tem aumentado. Butanol pode ser produzido por fermentação microbiana da biomassa a partir de culturas, tais como beterraba sacarina, milho, trigo e cana-de-açúcar. No entanto, o custo desses estoques de alimentação de carboidratos é influenciada por seu valor como alimento humano ou ração animal e cultivo de fécula ou de culturas produtoras de sacarose para a produção de butanol não é economicamente sustentável em todas as geografias. Portanto, é de interesse desenvolver tecnologias para converter mais baixos recursos de carbono de custos e/ou mais abundantes em butanol combustível.

As bactérias anaeróbicas, tais como aqueles do género Clostridium, têm sido demonstrados para produzir etanol a partir de CO, CO2 e H2 através do acetil-CoA via bioquímica. Por exemplo, várias estirpes de Clostridium 1jungdahlii que produzem etanol a partir de gases encontram-se descritas em WO 00/68407, EP 117.309, US N 0 s de patente. 5.173.429, 5.593.886, e 6.368.819, WO 98/00558 e WO 02/08438. A bactéria Clostridium sp autoetanogénio também é conhecida por produzir etanol a partir de gases (Abrini et ai, Archives of Microbiology 161, pp 345-351 (1994)).

No entanto, a produção de etanol por fermentação por microrganismos de gases está tipicamente associada com a co-produção de acetato e/ou ácido acético. Como uma parte do carbono disponível é convertido no etilo/ácido acético em vez de etanol, a eficiência de produção de etanol a partir de tais processos de fermentação podem ser menos do que desejável. Além disso, a menos que o de etilo/ácido acético por-produto pode ser usado para qualquer outro fim, pode constituir um problema de eliminação de resíduos. Ácido acetato/acético é convertido em metano por microrganismos e, portanto, tem o potencial de contribuir para as emissões de GEE. Outros produtos residuais, tais como o ácido butirico/butirato de etilo, também podem ser produzidos durante os processos de fermentação utilizados vulgarmente.

Além disso, os processos de fermentação biológicos, os quais tipicamente utilizam leveduras ou bactérias, podem ser limitados à produção de um ou dois álcoois que um determinado organismo é capaz de produzir a partir do substrato sobre o qual é cultivado (por exemplo um hidrato de carbono ou gases que contém o monóxido de carbono) . Se se desejar produzir um álcool diferente, um microrganismo diferente, podem ser obrigados a ser originado. Em muitos casos, um pode não ser capaz de abastecer a bactérias capazes de produzir o álcool desejado. Portanto, é de interesse desenvolver tecnologias para converter mais baixos recursos de carbono de custos e/ou mais abundantes, tais como ácidos orgânicos, em produtos desejáveis, tais como etanol.

Os processos para a conversão microbiana de ácidos para os seus álcoois correspondentes foram descritos anteriormente: Patentes US 4.851.344;Branco e Simon, o Arch Microbiol (1992) 158: 81-84; Huber et ai, Arch Microbiol (1995) 164: 110-118. No entanto, estes métodos também apresentam um certo número de desvantagens. Por exemplo, eles exigem a utilização de mediadores químicos muitos dos quais são tóxicos e/ou caro. Além disso, os métodos utilizam extratos de células, ou células isoladas que são dormentes e são obrigadas a ser centrifugadas e ressuspensas em tampão antes da conversão dos ácidos de álcoois. Estas etapas de processamento são de trabalho intenso e aumentar o risco de os micróbios serem expostos ao oxigénio, lisados ou de outro modo danificados. A presente invenção proporciona processos para a produção de álcoois valiosos por fermentação bacteriana anaeróbia que superar certas desvantagens dos métodos conhecidos na arte, ou, pelo menos, proporcionar ao público uma escolha útil.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Num aspeto amplo, o invento proporciona um método para a conversão de um ácido no seu álcool correspondente utilizando bactérias metabolicamente ativas em crescimento sobre um substrato que contém o monóxido de carbono e/ou hidrogénio.

Em formas de realização particulares, o método inclui: a. cultura num birreator, uma ou mais estirpes de uma bactéria carboxidotrófica na presença de um substrato compreendendo CO para produzir um ou mais ácidos e, opcionalmente, um ou mais álcoois; e b. perturbando a cultura microbiana, de tal modo que, pelo menos, um ácido é convertido em pelo menos um álcool.

Tipicamente, pelo menos uma porção do(s) ácido (s) produzido no passo (a) é convertida no álcool(s) no passo (b). Adicionalmente ou alternativamente, ácido adicional pode ser adicionado ao biorreator durante o passo (a) e/ou passo (b), e convertido em pelo menos um álcool.

Em certas formas de realização, perturbando a cultura microbiana inclui um ou mais dos seguintes: • alteração do pH de um meio nutriente líquido contendo a cultura microbiana; • alteração ORP de um meio nutriente líquido contendo a cultura microbiana; • adição de um ou mais ácidos para o biorreator; • adição de um ou mais agentes para o biorreator de redução; • alteração a concentração de CO em um meio nutriente líquido contendo a cultura microbiana; • alteração da pressão parcial de CO no biorreator, em que o substrato é composto por CO gasoso.

Em formas de realização particulares, o passo de alteração da concentração de CO inclui o aumento da concentração de CO no meio nutriente líquido, pelo menos, 1 mmol.

Em outro aspeto geral, o invento proporciona um método para a produção de um álcool, o método compreendendo pelo menos os passos de: (a) cultura num biorreator de uma ou mais estirpes de bactérias na presença de um substrato que contém o monóxido de carbono; (b) adição de um ácido para o biorreator em que a uma ou mais estirpes de bactérias são de uma fase de conversão para produzir o álcool correspondente do ácido; e, em que o álcool não é produzido um álcool que as uma ou mais estirpes de bactérias são capazes de produzir quando crescendo sobre o referido substrato, na ausência do referido ácido.

Em formas de realização particulares dos aspetos acima referidos, o método é conduzido na ausência de um mediador.

Numa forma de realização, duas ou mais ácidos são adicionados ao biorreator para produzir dois ou mais álcoois correspondentes.

Em certas formas de realização, a uma ou mais bactérias são as bactérias que são capazes de utilizar a via aldeído oxidorredutase (AOR) para reduzir um ácido no seu álcool correspondente. Bactérias apropriadas incluem espécies dos gêneros Clostridia, Moorella, Eubacteria, Acetobacteria, Butribacterium e Desulfobacterium. Numa forma de realização particular, as bactérias são Clostridium autoetanogénio.

Tipicamente, o ácido é um ácido monocarboxílico ou dicarboxílico. Em formas de realização particulares o ácido é escolhido a partir de ácido acético, ácido propiónico, ácido n-butírico, ácido n-pentanóico, ácido n-hexanóico e ácido benzoico.

Em formas de realização particulares, o álcool produzido é escolhido a partir de etanol, 1-propanol, 1-butanol, 1-pentanol, 1-hexanol, e álcool benzílico.

Em outro aspeto geral, o invento proporciona um método para a produção de butanol compreendendo o método pelo menos os passos de: (a) a cultura num biorreator de uma ou mais estirpes de bactérias que são adaptados para produzir um álcool diferente de butanol na presença de um substrato que contém o monóxido de carbono; (b) a produção de butanol por adição de butirato para o biorreator em que a uma ou mais estirpes de bactérias é produzir ativamente do álcool com exceção butanol.

Em outro aspeto geral, o invento proporciona um método para a produção de butanol compreendendo o método pelo menos os passos de: (a) a cultura num biorreator de uma ou mais estirpes de bactérias que são adaptadas para a produção de etanol, na presença de um substrato que contém o monóxido de carbono; (b) a produção de butanol por adição de butirato para o biorreator em que a uma ou mais estirpes de bactérias é produzir ativamente etanol.

Noutro aspeto geral, o invento proporciona um método para a produção de um álcool compreendendo o método pelo menos os passos de: (a) a cultura num biorreator de Clostridium autoetanogénio na presença de um substrato que contém o monóxido de carbono; (b) adição de um ácido para o biorreator quando

Clostridium autoetanogénio está numa fase de conversão para produzir o álcool correspondente do ácido; e, em que o álcool não é produzido um álcool que Clostridium autoetanogénio é capaz de produzir quando crescendo sobre o referido substrato, na ausência do referido ácido.

Num aspeto preferido amplo, a invenção proporciona um método para a produção de butanol compreendendo o método pelo menos os passos de: (a) a cultura num biorreator Gostridium autoetanogénio na presença de um substrato que contém o monóxido de carbono; (b) adição de butirato para o biorreator quando Clostridium auroethanogenum está numa fase de conversão para produzir butanol.

Os métodos da invenção são tipicamente conduzidos na ausência de um mediador.

Em formas de realização particulares, o ácido adicionado a um biorreator de acordo com os métodos da invenção é produzido por fermentação microbiana de um substrato que contém o monóxido de carbono.

Em certas formas de realização, as bactérias são cultivadas num meio líquido na ausência de extrato de levedura e/ou peptona. Numa forma de realização, os meios de comunicação é LM23 ou LM33, tal como aqui depois descrito.

Noutro aspeto geral, o invento proporciona um método para a produção de um ou mais álcoois compreendendo o método pelo menos os passos de: (a) um primeiro biorreator fermentação de um substrato para produzir um ou mais ácidos; (b) no segundo biorreator cultura de uma ou mais estirpes de bactérias na presença de um substrato que contém o monóxido de carbono; (c) introdução de um ou mais ácidos a partir de (a) para o segundo biorreator num momento em que as uma ou mais estirpes de bactérias estão numa fase solventogénico para produzir os álcoois correspondentes a um ou mais ácidos; e, em que o álcool não é produzido um álcool que as uma ou mais estirpes de bactérias são capazes de produzir quando crescendo sobre o referido substrato, na ausência do referido ácido.

Em formas de realização particulares, o método é conduzido na ausência de mediador.

Em certos enquadramentos, a uma ou mais estirpes de bactérias, no segundo biorreator são como aqui definidos antes.

Noutro aspeto da invenção, é proporcionado um método para a produção de álcoois a partir da fermentação bacteriana anaeróbia de um ácido num biorreator, na presença de um substrato compreendendo CO.

Numa forma de realização, o substrato é fornecido a uma concentração de CO de tal modo que a conversão de ácido álcool é promovida.

Numa forma de realização, a concentração de CO for superior a um limiar de concentração suficiente, de tal modo que a conversão de ácido álcool é promovida. Fornecer CO para a fermentação acima deste limiar de concentração suficiente reduz ou impede a produção de ácido e/ou reduz ou previne o crescimento microbiano, enquanto promove a conversão de ácido álcool.

Numa forma de realização, o substrato é fornecido a uma concentração de CO em um meio de fermentação de, pelo menos, cerca de 2,5 mmol/L. Numa forma de realização, a concentração de CO é pelo menos cerca de 2,75 mmol/L. Numa forma de realização, a concentração de CO é pelo menos cerca de 3 mmol/L. Numa forma de realização, a concentração é de pelo menos cerca de 3,5 mmol/L.

Os especialistas na técnica irão apreciar após consideração da presente memória descritiva que há diversos métodos para aumentar a solubilidade de CO nos meios de fermentação, incluindo, sem limitação variação de temperatura e/ou a adição de agentes solubilizantes, tais como óleos. Tais métodos podem ser empregues na prática da presente invenção, tal como necessário ou desejável para atingir uma concentração de CO em particular no meio de fermentação.

Numa forma de realização, o substrato compreendendo o CO é um substrato gasoso, e a quantidade de CO dissolvido num meio de fermentação é proporcional à pressão parcial de CO na fermentação. Como tal, a concentração limiar suficiente nos meios de fermentação pode ser conseguido através do aumento da pressão parcial de CO. Numa forma de realização, o substrato gasoso é fornecido de tal forma que a pressão parcial de CO é pelo menos cerca de 37 psi. Numa outra forma de realização, a pressão parcial de CO é pelo menos cerca de 47 psi.

De acordo com os métodos da invenção, o ácido adicional pode ser fornecido para o biorreator e convertido em álcool.

Em várias formas de realização da invenção, o método inclui um passo de captura e recuperação de um ou mais álcoois produzidos pela fermentação.

Em outro aspeto da invenção, é proporcionado um método de produção de álcoois e/ou ácidos, incluindo o método a fermentação anaeróbia de um primeiro substrato num biorreator para produzir um ou mais produtos, incluindo álcoois e/ou ácidos; em que um segundo substrato que compreende CO é adicionado a um ponto de tempo desejado de tal modo que a produção de álcool, tal como etanol, em relação ao ácido, tal como acetato, aumenta.

Numa forma de realização, a adição do segundo substrato compreendendo resultados CO em pelo menos uma porção do ácido a ser convertida em álcool, desde que a concentração de CO dissolvido resultante é igual ou superior a um limiar de concentração suficiente para que a fermentação.

Numa forma de realização, o primeiro substrato também inclui CO; no entanto, o método não está limitado a tais formas de realização. Por exemplo, em algumas formas de realização, o primeiro substrato pode incluir um ou mais hidratos de carbono ou piruvato. Hidratos de carbono adequados podem incluir, mas não estão limitados a celulose, hidrolisado de celulose, amido, hidrolisado de amido, glucose, frutose, xilose, arabinose, ou a lactose. Em algumas formas de realização, o hidrato de carbono é a frutose ou a xilose. Em outras formas de realização, o primeiro substrato pode compreender CO2 e/ou H2 ou quaisquer outros componentes adequados para a produção de ácidos e/ou álcoois por fermentação.

Em várias formas de realização, o método inclui o passo de captura e recuperação de um ou mais álcoois produzidos pela fermentação.

Noutro aspeto da invenção, é proporcionado um método de produção de álcoois e/ou ácidos, incluindo o método os passos de: (a) proporcionar um substrato que compreende CO a uma primeira concentração para um biorreator contendo uma cultura de um ou mais microrganismos; e (b) anaerobicamente fermentação da cultura no biorreator para produzir um ou mais produtos, incluindo álcoois e/ou ácidos a partir do referido substrato, em que a concentração do substrato fornecido ao biorreator pode, opcionalmente, ser aumentada a um ponto de tempo desejado, de tal modo que a produção de álcoois a ácidos aumentos relativos.

Em várias formas de realização, o aumento da concentração dos resultados de substrato em pelo menos uma porção do ácido a ser convertida em álcool e/ou a concentração do substrato pode ser aumentada acima de um limiar suficiente, em que pelo menos uma porção do ácido é convertido em álcool.

Em várias formas de realização, o método inclui o passo de captura e recuperação de um ou mais produtos produzidos a partir da fermentação.

Noutro aspeto da invenção, é proporcionado um método de produção de álcoois e/ou ácidos, incluindo o método os passos de: (a) proporcionar um substrato gasoso compreendendo CO a uma pressão parcial de CO num primeiro biorreator que contém uma cultura de um ou mais micro- organismos; e (b) anaerobicamente fermentação da cultura no biorreator para produzir um ou vários produtos incluindo etanol e/ou ácido acético a partir do referido substrato, em que a pressão parcial de CO pode, opcionalmente, ser aumentada a um ponto de tempo desejado de tal modo que a produção de etanol em relação ao acetato aumenta.

Numa forma de realização, o método inclui o controlo do crescimento microbiano e/ou a concentração de um ou mais produtos e/ou concentração de CO, em que para um produto e/ou concentração de CO desejada, a pressão parcial de CO pode ser aumentada. Numa forma de realização, a pressão parcial de CO pode ser aumentada acima de 27 psi.

Em várias formas de realização, aumentando os resultados de pressão parcial de CO de pelo menos uma porção do ácido a ser convertida em álcool e/ou a pressão parcial de CO pode ser aumentado acima de um limiar suficiente, em que pelo menos uma porção do ácido é convertido em álcool.

Em várias formas de realização, o método inclui o passo de recolher e recuperar o álcool produzido pela fermentação.

De acordo com outro aspeto da invenção, proporciona-se um método de regular o crescimento microbiano e/ou a produção de ácido, o método incluindo os passos de: (c) proporcionar um substrato gasoso compreendendo CO a uma pressão parcial de CO num primeiro biorreator gue contém uma cultura de um ou mais micro- organismos; e (c) anaerobicamente fermentação da cultura no biorreator para produzir um ou mais produtos, incluindo etanol e/ou ácido acético a partir do referido substrato, em gue a pressão parcial de CO pode ser aumentado em um ponto de tempo desejado de tal modo gue o crescimento microbiano e/ou a produção de ácido é reduzido ou substancialmente inibida.

Em várias formas de realização, aumentando os resultados de pressão parcial de CO de pelo menos uma porção do ácido a ser convertida em álcool e/ou a pressão parcial de CO pode ser aumentado acima de um limiar suficiente, em gue pelo menos uma porção do ácido é convertido em álcool.

Numa forma de realização, o crescimento microbiano e/ou a produção de ácido pode ser aumentada/promovido (ou reiniciados) quando a pressão parcial de CO é reduzido.

Em outro aspeto da invenção, é proporcionado um método de regulação da produção de álcool, o método incluindo os passos de: (a) proporcionar um substrato gasoso compreendendo CO a uma pressão parcial de CO num primeiro biorreator que contém uma cultura de um ou mais micro-organismos ; (b) anaerobicamente fermentar a cultura no biorreator para produzir um ou mais produtos, incluindo etanol e/ou ácido acético a partir do referido substrato; (c) aumentar a pressão parcial de CO acima de um limiar suficiente, de tal modo que pelo menos uma porção do ácido é convertido em etanol; e (d) opcionalmente, reduzir posteriormente o CO pressão parcial abaixo do limiar de tal modo que o crescimento microbiano e a produção de ácido são promovidos.

Em várias formas de realização, a produção de álcool e o ácido e/ou o crescimento microbiano pode ser monitorizado ao longo da fermentação e/ou os passos (c) e (d) são repetidos pelo menos uma vez.

Formas de realização da invenção encontram uma aplicação particular na fermentação de ácidos na presença de um substrato gasoso compreendendo CO. 0 substrato pode compreender um gás obtido como um subproduto de um processo industrial. Em certos enquadramentos, o processo industrial é selecionado a partir do grupo que consiste de produtos de metal ferroso de fabrico, os produtos não-ferrosos fabricação, processos de refinação de petróleo, a gaseificação de biomassa, a gaseificação do carvão, a produção de energia elétrica, a produção de negro de carbono, a produção de amónia, produção de metanol e coque fabricação. Em uma forma de realização da invenção, o substrato é gasosa de gás de síntese. Numa forma de realização, o substrato gasoso compreende um gás obtido a partir de um moinho de aço. 0 substrato contendo CO conterão tipicamente uma proporção importante de CO, tal como pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% de CO, em volume, de 40% a 95% de CO, em volume, de 40% a 60% de CO por de volume, e de 45% a 55% de CO, em volume. Em formas de realização particulares, o substrato compreende cerca de 25%, ou cerca de 30%, ou cerca de 35%, ou cerca de 40%, ou cerca de 45%, ou cerca de 50% de CO, ou cerca de 55% de CO, ou cerca de 60% em volume de CO. Substratos possuindo concentrações mais baixas de CO, tal como de 6%, podem também ser adeguadas, particularmente quando H2 e CO2 estão também presentes.

Em várias formas de realização, a fermentação é levada a cabo utilizando uma cultura de uma ou mais estirpes de bactérias carboxidotrofico. Em várias formas de realização, a bactéria carboxidotrofico é seleccionado a partir de Clostridium, Moorella, Oxobacter, Peptostreptococcus, Acetobacterium, Eubacterium ou Butribacterium. Numa forma de realização, a bactéria Clostridium carboxidotrofico é autoetanogénio.

Os métodos da invenção podem ser utilizados para produzir qualquer um de uma variedade de álcoois, incluindo, sem etanol e/ou butanol limitação, através da fermentação anaeróbica de ácidos na presença de substratos, em particular substratos gasosas contendo monóxido de carbono. Os métodos da invenção também pode ser aplicada para fermentações aeróbicas, anaeróbio para fermentações aeróbicas ou de outros produtos, incluindo mas não se limitando a isopropanol, e a fermentação do que outros gases que contêm carbono substratos.

FIGURAS

Estes e outros aspetos da presente invenção, que deve ser considerada em todos os seus novos aspetos, serão evidentes a partir da descrição seguinte, que é dada por meio de exemplo apenas, com referência às figuras anexas, em que:

Figura 1: Conversão de butirato em butanol por autoetanogénio C em frascos de soro. Condições iniciais: cultura activa de C autoetanogénio, etilo produzindo (4,7 g/1) e etanol (1,2 g/L) pH 5,5, espaço superior: Sobrepressão 25 psig de 95% de CO em CO2. Condições finais: pH 6,35, acetato de etilo (4,7 g/1), etanol (3,2 g/1), espaço de topo: 14 psig sobrepressão.

Figura 2: Efeito da adição de formato de uma cultura descontínua de Clostridium autoetanogénio produção de etilo e etanol mínima. Solução de formato foi adicionada a t = 0 e t = 30 minutos (aproximadamente), em seguida, continuamente em t = 60 min (aprox).

Figura 3: Efeito da adição de etilo em uma cultura contínua de Clostridium autoetanogénio produzindo cerca de 6 g/l/dia de etanol e 1 g/l/dia de etilo. De etilo (15 g/L/dia) foi adicionada de forma contínua a partir do dia 52.

Figura 4: Efeito do pH sobre a mudança de uma cultura microbiana, compreendendo a produção de Clostridium autoetanogénio de etilo e etanol. Reciclar celular foi iniciada durante aproximadamente 2 horas, em seguida, o pH foi ajustado para 5,9 a cerca de t = 3 dias. Depois da mudança de pH, etilo foi consumido e quantidades aumentadas de etanol foram produzidos.

Figura 5: Um sistema incluindo um biorreator de crescimento e um biorreator de conversão de acordo com formas de realização particulares da invenção.

Figura 6: Um sistema incluindo múltiplos birreatores de crescimento e um biorreator de conversão de acordo com formas de realização particulares da invenção.

FORMA(S) DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO 0 que se segue é uma descrição da presente invenção, incluindo as várias formas de realização da mesma, feita em termos gerais. A invenção é adicionalmente exemplificada na descrição dada na rubrica "Exemplos" aqui a seguir, que fornece os dados experimentais apoiam a invenção, os exemplos específicos dos aspetos da invenção, e os meios de realização ilustrativas da invenção.

Produtos incluindo ácidos e álcoois podem ser produzidos a partir de um substrato que compreende CO por uma cultura microbiana. Em conformidade com os métodos da invenção, perturbação da cultura microbiana surpreendentemente resulta em consumo de ácidos com concomitante produção de álcoois pela cultura microbiana. Considera-se que este resultado pode ser devido a, pelo menos, uma parte do ácido presente no caldo de fermentação seja direta ou indiretamente reduzida ao álcool, em particular o etanol. Esta pode ser referida como a "fase de conversão" da reação de fermentação. Em conformidade com os métodos da invenção, uma reação de fermentação pode ser comutado a partir de uma fase de produção (ou de crescimento), em que o crescimento microbiano é promovido e álcoois e/ou ácidos são produzidos, para a fase de conversão através da perturbação da cultura microbiana.

Reconhece-se que, pelo menos, uma porção da cultura microbiana pode estar numa fase de produção, enquanto, pelo menos, uma porção se encontra numa fase de conversão. No entanto, em perturbações, pelo menos uma porção da cultura microbiana nos comutadores de fase de produção para a fase de conversão, de modo a que a produção de álcoois a ácidos aumentos relativos. Numa concretização particular, não existe um consumo liquido do total de ácido(s) e a produção de álcool(s).

De acordo com uma forma de realização da invenção, o etanol é produzido por fermentação microbiana, quando uma cultura de produção do produto microbiano (s), tal como etilo e etanol, opcionalmente, a partir de um substrato que compreende CO é perturbado. Pelo menos uma porção de CO pode ser convertida em ácidos e/ou álcoois seguintes perturbações, mas a maior parte do etanol é produzido por redução microbiana do ácido acético/acetato ("conversão"). Há muitos exemplos de reações de fermentação usando substratos compreendendo CO para produzir álcoois e/ou ácidos, álcoois e ácidos que são produzidos ao mesmo tempo. No entanto, em tais exemplos, a proporção do produto favorece geralmente ácido (isto é, ácido acético/acetato) ao longo de álcool (etanol) . Numa outra forma de realização da invenção, em particular as condições de fermentação pode favorecer a produção de álcool através da produção de ácido. Sob tais condições, o ácido adicional adicionado ao fermentador pode ser convertido no álcool correspondente por cultura microbiana. Por exemplo, ácido tais como o ácido butírico pode ser adicionado à reação de fermentação e convertidos em álcoois, tais como o butirato.

De acordo com os métodos da invenção, verificou-se surpreendentemente que não é necessário o uso de um mediador, tal como metilviologênio, para auxiliar a conversão do(s) ácido(s) álcool(s). Na verdade, tem sido identificado que metilviologênio tem um efeito negativo na produção de butanol por C. Autoetanogénio. Isto está em contraste com relatos de que um mediador é necessário para a conversão microbiana de ácidos para os seus álcoois correspondentes.

Embora não se pretenda ficar limitado por qualquer teoria em particular, considera-se que a conversão dos ácidos de álcoois de Clostridium autoetanogénio de acordo com o invento ocorre por meio de uma via bioquímica que envolve a enzima oxidorredutase aldeído (AOR). AOR é um exclusivo ácidos carboxílicos enzima capaz de reduzir contendo tungsténio não activados para aldeídos. 0 aldeído pode ser adicionalmente reduzido por aldeído desidrogenases de álcool. AOR representa um importante ramo da via solventogenesis. 0 cofator de tungsténio foi demonstrado ser essencial para a atividade da enzima. Estas enzimas podem ser encontradas em microrganismos fermentativos, como Closiridium, Desulfitobacterium, ePyrococcus. Os ORa melhor caracterizados pertence ao Pyrococcus furiosus cujo genoma contém cinco dos quais foram caracterizados quatro. 0 primeiro AOR de P. furiosus tem uma ampla gama de substratos mas favorece aldeídos derivados de ácidos aminados. A sua estrutura cristalina revelou a presença de um local de ligação de tungsténio-base molibdopterina. A segunda AOR, gliceraldeído-3-fosfato ferredoxina oxidorredutase (GFOR), utiliza apenas glyceraldehydes-3-fosfato e o terceiro AOR, formaldeido ferredoxina oxidorredutase (DE), prefere 1-3 aldeídos de carbono. A quarta AOR, W0R5, tem uma ampla gama de substratos. AOR também foram purificados a partir de Closiridium formicoaceticum e thermoaceticum.

Clostridium autoetanogénio contém dois genes putativos AOR partilha -56% de identidade com AOR de P. furiosus e -80% com Clostridium botulinum. Os genes AOR marcam uma diferença significativa em relação a partir do C. autoetanogénio mais próximo sequenciado, Clostridium kluyveri, cujo genoma não contenha genes AOR e produção de álcool através do produto de acetil-CoA. Contempla-se que os resultados obtidos são aplicáveis à produção de álcool a partir de qualquer sua usando ácido Clostridium autoetanogénio ou qualquer outra bactéria capaz de utilizar a via AOR correspondente.

Assim, no seu aspeto mais amplo, a invenção proporciona um método para a conversão de um ácido no seu álcool correspondente, utilizando uma cultura microbiana. Em formas de realização específicas, a cultura microbiana converte o ácido para o álcool na presença de um substrato compreendendo CO e/ou H2.

Definições A menos que definido de outra forma, os seguintes termos utilizados ao longo desta especificação são definidos como segue:

Como aqui utilizado o termo "fase de conversão" utilizado, pretende referir-se a um período de tempo durante o qual as bactérias são fermentar um ou mais ácido(s) para produzir um ou mais de álcool (s) . Tipicamente, pelo menos uma porção de uma população bacteriana será em tal fase. No entanto, não é necessário que todas as bactérias em uma população de ser álcool produzindo ativamente. A fase de conversão é caracterizada pela presença de um nível de álcool no caldo de fermentação. 0 termo "perturbar", "perturbação" e semelhantes, tal como aqui utilizado em relação a uma cultura microbiana, destina-se a incluir qualquer alteração feita que direta ou indiretamente afeta a cultura microbiana. Alterações introduzidas na cultura microbiana incluem variações das condições operacionais da fermentação, tais como o pH, a concentração de CO, ORP ou alterar a composição de um meio nutriente líquido contendo a cultura. 0 termo "cultura microbiana" e semelhantes, tal como aqui utilizado destina-se a incluir, pelo menos, um micro-organismo suportado em e/ou sobre um meio nutriente adequado para promover o crescimento e/ou produção de metabolitos.

Tal como aqui mencionado, o "álcool produzido" por um processo da invenção não é um álcool que as uma ou mais estirpes de bactérias sejam capazes de produzir quando crescendo sobre o substrato, na ausência do ácido correspondente. No entanto, deve ser apreciado que os métodos podem produzir produtos adicionais; por exemplo, um ácido ou álcool, que as bactérias fermenta do substrato sobre o qual é cultivado. 0 "álcool produzido" pelo método pode ser referida como a "álcool primário" ou "produto primário" e qualquer produto adicional como "co-produtos".

Uso de "primária" não deve ser tomado como implicando um determinado nivel de produto em relação ao co-produtos. "Mediador redox(es)" e semelhantes, tal como aqui utilizado, pretende referir-se a um transporte de eletrões que atua como um doador de eletrões reversível e/ou aceitador de eletrões. Os mediadores incluem corantes viologen (tais como metilviologênio) , e outros corantes de antraquinona, corantes de trifenilmetano quinona, phthalocyanimes, corantes metino, corantes, corantes de pirrole de porfirina, pteridinas, pteridones, flavines, e complexos de metais dos grupos secundários VI, VII e VIII. A utilização do termo "ácido", "ácidos" e semelhantes, quando se refere a adição de um "ácido" para uma cultura ou biorreator de acordo com a invenção devem ser tomados em geral, incluindo qualquer monocarboxílicos e dicarboxílicos. Em adição, referência a "ácidos(s)" deve ser entendido como incluindo referência ao equivalente de sal ou uma mistura de sal e de ácido. Da mesma forma, neste documento deve ser feita referências a ácidos específicas a incluir uma referência aos sais equivalentes (para o ácido butírico exemplo e butirato) e vice-versa. A proporção de ácido molecular de carboxilato no caldo de fermentação é dependente do pH do sistema. Exemplos de ácidos incluem o ácido acético, ácido propiónico, ácido n-butírico, ácido n-pentanóico, ácido hexanóico, e ácido benzóico. 0 termo "biorreator" inclui um dispositivo de fermentação que consiste em um ou mais vasos e/ou torres ou configurações dos tubos, que inclui o tanque com agitação contínua Reator (CSTR), Reator de Células Imobilizadas (ICR), Trickle Bed Reator (TBR), Bolha Coluna, elevação a gás Fermenter, Membrana Reator como fibra oca membrana biorreator (HFMBR), Static Mixer, ou outro vaso ou outro dispositivo adequado para contacto gás-liquido.

Tal como será aqui descrito adiante, em algumas formas de realização o biorreator pode compreender um primeiro reator de crescimento e um segundo reator de fermentação. Como tal, quando se refere à adição de um ou mais hidratos de carbono para a reação de fermentação ou biorreator deve ser entendido para incluir a adição a um ou ambos destes reatores, onde apropriado. 0 termo "substratos compreendendo monóxido de carbono" incluem qualquer sólido, liquido ou gasoso que contém material de CO que podem ser introduzidos num biorreator para a fermentação. "Substratos gasosos que contém o monóxido de carbono" incluem qualquer gás que contém monóxido de carbono. 0 substrato gasoso será tipicamente contêm uma proporção substancial das emissões de CO, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 15% a cerca de 95% de CO, em volume. 0 termo "concentração de CO dissolvido" inclui a quantidade de CO presentes num caldo de fermentação/meios como uma função do volume. 0 termo "pressão parcial de CO" e similares incluem a pressão relativa exercida sobre um sistema de CO em um substrato, incluindo o co gasoso e gases adicionais opcionais. A frase "concentração-limiar", "concentração limiar suficiente" e semelhantes, podem ser quantitativamente definidos, mas pode variar em diferentes condições de fermentação, tais como aqueles empregues com diferentes micróbios; o termo inclui a concentração ou intervalo de concentração à qual muda de um micróbio substancialmente a produção de álcool e/ou ácido a partir de um substrato, para a produção de álcool e consumo de ácido durante um período prolongado. A menos que o contexto exija de outra forma, as frases "fermentação", "processo de fermentação" ou "reação de fermentação" e semelhantes, como aqui utilizados, destinam-se a abranger tanto a fase de fase de crescimento e a biossíntese do produto de um processo que envolve o crescimento e/ou a biossíntese de um produto por um micro-organismo .

De acordo com os métodos do invento, incluindo produtos ácidos e álcoois são produzidos a partir de um substrato que compreende CO, por exemplo, um substrato gasoso compreendendo CO, por fermentação microbiana. Em formas de realização particulares da invenção, uma cultura em crescimento ativo microbiana produzir produtos, tais como(s) ácido(s) e, opcionalmente, álcool(s) pode ser perturbada de tal forma que pelo menos uma porção da cultura microbiano consome um ou mais ácido(s) e produz um ou mais álcool correspondente (s). Este resultado pode ser devido a, pelo menos, uma parte do ácido presente no caldo de fermentação seja direta ou indiretamente reduzida ao álcool, em particular o etanol. Esta pode ser referida como a "fase de conversão" da reação de fermentação. De acordo com formas de realização particulares da invenção, uma reação de fermentação pode ser comutado a partir de uma fase substancialmente a produção, em que o crescimento microbiano é promovido e álcoois e/ou ácidos são produzidos, para a fase de conversão para o aumento da concentração de CO na reação de fermentação.

Em outras formas de realização da invenção, pelo menos uma porção de uma cultura em crescimento ativo pode ser a produção de álcool(s) e a perturbação inclui a adição de um ou mais ácido (s) à cultura de modo a que pelo menos uma porção de um ou mais ácido(s) são convertidos em um ou mais de álcool(s).

De um modo geral, os métodos do invento compreendem, pelo menos, (a) a cultura num biorreator de uma ou mais estirpes de bactérias na presença de um substrato que contém o monóxido de carbono para produzir um ou mais ácidos e, opcionalmente, um ou mais álcoois, e (b) perturbação das bactérias cultivadas, de tal modo que, pelo menos, um ácido é convertido em pelo menos um álcool.

Em formas de realização particulares, pelo menos, uma parte do ácido produzido pelas bactérias durante o passo (a) é convertido no álcool correspondente no passo (b) . No entanto, em formas de realização particulares, o(s) ácido(s) adicional pode ser adicionado ao biorreator, de tal forma que pelo menos uma porção do ácido adicionado (s) são convertidas para álcool(s) no passo (b). Em tais formas de realização, o álcool produzido pode não ser um álcool que as uma ou mais estirpes de bactérias são capazes de produzir quando crescendo sobre o substrato, na ausência de ácido. 0 método é de preferência realizado na ausência de um mediador.

Numa forma de realização particular, o método compreende, pelo menos, os passos de a) a cultura num biorreator de uma ou mais estirpes de bactérias na presença de um substrato que contém o monóxido de carbono, em que as bactérias são a produção de álcool(s); e b) a adição de ácido para a bactéria em cultura, quando pelo menos uma parte da cultura é de uma fase de conversão para produzir o álcool. Há muitos exemplos de reações de fermentação usando substratos compreendendo CO para produzir álcoois e/ou ácidos, álcoois e ácidos que são produzidos ao mesmo tempo. No entanto, em tais exemplos, a proporção do produto favorece geralmente ácido (isto é, ácido acético/acetato) ao longo de álcool (etanol).

Perturbações adequados para a comutação de uma cultura microbiana a partir de uma fase de produção de uma fase de conversão incluem, mas não estão limitados a: alteração do pH e/ou ORP de um meio de fermentação; alterando a concentração de CO em um caldo de fermentação (os especialistas na arte irão apreciar existem vários métodos de conseguir isso, dependendo do método de fermentação, incluindo alteração da composição do gás, alterando a pressão do gás, alterando taxa de fluxo de gás, alterando a velocidade de agitação em um CSTR); adição de um agente redutor; adição de um ou mais ácidos.

Por conseguinte, em formas de realização particulares da invenção, perturbando a cultura microbiana inclui um ou mais dos seguintes: • alteração do pH de um meio nutriente líquido contendo a cultura microbiana; • alterando ORP de um meio nutriente líquido contendo a cultura microbiana; • adição de um ou mais ácidos para o biorreator; • adição de um ou mais agentes para o biorreator de redução; • alterando a concentração de CO em um meio nutriente líquido contendo a cultura microbiana; • alteração da pressão parcial de CO no biorreator, em que o substrato é composto por CO gasoso.

Embora a descrição seguinte concentra-se em formas de realização particulares da invenção, deverá ser apreciado que a invenção é aplicável à produção de álcoois a partir de alternativas dos seus ácidos correspondentes. Álcoois exemplares incluem etanol, 1-propanol, 1-butanol, 1-pentanol, 1-hexanol, e álcool benzílico. Ácidos correspondentes exemplares incluem ácido acético, ácido propiónico, ácido n-butírico, ácido n-pentanóico, ácido n-hexanóico, e o ácido benzoico, respetivamente. Os exemplos de outros álcoois que podem ser produzidos de acordo com a invenção incluem os de uso nas indústrias de perfume, farmacêuticas e de combustível.

Além disso, o método pode ser realizado usando outras do que as bactérias C. autoetanogénio; por exemplo, pode ser utilizado espécies bacterianas de géneros Clostridia, Moorella, eubactérias, acetobacteria, Butribacterium e Desulfobacterium. Mais particularmente, ljungdahlii

Clostridium, Clostridium aceticum, Clostridium formicaceticum, Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Eubacterium limosum, Acetobacterium woodii, Butribacterium methylotrophicum, e Desulfobacterium autotrophicum pode ser usado.

Algumas formas de realização do invento estão adaptadas para utilizar fluxos de gases produzidos por um ou mais processos industriais. Tais processos incluem processos de aço fazendo, em particular os processos que produzem uma corrente de gás com um alto teor de CO ou um teor de CO acima de um nível pré-determinado (isto é, 5%) . De acordo com tais formas de realização, as bactérias são preferivelmente carboxidotrofico usadas para produzir ácidos e/ou álcoois, em particular o etanol ou butanol, dentro de um ou mais birreatores. Os peritos na arte estarão cientes após consideração da presente descrição que a invenção pode ser aplicada a várias indústrias ou correntes de gás de resíduos, incluindo os de veículos com motor de combustão interna. Além disso, os especialistas na arte estarão cientes após consideração da presente descrição que a invenção possa ser aplicada a outras reações de fermentação, incluindo aqueles que utilizam os mesmos ou diferentes micro-organismos. Por conseguinte, pretende-se que o âmbito da invenção não se limita às formas de realização e/ou aplicações particulares descritas, mas em vez disso é para ser entendido num sentido mais amplo; por exemplo, a origem do fluxo de gás não é limitativo, com exceção de que, pelo menos, um seu componente pode ser utilizado para alimentar uma reação de fermentação. A invenção tem uma aplicabilidade particular para melhorar a captura total de carbono e/ou de produção de etanol e outros álcoois de substratos gasosos tais como gases de escape de automóveis e de grande volume de gases de combustão industriais contendo CO.

Fermentação

Os processos para a produção de etanol e outros álcoois de substratos gasosos são conhecidos. Exemplos de processos incluem os descritos por exemplo no documento W02 0 07/117157, W02008/115080, US 6.340.581, US 6.136.577, US 5.593.886, US 5.807.722 e US 5.821.111.

Um número de bactérias anaeróbias é conhecido por ser capazes de levar a cabo a fermentação do CO para álcoois, incluindo o n-butanol e etanol, e ácidos tais como ácido acético, e são adequados para utilização no processo da presente invenção. Exemplos de tais bactérias que podem ser adequados para utilização na presente invenção incluem os do género Clostridium, tais como estirpes de Clostridium Ijungdahlii, incluindo os descritos em WO 00/68407, EP 117,309, patente norte-americana 5.173.429 de n 6.368.819, 5.593.886, e WO, 98/00558 e WO 02/08438, carboxydivorans Clostridium(Liou et ai, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: pp. 2085-2091), Clostridium ragsdalei (WO/2008/028055) e Clostridium autoetanogénio (Abrini et ai, Arquivos of Microbiology 161: pp 345-351). Outras bactérias adequadas incluem as do género Moorella, incluindo Moorella sp HUC22-1, (Sakai et al, Biotechnology Letters 29: pp 1607-1612), e os do género Carboxydothermus (Svetlichny, VA, Sokolova, TG et al (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260). Outros exemplos incluem Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Ruminococcus productus, Acetobacterium woodii, Eubacterium limosum, Butribacterium methylotrophicum, Oxobacter pfennigii, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina acetivorans, Desulfotomaculum kuznetsovii (Simpa et. al. Critical Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26. Pp41- 65). Além disso, deve ser entendido que outras bactérias anaeróbicas carboxidotrofico podem ser aplicáveis para o presente invento tal como seria entendido por uma pessoa com conhecimentos na arte. Também irá ser apreciado que a invenção pode ser aplicada a uma cultura mista de duas ou mais bactérias.

Um microrganismo exemplar apropriado para utilização na presente invenção é Clostridium autoetanogénio. Numa forma de realização, Clostridium autoetanogénio é um Clostridium autoetanogénio tendo as caracteristicas identificadoras da estirpe depositada no Centro de Recursos Alemão para material biológico (DSMZ) sob o número de depósito 19630. Noutra forma de realização, o Clostridium autoetanogénio é um Clostridium autoetanogénio tendo as caracteristicas de identificação de número de depósito DSMZ DSMZ 10061.

A cultura das bactérias utilizadas nos métodos da invenção pode ser realizada utilizando qualquer número de processos conhecidos na técnica para cultura e fermentação de substratos utilizando as bactérias anaeróbicas. Exemplos de técnicas são fornecidos na seção de "Exemplos" abaixo. A titulo de exemplo adicional, os processos geralmente descritos nos seguintes artigos usando substratos gasosos para a fermentação pode ser utilizada: (i) Klasson KT, et al. (1991). Birreatores para fermentações recursos de gás de síntese. Conservação e Reciclagem, 5; 145-165; (li) Klasson KT, et al. (1991) .Biorreator de criação para fermentações de gás de síntese. Combustível.70. 605-614; (Iii) Klasson KT, et al. (1992) .A bioconversão de gás de síntese em combustíveis líquidos ou gasosos. Enzima e Microbial Technology. 14; 602-608; (Iv) JL Vega, et al. (1989). Estudo do gasoso substrato de fermentação: Monóxido de Carbono Conversão de etilo. 2. Cultura continua. Biotech.Bioeng. 34. 6. 785-793; (V) JL Vega, et al. (1989). Estudo das fermentações de substratos gasosos: a conversão de monóxido de carbono em acetato. 1. cultura Batch. Biotecnologia e Bioengenharia. 34. 6. 774-784; (Vi) JL

Vega, et al.(1990). Projeto de biorreatores para o carvão Síntese fermentações de gás. Recursos, conservação e reciclagem. 3. 149-160. A fermentação pode ser realizada em qualquer biorreator apropriado, tal como um reator de tanque agitado contínuo (CSTR), um reator de células imobilizadas, um reator gás-elevador, um reator de coluna de bolhas (BCR), um reator de membrana, tal como uma fibra oca membrana biorreator (HFMBR) ou um reator de leito (TBR). Além disso, em algumas formas de realização da invenção, o biorreator pode compreender um primeiro, um reator de crescimento, no qual os microrganismos são cultivados, e um segundo reator de fermentação, para que o caldo de fermentação a partir do reator de crescimento é alimentado e em que a maior parte do produto de fermentação (por exemplo, etanol e acetato) é produzido.

Nalgumas formas de realização, em que o substrato é gasoso, pode ser desejável conduzir a produção e/ou da fase (s) de conversão a uma pressão elevada; que pode ser, pelo menos, várias atmosferas. Tais sistemas irão empregar o uso de um biorreator adaptada para suportar uma pressão elevada. Muitos tipos de birreatores podem ser adaptados para resistir a pressões mais elevadas; um exemplo de um tal biorreator é do reator Buchi AUTOKLAV ™.

Nalgumas formas de realização da invenção, o biorreator pode compreender um primeiro, um reator de crescimento, na qual os microrganismos são cultivados ácidos e, opcionalmente, são produzidos, e um segundo reator de fermentação, para que o reator a partir de caldo de crescimento é alimentado e em que adicional, se não a maioria de, o produto de fermentação do álcool (etanol, por exemplo) é produzido. Como notado acima, uma pressão nominal de fermentação biorreator pode ser empregue.

De acordo com diversas formas de realização da invenção, a fonte de carbono para a reação de fermentação é um substrato gasoso contendo CO. 0 substrato pode ser um gás residual contendo CO obtido como um subproduto de um processo industrial, ou de alguma outra fonte tal como de gases de escape automóvel. Em certos enquadramentos, o processo industrial é selecionado a partir do grupo que consiste de produtos de metal ferroso de fabrico, tal como um moinho de fabricação de aço, produtos não-ferrosos, processos de refinação de petróleo, a gaseificação do carvão, a produção de energia elétrica, a produção de negro de carbono, a produção de amoníaco, produção de metanol e fabricação de coque. Nestas formas de realização, o substrato que contém o CO pode ser captada a partir do processo industrial, antes de ser emitido para a atmosfera, utilizando qualquer método conveniente. Dependendo da composição do substrato molecular contendo CO, pode também ser desejável trata-lo para remover quaisquer impurezas indesejadas, tais como as partículas de poeira antes de introduzi-lo para a fermentação. Por exemplo, o substrato gasoso pode ser filtrado ou esfregado utilizando métodos conhecidos.

Em alternativa, o substrato que contém o CO pode ser originado a partir da gaseificação de biomassa. 0 processo de gaseificação envolve a combustão parcial da biomassa num fornecimento restrito de ar ou oxigénio. 0 gás resultante compreende, tipicamente, principalmente CO e H2, com volumes mínimos de CO2, metano, eteno e etano. Por exemplo, subprodutos da biomassa obtida durante a extração e processamento de alimentos, como açúcar de cana, ou amido de milho ou grãos, ou não alimentar resíduos de biomassa gerada pela indústria florestal pode ser gaseificado para produzir um gás contendo CO apropriado para o uso na presente invenção. 0 substrato contendo CO conterão tipicamente uma proporção importante de CO, tal como pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% de CO, em volume, de 40% a 95% de CO, em volume, de 40% a 60% de CO por de volume, e de 45% a 55% de CO, em volume. Em formas de realização particulares, o substrato compreende cerca de 25%, ou cerca de 30%, ou cerca de 35%, ou cerca de 40%, ou cerca de 45%, ou cerca de 50% de CO, ou cerca de 55% de CO, ou cerca de 60% em volume de CO. Substratos possuindo concentrações mais baixas de CO, tal como de 6%, podem também ser adequadas, particularmente quando H2 e CO2 estão também presentes.

Embora não seja necessário para o substrato para conter qualquer de hidrogénio, na presença de H2 não deve ser prejudicial para a formação do produto de acordo com os métodos da invenção. Em formas de realização particulares, a presença de resultados de hidrogénio em uma maior eficiência global da produção de álcool. Por exemplo, em formas de realização particulares, o substrato pode compreender um aprox 2: 1, ou 1: 1, ou 1: 2, razão de H2: CO. Em outras formas de realização, o fluxo de substrato compreende baixas concentrações de H2, por exemplo, menos do que 5%, ou menos do que 4%, ou menos de 3%, ou menos de 2%, ou menos do que 1%, ou é substancialmente livre de hidrogénio. O substrato também pode conter algum CO2 por exemplo, tal como cerca de 1% a cerca de 80% em volume de CO2, ou de 1% a cerca de 30% de CO2 em volume.

Tipicamente, o monóxido de carbono vai ser adicionado à reação de fermentação no estado gasoso. No entanto, os métodos da invenção não estão limitados a adição do substrato, neste estado. Por exemplo, o monóxido de carbono pode ser fornecida em um liquido. Por exemplo, um liquido pode ser saturado com um gás contendo monóxido de carbono e que o liquido adicionado ao biorreator. Esta pode ser conseguida utilizando metodologia padrão. A titulo de exemplo, um gerador de dispersão de microbolhas (Hensirisak et ai Scale-up de gerador de dispersão de microbolhas de fermentação aeróbica; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October, 2002) pode ser utilizado para este fim.

Numa forma de realização da invenção, os produtos são produzidos por fermentação de um primeiro substrato e um segundo substrato. Numa forma de realização particular da invenção, os álcoois e/ou ácidos serão produzidas quando um primeiro substrato, tal como piruvato ou um hidrato de carbono, tais como frutose ou xilose, e um segundo substrato, tal como um substrato que compreende CO, são fornecidos. Quando a fermentação é perturbado, pelo menos uma porção dos ácidos (ácido acético/acetato) são convertidas em álcoois (etanol). Será apreciado tendo em consideração a presente divulgação, que existem muitos exemplos de hidratos de carbono adequados para a fermentação conhecidos na arte e muitos exemplos dos tipos de processos utilizados para fermentar o substrato hidrato de carbono aplicáveis aos métodos da invenção. A titulo de exemplo, os substratos adequados podem incluir, mas não estão limitados a, monossacáridos tais como a glucose e a frutose, oligossacáridos tais como a sacarose ou a lactose, polissacáridos, tais como celulose ou amido. Embora todos estes substratos de hidratos de carbono (e suas misturas) sejam adequados para utilização em várias formas de realização da presente invenção, os substratos de hidratos de carbono que podem ser mais comumente utilizados incluem glucose, frutose, xilose e sacarose (e suas misturas).

Os especialistas na técnica irão apreciar a partir da consideração desta divulgação que açúcares fermentáveis adequados para utilização nos presentes métodos podem ser obtidos a partir de biomassa lignocelulósica celulósica e por meio de processos de pré-tratamento e sacarificação, tal como descrito, por exemplo, no pedido de patente dos Estados Unidos 2007/0031918 publicação. Biomassa refere-se a qualquer material de celulose ou lignocelulósica e inclui materiais que contêm celulose, e, opcionalmente, compreendendo ainda hemicelulose, lignina, amido, oligossacáridos e/ou monossacáridos. A biomassa inclui, mas não está limitado a culturas energéticas, resíduos agrícolas, resíduos sólidos urbanos, resíduos sólidos industriais, lamas do fabrico de papel, resíduos de jardim, madeira e resíduos florestais.

Numa forma de realização da invenção, a frutose ou a xilose disponíveis comercialmente são usados como fontes de carbono e de energia opcionais para a fermentação.

Faz-se observar que para o crescimento das bactérias de fermentação e de CO para o produto a ocorrer, em adição ao gás contendo CO-substrato, num meio nutriente líquido adequado deverá ser alimentado ao biorreator. Um meio nutriente conterá vitaminas e minerais suficientes para permitir o crescimento do micro-organismo utilizado. Os meios anaeróbios adequados para a fermentação de etanol utilizando CO como única fonte de carbono são conhecidos na arte. Por exemplo, meios adequados são descritos na patente US η 5.173.429 e de 5.593.886 e WO 02/08438, documento WO2007/115157 e W02008/115080 acima referido. A presente invenção proporciona um novo suportes que tenham maior eficácia no apoio ao crescimento dos microrganismos e/ou produção de álcool no processo de fermentação. Este suporte de dados vai ser descrito em mais detalhe a seguir. A fermentação deve desejavelmente ser levada a cabo sob condições apropriadas para a fermentação desejado que ocorra (por exemplo, co-a-etanol). As condições reacionais que devem ser considerados incluem a pressão, temperatura, taxa de fluxo de gás, o caudal de liquido, do pH do meio, meios potencial redox, velocidade de agitação (se usando um reator continuo de tanque agitado), nível de inoculação, as concentrações máximas de substrato de gás para assegurar que o CO em a fase líquida não se torne limitante e as concentrações máximas do produto para evitar a inibição do produto. As condições adequadas são descritas em W002/08438, WO07/117157 e W008/115080.

As condições de reação ótimas dependerão, em parte, do microrganismo particular utilizado. No entanto, em geral, prefere-se que a fermentação ser realizada a uma pressão superior à pressão ambiente. Operando a aumento de pressões permite um aumento significativo da taxa de transferência de CO a partir da fase gasosa para a fase líquida em que pode ser tomada por o micro-organismo como fonte de carbono para a produção de etanol. Isto por sua vez significa que a retenção tempo (definida como o volume de líquido no biorreator dividido pela taxa de fluxo de gás de entrada) pode ser reduzida quando birreatores são mantidos a uma pressão elevada, em vez do que a pressão atmosférica.

Além disso, uma vez que um determinado taxa de conversão produto para CO é, em parte, uma função do tempo de retenção do substrato, e alcançar um tempo de retenção desejado, por sua vez determina o volume necessário de um biorreator, o uso de sistemas pressurizados pode reduzir grandemente o volume do biorreator requerida, e, consequentemente, o custo do capital de equipamento de fermentação. De acordo com os exemplos apresentados na patente US n°. 5.593.886, volume do reator pode ser reduzido em proporção linear com o aumento da pressão de operação do reator, isto é, biorreatores operados a 10 atmosferas de pressão precisa ser apenas um décimo do volume das pessoas operadas a 1 atmosfera de pressão.

As vantagens da realização de uma fermentação de gás-para-etanol a pressões elevadas também foram descritas noutro local. Por exemplo, o documento WO 02/08438 descreve fermentações gás-para-etanol realizadas sob pressões de 30 psig e 75 psig, dando produtividades de etanol de 150 g/l/dia e 369 g/l/dia, respetivamente. No entanto, o exemplo fermentações realizadas utilizando meios semelhantes e as composições de gás de entrada à pressão atmosférica foram encontrados para produzir entre 10 e 20 vezes menos do etanol por litro por dia. É também desejável que a velocidade de introdução do substrato gasosa contendo CO é de molde a assegurar que a concentração de CO na fase líquida não se torne limitante. Isso é porque uma consequência de condições limitadas-CO pode ser que o produto de etanol é consumido pela cultura.

Em formas de realização particulares da invenção, o etanol é produzido por fermentação microbiana, quando o sistema é perturbado em recipientes fechados. Em vários exemplos aqui proporcionados, o pH da fermentação é descontrolada e na conversão do ácido para o álcool, o pH aumenta. Nestes exemplos, o pH aumenta para cerca de 6,5 e pode ter um efeito inibidor sobre a conversão; aqueles peritos na arte apreciarão que os métodos da invenção podem incluir o controlo do meio de fermentação de pH.

Recuperação do Produto

Uma fermentação de acordo com os métodos do presente invento irá resultar em um caldo de fermentação contendo um produto desejado (tal como o etanol e/ou butanol) e/ou um ou mais subprodutos (tais como acetato e butirato) como bem como células bacterianas, em um meio nutriente.

Os produtos da reação de fermentação podem ser recuperados usando métodos conhecidos. Exemplos de métodos incluem aqueles descritos em WO07/117157, W008/115080, US 6.340.581, US 6.136.577, US 5.593.886, US 5.807.722 e US 5.821.111. No entanto, resumidamente e por meio apenas de exemplo o etanol pode ser recuperado a partir do caldo de fermentação por métodos tais como a destilação fracionada ou a evaporação, e a fermentação extrativa. A destilação do etanol a partir de um caldo de fermentação produz uma mistura azeotrópica de etanol e água (isto é, 95% de etanol e 5% de água) .0 etanol anidro pode subsequentemente ser obtido através do uso de tecnologia de desidratação etanol crivo molecular, que também é bem conhecido na arte.

Procedimentos de fermentação extrativa envolvem o uso de um solvente miscível em água que apresenta um baixo risco de toxicidade para o organismo de fermentação, para se recuperar o etanol a partir do caldo de fermentação diluído. Por exemplo, o álcool oleílico é um solvente que pode ser usado neste tipo de processo de extração. 0 álcool oleilico é continuamente introduzida num fermentador, após o que esta subida de solventes que formam uma camada na parte superior do fermentador, que é extraída continuamente e alimentado através de uma centrífuga. Água e as células são então facilmente separadas a partir do álcool oleilico e devolvido para o fermentador, enquanto o solvente etanol-carregado é introduzido numa unidade de vaporização por faiscamento. A maior parte do etanol é vaporizado e condensado, enquanto o álcool oleilico é não volátil, e é recuperado para reutilização na fermentação.

Etilo, o qual é produzido como um subproduto na reação de fermentação, também pode ser recuperado a partir do caldo de fermentação, utilizando métodos conhecidos na arte.

Por exemplo, pode ser utilizado um sistema de adsorção que envolve um filtro de carvão ativado. Neste caso, prefere-se que as células microbianas são primeiro removidas do caldo de fermentação, utilizando uma unidade de separação adequada. Numerosos métodos de filtração à base de geração de um caldo de fermentação isento de células para a recuperação do produto são conhecidos na arte. A célula livre de etanol - acetato de e - contendo, permeado é então passada através de uma coluna que contém carvão ativado para adsorver o etilo. De etilo sob a forma de ácido (ácido acético), em vez de a forma de sal (acetato) é mais facilmente adsorvido pelo carvão ativado. Prefere-se, portanto, que o pH do caldo de fermentação é reduzido para menos do que cerca de 3 antes de ser passado através da coluna de carvão ativado, para converter a maior parte do acetato na forma de ácido acético. 0 ácido acético adsorvido para o carvão ativado pode ser recuperada por eluição utilizando métodos conhecidos na arte. Por exemplo, o etanol pode ser usado para eluir o limite de etilo. Em certas formas de realização, o etanol produzido pelo processo de fermentação em si pode ser usada para eluir o etilo. Porque o ponto de ebulição de etanol é 78,8 °C e a de ácido acético é de 107 °C, de etanol e de acetato podem ser facilmente separados uns dos outros utilizando um método à base de volatilidade tal como destilação.

Outros métodos para a recuperação de etilo a partir de um caldo de fermentação também são conhecidos na arte e podem ser utilizados nos processos da presente invenção. Por exemplo, a patente US n 6.368.819 e de 6.753.170 descrevem um sistema de solvente e co-solvente que pode ser utilizado para a extração de ácido acético a partir de caldos de fermentação. Tal como acontece com o exemplo do sistema à base de álcool oleilico descrito para a fermentação extrativa de etanol, os sistemas descritos na patente n de 6.368.819 e 6.753.170 descrevem um imiscivel em água solvente/co-solvente que pode ser misturado com o caldo de fermentação quer na presença dos Estados Unidos ou ausência de microrganismos fermentados, a fim de extrair o produto de ácido acético. O solvente/co-solvente que contém o produto de ácido acético é então separado a partir do caldo por destilação. Um segundo passo de destilação, em seguida, pode ser usado para purificar o ácido acético a partir do/sistema de co-solvente de solvente.

Os produtos da reação de fermentação (por exemplo, etanol e acetato) podem ser recuperados a partir do caldo de fermentação por remoção continua de uma porção do caldo de fermentação a partir do biorreator, que separa as células microbianas a partir do caldo (convenientemente por meio de filtração), e recuperando um ou mais produto a partir do caldo em simultâneo ou sequencialmente. No caso de etanol, que pode ser convenientemente recuperado por destilação, e o acetato pode ser recuperado por adsorção sobre carvão ativado, utilizando os métodos descritos acima. As células microbianas são separadas de preferência devolvido ao biorreator fermentação. 0 permeado isento de células remanescentes após o etanol e acetato de ter sido removido é também, de preferência devolvido ao biorreator fermentação. Nutrientes adicionais (tais como vitaminas B) podem ser adicionados ao permeado isento de células para repor o meio nutriente antes de ser devolvido ao biorreator. Além disso, se o pH do caldo foi ajustado tal como descrito acima, para aumentar a adsorção de ácido acético para o carvão ativado, o pH deve ser reajustado para um pH semelhante ao do caldo no biorreator de fermentação, antes de ser retornado para o biorreator. A invenção será agora descrita em mais detalhe com referência aos seguintes exemplos não limitativos. A conversão de ácido (s) álcool (s)

Em particular, um aspeto amplo, o invento proporciona um método de conversão de ácido(s) a um álcool(s) correspondente, utilizando uma cultura microbiana. Em formas de realização especificas, a cultura microbiana converte o ácido para o álcool na presença de um substrato compreendendo CO e/ou H2.

De acordo com os métodos da invenção, uma cultura microbiana que compreende uma ou mais bactérias carboxidotroficas pode ser perturbada de tal forma que a cultura microbiana converte o(s) ácido(s) álcool(s). Os métodos da invenção são aplicáveis a uma variedade de reações de fermentação microbianos que utilizam CO como um substrato primário e produzem uma ou mais ácidos e/ou álcoois. Por exemplo, as fermentações para a produção de acetato, butirato, propionato, caproato, etanol, propanol, butanol e pode ser conduzida de acordo com os métodos da invenção. Os métodos da invenção também podem ser utilizados na produção de hidrogénio. Estes produtos podem ser produzidos, por exemplo, por fermentação utilizando microrganismos do género carboxidotrofico Moorella, Clostridia, Ruminococcus/Peprostreprococcus, Acetobacterium, Eubacterium, Butribacterium, Oxobacter, Methanosarcina, Meihanosarcina, e Desulfotomaculum.

Em formas de realização particulares, a cultura microbiana compreende bactérias acetogénicas, tais como Clostridium autoetanogénio que tipicamente utilizam um substrato compreendendo CO para produzir produtos incluindo acetato e/ou etanol. Em tais formas de realização, a cultura microbiana pode ser crescida sob condições desejáveis de um caldo de fermentação para promover o crescimento e produção de etilo. 0 crescimento (ou produção) de fase de bactérias acetogénicas é tipicamente associado com um aumento na matéria celular (acumulação de biomassa) e a produção de acetato, com pouca ou nenhuma produção de álcool concomitante. Em formas de realização particulares da invenção, a cultura microbiana é perturbada de tal forma que os ácidos presentes no caldo de fermentação são convertidos em álcoois correspondentes (por exemplo etilo a etanol e/ou butirato de butanol). A conversão de ácidos de álcoois pode ser referida como a fase de conversão.

Em formas de realização particulares da invenção, a cultura microbiana pode ser perturbada de tal forma que os ácidos produzidos pela cultura durante a fase de produção são convertidos em álcoois. Adicionalmente ou em alternativa, a cultura microbiana pode ser perturbada de tal forma que os ácidos não produzidos pela cultura durante a fase de produção são convertidos a álcoois. Por exemplo, álcoois não produzidos pela cultura microbiana (tais como propionato, butirato, valerato, hexanoato, isovalerato, 2-metilbutirato) podem ser adicionados ao caldo de fermentação e convertidos em álcoois correspondentes.

Numa forma de realização da invenção, o ácido é primeiro alimentado ou adicionado à reação de fermentação, antes ou durante a etapa de conversão. 0 ácido pode, opcionalmente, ser adicionado em séries simples ou múltiplas ou de forma continua ao longo de um período de tempo desejado. A quantidade de ácido adicionado ao biorreator pode variar. No entanto, os inventores contemplam adição de ácido numa quantidade que fornece uma concentração de cerca de 0,1 a 100 g de ácido por L de caldo de fermentação. Mais preferivelmente, o ácido é adicionado numa quantidade para proporcionar uma concentração de cerca de 0,1 a 50 g/L, ou 1 a 20 g/L. Outros exemplos de níveis apropriados de ácido a ser adicionado a uma cultura de bactérias são fornecidos na seção de "Exemplos" em seguida. O ácido pode ser adicionado ao biorreator num lote, semi-contínuo, ou modo contínuo. Numa concretização, o ácido é adicionado num fed-batch ou modo contínuo de modo a manter uma concentração de ácido no biorreator dentro do intervalo mencionado acima. O ácido pode ser adicionado ao biorreator, em qualquer forma adequada, incluindo as composições contendo o ácido e um ou mais outros ingredientes, transportadores, ou diluentes. Numa forma de realização, o ácido é, de preferência preparada e adicionada ao biorreator como uma solução estoque, tamponado a pH 5,5.

Os ácidos de utilização na presente invenção podem ser produzidos por qualquer número de métodos conhecidos, incluindo a fermentação microbiana. Numa forma de realização, os ácidos são produzidos por fermentação microbiana em substratos que compreendem hidratos de carbono ou monóxido de carbono, por exemplo. De preferência, eles são produzidos por fermentação microbiana sobre um substrato que contém o monóxido de carbono, mais preferencialmente um substrato gasoso que contém o monóxido de carbono. Exemplos de bactérias de utilização na produção dos ácidos incluem aqueles dos gêneros Clostridia, Moorella e Ruminococcus, Eubacteria, Butribacterium, Oxobacter e acetobacteria são de uso para esse fim. Em formas de realização preferidas, as bactérias são escolhidos a partir de Clostridium autoetanogénio, Clostridium Ijungdahlii, aceticum Clostridium, Clostridium formicaceticum, Clostridium tetanomorphum, carboxidivorans Clostridium, Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Ruminococcus productus, Eubacterium limosum, Butribacterium methylotrophicum, Oxobacter pfennigii, e Acetobacterium woodii. Peritos podem prontamente apreciar bactérias adicionais de utilização na produção de ácidos aplicáveis à presente invenção.

Os processos de fermentação microbiana para produzir ácidos de utilização no invento será prontamente apreciado pelos peritos na arte, especialmente tendo em conta a informação aqui fornecida. No entanto, a título de exemplo, o butirato pode ser produzido a partir de monóxido de carbono com gases, como descrito por Grethlein et al, 1991 (Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol 72, No 1, 58-60).

Numa forma de realização da invenção, o método é um processo semi-continuo ou continuo, que liga a produção de um ácido desejado por fermentação microbiana seguido pelo uso de tal ácido para produzir o seu álcool correspondente, em conformidade com os métodos descritos aqui anteriormente. Nesta forma de realização, o método compreende, pelo menos, os passos de a) num primeiro biorreator de fermentação de um substrato (de preferência um substrato que contém o monóxido de carbono, mais preferencialmente um substrato gasoso que contém o monóxido de carbono) para produzir um ou mais ácidos, b) numa segunda biorreator cultura de uma ou mais estirpes de bactérias na presença de um substrato que contém o monóxido de carbono, e c) introduzir o um ou mais ácidos a partir de (a) para o segundo biorreator num momento em que as uma ou mais estirpes de bactérias estão numa conversão fase para produzir os álcoois correspondentes a um ou mais ácidos. Numa forma de realização relacionada com os reatores de crescimento podem alimentar as bactérias para o primeiro e/ou segundo biorreatores.

Enquanto em formas de realização particulares as bactérias são cultivadas na presença de um substrato que contém o monóxido de carbono, em formas de realização alternativas as bactérias podem ser cultivadas em primeiro lugar para uma densidade desejada sobre um substrato alternativo, por exemplo, uma compreendendo açúcares ou outros hidratos de carbono. As bactérias podem ser, em seguida, transferidos para um substrato que contém o monóxido de carbono para a conversão de ácidos para os seus álcoois correspondentes.

Esta forma de realização pode ser conduzida num sistema de dois reatores, como descrito acima.

Reações de fermentação utilizando um substrato misto, tais como hidratos de carbono e um substrato gasoso que contém o monóxido de carbono podem ser usadas para produzir os álcoois e/ou ácidos. Em conformidade com os métodos da invenção, em perturbação de tais reações de fermentação, pelo menos uma porção do ácido é consumido, e aumenta a produção de álcool.

De acordo com os métodos da invenção, os álcoois e/ou ácidos, podem ser produzidos por fermentação microbiana de um substrato alternativo, tal como hidratos de carbono. Num ponto de tempo predeterminado, ou sobre a acumulação de uma quantidade em excesso de ácido, CO podem ser adicionados ao biorreator e a reação de fermentação opcionalmente ainda perturbado para converter pelo menos uma porção do ácido para o álcool.

Será apreciado que, a fim de suportar o crescimento e conversão por bactérias de utilização na presente invenção num meio nutriente adequado terá de ser alimentado ao biorreator. As pessoas especialistas na arte apreciarão facilmente meios de utilização na presente invenção. No entanto, em geral, um meio nutriente que contém vitaminas, minerais e metais suficientes para permitir o crescimento das bactérias em substratos compreendendo a co. Em particular, os meios de comunicação irá incluir um ou mais metais que assistem a atividade de enzimas que podem estar envolvidos na conversão de ácidos para os seus álcoois correspondentes; por exemplo, CODH (CO-desidrogenase) e enzimas AOR. Em uma forma de realização da invenção, os meios nutrientes não contém nem de triptona extracto de levedura. Os meios anaeróbios adequados para utilização na presente invenção inclui a formulação meios LM23 e LM33 descrito aqui posteriormente na seção intitulada "Exemplos" aqui depois.

Enquanto um único tipo de suporte pode ser utilizado para suportar o crescimento e formação de produto, deve ser apreciado que mais do que um meio pode ser utilizado num processo da invenção. Por exemplo, onde o processo utiliza crescimento e fermentação separado reatores, um meio pode ser utilizado no reator de crescimento e meios separados no reator de fermentação.

As culturas das bactérias devem desejavelmente ser levadas a cabo sob condições apropriadas para permitir a conversão de ácidos de álcoois de ocorrer. As condições reacionais que devem ser considerados incluem a pressão, temperatura, taxa de fluxo de gás, o caudal de liquido, do pH do meio, meios potencial redox, velocidade de agitação (se usando um reator continuo de tanque agitado), nivel de inoculação, as concentrações máximas de substrato de gás para assegurar que o CO em a fase liquida não se torne limitante e as concentrações máximas do produto para evitar a inibição do produto. Exemplos de condições são fornecidos na seção de "Exemplos" aqui depois. As condições de reação ótimas dependerão, em parte, as bactérias a serem usadas e o álcool a ser produzido. É também desejável que a velocidade de introdução do substrato que contém o CO é de molde a assegurar que a concentração de CO na fase liquida não se torne limitante. Isso é porque uma consequência de condições limitadas-CO pode ser que o(s) produto(s) é(são) consumida pela cultura.

Será apreciado por pessoas peritas geral, tendo em consideração a presente descrição, que uma variedade de condições de fermentação ou parâmetros podem ser alterados de modo a perturbar a cultura microbiana de tal modo que pelo menos uma porção da cultura microbiana muda de uma produção fase para uma fase de conversão. Por exemplo, um parâmetro de fermentação pode ser alterado de tal modo que os ácidos são convertidos em álcoois pela cultura microbiana. Perturbações adequadas para a comutação de uma cultura microbiana a partir de uma fase de produção de uma fase de conversão incluem: alteração do pH e/ou ORP de um meio de fermentação; alterando a concentração de CO em um caldo de fermentação (existem vários métodos de conseguir isso, dependendo do método de fermentação, incluindo alteração da composição do gás, alterando a pressão do gás, alterando taxa de fluxo de gás, alterando agitação velocidade num CSTR); adição de um agente redutor; adição de um ou mais ácidos. Os peritos na arte apreciarão métodos adequados para alcançar o desejado perturbação e também apreciarão métodos adicionais para perturbar uma cultura microbiana, de acordo com os métodos da invenção. No entanto, vários métodos exemplificativos estão descritos na seção "Exemplos" aqui a seguir. Em formas de realização particulares da invenção, a adição de um ou mais ácidos para o caldo de fermentação proporciona perturbação adequada para pelo menos uma porção da cultura microbiana a mudar de uma fase de produção de uma fase de conversão. Por exemplo, o acetato pode ser adicionado a uma cultura em crescimento ativo microbiana e produção de etilo e álcoois e a cultura converte pelo menos uma porção do acetato adicionado em etanol.

Numa forma de realização da invenção, etilo adicional pode ser adicionado a uma reação de fermentação e a produção contínua de álcool de etilo, a uma taxa de aproximadamente 15 g/L/dia. Consequentemente, a cultura irá converter o de etilo para etanol, a uma taxa de 6-15g/l/dia.

Numa forma de realização alternativa, os ácidos adicionais pode ser adicionado em conjunto com pelo menos uma outra perturbação, tal como alteração da concentração do CO caldo de fermentação ou a adição de um agente redutor.

Qualquer agente redutor adequado pode ser utilizado de acordo com os métodos da invenção, no entanto, a título de exemplo, sais ditionito (tais como ditionito de sódio), sais de sulfureto (tal como sulfureto de sódio) ou cisteína e opcionalmente ácido adicional(s) pode ser adicionado a uma reação de fermentação de tal forma que pelo menos uma porção da cultura microbiana muda de uma fase de produção de uma fase de conversão, convertendo portanto o(s) ácido(s) álcool(s) correspondente. Em formas de realização particulares, o sulfureto de sódio é adicionado a uma reação de fermentação que produz predominantemente de etilo, de modo a que pelo menos uma parte do acetato é convertida em etanol. Os peritos na arte serão capazes de determinar a quantidade de agente redutor necessária para perturbar o sistema suficientemente para converter ácidos de álcoois. No entanto, a título de exemplo agentes de redução podem ser adicionados na gama de 0,005 mM a 10 mM ou concentração de 0,05 mM a 1 mM. Em formas de realização particulares da invenção, um mediador redox, tal como metilviologênio é adicionado em adição ao agente de redução. A adição do mediador redox tem um efeito prejudicial, assim, de acordo com formas de realização particulares da invenção, o método para a conversão de ácido(s) álcool(s) é preferivelmente conduzida na ausência de um mediador redox.

Numa outra forma de realização da invenção, o formato é adicionado a uma reação de fermentação para exibir a cultura microbiana a partir da fase de produção para a fase de conversão. Em formas de realização particulares da invenção, o formato/L 2-5g pode ser adicionada à cultura microbiana tais que o acetato produzido pela cultura durante a fase de produção é convertido em etanol. Em formas de realização particulares, o formato pode ser adicionada a uma taxa de cerca de 3-6g/L/dia de tal modo que pelo menos uma porção de etilo produzido pela cultura é convertida em etanol.

Numa outra forma de realização da invenção, a cultura microbiana pode ser perturbado pela alteração do pH e/ou ORP (potencial redox aberto) de um meio de fermentação contendo uma cultura microbiana, de tal modo que o(s) ácido(s) é convertido em álcool(s) . Os peritos na arte

apreciarão meios e/ou métodos para alteração do pH e/ou ORP de um meio de fermentação. No entanto, a título de exemplo, o pH de um meio nutriente líquido contendo uma cultura microbiana pode ser ajustado utilizando ácidos (tais como ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou ácido acético) ou base (tal como hidróxido de sódio). Da mesma forma, ORP pode ser ajustado em combinação com ou de forma independente do pH por adição de agentes redutores.

Numa forma de realização particular, o pH de um meio nutriente líquido mantido a pH 5,5 é aumentado para 5,9 pela adição de hidróxido de sódio tais que o acetato produzido durante uma fase de produção é convertido em etanol. Sobre a alteração do pH, o potencial redox dos meios de comunicação reduzida de cerca de -430 a -470mV.

Numa outra forma de realização da invenção, o aumento da concentração de CO num biorreator alterna, pelo menos, uma porção da cultura microbiana a partir de uma fase de produção de uma fase de conversão. Em certas formas de realização, uma cultura microbiana é estabelecida num meio nutriente líquido num biorreator agitado, tal como um CSTR. É reconhecido que, devido à baixa solubilidade do CO, com uma densidade celular elevada (por exemplo de 0,5 - 5 g/L) , a concentração de CO no meio nutriente líquido irá aproximar de zero como a cultura microbiano consome o CO aproximadamente à mesma velocidade a que é transferido em solução. Concentração de CO do meio nutriente líquido pode ser aumentada, aumentando a pressão parcial de CO de acordo com a lei de Henry. Assim, de acordo com formas de realização particulares da invenção, a cultura microbiana é perturbado através do aumento da pressão parcial de CO num biorreator.

De acordo com uma forma de realização da invenção, o etanol é produzido por fermentação microbiana, quando a concentração de CO nos meios de fermentação é aumentada. Pelo menos uma porção do CO pode ser convertida em ácidos e/ou álcool, durante esta fase de conversão, mas a maior parte do etanol pode ser produzido, por redução microbiana do ácido/etilo acético. É reconhecido que algumas reacções de fermentação podem ser levadas a cabo com uma pressão parcial de CO elevado. Como tal, a fim de aumentar a concentração de CO nos meios de fermentação, a pressão parcial de monóxido de carbono podem ser aumento de pelo menos 15 psi, ou, pelo menos, 20 psi, ou, pelo menos, 25psi, ou, pelo menos, 30 psi, ou, pelo menos, 35 psi, ou, pelo menos, 40 psi tais que o(s) ácido (s) são convertidas para álcool(s).

Numa forma de realização da invenção, uma porção substancial do ácido em um caldo de fermentação é convertido ao álcool. Em algumas formas de realização da invenção, aumentando a concentração de CO nos resultados, pelo menos 60% do ácido disponível no caldo de fermentação a ser convertida em álcool. Em outras formas de realização, pelo menos 70% do ácido é convertido em álcool. Em outras formas de realização, pelo menos 80% do ácido é convertido em álcool.

Em formas de realização particulares da invenção, a pressão parcial de CO é aumentado para aproximadamente 15.9 psia, ou, pelo menos, 20psia, ou, pelo menos, 30psia, ou, pelo menos, 40psia, ou, pelo menos, 50psia tal que os ácidos são convertidos nos álcoois correspondentes. Em tais formas de realização, de acordo com a lei de Henry, a concentração de CO no meio nutriente líquido deverá ser de, pelo menos, 1 mmol, ou, pelo menos, 1,2 mmol, ou, pelo menos, 1,4 mmol, ou, pelo menos, 1,6 mmol, ou, pelo menos, 1,8 mmol, ou pelo menos, 2,2 mmol, ou, pelo menos, 2,6 mmol, ou, pelo menos, 3,2 mmo1.

Em certas formas de realização da invenção, os ácidos são convertidos nos álcoois correspondentes a uma taxa de cerca de pelo menos 12 g/L/dia, ou, pelo menos, 14 g/L/dia, ou, pelo menos, 16 g/L/dia, ou pelo menos 18g/L/dia, ou, pelo menos, 20 g/L/dia, ou, pelo menos, 22 g/L/dia, ou, pelo menos, 24 g/L/dia no período após perturbação (por exemplo, até uma hora, ou até 2h, ou até 3h, ou até 5h após perturbação). Em particular, as formas de realização, na presença de hidrogénio para além de CO, a taxa de conversão do ácido para o álcool aumentam para até 25 g/L/dia, ou até 26 g/L/dia, ou até 27 g/L/dia seguinte perturbação. No entanto, a taxa de conversão diminui ao longo do tempo, de tal modo que, em certas formas de realização de ácido (s) (por exemplo de etilo) pode continuar a acumular-se ao longo do curso da reação de fermentação. 0 aumento da concentração (ou pressão parcial) de CO, em conformidade com os métodos da invenção promove a produção de ácido e crescimento microbiano. No entanto, quando a concentração de CO (ou pressão parcial) é aumentado acima de um limiar de concentração suficiente, a produção de ácido e/ou o crescimento microbiano é substancialmente inibida. Por conseguinte, em conformidade com os métodos da invenção, o crescimento microbiano e/ou a produção de ácido pode ser regulado através da adição de CO. Assim, o invento proporciona um meio para controlar a produção de produtos, incluindo álcoois e/ou ácidos de fermentação microbiana de CO, em que, na acumulação de um excesso de ácido num caldo de fermentação, a concentração de CO pode ser aumentado acima de um limiar de concentração para converter pelo menos uma porção do ácido para o álcool.

Numa forma de realização, a invenção proporciona um método para a produção de álcoois a partir da fermentação bacteriana anaeróbia de um ácido. Numa forma de realização, o método compreende, pelo menos, o passo de fermentar anaerobiamente um ácido na presença de substrato que compreende CO, de preferência um substrato gasoso compreendendo CO, em que a concentração de CO for superior a um limiar de concentração suficiente.

Numa forma de realização da invenção, o etanol é produzido por fermentação microbiana do ácido acético/acetato, quando a concentração de CO nos meios de fermentação está acima de um limiar de concentração suficiente. Numa forma de realização, um substrato compreendendo CO é fornecida de modo a que a concentração de CO nos meios de fermentação é um a uma concentração limite de pelo menos cerca de 2,5 mmol/L. Em outras formas de realização, a concentração de CO é relativamente a um limite de pelo menos cerca de 2,75 mmol/L, pelo menos cerca de 3 mmol/L ou pelo menos cerca de 3,5 mmo1/L.

Numa forma de realização da invenção, o substrato compreendendo o CO é gasoso e o substrato gasoso é fornecido de tal modo que o CO tem uma pressão parcial de, pelo menos, cerca de 37 psi. Numa forma de realização, a pressão parcial de CO é pelo menos cerca de 47 psi.

Numa outra forma de realização, é proporcionado um método de produção de álcoois e/ou ácidos, incluindo o método a fermentação anaeróbia de um primeiro substrato num biorreator para produzir um ou mais produtos, incluindo álcoois e/ou ácidos; em que um segundo substrato que compreende CO pode ser adicionado num ponto de tempo desejado de tal modo que a produção de etanol em relação ao acetato de aumentos. 0 segundo substrato compreendendo CO é fornecida de modo a que a concentração de CO for superior a um limiar de concentração suficiente. Sob tais condições, os aumentos de produção de álcool, enquanto o ácido é consumido e CO podem ser substancialmente não convertidos.

Numa forma de realização da invenção, o primeiro substrato contém CO; no entanto, o método não está limitado a uma tal forma de realização. Por exemplo, em algumas formas de realização da invenção, o primeiro substrato pode incluir piruvato ou um ou mais hidratos de carbono. Os um ou mais hidratos de carbono podem ser, por exemplo e sem limitação, celulose, hidrolisado de celulose, amido, hidrolisado de amido, glucose, frutose, xilose, arabinose, ou a lactose.

Numa forma de realização, o hidrato de carbono é a frutose ou a xilose. Alternativamente, o primeiro substrato pode compreender CO2 e/ou H2 ou quaisquer outros componentes adequados para a produção de ácidos e/ou álcoois por fermentação.

Numa outra forma de realização da invenção, é proporcionado um método de produção de álcoois e/ou ácidos, incluindo o método pelo menos os passos de: (a) proporcionar um substrato que compreende CO a uma primeira concentração num biorreator contendo um cultura de uma ou mais micro-organismos; e (b) anaerobicamente fermentação da cultura para produzir um ou mais produtos, incluindo álcoois e/ou ácidos a partir do referido substrato, em que a concentração do substrato fornecido ao biorreator pode, opcionalmente, ser aumentada a um ponto de tempo desejado, de tal modo que a produção de álcoois relativos para ácidos aumenta.

Numa forma de realização, o substrato é fornecido em (a) tal que a concentração de CO nos meios de fermentação está abaixo de um limiar de concentração suficiente. Em um tal tempo em que a concentração de CO é aumentado, o substrato pode ser fornecida de modo a que a concentração de CO for superior a um limiar de concentração suficiente.

Numa outra forma de realização da invenção, o método inclui pelo menos as etapas de: (a) proporcionar um substrato gasoso compreendendo CO a uma pressão parcial de CO num primeiro biorreator que contém uma cultura de um ou mais micro-organismos; e (b) anaerobicamente fermentação da cultura para produzir um ou mais produtos, incluindo etanol e/ou ácido acético a partir do referido substrato, em que a pressão parcial de CO pode, opcionalmente, ser aumentada a um ponto de tempo desejado de tal modo que a produção de etanol em relação ao acetato de aumentos.

Em formas de realização particulares, a produção de álcool e o ácido e/ou o crescimento microbiano é monitorizada durante todo durante o processo de fermentação. Sob tais condições, a fermentação pode ser facilmente alterado entre a produção de ácido substancial a produção substancial de álcool, como necessário ou desejado. Em várias formas de realização, os passos (c) e (d) podem ser repetidos durante o processo de fermentação para manter as condições ótimas para a produção de álcool.

Gases residuais industriais que compreendem CO, como forma de gás residual de um moinho de aço pode ser utilizado para converter o(s) ácido(s) álcool(s) de acordo com os métodos da invenção. Além disso, os gases livres que compreendem CO H2 também podem ser usados para converter o(s) ácido(s) álcool(s) de acordo com os métodos da invenção. A invenção também proporciona um meio para alternar entre uma fase de produção, e uma fase de conversão, alterando as concentrações de CO para mudar desde a fase de produção para a fase de conversão e de volta. Por exemplo, e como mostrado nos exemplos, o aumento da concentração de CO acima de um limiar de concentração resulta numa substancial porção de ácido acético disponível num caldo de fermentação de serem consumidos com um concomitante aumento na produção de etanol. A redução da concentração de CO abaixo da concentração-limiar poderá promover o crescimento e a produção microbiana de ácido tal como observado na fase de produção. Por exemplo, uma reação de fermentação em particular pode operar a uma pressão parcial de CO e desejável produzir produtos que incluem ácido(s). Num ponto de tempo apropriado, ou uma concentração de ácido em particular (tal como até 20 g/L, ou de até 30 g/L, ou até 40 g/L, ou até 50g/L), a cultura microbiana pode ser perturbado tal que o(s) ácido(s) é convertido em álcool. Em conformidade com os métodos da invenção, a pressão parcial de CO pode ser aumentada em pelo menos 15 psi, ou, pelo menos, 20 psi, ou, pelo menos, 25psi, ou, pelo menos, 30 psi, ou, pelo menos, 35 psi, ou, pelo menos, 40 psi, tais que o ácido (s) são convertidas para álcool (s) . Após a conversão, a pressão parcial pode ser reduzida em pelo menos 15 psi, ou, pelo menos, 20 psi, ou, pelo menos, 25psi, ou, pelo menos, 30 psi, ou, pelo menos, 35 psi, ou, pelo menos, 40 psi, de modo que a produção de acetato recomeça. Este processo pode ser repetido para evitar a acumulação de etilo e aumentar a concentração de álcool.

Em formas de realização alternativas, a cultura microbiana pode converter o(s) ácido (s) álcool (s) de até 1 hora, ou até 2 horas, ou até 3 horas, ou até 5h seguinte perturbação. Subsequentemente, como a cultura ajusta à pressão parcial elevada de CO e/ou CO consome de tal modo que a concentração de CO diminui, a cultura irá voltar para a produção de ácido.

Considera-se que ao longo de vários ciclos, os níveis de álcool irá aumentar enquanto os níveis de ácido permanecer em baixa concentração, tal como abaixo de 20 g/L, ou em 30 g/L, ou inferior a 40 g/L, ou em 50 g/L).

Duas (ou mais) do sistema biorreator

Nalgumas formas de realização da invenção, as reações de fermentação pode ser levada a cabo em duas ou mais fases em que um sistema pode compreender um crescimento (ou produção) reator no qual os microrganismos são cultivados ácidos e, opcionalmente, são produzidos, e um reator de conversão, para que o reator a partir de caldo de crescimento é alimentado e uma perturbação aplicada de tal modo que os ácidos produzidos ou adicionadas são convertidas em álcoois. Como notado acima, uma pressão nominal de fermentação biorreator pode ser empregue.

Referindo-nos à Figura 5, o sistema 100 compreende a fermentação num biorreator de crescimento 1, onde as condições de fermentação pode ser adaptado para promover a acumulação de biomassa microbiana ou crescimento e/ou produção de ácido. Por exemplo, as condições, tais como meios componentes líquidos nutrientes, taxa de alimentação de nutrientes, pressão de operação, pH de funcionamento, conteúdo e concentração de substrato, taxa de alimentação de substrato, velocidade de agitação fermentador (se aplicável) e densidade de células pode ser adaptado para promover o crescimento e/ou ácido microbiana produção. Exemplos de condições para a produção de biomassa microbiana fornecimento e ácido estado estacionário são fornecidos na seção de "Exemplos" abaixo. O substrato fornecido ao biorreator crescimento 1 podem ser selecionados a partir daqueles descritos anteriormente, no entanto, em formas de realização particulares do substrato de hidrato de carbono ou de CO é, ou é uma combinação de hidratos de carbono e de CO. 0 meio nutriente liquido pode ser substancialmente mantida no biorreator crescimento 1 para um tal tempo em que a biomassa e/ou ácidos microbiana atingir os niveis desejados e/ou as taxas de produção pretendidas. A biomassa microbiana e/ou a produção de ácido no biorreator de crescimento podem ser monitorizados rotineiramente ou continuamente através de meios conhecidos na arte. Além disso, as condições de crescimento no biorreator pode ser ajustada para manter condições ótimas para substancialmente o crescimento e/ou produção de ácido.

Será apreciado pelos peritos na técnica que o álcool também pode ser produzido sob certas condições de crescimento no biorreator. No entanto, em formas de realização particulares, o(s) ácido(s) irá ser o produto principal de crescimento no biorreator.

Num tal tempo em que os niveis de biomassa e/ou de ácido desejado ou as taxas tiverem sido atingidos, pelo menos uma porção do ácido e, opcionalmente, pelo menos uma parte da biomassa microbiana pode ser transmitida, por uma conduta apropriada significa, a partir da crescimento do reator 1 a um reator de conversão de 2, continuamente ou em intervalos de tempo desejados. Por exemplo, a uma concentração de ácido desejado no biorreator de crescimento 1, tal como pelo menos 5 g/L, ou pelo menos 10g/l, ou, pelo menos, 20 g/L, ou pelo menos 30g/l, ou, pelo menos, 40 g/L, ou pelo menos 50g/l, ou, pelo menos, 60 g/L, ou pelo menos 70g/l, ou, pelo menos, 80 g/L, ou pelo menos 90 g/L ou pelo menos 100 g/L, uma porção do liquido nutriente compreendendo meio referidos ácidos e biomassa microbiana, opcionalmente, pode ser passado para o biorreator de conversão de 2, em que uma cultura microbiana pode ser perturbada de tal forma que os ácidos são convertidos a álcoois. 0 meio nutriente líquido que sai do biorreator de crescimento 1 irá tipicamente ser substituído com meio nutriente líquido fresco para proporcionar condições adequadas para a biomassa no estado estacionário e/ou a produção de ácido. A concentração de ácido no biorreator de crescimento 1 deve ser mantida abaixo de um nível em que a inibição do micróbio particular ocorre.

Em formas de realização particulares da invenção, que compreende um substrato de CO é fornecido ao biorreator de conversão de 2 de tal modo que a concentração de CO no meio nutriente líquido é pelo menos cerca de 2,5 mmol/L ou pelo menos cerca de 2,75 mmol/L, ou pelo menos cerca de 3 mmol/L ou pelo menos cerca de 3,5 mmol/L. Em formas de realização particulares, o substrato compreendendo de CO gasoso é fornecido e pode ser tal que a pressão parcial de CO é pelo menos cerca de 27psi, ou pelo menos cerca de 37psi ou pelo menos cerca de 47psi. 0 consumo de ácido e/ou produção de álcool no biorreator de conversão 2 podem ser rotineiramente monitorizados continuamente, ou por meios conhecidos na arte. Nesse momento, quando o meio nutriente líquido atinge uma concentração de álcool desejada, tal como pelo menos 5 g/L, ou pelo menos 10 g/L, ou pelo menos 20 g/L, ou pelo menos 30g/l, ou, pelo menos, 40 g/L, ou, pelo menos, 50 g/L, ou pelo menos 60g/l, ou, pelo menos, 70 g/L, ou pelo menos 80g/l, ou, pelo menos, 90 g/L ou pelo menos 100 g/L, uma porção do líquido nutriente compreendendo o referido meio de álcoois, podem ser passados para um aparelho de recuperação de produto 3. A concentração de álcool no biorreator de conversão deve ser mantida abaixo de um nível em que a inibição da cultura microbiana utilizada para a produção de álcool ocorre.

Numa forma de realização do invento, o microrganismo cultivado e cultivadas no biorreator de crescimento 1 é um micróbio carboxidotrofico tais como os descritos anteriormente, e as condições são otimizadas para o crescimento microbiano e/oracid produção. Um segundo micróbio (também um micróbio carboxidotrofico) pode ser fornecido para o biorreator de conversão de 2 e as condições otimizadas para a produção do álcool. A cultura microbiana fornecida no crescimento e conversão biorreatores podem ser iguais ou diferentes. No entanto, numa forma de realização particular, o micróbio fornecida a ambos os biorreatores é Clostridium autoetanogénio.

Em certas formas de realização da invenção, o biorreator de crescimento 1 inclui um sistema de reciclagem de células, em que pelo menos uma parte da biomassa microbiana pode ser removida a partir do meio nutriente líquido que sai do biorreator crescimento e devolvido ao biorreator 1. Isto promove o crescimento da biomassa acumulação no reator crescimento 1. Alternativamente, a biomassa microbiana não é removido a partir do meio nutriente líquido que sai do reator de crescimento, mas é passado diretamente para o biorreator de conversão de 2.

Em formas de realização particulares, a cultura microbiana e produz ácidos cresce no reator crescimento 1. Pelo menos uma porção da mesma cultura microbiana é continuamente ou intermitentemente passado para o biorreator de conversão de 2, juntamente com os ácidos em meio nutriente líquido, caracterizado as condições do biorreator de conversão de 2 (tal como a concentração elevada de CO) promovem a produção de álcool através da mesma cultura microbiana. 0 tempo de retenção do meio nutriente liquido no biorreator de crescimento 1 pode ser regulado para otimizar a acumulação de biomassa e/ou a produção de ácido. Por exemplo, no arranque, a acumulação de biomassa pode ser desejável e a taxa de fluxo de meio nutriente liquido que passa para dentro e fora do biorreator crescimento 1 pode ser reduzido para aumentar o tempo de retenção dos meios de crescimento no biorreator 1 e, assim, permitir que a biomassa e/ou ácido para alcançar os niveis desejados ou taxas.

Quando a biomassa e/ou produção de ácido abordagens ou atingir niveis desejados ou de taxas, o tempo de retenção de liquido pode ser reduzida por aumento da taxa de fluxo do meio nutriente liquido a partir do biorreator de crescimento 1 para a conversão biorreator 2. Em certas formas de realização, os niveis de biomassa e/ou do ácido microbianas são monitorizadas e o tempo de retenção pode ser ajustada para se obter uma concentração de ácido estado substancialmente estável. Além disso, as condições podem também ser reguladas para conseguir a concentração desejada de ácido estado estacionário de pelo menos 5 g/L, ou pelo menos 10g/l, ou, pelo menos, 20 g/L, ou pelo menos 30g/l, ou, pelo menos, 40 g/L, ou pelo menos 50 g/L, ou, pelo menos, 60 g/L, ou pelo menos 70g/l, ou, pelo menos, 80 g/L, ou pelo menos 90 g/L ou pelo menos 100 g/L, no biorreator de crescimento 1. O tempo de retenção de liquido do meio nutriente liquido pode também ser regulado no biorreator de conversão 2 para atingir uma produção eficiente de álcool. Por exemplo, o meio nutriente liquido pode ser fornecido continuamente a uma velocidade constante e o volume do meio nutriente liquido no biorreator de conversão de 2 pode ser ajustado para proporcionar um tempo de retenção adequado para alcançar a conversão de álcool desejável. Em formas de realização particulares da invenção, a taxa de produção de álcool na fase de conversão do álcool em elevadas concentrações de CO é mais rápida do que a taxa de crescimento e/ou produção de ácido. Como tal, o biorreator de conversão de 2 pode ser substancialmente menor do que o biorreator de crescimento que conduz a um menor tempo de retenção substancialmente liquido no biorreator de conversão 2.

Após a consideração da presente descrição, os especialistas na arte irão apreciar as configurações adequadas ou desejadas para cada biorreator, no entanto, numa forma de realização particular, uma porção do meio nutriente liquido que compreende uma cultura microbiana, e opcionalmente álcool de ácido é passado para um segundo recipiente configurado como um biorreator de fluxo tampão. A pressão parcial de CO pode ser elevada no recipiente de fluxo tampão, de tal modo que, como uma parte do meio nutriente liquido passa através do(s) ácido(s) são convertidas para álcool (s) . Os peritos na arte apreciarão meios para manter o fluxo através do biorreator, tal como misturadores estáticos. Além disso, o biorreator pode incluir fornecimento de substrato ao longo de meios adicionais, a fim de manter a concentração de CO necessário e/ou desejado em todo o biorreator.

Numa outra forma de realização, o biorreator de produção compreende, pelo menos, uma cultura microbiana e biorreator de conversão compreende, pelo menos, uma cultura microbiana. Enquanto caldo de fermentação contendo ácido(s) e/ou de álcool(s) pode passar a partir do biorreator de produção para o reator de conversão e a partir do biorreator de conversão para a recuperação do produto, as respetivas culturas microbianas são substancialmente retidos em cada biorreator por sistemas de reciclagem de células. Em tais formas de realização, as culturas microbianas podem ser diferentes, desde que a cultura no biorreator de produção produz ácido (s) e a cultura no biorreator de conversão converte o(s) ácido(s) álcool(s). Em formas de realização particulares, a cultura microbiana no biorreator de conversão converte o(s) ácido(s) de álcool(s) a pressão parcial de CO elevado.

Em certas formas de realização, o(s) ácido(s) produzido a partir de outro de fermentação e/ou processos industriais podem ser adicionados ao biorreator conversão conforme desejado, para converter o álcool(s).

Numa outra forma de realização, um sistema de fermentação que compreende múltiplos birreatores de crescimento, configurado para fornecer um único biorreator de conversão, com ácidos que compreendem meios nutrientes líquido e biomassa microbiana é fornecido opcionalmente. Por exemplo, referindo-se à Figura 6, o sistema de fermentação 101 compreende uma primeira e segunda la e lb biorreator de crescimento, e cada um pode ser configurado para produzir o(s) ácido(s). Meio nutriente líquido contendo ácidos e, opcionalmente, a partir da biomassa birreatores de crescimento la e b, podem ser alimentados para o biorreator de conversão de 2 para a produção de álcool. Alternativamente, um primeiro biorreator de crescimento la pode ser configurado para a acumulação rápida de biomassa (por exemplo, liquido de alta tempo de retenção) , enquanto o sequndo biorreator de crescimento lb é confiqurado para a produção de ácido ótimo (por exemplo, menor tempo de retenção de liquido). Os tempos de retenção de líquidos de cada biorreator crescimento la e b podem ser ajustados em conformidade para manter condições ótimas produtoras de álcool ao longo de todo o sistema.

Em formas de realização, incluindo vários biorreatores de crescimento, um ou mais biorreatores de crescimento podem ser inteiramente encerrados por um período (por exemplo, para manutenção), sem afetar substancialmente negativamente a produção de álcool.

EXEMPLOS

Preparação de Meio:

0 meio foi preparado a pH 5,5 como se segue. Todos os ingredientes com excepção de cisteina-HCI foram misturados em água destilada de 400 ml. Esta solução foi tornada anaeróbio por aquecimento até à ebulição e deixada a arrefecer até à temperatura ambiente, sob um fluxo constante de 95% de CO, 5% CO2 gasoso. Depois de arrefecer, a cisteina-HCI foi adicionado e o pH da solução foi ajustado para 5,5 antes de fazer o volume até 1000 ml; anaerobicidade foi mantida ao longo das experiências.

Bactérias:

Clostridium autoetanogénio foi obtido a partir do Centro de Recursos alemão de Material Biológico (DSMZ). O número de acesso dado às bactérias é DSMZ 10061. Como alternativa, o Clostridium autoetanogénio usado é que depositado no Centro de Recursos alemão de Material Biológico (DSMZ), imputando o número de acesso 19630. A fermentação contínua em contínua reator de tanque agitado (CSTR) (típico set-up):

Um biorreator de cinco litros foi carregado com 4.9L de LM23 ou LM33 meios preparado como descrito acima. O gás foi mudado para 95% de CO, 5% de CO2 à pressão atmosférica, antes da inoculação com 100 mL de uma Clostridium autoetanogénio cultura. O biorreator foi mantido a 37 °C, agitada a 200 rpm no inicio da cultura. Durante a fase de crescimento, a agitação foi aumentada para 400 rpm. O pH foi ajustado para 5,5 e mantido pela adição automática de NaOH 5 M. Meios anaeróbio fresco foi continuamente adicionada ao biorreator para manter uma biomassa definido e nivel de etilo do biorreator.

Fermentação em batelada sob pressão no frasco de soro

Frascos de soro estéreis foram purgados três vezes com gás CO contendo (ver exemplos de composição) e evacuados a um vácuo de -5 psi. 50 ml de cultura contendo biomassa activa, etilo e vestígios de etanol, à pressão atmosférica foi transferida diretamente a partir de um biorreator continuo para a garrafa de soro de 234ml. O espaço superior 204ml foi então preenchido com CO contendo gás para a sobrepressão necessária. Uma incubadora com agitação e foi usada a temperatura da reação foi mantida a 37 °C.

Densidade celular:

Para determinar a densidade de células nestas experiências, a absorvância das amostras foi medida a 600 nm (espectrofotómetro) e a massa seca, determinado por meio de cálculo de acordo com procedimentos publicados. O nivel de metabolitos foi caracterizado usando Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (HPLC) e em alguns casos de cromatografia gasosa (GC). HPLC: HPLC Sistema Agilent 1100 Series. Fase móvel: 0.0025N Ácido Sulfúrico. Fluxo e pressão: 0.800 mL/min. Coluna: Alltech IOA; Catálogo # 9648.150 x 6,5 milímetros, tamanho das partículas 5 pm. Temperatura da coluna: 60 °C. Detetor:

Refractive Index. Temperatura do Detetor: 45 °C. Método para preparação de amostras: 400 μΐ da amostra e 50 pL de 0,15 M ZnSCh e 50 pL de 0,15 M de Ba (OH)2 são carregados para um tubo Eppendorf. Os tubos são centrifugados durante 10 min. em 12,000rpm, 4 °C. 200

μΐ do sobrenadante são transferidas para um frasco de HPLC

Cromatógrafo a Gás HP 5890 série II utilizando um Detetor de Ionização de Chama. GC capilar Coluna: EClOOO-Alltech EC1000 30m x 0,25 milímetros x 0.25um. O cromatógrafo de gás foi operado no modo de divisão com um fluxo total de hidrogénio de 50 ml/min com 5 ml de fluxo de purga (1:10 split), uma pressão da cabeça da coluna de 10 PIS resultando em uma velocidade linear de 45 cm/seg. O programa de temperaturas foi iniciado a 60 °C, mantida durante 1 minuto, em seguida, aumentada até 215 °C a 30 °C por minutos, em seguida, mantida durante 2 minutos. Temperatura do injetor foi de 210 °C e a temperatura do detetor foi de 225 °C. Método para preparação de amostras: 500 μΐ da amostra é centrifugada durante 10 min a 12,000rpm, 4 °C. 100 mL do sobrenadante é transferido para um frasco de GC contendo 200 pL de água e 100 mL de solução padrão interna de cravação (10 g/L de propan-l-ol, 5 g/L de ácido iso-butírico, ácido clorídrico 135mm). 1 μΐ da solução é injetada no instrumento de GC.

Exemplo 1: A conversão do ácido orgânico correspondente ao álcool

Exemplo IA: A conversão do ácido butírico de butanol num CSTR

Um reator de oito litros foi cheio com 7200 ml do meio LM23 e autoclavado durante 30 minutos a 121 °C. Enquanto se arrefecia para baixo, o meio foi purgada com N2. O gás foi mudado para 95% de CO, 5% de CO2 antes da inoculação com 160 mL de uma Clostridium autoetanogénio cultura. O biorreator foi mantido a 37 °C, agitada a 200 rpm no inicio da cultura. Durante a fase de crescimento, a agitação foi aumentada para 500 rpm. O pH foi ajustado para 5,5 e mantido pela adição automática de NaOH 5 Μ. A solução de n-butirato contendo ácido butirico 20g tamponado a pH 5,5 foi adicionada diretamente à cultura em crescimento ativo. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas às 0, 24 e 48 horas após a adição de ácido butirico (ver Tabela 1).

Tabela 1: Conversão de 20 g de n-Butirato em 1-Butanol por 8 litros de cultura de C. autoetanogenio que produz acetato e etanol num biorreator mantido a um pH de 5,5. Condições iniciais: ativar a cultura de C. autoetanogenio, produção de acetato (8,3 g/1) e etanol (5,4 g/1) pH 5,5 e aspersão de gás contendo 95% de CO em CO2.

Exemplo 1B: Conversão de acetato e butirato de álcoois correspondentes:

Frascos de soro foram preparados de acordo com o acima exposto. Uma vez que o crescimento microbiano foi estabelecida (associada com acetato de e pequenas quantidades de etanol produzido), os seguintes compostos foram adicionados em 50 ml de cultura ativa no frasco de soro de: 1 ml de ditionito de sódio a 10 g/1 solução, 2 ml de solução de ácido n-butirico 100 g/1 (pH ajustado para 5,5 com hidróxido de sódio 5 M). A fase de gás foi trocada para 25 psig de sobrepressão de uma mistura de 95% de CO, 5% CO2 gasoso. Após a adição do ácido, 1 ml de amostra foi feita por quantificação dos metabolitos em diferentes pontos no tempo (ver Tabela 2).

Quadro 2: Conversão de n-butirato de metilo em 1-butanol por produzir uma cultura de C. autoetanogénio de etilo e etanol em um frasco de soro, a pH 5,5, na presença ou ausência de 0,8 mM de metilviologénio (MV). A partir condições: a cultura de C. autoetanogénio ativo, produzindo etilo (4,7 g/1) e etanol (1,2 g/L) pH 5,5, espaço superior: 25 psig sobrepressão de 95% de CO em CO2. A presença do mediador viologen metil inibe significativamente a conversão de n-butirato de n-butanol (Tabela 2). Além disso, o ácido butirico foi estequiometricamente convertido em butanol (Figura 1).

Os resultados ilustram uma série de vantagens significativas em relação aos métodos descritos anteriormente para a conversão microbiana de ácidos para os seus álcoois correspondentes. Por exemplo, eles demonstram pela primeira vez que a Clostridium autoetanogénio (C.auto) pode ser usado para produzir álcoois que não se sabe ser capaz de produzir, em condições de fermentação normalizados.

As células bacterianas não são necessariamente colhidas antes da adição de ácido para produzir um álcool desejado; a conversão do ácido para o álcool é levada a cabo diretamente no meio de cultura. Isto reduz significativamente a manipulação de células, o risco de dano celular que pode ser causada por centrifugação e ressuspensão, e o risco de contaminação por oxigénio. A conversão não requer o uso de um mediador, tal como metilviologênio. De facto, a adição de metilviologênio foi demonstrada para inibir ou pelo menos reduzir a taxa de conversão de ácidos a álcoois. Tais mediadores são muitas vezes tóxicos. Removendo a necessidade de um mediador tem a vantagem de reduzir o manuseamento de produtos químicos tóxicos e reduzindo os custos associados com a produção de álcoois.

Pelo menos no caso de C. autoetanogénio, as células bacterianas podem ser mantidas ao mesmo pH e temperatura durante a fase de crescimento e a fase de conversão do ácido para o álcool (37 °C e pH 5,5) . Isso simplifica o processo e reduz o risco de choque para as células.

Além disso, a adição do ácido, quando as bactérias estão na fase de conversão, e a capacidade das células para continuar a consumir o monóxido de carbono e produzir de etilo e etanol (por exemplo), enquanto eles estão a conversão dos ácidos adicionados aos álcoois correspondentes, fornece um método no qual um certo número de produtos valiosos podem ser produzidos simultaneamente.

Exemplo 1C: Conversão de vários ácidos para os álcoois correspondentes:

Frascos de soro foram preparados de acordo com o acima exposto. No entanto, 5 mL de uma solução aquosa de ácido acético foi adicionada ao frasco vazio e o pH ajustado a 5,5 com NaOH. Ditionato de sódio (0,5 mL de uma solução aquosa de 10 g/L) ou cisteina (1 mL de uma/solução aquosa 6,25 g L) foi adicionado antes da inoculação. Cada frasco de soro foi pressurizado a 30psig com 95% de gás de CO e incubadas a 37 °C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas às 72 horas (ver Tabela 3).

Tabela 3: conversão dos diversos ácidos para os álcoois correspondentes por Clostridium autoetagénio. Como pode ser visto acima, Clostridium autoetagénio pode ser utilizado para converter uma variedade de ácidos para os seus álcoois correspondentes na presença de um agente redutor. Mais uma vez, esta é particularmente significativa, como os ácidos e álcoois acima não são conhecidos por ser produzida naturalmente metabolitos de C.auto.

Exemplo 2: Efeito da redução da concentração do agente na produção de álcool

Exemplo 2A: Efeito da concentração de ditionito de sódio na produção de álcool

Frascos de soro foram preparados de acordo com o acima exposto. No entanto, ditionato de sódio (/ solução aquosa de lOg L) foi adicionado antes da inoculação. Cada frasco de soro foi pressurizado a 30psig com 70% de CO de 15% de CO2, 14% de N2, 1% de gás H2 e incubadas a 37 °C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas às 48h (ver Tabela 4)

Tabela 4: conversão de acetato em etanol a diferentes concentrações de ditonito de sódio por Clastridium autoetagénio.

Os resultados significam que, embora a conversão do ácido álcool ocorre ao longo de uma vasta gama de concentrações de agente de redução, existe uma concentração óptima de cerca de 2 g/L.

Exemplo 2B: Efeito da concentração de sulfureto de sódio na produção de álcool

Frascos estéreis de 234ml de soro foram purgados com 100% de gás N2 e, em seguida, 50 mL de meios de comunicação (LM33) de acordo com a receita acima foram adicionados e a seguir autoclavadas a 121 °C durante 20 minutos. O meio foi reduzido com uma solução de Cr (II) (aprox. 0,4 mM) e sulfureto de sódio solução aquosa adicionada. Os frascos de soro foram inoculados com 2,5 ml de um crescimento ativo Clostridium autoetanogéniocultura a partir de um biorreator continuo. O espaço superior 184ml foi purgado três vezes com 70% de CO, 1% de H2, 15% de CO2, e 14% de gás N2 e evacuado para um vácuo de -14psig para remover o fundo N2 e foi, em seguida, encheu-se com 70% de CO, 1% de H2, 15% de CO2, e 14% de N2 gasoso, a 30psig. A temperatura da reação foi mantida a 37 °C. As amostras foram tomadas a intervalos e o espaço superior foi purgado e refrescou-se para 30 psi de amostragem seguinte (ver Tabela 5).

Tabela 5: Conversão de acetato em etanol a diferentes concentrações de sulfato de sódio por Clastridium autoetagénio. Nota: os frascos de soro com várias concentrações de sulfato de sódio foram aplicadas em duplicado e as médias foram fornecidas.

Os resultados indicam que, embora exista uma curta fase de retardamento associado a um pequeno aumento na concentração de etilo, o acetato em cada um dos frascos contendo sulfureto de sódio é convertido em álcoois ao longo do tempo da experiência.

Exemplo 3: Efeito da pressão parcial de CO

Exemplo 3Ά: Efeito da pressão parcial de CO na produção de álcool

Frascos de soro foram preparados de acordo com o acima exposto. Cada frasco de soro foi pressurizado a 30 ou 40 ou 50 psia usando um CO 95% em mistura de gás de CO2 e incubadas a 37 °C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas às 18 horas (ver Tabela 6).

Tabela 6: 0 efeito de diferentes sobrepressões superiores no metabolismo de um subtrato gasoso compreendendo 95% CO em CO2 através de uma cultura de C. autoetanogénio num frasco de soro a um pH 5,5 após 18 horas de fermentação. Condições iniciais: cultura continua de C. autoetanogénio, contendo 3,3 g/1 de acetado e 0,0 g/1 de etanol a um pH de 5,5 .

Nas garrafas de biorreatores a 30 psi a 40 psi, cerca de 2 g/L de acetato e 0,6 g/1 de etanol foram produzidos e a queda de pressão no espaço de topo foi de cerca de 17 psi. Isto indica que uma quantidade substancial do CO tem sido utilizado para a produção de etilo.

Surpreendentemente, a 50 psi, cerca de 3 g/1 de etilo foi consumido e 2,6 g/1 de etanol produzido. Os resultados indicam que existe um limiar de pressão parcial de CO equilíbrio em que o álcool de etilo para conversão ocorre por um período prolongado. Como a concentração de CO é proporcional à pressão parcial de CO, os resultados indicam que existe um limiar de concentração de CO em que suficiente C.auto converte ácidos de álcoois. No entanto, deve notar-se que os sistemas de baixa pressão pode também converter ácidos ao álcool, mas como se esgota CO prevalece produção de etilo. Além disso, sob condições particularmente CO (ou H2) esgotada, a cultura pode reconsume álcool de etilo para produzir (ver exemplo 4).

Exemplo 3B: Efeito da pressão parcial de CO na produção de álcool

Com base nestes resultados, uma fermentação semelhante foi realizada usando o mesmo substrato gasoso com meios suplementados com diferentes fontes de carbono. Frascos de soro foram preparadas de acordo com o acima. Cada frasco de soro foi pressurizado a 40 ou 50 psia usando um CO 95% em mistura de gás de CO2 e incubadas a 37 °C com agitação constante. Uma garrafa de controlo de biorreator (A) era não suplementado, enquanto outras garrafas foram suplementadas com alguns frutose (B) , xilose (C) ou piruvato (D) . Estes frascos foram incubados a 37 °C com agitação constante. Os metabolitos e as concentrações de biomassa, assim como o espaço superior de sobrepressão e de pH, foram medidos no início da fermentação, e após 40 horas. Os resultados na 40psia são mostrados na Tabela 7 e na 50psia resultados são mostrados na Tabela 8.

Tabela 7: Metabolismo de 40psia sobrepressão de um substrato gasoso que contém 95% em CO em CO2 por uma cultura de C. autoetanogénio em um frasco de soro, a pH 5,5, após 40h de fermentação. Condições iniciais: cultura contínua de C. autoetanogénio a taxa de diluição = 0,04 ir 1, fluxo contínuo de substrato gasosa compreendendo 95% de CO em CO2 (sem sobrepressão), produção de etanol e de acetato a pH 5,5. Dados para o acetato, etanol, frutose, xilose, piruvato são concentrações em gramas por litro. Biomassa é dada como grama de peso seco de células por litro. Sobrepressão de gás no espaço superior é mostrada em psig.

Em todas as garrafas do biorreator a 40 psia, para todas as condições testadas aqui, cerca de 3,5 g/L de acetato e quantidades menores de etanol foram produzidos. A queda de pressão no espaço de topo foi de cerca de 17 psig. Isto indica que uma porção substancial do CO foi consumida para a produção de etilo. O pH diminuiu de cerca de 0,9 a 4,6 unidades. Em todos os casos, houve crescimento microbiano mínimo.

Tabela 8: Metabolismo de 50psia sobrepressão de um substrato gasoso que contém 95% de CO em CO2 por uma cultura de C. autoetanogénio em um frasco de soro, a pH 5,5, após 40h de fermentação. Condições iniciais: cultura contínua de C. autoetanogénio a taxa de diluição = 0,04 tr 1, fluxo contínuo de substrato gasosa compreendendo 95% de CO em CO2 (sem sobrepressão), produção de etanol e de acetato a pH 5,5. Dados para o acetato, etanol, frutose, xilose, piruvato são concentrações em gramas por litro. Biomassa é dada como grama de peso seco de células por litro. Sobrepressão de gás no espaço superior é mostrada em psig.

Em todas as garrafas do biorreator a 50 psia, para todas as condições testadas aqui, quantidades significativas de etilo foram consumidos, e mais de 3 g/1 de etanol foi produzido. Existe uma forte correlação entre o consumo de etilo e a produção de etanol. Produção de consumo/etanol Acetato ocorre de tal maneira que, para cada mole de etilo consumiu aproximadamente uma mole de etanol, foi produzido (Tabela 9) . No entanto, o hidrato de carbono suplementado (ou piruvato) foi substancialmente consumido, e os níveis de biomassa, estimado pela densidade ótica, reduzida. Em cada caso, a queda de pressão no espaço superior foi inferior a 10 psi. Em todos os casos, o pH aumentou em cerca de 0,9 unidades a 6,4.

Tabela 9: Rácios molares de fermentação em lotes a 35 psi de sobrepressão, com base em resultados mostrados na Tabela 2 e 3.

Dado o acetato consumido/acetato no início (linha 1), pelo menos 50% e, em alguns casos, mais de 75% do acetato presente no caldo de fermentação é consumida a uma pressão elevada. Dado o etanol produzido/acetato no início (linha 2), pelo menos 60% e, em alguns casos, pelo menos 80% do ácido consumido é substituído por álcool. Dado o etanol produzido/acetato consumido (linha 3), há uma forte correlação entre a quantidade de acetato consumido no processo de fermentação, e o álcool produzido. A nível teórico de CO dissolvido nos meios de comunicação, a 40 e 50 psia sobrepressão espaço superior foi calculado na Tabela 10 com base na lei de Henry.

Tabela 10: Cálculo da dissolução de CO em meio em diferentes sobrepressões de espaço superior de um substrato gasoso compreendendo 95% de CO em CO2. A constante de Henry para C em água a 298 K é 1052.6 L. atm. Mol-1.

Os resultados aqui apresentados demonstram que existe uma pressão parcial de CO acima do qual o metabolismo de C. autoetanogénio substancialmente alterações da produção de acetato e de biomassa a partir do substrato de CO para a conversão de pelo menos uma porção de etilo em etanol. Assim, para uma pressão parcial de CO inferior a 37 psi, de etilo e de biomassa são os principais produtos do metabolismo do gás de CO e o pH se torna ácido, e ainda mais o crescimento é inibido. Quando a pressão parcial de CO for superior a 37psi, o crescimento da biomassa e a produção de acetato parece ser inibida, e o consumo de etilo ocorre. Além disso, a produção de etanol ocorre com menor consumo de CO. Ao mesmo tempo, o pH aumenta, até atingir 6,5, onde as bactérias parecem ser substancialmente inibida e a conversão de etilo para etanol pára. Não há nenhum efeito percetível de frutose, xilose ou piruvato na concentração testada.

Exemplo 3C: Efeito da pressão parcial de CO na produção de álcool

Frascos de soro foram preparados de acordo com o acima exposto. Cada frasco de soro foi pressurizado a 25psig (40psia) com o gás indicado e incubadas a 37 °C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas em intervalos de 1 hora, 3 horas e 5 horas (ver A Tabela 11).

Os resultados indicam que o limiar de pressão parcial de CO suficiente em que os ácidos são convertidos em álcoois é inferior a 20psia. Ao longo de um intervalo de tempo de reação curto (cf exemplos 3A-C), acetato é convertido em álcool substancialmente estequiometricamente em todas as pressões parciais de CO testados. Por conseguinte, uma pressão parcial de CO ao longo 20psia é suficiente para C.auto para converter ácidos de álcoois.

Exemplo 4: Efeito da composição do gás

Exemplo 4A: Efeito de gás puro na conversão de etllo para etanol

Frascos de soro foram preparados de acordo com o acima exposto. Cada frasco de soro foi pressurizado a 25psig (40psia) com o gás indicado e incubadas a 37 °C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas em intervalos de 1 hora, 3 horas e 5 horas (ver quadro 12).

Tabela 12: conversão de acetato em etanol por Clostridium autoetanogénio usando composições de gás alternativas.

Os resultados indicam claramente um gás redutor, tal como CO ou H2 é necessário para C.auto para converter ácidos de álcoois. Considera-se gue o hidrogénio pode ser utilizado em lugar de CO, a via metabólica de ácidos de álcoois inclui enzimas hidrogenase. Considera-se, além disso, gue enquanto H2 é uma fonte de energia apropriada para a conversão de ácidos, álcoois, não seria adequado para a biossintese e/ou produção de etilo, o qual requer uma fonte de carbono, bem como uma fonte de energia.

Exemplo 4B: Efeito da composição do gás na produção de etanol

Frascos de soro foram preparados de acordo com o acima exposto. No entanto, antes da inoculação, os frascos foram misturadas com uma solução de ácido butirico tamponado a pH 5,5 com NaOH (aq). As concentrações iniciais em t = 0 foram de etilo 6,7 g/1 de butirato e 0,8 g/L (sem etanol ou butanol estava presente). Amostras do caldo de fermentação foram tiradas às 24 h (ver tabela 13).

Tabela 13: Conversão de ácidos em álcoois sob diferentes pressões parciais de CO por Clostridium autoetanogénio, na presença e ausência de hidrogénio.

Os ácidos, tais como ácidos butiricos e ácido acético, podem ser convertidos em álcoois, incluindo etanol e butanol na presença de substratos mistos C0/H2. É evidente que, na ausência de H2, o aumento da pressão parcial de CO melhora a conversão global. No entanto, a presença de H2, em particular, à pressão parcial elevada também aumenta a conversão global.

Exemplo 4C: Efeito da composição do gás na produção de etanol

Frascos de soro foram preparados de acordo com o acima exposto. Cada frasco de soro foi pressurizado a 35psig (50psia) com o gás indicado e incubadas a 37 °C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas às 18 horas (ver Tabela 14).

Tabela 14: Conversão de acetato em etanol sob diferentes pressões parciais de CO por Clostridium autoetanogénio, na presença e ausência de hidrogénio

Substratos mistos compreendendo CO e H2 podem ser utilizados para converter os ácidos de álcoois na presença de C.auto. Interessantemente, através da escala de tempo da experiência, significativamente mais do que o álcool é produzido de etilo é consumido. Isto indica que, apesar de etilo pode ser estequiometricamente convertidos em etanol, acetato adicional acumula e pode ser convertido em álcool até CO é completamente consumida.

Exemplo 4E: Efeito da pressão parcial de CO e H2 na produção de álcool

Frascos de soro foram preparados de acordo com o acima exposto. Cada frasco de soro foi pressurizado a 35psig (50psia) com o gás indicado e incubadas a 37 °C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas, a intervalos de 1,5 h, 3 h, 5 h e 24 h (ver tabela 15) .

Os resultados indicam que, em níveis elevados de H2, existe uma melhoria na conversão global de ácidos em álcoois. No entanto, considera-se que o etanol é reconvertido de volta para os níveis de etilo como H2 esgotar durante o decurso da experiência, particularmente em níveis baixos de H2 (por exemplo, 20%).

Exemplo 4F: Efeito da pressão parcial de CO em gás residual de um moinho de aço

Frascos de soro foram preparados de acordo com o acima exposto. Cada frasco de soro foi pressurizado a 25psig (40psia) com o moinho de aço de gás residual (aproximadamente 53% de CO, 18% de CO2; 26% de N2; 3% H2) e incubou-se a 37 °C com agitação constante.

Amostras do caldo de fermentação foram tiradas em intervalos de 1 hora, 3 horas e 5 horas (ver Tabela 16).

Tabela 16: Conversão de acetato em etanol a diferentes pressões parciais de CO usando gás de resíduos de aço Moídos.

Gases residuais do lagar de aço podem ser utilizados para converter os ácidos em álcoois. 0 aumento da pressão parcial de CO nos gases residuais, tem um efeito benéfico sobre a conversão de ácido.

Exemplo 4G: Efeito da pressão parcial de CO2 na produção de etanol

Frascos de soro foram preparados de acordo com o acima exposto. Cada frasco de soro foi pressurizado a 35psig (50psia) com o gás indicado e incubadas a 37 °C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas em intervalos de 1 hora, 3 horas e 5 horas (ver Tabela 17).

Tabela 17: Conversão de acetato em etanol a diferentes pressões parciais de CO Clostridium autoetanogénio Os substratos compreendendo CO contendo uma variedade de componentes pode ser processada para converter os ácidos em álcoois. No entanto, é de notar que o aumento dos niveis de CO2 tem um ligeiro efeito inibidor sobre a produção de álcool.

Exemplo 5: Efeito da adição de formato:

Exemplo 5A: concentração Formato em vasos de lote:

Frascos de soro foram preparados de acordo com o acima exposto. No entanto, uma solução aquosa de formato foi adicionada ao frasco vazio e o pH ajustado a 5,5 com NaOH antes da inoculação. Cada frasco de soro foi pressurizado a 25 psig com 50% de CO; 12,5% de CO2; 37,5% de gás N2 e incubadas a 37 °C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas às 72 horas (ver Tabela 18).

Tabela 18: Conversão de acetato em etanol na presença de formato de diferentes concentrações usando Clostridium autoetanogénio.

Na ausência de formato, C.auto continua a produzir de etilo e uma pequena quantidade de álcool. No entanto, quando o formato é adicionado à reação de fermentação, de etilo é convertido no álcool em quantidades substancialmente estequiométricas. A taxa de conversão é mais elevada a baixas concentrações de formato (2 g/L), indicando que pode haver um efeito inibidor e/ou tóxico em concentrações maiores de formato.

Exemplo 5B: Adição de Formato num CSTR: 5 L de meio de fermentação anaeróbia (preparado como descrito acima) em 5 litros CSTR foi inoculado com um crescimento ativo Clostridium autoetanogénio cultura (DSMZ 19630) a um nivel de 5% (v/v). Um fluxo continuo de 70% de CO e 15% de CO2 1% H2 14% de N2 gasoso foi introduzido na parte inferior do vaso fermentador através de um pulverizador de difusão a um caudal volumétrico de 60 ml/minuto. O pH inicial do fermentador foi mantido a 5,5. Após vários dias de crescimento microbiano, uma cultura continua foi estabelecida ao ligar uma bomba de introdução de meios de fermentação frescos aspergidos com N2 no CSTR a um caudal de 2 mL/min. Controladores de nivel são usados para manter o nivel correto de cultura dentro do vaso fermentador, definida usando uma sonda de nivel e bomba que liga automaticamente quando o nivel em vasos de fermentação sobe muito alto e bombas de cultura para fora da embarcação até o nivel cai de volta para baixo para definir nivel, isso permite um fornecimento estável de meios frescos a serem prestados à cultura e um crescendo ativamente, alta cultura viabilidade de ser mantido.

Depois de vários dias de operação contínua, o fornecimento de meio fresco foi interrompido e o fermentador devolvido para uma configuração de lote. No tempo = 0 (Figura 2) ácido fórmico (15 mL) foi adicionado e o pH ajustado para 5,5 por adição de NaOH. Ao longo de aproximadamente 30 minutos, o pH do meio de fermentação aumentou para 6 como etilo foi consumida pela cultura e o etanol foi produzido. Conseguentemente, ácido fórmico adicional (3 mL) foi adicionado para baixar o pH de volta para baixo para 5,5. Em cerca de t = 60 min, ácido fórmico foi introduzido através de uma bomba de doseamento para dosear automaticamente configurado para dentro do reator guando o pH subiu acima do ponto de 5.5 conjunto. A bomba de dosagem formato foi corrida, durante cerca de 5 horas, durante o gual o tempo de etilo foi consumido pela cultura e etanol produzidos.

Os resultados mostram uma reação de fermentação a produção contínua de etilo pode ser comutada de produção de acetato de etilo para a conversão de álcool através da perturbação do sistema, por exemplo, por adição de formato. A conversão é substancialmente esteguiométrica, ao longo da experiência.

Exemplo 6: Efeito da adição de etilo adicional 1 L meios de fermentação anaeróbia (preparada tal como descrito acima com as seguintes modificações: a solução de menor concentração de vitamina [0,4 ml/L LS03 sem ácido pantoténico e 500ul/L de solução de ácido pantoténico (40mg/L)] foi adicionada à solução mãe) em 1L um CSTR foi inoculado com um crescimento ativo Clostridium autoetanogénio cultura (DSMZ 19630) a um nivel de 5% (v/v). Um fluxo continuo de 35% de CO e 60% de H2 a 5% do gás CH4 foi introduzido no fundo do vaso fermentador através de um pulverizador de difusão a um caudal volumétrico de 10 mL/minuto. O pH inicial do fermentador foi mantido a 5,5. Após vários dias de crescimento microbiano, a taxa de fluxo de gás aumentou para 20 ml/minuto, sendo a agitação aumentada de 200 rpm para 500 rpm. Uma cultura continua foi criada através da introdução de meio fresco (preparado tal como descrito acima com as seguintes modificações: a solução de menor concentração de vitamina [0,4 ml/L LS03 sem ácido pantoténico e 1 ml/L de solução de ácido pantoténico (40mg/L)] foi adicionado a a solução de reserva), enquanto se mantinha um volume constante de meio no fermentador. A taxa de fluxo de meio fresco foi aumentada de 6 ml/hora para 54 ml/hora, ao longo de várias semanas. Após várias semanas de operação continua, o gás de alimentação foi mudada para 35% de CO de 45% de H2 de 15% de CH4 5% de CO2 e operado por várias semanas. Produtividade de etanol foi mantida a cerca de 6 g/L/dia. No dia 52, os meios frescos fornecidos à cultura continua foi suplementado com 15 g/L de ácido acético tamponado a pH 5,5, durante 2 dias. Durante este tempo, a produtividade aumentada de álcool para cerca de 15 g/L (dia 53 - Figura 3), em seguida, 12 g/L (dia 54).Considera-se que uma grande parte do acetato introduzida no fermentador foi convertida em álcool.

Os resultados mostram que a produtividade pode ser melhorada álcool numa reação de fermentação a produção continua de álcool(s) por adição de ácido(s) adicional. A adição de ácido(s) adicional (por exemplo etilo) perturba a reação de fermentação de tal forma que uma porção substancial do ácido adicionado (s) é convertido ao álcool(s), tal como o etanol.

Exemplo 7: Efeito do pH sobre a produção de etanol a partir de gás contendo CO 1 L de meios de meios de fermentação anaeróbica LM33 num 1 Litro CSTR foi inoculado com um crescimento ativo de cultura Clostridium autoetanogénio (DSMZ 19630) a um nivel de 5% (v/v). Um fluxo continuo de 70% de CO e 15% de CO2 1% H2 14% de N2 gasoso foi introduzido na parte inferior do vaso fermentador através de um pulverizador de difusão a um caudal volumétrico de 19 mL/minuto. O pH inicial do fermentador foi ajustado para 5,5. Para a maior parte da experiência, a concentração de ácido acético a cultura foi mantida abaixo de 4 g/L por um sistema de troca de reciclo de células e meios de comunicação. As células foram passadas através de uma membrana de fluxo cruzado Viva 200, o filtrado foi recolhido e as células foram devolvidas ao recipiente de reator. O filtrado foi substituído com meio fresco para assegurar o volume do meio dentro do reator se manteve constante. No dia 3, o sistema de reciclagem de células foi desligado e o pH, que tinha sido mantida a cerca de 5,6, durante 3 dias, com ORP oscilando entre -400 e -430 mV foi aumentada. O pH foi ajustado para aproximadamente 5,9, e o ORP diminuiu para cerca de -470 mV.

Estes resultados mostram que, a pH 5,6, acetato e etanol são produzidos simultaneamente, com um excesso de etilo. Fazendo referência à Figura 4, nesta fase da fermentação também está relacionado com um período de crescimento microbiano. Quando o pH é aumentado a ORP diminuiu para cerca de -470mV e a taxa de produção de álcool aumentou para aproximadamente 1,2 g/L/dia, enquanto alguns etilos foram consumidos a um índice de cerca de 0,2 g/L/dia. Por conseguinte, a cultura microbiana pode ser comutada de uma fase de produção em que é produzido de etilo, a uma fase de conversão onde acetato é convertido em etanol ajustando o pH do meio nutriente líquido.

Ao longo desta especificação e todas as reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija de outra forma, as palavras "compreende", "compreendendo" e semelhantes são para ser entendidas num sentido inclusivo em oposição a um sentido exclusivo, que é dizer, no sentido de "incluindo, mas não limitado a".

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a conversão de ácido(s) de álcool (s) correspondente, utilizando uma cultura microbiana na presença de um substrato que compreende CO ou CO e H2, compreendendo o dito método; a. cultura, num biorreator, uma ou mais estirpes de bactérias carboxidotroficas na presença do referido substrato para produzir um ou mais ácidos e, opcionalmente, um ou mais álcoois, e b. perturbando a cultura microbiana, de tal modo que pelo menos uma porção da cultura microbiana é comutada a partir de uma fase substancialmente a produção de uma fase de conversão, substancialmente, em que pelo menos uma porção de pelo menos um dos um ou mais dos referidos ácidos é convertido no seu correspondente álcool; e c. recuperar pelo menos uma parte dos álcoois.
2. 0 método da reivindicação 1, em que a concentração de H2 no substrato é inferior a 40% em volume.
3. O método da reivindicação 1, em que as bactérias são seleccionadas do grupo que consiste em Clostridium, Moorella, Pyrococcus, Eubacterium, Desulfobacterium, Carboxydothermus, Acetogenium, Acetobacterium, Acetoanaerobium, Butribacterium e Peptostreptococcus.
4. O método da reivindicação 1, em que as bactérias carboxidotroficas têm todas as caracteristicas definidoras do Clostridium autoetanogénio estirpe depositada no Centro de Recursos alemão de Material Biológico (DSMZ) sob o número de depósito identificar DSMZ 10061.
5. 0 método da reivindicação 1, em que o um ou mais ácidos do passo (a) são produzidos de forma continua, e, o um ou mais ácidos são continuamente convertido ao álcool correspondente no passo (b).
6. 0 método da reivindicação 1, em que o referido um ou mais álcoois são produzidos no passo (a) e uma substancialmente maior quantidade de ácido é produzida no passo (a) em relação à quantidade de álcool produzido na etapa (a).
7. 0 método da reivindicação 1, em que o ácido produzido no passo (a) é de etilo e o correspondente álcool é etanol.
8. 0 método da reivindicação 1, que compreende ainda a adição de um ácido ao biorreator durante o passo (a) e/ou passo (b) e converter o referido ácido adicionado ao seu álcool correspondente.
9. 0 método da reivindicação 1, em que o passo perturbando é efetuada por um ou mais dos seguintes: a. ajuste do pH de um meio nutriente liquido contendo a cultura microbiana; b. ajuste do potencial redox aberta de um meio nutriente liquido contendo a cultura microbiana; c. adição de um segundo ácido à biorreator; d. adição de um ou mais agentes para o biorreator de redução; e. ajuste da concentração de CO em um meio nutriente liquido contendo a cultura microbiana; f. ajuste da pressão parcial de CO no biorreator.
10. O método da reivindicação 1, que compreende ainda a realização do passo (a) num primeiro biorreator e o passo (b) num segundo biorreator.
11. O método da reivindicação 1, em que o substrato que compreende CO compreende, pelo menos, 15% até cerca de 100% de CO, em volume.
12. O método da reivindicação 9, em que o passo perturbando compreende a adição de um segundo ácido e o ácido é selecionado de entre o grupo constituído por formato, acetato e suas misturas.
13. O método da reivindicação 9, em que o passo perturbando compreende a adição de um agente redutor e o agente é selecionado a partir do grupo que consiste de ditionito de sódio, cisteína, sulfureto de sódio e suas misturas.
14. O método da reivindicação 9, em que o passo perturbando compreende o ajustamento da concentração de CO, aumentando a concentração de CO no meio nutriente líquido, pelo menos, 1 mmol.
15. O método da reivindicação 9, em que o passo compreende o ajustamento perturbando a pressão parcial de CO através do aumento da pressão parcial de, pelo menos, (15 psi) 1,03 x 105 Pa.