BRPI0909334B1

BRPI0909334B1 - método para a conversão de ácido em álcool correspondente

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Publication number: BRPI0909334B1
Application number: BRPI0909334-6A
Authority: BR
Inventors: Al-Sinawi Bakir; Collet Christophe; Chan Gary; Mon Yee Fung Jennifer; Marie Mahar Kelly; James Rowe Matthew; Loan Tran Phuong; Llewellyn Sydney Forster Richard; Dennis Simpson Sean
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Priority date: 2008-03-12
Filing date: 2009-02-18
Publication date: 2019-10-29
Also published as: CN101998997A; EP2250274A1; CA2718219C; KR101312107B1; AU2009224112A1; EP2250274A4; WO2009113878A1; US8119378B2; AU2009224112B9; ZA201006146B; CN101998997B; US20110059499A1; KR20100132974A; JP2013063081A; ES2536786T3; HK1150631A1; EA019266B1; PT2250274E; NZ587563A; CA2718219A1

Abstract

método para a conversão de ácido em álcool correspondente a presente invenção refere-se à produção de alcoóis por fermentação microbiana, particularmente à produção de alcoóis 5 por fermentação microbiana dos substratos compreendendo co. mas particularmente referese a processos para a produção de alcoóis a partir de seus ácidos correspondentes na presença de um substrato compreendendo co. em concretizações particulares, uma reação de fermentação que produz ácido(s) e op10 cionalmente álcool(óis) é perturbada tal que pelo menos um ou mais ácidos são convertidos em álcool.

Description

A presente invenção refere-se à produção de alcoóis por fermentação microbiana, particularmente a produção de alcoóis por fermentação microbiana de substratos compreendendo CO. Mais particularmente referese a processos para a produção de alcoóis a partir de seus ácidos correspondentes.

Antecedentes

Alcoóis são de uso em muitas indústrias incluindo as indústrias de perfume, produto farmacêutico e de combustível. Etanol e butanol, por exemplo, estão rapidamente se tornando combustíveis de transporte de líquido principais em volta do mundo. Processos para a produção de vários alcoóis são conhecidos.

Produção de álcool industrial é grandemente sintética, que deriva de processos pretroquímicos. No entanto, fermentação microbiana pode também ser usada para produzir alcoóis, por exemplo, biocombustíveis, e tem se tornando crescentemente popular.

Biocombustíveis para o transporte são substituições atraentes para gasolina e são mercados de combustível de penetração rápida como combinações de baixa concentração. Biocombustíveis, derivados de fontes de planta naturais, são mais ambientalmente sustentáveis do que aqueles derivados de recursos fósseis (tal como gasolina), seu uso permitindo uma redução nos níveis de gás de dióxido de carbono fóssil (CO2) assim chamado que é liberado para dentro da atmosfera como um resultado de combustão de combustível. Além disso, biocombustíveis podem ser produzidos localmente em muitas geografias, e podem agir para reduzir a dependência dos recursos de energia fóssil importada. Alcoóis adequados para o uso como biocombustíveis incluem etanol, butanol e 2,3-butanodiol, entre outros.

Etanol está rapidamente se tornando um principal combustível de transporte de líquido rico em hidrogênio em volta do mundo. Consumo mundial de etanol em 2005 era estimado em 12,2 bilhões de galões (1 galão

Petição 870180051376, de 15/06/2018, pág. 16/20 = 3,785 I). O mercado global para a indústria de etanol combustível foi também previsto continuar a se desenvolver acentuadamente no futuro, devido a um interesse aumentado no etanol na Europa, Japão, e nos EUA e várias nações em desenvolvimento.

Por exemplo, nos EUA, etanol é usado para produzir E10, uma mistura com 10% de etanol em gasolina. Nas combinações de E10, o componente de etanol age como um agente de oxigenação, aperfeiçoando a eficácia da combustão e redução da produção de poluentes no ar. No Brasil, etanol satisfaz cerca de 30% da demanda de combustível no transporte, tanto como um agente de oxigenação combinada na gasolina, ou como um combustível puro por sua própria natureza. Também, na Europa, preocupações ambientais que envolvem as consequências de emissões de Gás de efeito estufa (GHG) eram o estímulo para a União Européia estabelecer nações membro um alvo determinado para o consumo de biocombustíveis de transporte sustentáveis.

Butanol pode também ser usado como um combustível em um motor de combustão interno. É em vários modos mais similares à gasolina do que é a etanol. Uma vez que o interesse na produção e na aplicação de combustíveis ambientalmente sustentáveis reforçou, interesse em processos biológicos para produzir butanol (frequentemente chamado de bio-butanol) aumentou. Butanol pode ser produzido por fermentação microbiana de biomassa a partir de colheitas tais como beterraba, milho, trigo e cana-deaçúcar. No entanto, o custo desses estoques alimentícios de carboidrato é influenciado por seu valor como alimento humano ou ração animal e o cultivo de colheitas de produção de sacarose ou amido para produção de butanol não é economicamente sustentável em todas as geografias. Portanto, é de interesse desenvolver tecnologias para converter custo menor e/ou mais recursos de carbono abundantes em combustível butanol.

Bactérias anaeróbicas, tais como aquelas oriunda do gênero Clostrídium, foram demonstradas produzir etanol a partir de CO, CO2 e H₂via o trajetório bioquímico de acetil CoA. Por exemplo, várias cepas de Clostrídium Ijungdahlii que produzem etanol a partir de gases são descritas na

WO 00/68407, EP 117309, patentes U.S. N^oS 5.173.429, 5.593.886, e 6.368.819, WO 98/00558 e WO 02/08438. A bactéria Clostrídium autoethanogenum sp é também conhecida por produzir etanol a partir de gases (Abrini e outros, Archives of Microbiology 161, pp. 345-351 (1994)).

No entanto, produção de etanol pelos micro-organismos por fermentação de gases é tipicamente associada à coprodução de acetato e/ou ácido acético. Uma vez que um pouco do carbono disponível é convertido em acetato/ácido acético em vez de etanol, a eficácia da produção de etanol usando-se tais processos de fermentação pode ser menor do que desejável. Também, a não ser que o subproduto de acetato/ácido acético possa ser usado para alguma outra finalidade, pode apresentar um problema de descarte residual. Acetato/ácido acético é convertido em metano por microorganismos e, portanto, tem o potencial para contribuir para emissões de GHG. Outros produtos residuais, tais como ácido butírico/butirato podem também ser produzidos durante os processos de fermentação comumente usados.

Além do mais, processos de fermentação biológicos, que tipicamente utilizam levedura ou bactérias, podem ser limitados à produção de um ou dois alcoóis os quais um organismo particular é capaz de produzir a partir do substrato em que é desenvolvido (por exemplo um carboidrato ou gás compreendendo monóxido de carbono). Se deseja-se produzir um álcool diferente, um micro-organismo diferente pode ser necessário de ser originado. Em muitos casos, pode não ser capaz de originar uma bactéria capaz de produzir álcool desejado. Portanto, é de interesse desenvolver tecnologias para converter recursos de carbono mais abundantes e/ou custo mais baixo tais como ácidos orgânicos, em produtos desejáveis tal como combustível etanol.

Processos para a conversão microbiana de ácido a seus alcoóis correspondentes foram descritos anteriormente: patente U.S. N° 4.851.344; White and Simon, Arch Microbiol (1992) 158: 81-84; Huber e outros, Arch Microbiol (1995) 164: 110-118. No entanto, esses métodos também sofrem de numerosas desvantagens. Por exemplo, eles exigem o uso de mediado res químicos muitos dos quais são tóxicos e/ou dispendiosos. Além disso, os métodos usam extratos de célula, ou células isoladas que são inativas e são necessárias serem giradas por rotação e são ressuspensas em tampão antes da conversão dos ácidos em alcoóis. Essas etapas de processamento têm mão-de-obra dispendiosa intensiva e aumentam o risco dos micróbios a serem expostos a oxigênio, lisados ou de outra maneira danificados.

A presente invenção provê processos para a produção de alcoóis valiosos por fermentação de bactérias anaeróbicas que superam certas desvantagens dos métodos conhecidos na técnica, ou pelo menos para prover o público com uma escolha útil.

Afirmação da Invenção

Em um amplo aspecto, a invenção provê um método para a conversão de um ácido em seu álcool correspondente usando-se bactérias metabolicamente ativas que se desenvolvem um substrato compreendendo monóxido de carbono e/ou hidrogênio.

Em concretizações particulares, o método inclui:

a. cultivo em um biorreator de uma ou mais cepas de uma bactéria carboxidotrófica na presença de um substrato compreendendo CO para produzir um ou mais ácidos e opcionalmente um ou mais alcoóis; e

b. perturbação da cultura microbiana, tal que pelo menos um ácido é convertido em pelo menos um álcool.

Tipicamente, pelo menos uma porção do(s) ácido(s) produzido(s) na etapa (a) é convertida em álcool(óis) na etapa (b). Adicionalmente ou alternativamente, ácido adicional pode ser adicionado ao biorreator durante a etapa (a) e/ou etapa (b) e convertido em pelo menos um álcool.

Em certas concretizações, perturbação da cultura microbiana inclui um ou mais de:

- alteração de pH de um meio de nutriente líquido contendo uma cultura microbiana;

- alteração de ORP de um meio de nutriente líquido contendo uma cultura microbiana;

- adição de um ou mais ácidos ao biorreator;

- adição de um ou mais agentes de redução ao biorreator;

- alteração da concentração de CO em um meio de nutriente líquido contendo uma cultura microbiana;

- alteração de pressão parcial de CO no biorreator, em que o substrato compreendendo CO é gasoso.

Em concretizações particulares, a etapa de alteração da concentração de CO inclui aumento da concentração de CO no meio de nutriente líquido por pelo menos 1 mmol. Em um outro amplo aspecto, a invenção provê um método para a produção de um álcool, o método compreendendo pelo menos as etapas de:

(a) cultivo em um biorreator de uma ou mais cepas de bactéria na presença de um substrato compreendendo monóxido de carbono;

(b) adição de um ácido ao biorreator quando uma ou mais cepas de bactérias estão em uma fase de conversão para produzir o álcool correspondente do ácido; e, em que o álcool produzido não é um álcool que a uma ou mais cepas de bactérias são capazes de produzir quando do desenvolvimento no dito substrato na ausência do dito ácido. Em concretizações particulares dos aspectos acima, o método é conduzido na ausência de um mediador.

Em uma concretização, dois ou mais ácidos são adicionados ao biorreator para produzir dois ou mais alcoóis correspondentes. Em certas concretizações, a uma ou mais bactérias são bactérias que são capazes de usar a trajetória de aldeído de óxido-redutase (AOR) para reduzir um ácido a seu álcool correspondente. Bactérias apropriadas incluem espécies dos gêneros Clostridia, Moorella, Eubacteríum, Acetobacteríum, Butyríbacteríum e Desulfobacterium. Em uma concretização particular a bactéria é Clostrídium autoethanogenum. Tipicamente, o ácido é um ácido monocarboxílico ou dicarboxílico. Em concretizações particulares o ácido é escolhido de ácido acético, ácido propiônico, ácido n-butírico, ácido n-pentanoico, ácido nhexanoico, e ácido benzoico.

Em concretizações particulares, o álcool produzido é escolhido de etanol, 1-propanol, 1- butanol, 1- pentanol, 1-hexanol, e álcool benzílico.

Em um outro amplo aspecto, a invenção provê um método para a produção de butanol o método compreendendo pelo menos as etapas de:

(a) cultivo em um biorreator de uma ou mais cepas de bactéria que são adaptadas para produzir um álcool diferente de butanol na presença de um substrato compreendendo monóxido de carbono;

(b) produção de butanol por adição de butirato ao biorreator quando a uma ou mais cepas de bactérias estão ativamente produzindo o álcool diferente de butanol.

(a) cultivo em um biorreator de uma ou mais cepas de bactéria que são adaptadas para produzir etanol na presença de um substrato compreendendo monóxido de carbono;

(b) produção de butanol por adição de butirato ao biorreator quando a uma ou mais cepas de bactérias estão ativamente produzindo etanol.

Em um outro amplo aspecto, a invenção provê um método para a produção de um álcool, o método compreendendo pelo menos as etapas de:

(a) cultivo em um biorreator de Clostrídium autoethanogenum na presença de um substrato compreendendo monóxido de carbono;

(b) adição de um ácido ao biorreator quando Clostrídium autoethanogenum está em uma fase de conversão para produzir o álcool correspondente do ácido; e, em que o álcool produzido não é um álcool que Clostrídium autoethanogenum é capaz de produzir quando do desenvolvimento no dito substrato na ausência do dito ácido.

Em um aspecto amplamente preferido, a invenção provê um método para a produção de butanol, o método compreendendo pelo menos as etapas de:

(b) adição de butirato ao biorreator quando Clostrídium autoe thanogenum está em uma fase de conversão para produzir butanol. Os métodos da invenção são tipicamente conduzidos na ausência de um mediador.

Em concretizações particulares, o ácido adicionado a um biorreator de acordo com os métodos da invenção é produzido por fermentação microbiana de um substrato compreendendo monóxido de carbono.

Em certas concretizações, as bactérias são cultivadas em um meio líquido na ausência de extrato de levedura e/ou peptona. Em uma concretização, o meio é LM23 ou LM33 como aqui mais acima descrito.

Em um outro amplo aspecto, a invenção provê um método para a produção de um ou mais alcoóis, o método compreendendo pelo menos as etapas de:

(a) em um primeiro biorreator que fermenta um substrato a produção de um ou mais ácidos;

(b) no segundo biorreator que cultiva uma ou mais cepas de bactérias na presença de um substrato compreendendo monóxido de carbono;

(c) introdução do um ou mais ácidos para dentro de (a) no segundo biorreator de uma vez quando a uma ou mais cepas de bactérias estão em um fase solventogênica para produzir os alcoóis que correspondem ao um ou mais ácidos; e, em que o álcool produzido não é um álcool que a uma ou mais cepas de bactérias são capazes de produzir quando do desenvolvimento no dito substrato na ausência do dito ácido.

Em concretizações particulares, o método é conduzido na ausência de mediador.

Em certas concretizações a uma ou mais cepas de bactérias no segundo biorreator são como definidas aqui mais acima.

Em um outro aspecto da invenção, é provido um método para a produção alcoóis a partir da fermentação de bactérias anaeróbicas de um ácido em um biorreator, na presença de um substrato compreendendo CO.

Em uma concretização, o substrato é provido a uma concentração de CO tal que a conversão de ácido em álcool é promovida.

Em uma concretização, a concentração de CO está acima de uma concentração limiar suficiente, tal que conversão de ácido em álcool é promovida. Provisão de CO à fermentação acima dessa concentração limiar suficiente reduz ou previne produção de ácido e/ou reduz ou previne crescimento microbiano, enquanto promovendo conversão de ácido em álcool.

Em uma concretização, o substrato é provido a uma concentração de CO em um meio de fermentação de pelo menos cerca de 2,5 mmols/L. Em uma concretização, a concentração de CO é pelo menos cerca de 2,75 mmols/L. Em uma concretização, a concentração de CO é pelo menos cerca de 3 mmols/L. Em uma concretização, a concentração é pelo menos cerca de 3,5 mmols/L.

Aqueles versados na técnica apreciam mediante consideração dessa descrição que há muitos métodos para o aumento da solubilidade de CO no meio de fermentação, incluindo sem limitação, variação de temperatura e/ou a adição de agentes de solubilização tais como óleos. Tais métodos podem ser empregados na prática da presente invenção quando necessário ou desejável para alcançar uma concentração de CO particular no meio de fermentação.

Em uma concretização, o substrato compreendendo CO é um substrato gasoso, e a quantidade de CO dissolvida em um meio de fermentação é proporcional à pressão parcial de CO na fermentação. Como tal, a concentração limiar suficiente no meio de fermentação pode ser alcançada por aumento de pressão parcial de CO. Em uma concretização, o substrato gasoso é provido tal que a pressão parcial de CO seja pelo menos cerca de 255 kPa (37 psi). Em uma outra concretização, a pressão parcial de CO é pelo menos cerca de 324 kPa (47 psi) De acordo com os métodos da invenção, ácido adicional pode ser fornecido ao biorreator e convertido em álcool.

Em várias concretizações da invenção, o método inclui uma etapa de captura e recuperação de um ou mais alcoóis produzidos pela fermentação.

Em um outro aspecto da invenção, é provido um método de produção de alcoóis e/ou ácidos, o método incluindo fermentação anaeróbica de um primeiro substrato em um biorreator para produzir um ou mais produ tos incluindo alcoóis e/ou ácidos; em que um segundo substrato compreendendo CO é adicionado em um ponto de tempo desejado tal que a produção de álcool, tal como etanol, em relação a ácido, tal como acetato, aumenta.

Em uma concretização, adição do segundo substrato compreendendo CO resulta em pelo menos uma porção do ácido sendo convertida em álcool, com a condição de que a concentração de CO dissolvido resultante esteja a ou acima da concentração limiar suficiente para aquela fermentação.

Em uma concretização, o primeiro substrato também inclui CO; no entanto, o método não é limitado a tais concretizações. Por exemplo, em algumas concretizações, o primeiro substrato pode incluir um ou mais carboidratos ou piruvato. Carboidratos adequados podem incluir, mas não são limitados a, celulose, hidrolisado de celulose, amido, hidrolisado de amido, glicose, frutose, xilose, arabinose, ou lactose. Em algumas concretizações, o carboidrato é frutose ou xilose. Em outras concretizações, o primeiro substrato pode compreender CO2 e/ou H₂ ou quaisquer outros componentes adequados para a produção de ácidos e/ou alcoóis por fermentação.

Em várias concretizações, o método inclui a etapa de captura e recuperação de um ou mais alcoóis produzidos pela fermentação.

Em um outro aspecto da invenção, é provido um método de produção de alcoóis e/ou ácidos, o método incluindo as etapas de:

(a) provisão de um substrato compreendendo CO a uma primeira concentração para um biorreator contendo uma cultura de um ou mais micro-organismos; e (b) fermentação anaeróbica da cultura no biorreator para produzir um ou mais produtos incluindo alcoóis e/ou ácidos a partir do dito substrato, em que a concentração do substrato provida ao biorreator pode opcionalmente ser aumentada em um ponto de tempo desejado, tal que a produção de alcoóis em relação a ácidos aumenta.

Em várias concretizações, aumento da concentração do substrato resulta em pelo menos uma porção do ácido sendo convertida em álcool e/ou a concentração do substrato pode ser aumentada acima de um limiar suficiente, em que pelo menos uma porção do ácido é convertida em álcool.

Em várias concretizações, o método inclui a etapa de captura e recuperação de um ou mais produtos produzidos pela fermentação.

(a) provisão de um substrato gasoso compreendendo CO a uma primeira pressão parcial de CO em um biorreator contendo uma cultura de um ou mais micro-organismos; e (b) fermentação anaeróbica da cultura no biorreator para produzir um ou mais produtos incluindo etanol e/ou ácido acético a partir do dito substrato, em que a pressão parcial de CO pode opcionalmente ser aumentada em um ponto de tempo desejado tal que a produção de etanol em relação a acetato aumenta.

Em uma concretização, o método inclui monitorar crescimento microbiano e/ou a concentração de um ou mais produtos e/ou concentração de CO, em que em um produto desejado e/ou concentração de CO, a pressão parcial de CO pode ser aumentada. Em uma concretização, a pressão parcial de CO pode ser aumentada acima de 186 kPa (27 psi).

Em várias concretizações, aumentar a pressão parcial de CO resulta em pelo menos uma porção do ácido sendo convertida em álcool e/ou a pressão parcial de CO pode ser aumentada acima de um limiar suficiente, em que pelo menos uma porção do ácido é convertida em álcool.

Em várias concretizações, o método inclui a etapa de captura e recuperação de álcool produzido pela fermentação.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é provido um método de regulagem de crescimento microbiano e/ou produção de ácido, o método incluindo as etapas de:

(a) provisão de um substrato gasoso compreendendo CO a uma primeira pressão parcial de CO em um biorreator contendo uma cultura de um ou mais micro-organismos; e (b) fermentação anaeróbica da cultura no biorreator para produzir um ou mais produtos incluindo etanol e/ou ácido acético a partir do dito substrato, em que a pressão parcial de CO pode ser aumentada em um ponto de tempo desejado tal que o crescimento microbiano e/ou a produção de ácido é reduzida ou substancialmente inibida.

Em uma concretização, crescimento microbiano e/ou produção de ácido podem ser aumentados/promovidos (ou reiniciados) quando a pressão parcial de CO é reduzida.

Em um outro aspecto da invenção, é provido um método de regulagem de produção de álcool, o método incluindo as etapas de:

(a) provisão de um substrato gasoso compreendendo CO a uma primeira pressão parcial de CO em um biorreator contendo uma cultura de um ou mais micro-organismos;

(b) fermentação anaeróbica da cultura no biorreator para produzir um ou mais produtos incluindo etanol e/ou ácido acético a partir do dito substrato;

(c) aumento da pressão parcial de CO acima de um limiar suficiente, tal que pelo menos uma porção do ácido é convertida em etanol; e (d) opcionalmente depois disso redução da pressão parcial de CO abaixo do limiar tal que crescimento microbiano e a produção de ácido são promovidos.

Em várias concretizações, produção do álcool e ácido e/ou o crescimento microbiano pode ser monitorada através de toda a fermentação e/ou as etapas (c) e (d) são repetidas pelo menos uma vez.

Concretizações da invenção encontram aplicação particular na fermentação de ácidos na presença de um substrato gasoso compreendendo CO. O substrato pode compreender um gás obtido como um subproduto de um processo industrial. Em certas concretizações, o processo industrial é selecionado do grupo que consiste em fabricação de produtos de metal ferroso, fabricação de produtos não ferrosos, processos de refinamento de petróleo, gaseificação de biomassa, gaseificação de carvão vegetal, produção de energia elétrica, produção de negro de fumo, produção de amônia, produção de metanol e fabricação de coque. Em uma concretização da invenção, o substrato gasoso é gás sintético. Em uma concretização, o substrato gasoso compreende um gás obtido a partir de um moinho de aço.

O substrato contendo CO tipicamente conterá uma maior proporção de CO, tais como pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% em volume de CO, de 40% a 95% em volume de CO, de 40% a 60% em volume de CO, e de 45% a 55% em volume de CO. Em concretizações particulares, o substrato compreende cerca de 25%, ou cerca de 30%, ou cerca de 35%, ou cerca de 40%, ou cerca de 45%, ou cerca de 50% CO, ou cerca de 55% CO, ou cerca de 60% em volume de CO. Substratos tendo concentrações mais baixas de CO, tais como 6%, podem também ser apropriados, particularmente quando H2 e CO2 estão também presentes.

Em várias concretizações, a fermentação é realizada usando-se uma cultura de uma ou mais cepas de bactéria carboxidotrófica. Em várias concretizações, a bactéria carboxidotrófica é selecionada de Clostrídium, Moorella, Oxobacter, Peptostreptococcus, Acetobacterium, Eubacteríum ou Butyríbacteríum. Em uma concretização, a bactéria carboxidotrófica é Clostrídium autoethanogenum.

Os métodos da invenção podem ser usados para produzir qualquer um de uma variedade de alcoóis, incluindo sem limitação etanol e/ou butanol, por fermentação anaeróbica de ácidos na presença de substratos, particularmente substratos gasosos contendo monóxido de carbono. Os métodos da invenção podem também ser aplicados a fermentações aeróbicas, a fermentações anaeróbicas ou aeróbicas de outros produtos, incluindo mas não limitados a isopropanol, e a fermentação de substratos diferentes de gases contendo carbono.

A invenção pode também incluir as partes, os elementos e as características mencionados ou indicados no realatório descritivo, individu almente ou coletivamente, em quaisquer ou a totalidade das combinações de dois ou mais das ditas partes, elementos ou características, e onde números inteiros específicos são mencionados aqui, os quais têm equivalentes conhecidos na técnica à qual a invenção refere-se, tais equivalentes conhecidos são considerados como sendo incorporados aqui como se individualmente fossem indicados.

Figuras

Esses e outros aspectos da presente invenção, que seriam considerados na totalidade de seus novos aspectos, tornar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição, que é dada à título apenas de exemplo, com referência às figuras anexas, em que:

Figura 1: conversão de Butirato em Butanol por C. autoethanogenum nas garrafas de soro. Condições de partida: cultura ativa de C. autoethanogenum, produção de acetato (4,7 g/l) e de etanol (1,2 g/l) pH 5,5, espaço de topo: 172,4 kPa (25 psig) de ultrapressão de 95% CO em CO2. Condições finais: pH 6,35, acetato (4,7 g/l), etanol (3,2 g/l), espaço de topo: 96,6 kPa (14 psig) de ultrapressão.

Figura 2: efeito de adição de formiato em uma cultura de carga de Clostrídium autoethanogenum produzindo acetato e etanol mínimo. Solução de formiato foi adicionada a t = 0 e t = 30 min. (aprox) então continuamente a t = 60 min (aprox).

Figura 3: efeito de adição de acetato em uma cultura contínua de Clostrídium autoethanogenum que produz cerca de 6 g/L/dia de etanol e I g/L/dia de acetato. Acetato (15 g/L/dia) foi adicionado continuamente a partir do dia 52.

Figura 4: efeito de mudança de pH em uma cultura microbiana compreendendo Clostrídium autoethanogenum que produz acetato e etanol. Reciclo de célula foi iniciado por cerca de 2 horas então pH foi ajustado para 5,9 a cerca de t = 3 dias. Após a mudança de pH, acetato foi consumido e quantidades aumentadas de etanol foram produzidas.

Figura 5: um sistema incluindo um biorreator de crescimento e um biorreator de conversão de acordo com particulares concretizações da invenção.

Figura 6: um sistema incluindo múltiplos biorreatores de crescimento e um biorreator de conversão de acordo com concretizações particulares da invenção.

Concretização(ões) da Invenção

O que se segue é uma descrição da presente invenção, incluindo várias concretizações da mesma, dadas em termos gerais. A invenção é ulteriormente exemplificada na descrição dada sob o título de Exemplos aqui mais abaixo, que provê dados experimentais que suportam a invenção, exemplos específicos dos aspectos da invenção, e meios ilustrativos de realização da invenção.

Produtos incluindo ácidos e alcoóis podem ser produzidos a partir de um substrato compreendendo CO por uma cultura microbiana. De acordo com os métodos da invenção, perturbação da cultura microbiana surpreendentemente resulta em consumo dos ácidos com concomitante produção de alcoóis pela cultura microbiana. É considerado que esse resultado pode ser devido a pelo menos uma porção do ácido presente no caldo de fermentação sendo diretamente ou indiretamente reduzida a álcool, particularmente etanol. Isso pode ser chamado da fase de conversão da reação de fermentação. De acordo com os métodos da invenção, uma reação de fermentação pode ser mudada de uma fase de produção (ou crescimento), onde o crescimento microbiano é promovido e alcoóis e/ou ácidos são produzidos, para a fase de conversão por perturbação da cultura microbiana.

É reconhecido de que pelo menos uma porção da cultura microbiana pode estar em uma fase de produção enquanto pelo menos uma porção está em uma fase de conversão. No entanto, na perturbação, pelo menos uma porção da cultura microbiana na fase de produção muda para a fase de conversão, tal que a produção de alcoóis em relação a ácidos aumenta. Em uma concretização particular, há um consumo livre total de ácido(s) e produção de álcool(óis).

De acordo com uma concretização da invenção, etanol é produzido por fermentação microbiana quando produto(s) de cultura microbiana, tal(is) como acetato e opcionalmente etanol, oriundo(s) de um substrato compreendendo CO é(são) perturbado(s). Pelo menos uma porção do CO pode ser convertida em ácidos e/ou alcoóis após a perturbação, mas a maior parte do etanol é produzida por redução microbiana do ácido acético/acetato ('conversão').

Há muitos exemplos de reações de fermentação usando-se substratos compreendendo CO para produzir alcoóis e/ou ácidos, onde alcoóis e ácidos são produzidos ao mesmo tempo. No entanto, em tais exemplos, a razão de produto em geral favorece ácido (isto é, ácido acético/acetato) para álcool (etanol). Em uma outra concretização da invenção, particulares condições de fermentação podem favorecer a produção de álcool sobre produção de ácido. Sob tais condições, ácido adicional adicionado ao fermentador pode ser convertido no álcool correspondente pela cultura microbiana. Por exemplo, ácidos, tal como ácido butírico, pode ser adicionado à reação de fermentação e convertido em alcoóis tal como butirato.

De acordo com os métodos da invenção, surpreendentemente verificou-se que não é necessário usar um mediador, tal como metil viologen, para auxiliar a conversão de ácido(s) em álcool(óis). De fato, foi identificado que metil viologen tem um efeito negativo na produção de butanol por C. autoethanogenum. Isso está em contraste com relatos que um mediador é necessário para conversão microbiana de ácidos em seus alcoóis correspondentes.

Embora não querendo estar ligado por qualquer teoria particular, é considerado que a conversão de ácidos em alcoóis por Clostrídium autoethanogenum de acordo com a invenção ocorre via uma trajetória bioquímica que envolve a óxido-redutase de aldeído da enzima (AOR). AOR é uma única enzima contendo tungstênio capaz de reduzir ácidos carboxílicos não ativados a aldeídos. O aldeído pode ser ulteriormente reduzido por desidrogenases de aldeído a álcool. AOR representa uma ramificação importante da trajetória de solventogênese. O cofator de tungstênio mostrou ser crucial para a atividade de enzima. Essas enzimas podem ser encontradas em micro-organismo fermentativo tais como Clostrídium, Desulfitobacteríum, e P yrococcus. Os melhores AORs caracterizados pertencem a Pyrococcus furíosus cujo genoma contém cinco dos quais quatro foram caracaterizados. O primeiro AOR de P. furíosus tem uma ampla faixa de substrato, mas favorece aldeídos derivados de aminoácidos. Sua estrutura de cristal descreveu a presença de um sítio de ligação de tungstênio à base de molibdopterina. O segundo AOR, oxidorredutase de ferredoxina de gliceraldeído-3-fosfato (GFOR),apenas utiliza gliceraldeídos-3-fosfato e o terceiro AOR, oxidorredutase de ferredoxina de formaldeído (FOR), prefere de um a três aldeídos de carbono. O quarto AOR, W0R5, tem uma faixa de substrato ampla. AOR também foi purificado de

Clostrídium formicoaceticum e thermoaceticum.

Clostrídium autoethanogenum contém dois genes de AOR putativos que partilham ~56% de identidade com AOR de P. furíosus e ~80% com Clostrídium botulinum. Os genes de AOR marcam uma diferença significativa de parente sequenciado mais próximo de C.autoethanogenum, Clostrídium kluyverí, cujo genoma não contém genes de AOR e a produção de álcool prossegue via acetil-CoA. É contemplado que os resultados obtidos são aplicáveis à produção de qualquer álcool de seu ácido correspondente usando-se Clostrídium autoethanogenum ou qualquer outra bactéria capaz de usar a trajetória de AOR.

Assim, em seu amplo aspecto, a invenção provê um método para a conversão de um ácido em seu álcool correspondente usando-se uma cultura microbiana. Em concretizações particulares, a cultura microbiana converte o ácido no álcool na presença de um substrato compreendendo CO e/ou H2.

Definições

A não ser que outra maneira definido, os seguintes termos como usados através de todo esse relatório são definidos como se segue:

Como usado aqui o termo fase de conversão destina-se a se referir a um período de tempo durante o qual bactérias estão fermentando um ou mais ácido(s) para produzir um ou mais álcool(óis). Tipicamente pelo menos uma porção de uma população bacteriana estará em tal fase. No en tanto, não é necessário que a totalidade de bactéria em uma população esteja ativamente produzindo álcool. A fase de conversão é caracterizada pela presença de um nível de álcool no caldo de fermentação.

Os termos perturbar, perturbação e similares, como usados aqui em relação a uma cultura microbiana, destinam-se a incluir qualquer alteração feita que diretamente ou indiretamente afeta a cultura microbiana. Alterações feitas na cultura microbiana incluem mudança de condições de operação de fermentação tal como pH, concentração de CO, ORP ou alteração da composição de um meio de nutriente líquido contendo a cultura.

O termo cultura microbiana e similares, como usado aqui destina-se a incluir pelo menos um micro-organismo suportado sobre e/ou em um meio de nutriente adequado para promover crescimento e/ou produção de metabólito.

Como mencionado aqui, o álcool produzido por um processo da invenção não é um álcool que a uma ou mais cepas de bactéria são capazes de produzir quando do desenvolvimento no substrato na ausência do ácido correspondente. No entanto, deveria ser apreciado que os métodos podem produzir produtos adicionais; por exemplo, um ácido ou álcool que a bactéria fermenta a partir do substrato no qual ele é cultivado.

O álcool produzido pelo método pode ser chamado do álcool primário ou produto primário e quaisquer produtos adicionais como coprodutos. Uso de primário não seria tomado para implicar em um nível particular do produto comparado com coprodutos.

Mediador(es) de redox e similares, como usado aqui destina-se a se referir a um transporte bidirecional elétrico que age como um doador de elétron reversível e/ou aceitante de elétron. Mediadores incluem corantes de viologen (tal como metil viologen), antraquinona e outros corantes de quinona, corantes de trifenilmetano, ftalocianimas, corantes de metina, corantes de pirrol, corantes de porfirina, pteridinas, pteridonas, flavinas, e complexos de metal de grupos secundários VI, VII e VIII.

O uso dos termos ácido, ácidos e similares quando referindose à adição de um ácido a uma cultura ou biorreator de acordo com a in venção seria tomado amplamente, incluindo quaisquer ácidos monocarboxílico e dicarboxílico. Na referência adicional à adição de ácidos(s) seria tomado a incluir referência ao sal equivalente ou uma mistura de sal e ácido.

Similarmente, referências a ácidos específicos aqui seriam tomadas a incluir referência a sais equivalentes (por exemplo ácido butírico e butirato) e vice-versa. A razão de ácido molecular para carboxilato no caldo de fermentação é dependente do pH do sistema. Ácidos exemplares incluem ácido acético, ácido propiônico, ácido n-butírico, ácido n-pentanoico, ácido nhexanoico, e ácido benzoico.

O termo biorreator inclui um dispositivo de fermentação que consiste em um ou mais recipientes e/ou torres ou disposições de tubulamento, que incluem o Reator de Tanque Agitado Contínuo (CSTR), Reator de Célula Imobilizada (ICR), Reator de Leito de Gota (TBR), Coluna de Bolha, Fermentador de Suspensão de Gás, Reator de Membrana tal como Biorreator de Membrana de Fibra Oca (HFMBR), Misturador Estático, ou outro recipiente ou outro dispositivo adequado para o contato de gás-líquido.

Como será apreciado ulteriormente aqui, em algumas concretizações o biorreator pode compreender um primeiro reator de crescimento e um segundo reator de fermentação. Como tal, quando da referência à adição de um ou mais carboidratos ao biorreator ou reação de fermentação seria entendido incluir adição a qualquer dos ou ambos desses reatores onde apropriado.

O termo substratos compreendendo monóxido de carbono inclui qualquer material sólido, líquido ou gasoso contendo CO que pode ser introduzido para dentro de um biorreator para a fermentação.

Substratos gasosos compreendendo monóxido de carbono incluem qualquer gás que contém monóxido de carbono. O substrato gasoso tipicamente conterá uma proporção substancial de CO, tais como, por exemplo, pelo menos cerca de 15% a cerca de 95% em volume de CO.

O termo concentração de CO dissolvida inclui a quantidade de CO presente em um caldo de fermentação/meios como uma função de volume.

O termo pressão parcial de CO e similares incluem a pressão relativa exercida em um sistema por CO em um substrato gasoso incluindo CO e gases adicionais opcionais.

As frases concentração limiar, concentração limiar suficiente e similares podem ser quantitativamente definidas, mas podem variar sob condições de fermentação diferentes, tais como aquelas empregadas com diferentes micróbios; o termo inclui a concentração ou faixa de concentração em que um micróbio muda da produção substancial de álcool e/ou ácido de um substrato, a produção de álcool e consumo de ácido por um período prolongado.

A não ser que de outra maneira exigências de contexto, as frases fermentação, processo de fermentação ou reação de fermentação e similares, como usadas aqui, destinam-se a incluir tanto a fase de crescimento quanto fase de biossíntese de produto de um processo que envolvem o crescimento/e ou biossíntese de um produto por um micro-organismo. De acordo com os métodos da invenção, produtos incluindo ácidos e alcoóis são produzidos a partir de um substrato compreendendo CO, por exemplo, um substrato gasoso compreendendo CO, por fermentação microbiana. Em concretizações particulares da invenção, uma cultura microbiana ativamente em desenvolvimento que produz produtos tais como ácido(s) e opcionalmente álcool(ois) podeser perturbada tal que pelo menos uma porção da cultura microbiana consome um ou mais ácido(s) e produz um ou mais álcool(óis) correspondente(s). Esse resultado pode ser devido a pelo menos uma porção do ácido presente no caldo de fermentação sendo diretamente ou indiretamente reduzida a álcool, particularmente etanol. Isso pode ser chamado da fase de conversão da reação de fermentação. De acordo com particulares concretizações da invenção, uma reação de fermentação pode ser mudada de uma fase de produção substancial, onde crescimento microbiano é promovido e alcoóis e/ou ácidos são produzidos, para fase de conversão concentração de CO crescente na reação de fermentação.

Em outras concretizações da invenção, pelo menos uma porção de uma cultura ativamente em desenvolvimento pode estar produzindo álco ol(óis) e a perturbação inclui adição de um ou mais ácido(s) à cultura tal que pelo menos uma porção do um ou mais ácido(s) é convertida em um ou mais álcool(ois).

Em geral, os métodos da invenção compreendem pelo menos (a) cultivo em um biorreator de uma ou mais cepas de bactéria na presença de um substrato compreendendo monóxido de carbono para produzir um ou mais ácidos e opcionalmente um ou mais alcoóis, e (b) pertubação de uma bactéria cultivada, tal que pelo menos um ácido é convertido em pelo menos um álcool.

Em concretizações particulares, pelo menos uma porção do ácido produzida pela bactéria durante a etapa (a) é convertida á um álcool correspondente na etapa (b). No entanto, em concretizações particulares, ácido(s) adicional(ais) pode(m) ser adicionado(s) ao biorreator, tal que pelo menos uma porção do(s) ácido(s) adicionado(s) é convertida em álcool(óis) na etapa (b). Em tais concretizações, o álcool produzido pode não ser um álcool o qual a uma ou mais cepas de bactéria são capazes de produzir quando do desenvolvimento no substrato na ausência do ácido. O método é de preferência conduzido na ausência de um mediador.

Em uma concretização particular o método compreende pelo menos as etapas de

a) cultivo em um biorreator de uma ou mais cepas de bactéria na presença de um substrato compreendendo monóxido de carbono, em que as bactérias estão produzindo álcool(óis); e

b) adição de ácido a uma bactéria cultivada quando pelo menos uma porção da cultura está em uma fase de conversão para produzir álcool.

Há muitos exemplos de reações de fermentação usando-se substratos compreendendo CO para produzir alcoóis e/ou ácidos, onde alcoóis e ácidos são produzidos ao mesmo tempo. No entanto, em tais exemplos, a razão de produto em geral favorece ácido (isto é, ácido acético/acetato) sobre álcool (etanol).

Perturbações adequadas para a mudança de uma cultura microbiana de uma fase de produção na fase de conversão incluem, mas não são limitadas a: mudança de pH e/ou ORP do meio de fermentação; mudança de concentração de CO em um caldo de fermentação (aqueles versados na técnica apreciarão que há múltiplos métodos de alcançar essa dependência do método de fermentação incluindo alteração de composição gasosa, alteração de pressão de gás, alteração de taxa de fluxo de gás, alteração de velocidade de agitação em um CSTR); adição de agente de redução; adição de um ou mais ácidos.

Correspondentemente, em concretizações particulares da invenção, perturbação da cultura microbiana inclui um ou mais de:

- alteração de pH de um meio de nutriente líquido contendo a cultura microbiana;

- alteração de ORP de um meio de nutriente líquido contendo a cultura microbiana;

- adição de um ou mais ácidos ao biorreator;

- adição de um ou mais agentes de redução ao biorreator;

- alteração da concentração de CO em um meio de nutriente líquido contendo a cultura microbiana;

Enquanto a seguinte descrição focaliza concretizações particulares da invenção, seria apreciado que a invenção é aplicável à produção de alcoóis alternativos a partir de seus ácidos correspondentes. Alcoóis exemplares incluem etanol, 1-propanol, 1-butanol, 1-pentanol, 1-hexanol, e álcool benzílico. Ácidos correspondentes exemplares incluem ácido acético, ácido propiônico, ácido n-butírico, ácido n-pentanoico, ácido n-hexanoico, e ácido benzoico, respectivamente. Exemplos de outros alcoóis que podem ser produzidos de acordo com a invenção incluem aqueles de uso nas indústrias de perfume, farmacêutica e de combustível.

Além disso, o método pode ser conduzido usando-se bactéria diferente de C. autoethanogenum; por exemplo, espécies bacterianas dos gêneros Clostrídia, Moorella, Eubactéria, Acetobactéria, Butyribacteríum e Desulfobacterium podem ser usadas. Mais particularmente, Clostridium Ijung dahlii, Clostrídium aceticum, Clostrídium formicaceticum, Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Eubacteríum limosum, Acetobacterium woodii, Butyríbacteríum methylotrophicum, e Desulfobacteríum autotrophicum podem ser usadas.

Certas concretizações da invenção são adaptadas para o uso de correntes de gás produzidas por um ou mais processos industriais. Tais processos incluem processos de produção de aço, particularmente processos que produzem uma corrente de gás tendo um alto teor de CO ou um teor de CO acim do nível predeterminado (isto é, 5%). De acordo com tais concretizações, bactérias carboxidotróficas são de preferência usadas para produzir ácidos e/ou alcoóis, particularmente etanol ou butanol, dentro de um ou mais biorreatores. Aqueles versados na técnica estarão cientes da consideração da presente descrição que a invenção pode ser aplicada a várias indústrias ou correntes de gás residual, incluindo aqueles de veículos com um motor de combustão interna. Também, aqueles versados na técnica estarão cientes na consideração da presente revelação que a invenção pode ser aplicada a outras reações de fermentação incluindo aquelas usando-se os microorganismos iguais ou diferentes. Portanto, pretende-se que o escopo da invenção não seja limitado às concretizações e/ou aplicações particulares descritas mas pretende-se que seja entendido em um sentido mais amplo; por exemplo, a fonte da corrente gasosa não é limitante, diferente daquele pelo menos um componente do mesmo é usável para alimentar uma reação de fermentação. A invenção tem aplicabilidade particular a aperfeiçoamento da captura de carbono total e/ou produção de etanol e outros alcoóis de substratos gasosos tais como gases de exaustão de automóvel e gases de combustível industrial contendo alto volume de CO.

Fermentação

Processos para a produção de etanol e outros alcoóis a partir de substratos gasosos são conhecidos. Processes exemplares incluem aqueles descritos, por exemplo na WO 2007/117157, na WO 2008/115080, na patente de U.S. N° 6.340.581, na patente de U.S. N° 6.136.577, na patente de U.S. N° 5.593.886, na patente de U.S. N° 5.807.722 e na patente de U.S. N°

5.821.111, cada uma das quais é incorporada aqui por referência.

Numerosas bactérias anaeróbicas são conhecidas como sendo capazes de realizar a fermentação de CO para alcoóis, incluindo n-butanol e etanol, e ácidos tal como ácido acético, e são adequadas para o uso no processo da presente invenção. Exemplos de tal bactéria que pode ser adequada para o uso na invenção incluem aqueles do gênero Clostrídium, tais como cepas de Clostrídium Ijungdahlii, incluindo aquelas descritas na WO 00/68407, na EP 117309, nas patentes de U.S. N⁰⁵ 5.173.429, 5.593.886, e 6.368.819, WO 98/00558 e WO 02/08438, Clostrídium carboxydivorans (Liou e outros., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: pp. 2085-2091), Clostrídium ragsdalei (WO/2008/028055) e Clostrídium autoethanogenum (Abrini e outros, Archives of Microbiology 161: pp. 345351). Outras bactérias adequadas incluem aquelas do gênero Moorella, incluindo Moorella sp HUC22-1, (Sakai e outros, Biotechnology Letters 29: pp. 1607-1612), e aquelas do gênero Carboxydothermus (Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G. e outros (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254260). Outros exemplos incluem Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Ruminococcus productus, Acetobacterium woodii, Eubacterium limosum, Butyríbacteríum methylotrophicum, Oxobacter pfennigii, Methanosarcina barkerí, Methanosarcina acetivorans, Desulfotomaculum kuznetsovii (Simpa e outros, Criticai Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26. pp. (41-65). Além disso, seria entendido que outras bactérias anaeróbicas carboxidotrópicas podem ser aplicáveis à presente invenção como seria entendido por uma pessoa de habilidade na técnica. Será também apreciado que a invenção pode ser aplicada a uma cultura mista de duas ou mais bactérias.

Um micro-organismo exemplar adequado para o uso na presente invenção é Clostrídium autoethanogenum. Em uma concretização, o Clostrídium autoethanogenum é um Clostrídium autoethanogenum tendo as características de identificação da cepa depositada no German Resource Centre for Biological Material (DSMZ) sob o número de depósito de identificação 19630. Em uma outra concretização, o Clostrídium autoethanogenum é um Clostrídium autoethanogenum tendo as características de identificação de número de depósito de DSMZ DSMZ 10061.

Cultivo das bactérias usadas nos métodos da invenção pode ser conduzido usando-se qualquer número de processos conhecidos na técnica para o cultivo e fermentação de substratos usando-se bactérias anaeróbicas. Técnicas exemplares são providas na seção de Exemplos abaixo.

A título de outro exemplo, aqueles processos em geral descritos nos seguintes artigos usando-se substratos gasosos para a fermentação podem ser utilizados: (i) K. T. Klasson, e outros. (1991).

Bioreactors for synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recycling, 5;

145-165; (ii) K. T. Klasson, e outros. (1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations.

FueL 70. 605-614; (iii) K. T. Klasson, e outros. (1992). Bioconversion de synthesis gas into liquid or gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J. L Vega, e outros. (1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation: Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Cultura. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793; (v) J. L Vega, e outros. (1989). Study of gaseous substrate fermentations: conversão de monóxido de carbon em acetato. 1. cultura em batelada. Biotechnology and Bioengineering. 34. 6. 774-784; (vi) J. L. Vega, e outros. (1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas fermentations. Resourse, Conservation and Recycling. 3. 149-160; todos os quais são incorporados aqui por referência.

A fermentação pode ser realizada em qualquer biorreator adequado, tal como um reator de tanque agitado contínuo (CSTR), um reator de célula imobilizada, um reator de suspensão de gás, um reator de coluna de bolha (BCR), um reator de membrana, tal como um Biorreator de Membrana de Fibra Oca (HFMBR) ou um reator de leito de gota (TBR). Também, em algumas concretizações da invenção, o biorreator pode compreender um primeiro reator de crescimento em que os micro-organismos são cultivados, e um segundo reator de fermentação, ao qual caldo de fermentação oriundo do reator de crescimento é alimentado e em que a maior parte do produto de fermentação (por exemplo, etanol e acetato) é produzida.

Em algumas concretizações, onde o substrato é gasoso, pode ser desejável conduzir as fases de produção e/ou de conversão à pressão elevada; que pode ter pelo menos várias atmosferas. Tais sistemas empregarão o uso de um biorreator adaptado para resistir à pressão elevada. Muitos tipos de biorreatores podem ser adaptados para resistir pressões mais altas; um exemplo de tal biorreator é o reator de Buchi AUTOKLAV⁰^.

Em algumas concretizações da invenção, o biorreator pode compreender um primeiro reator de crescimento em que os microorganismos são cultivados e opcionalmente ácidos são produzidos, e um segundo reator de fermentação, ao qual caldo oriundo do reator de crescimento é alimentado e em que adicional, se não a maioria do produto de fermentação de álcool (etanol, por exemplo) é produzida. Como observado acima, biorreator de fermentação ajustado por pressão pode ser empregado.

De acordo com várias concretizações da invenção, a fonte de carbono para a reação de fermentação é um substrato gasoso contendo CO. O substrato pode ser um gás residual contendo CO obtido como um subproduto de um processo industrial, ou oriundo de alguma outra fonte tal como oriundo de emanações de exaustão de automóvel. Em certas concretizações, o processo industrial é selecionado do grupo que consiste em fabricação de produtos de metal ferroso, tais como um moinho de aço, fabricação de produtos não ferrosos, processos de refinamento de petróleo, gaseificação de carvão vegetal, produção de energia elétrica, produção de negro de fumo, produção de amônia, produção de metanol e fabricação de coque. Nessas concretizações, o substrato contendo CO pode ser capturado a partir do processo industrial antes dele ser emitido para dentro da atmosfera, usando-se qualquer método conveniente. Dependendo da composição do substrato contendo CO, pode também ser desejável tratá-la para remover quaisquer impurezas indesejadas, tal como partículas de poeira antes da introdução dela à fermentação. Por exemplo, o substrato gasoso pode ser filtrado ou purificado usando-se métodos conhecidos.

Alternativamente, o substrato contendo CO pode ser originado da gaseificação de biomassa. O processo de gaseificação envolve combus tão parcial de biomassa em um fornecimento restrito de ar ou oxigênio. O gás resultante tipicamente compreende principalmente CO e H2, com volumes mínimos de CO2, metano, etileno e etano. Por exemplo, subprodutos de biomassa obtidos durante a extração e processamento de gêneros alimentícios tal como açúcar a partir de cana-de-açúcar, ou amido a partir de milho ou grãos, ou resíduo de biomassa não alimentício gerado pela indústria da silvicultura podem ser gaseificados para produzir um gás contendo CO adequado para o uso na presente invenção.

O substrato contendo CO tipicamente conterá uma maior proporção de CO, tal como pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% em volume de CO, de 40% a 95% em volume de CO, de 40% a 60% em volume de CO, e de 45% a 55% em volume de CO. Em concretizações particulares, o substrato compreende cerca de 25%, ou cerca de 30%, ou cerca de 35%, ou cerca de 40%, ou cerca de 45%, ou cerca de 50% CO, ou cerca de 55% CO, ou cerca de 60% em volume de CO. Substratos tendo concentrações mais baixas de CO, tais como 6%, podem também ser apropriados, particularmente quando H2 e CO2 estão também presentes.

Embora não seja necessário para o substrato conter qualquer hidrogênio, a presença de H₂ não seria nociva à formação do produto de acordo com os métodos da invenção. Em concretizações particulares, a presença de hidrogênio resulta em uma eficácia total aperfeiçoada da produção de álcool. Por exemplo, em concretizações particulares, o substrato pode compreender uma razão de aprox. de 2:1, ou de 1:1, ou de 1:2 de H2:CO. Em outras concretizações, a corrente de substrato compreende baixas concentrações de H₂, por exemplo, menos do que 5%, ou menos do que 4%, ou menos do que 3%, ou menos do que 2%, ou menos do que 1%, ou está substancialmente livre de hidrogênio. O substrato pode também conter um pouco de CO2, por exemplo, tais como cerca de 1% a cerca de 80% em volume de CO₂, ou de 1% a cerca de 30% em volume de CO2.

Tipicamente, 0 monóxido de carbono será adicionado à reação de fermentação em um estado gasoso. No entanto, os métodos da invenção não são limitados à adição do substrato nesse estado. Por exemplo, o mo27 nóxido de carbono pode ser provido em um líquido. Por exemplo, um líquido pode ser saturado com um monóxido de carbono contendo gás e que líquido adicionado ao biorreator. Isso pode ser alcançado usando-se metodologiapadrão. A título de exemplo um gerador de dispersão de microbolhas (Hensirisak e outros Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3/outubro de 2002) poderia ser usado para essa finalidade.

Em uma concretização da invenção, produtos são produzidos por fermentação de um primeiro substrato e um segundo substrato. Em uma concretização particular da invenção, alcoóis e/ou ácidos serão produzidos quando um primeiro substrato, tal como piruvato ou um carboidrato tal como frutose ou xilose, e um segundo substrato, tal como um substrato compreendendo CO, são providos. Quando a fermentação é perturbada, pelo menos uma porção dos ácidos (ácido acético/acetato) é convertida em alcoóis (etanol). Será apreciado na consideração da presente descrição que há muitos exemplos de carboidratos adequados para a fermentação conhecidos na técnica e muitos exemplos dos tipos de processos usados para fermentar o substrato de carboidrato aplicável aos métodos da invenção. A título de exemplo, substratos adequados podem incluir, mas não são limitados a, monossacarídeos tais como glicose e frutose, oligossacarídeos tal como sacarose ou lactose, polissacarídeos, tal como celulose ou amido. Embora todos esses substratos de carboidrato (e suas misturas) são adequados para o uso em várias concretizações da presente invenção, substratos de carboidrato que podem ser mais comumente usados incluem glicose, frutose, xilose e sacarose (e misturas dos mesmos).

Aqueles versados na técnica apreciarão a partir da consideração dessas descrições que açúcares fermentáveis adequados para o uso nos presentes métodos podem ser obtidos a partir da biomassa celulósica ou lingocelulósica através dos processos de pré-tratamento e sacarificação, como descrito, por exemplo, na publicação do pedido de patente US 2007/0031918. Biomassa refere-se a qualquer material de celulose ou lignocelulósico e inclui materiais compreendendo celulose, e opcionalmente ulte riormente compreendendo hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. Biomassa inclui, mas não é limitada a, coletas de bioenergia, resíduos agrícolas, resíduo sólido municipal, resíduo sólido industrial, lama oriunda da fabricação de papel, resíduo de curral, resíduo de silvicutura e de mandeira. Em uma concretização da invenção, frutose ou xilose comercialmente disponível é usada como carbono opcional e fontes de energia para a fermentação.

Será apreciado que para o crescimento das bactérias e fermentação de CO para produto ocorrer, na adição ao substrato contendo gás de CO, um meio de nutriente líquido adequado necessitará ser alimentado ao biorreator. Um meio de nutriente conterá vitaminas e minerais suficientes para permitir crescimento do micro-organismo usado. Meios anaeróbicos adequados para a fermentação de etanol usando-se CO como a única fonte de carbono são conhecidos na técnica. Por exemplo, meios adequados são descritos nas patentes U.S. n°^s 5.173.429 e 5.593.886 e na WO 02/08438, WO 2007/115157 e WO 2008/115080 mencionadas acima. A presente invenção provê um novo meio que aumentou a eficácia no suporte de crescimento dos micro-organismos e/ou produção de álcool no processo de fermentação. Esse meio será descrito em mais detalhes aqui em seguida.

A fermentação desejavelmente seria realizada sob condições apropriadas para a fermentação desejada ocorrer (por exemplo, CO para etanol). Condições de reação que seriam consideradas incluem pressão, temperatura, taxa de fluxo de gás, taxa de fluxo líquido, pH médio, potencial de redox médio, taxa de agitação (se usar um reator de tanque agitado contínuo), nível inóculo, máximas concentrações de substrato de gás para assegurar que CO na fase líquida não se torne limitante, e máximas concentrações de produto para evitar inibição de produto. Condições adequadas são descritas na WO 02/08438, na WO 07/117157 e na WO 08/115080.

As ótimas condições de reação dependerão do micro-organismo particular usado. No entanto, em geral, é preferido que a fermentação seja realizada na pressão mais alta do que a pressão ambiente. Operação a pressões aumentadas permite um aumento significativo na taxa de transfe rência de CO da fase gasosa para a fase aquosa onde pode ser colocada pelo micro-organismo como uma fonte de carbono para a produção de etanol. Esse por sua vez significa que o tempo de retenção (definido como o volume líquido no biorreator dividido pela taxa de fluxo de gás de entrada) pode ser reduzido quando biorreatores são mantidos à pressão elevada em vez da pressão atmosférica.

Também, uma vez que a taxa de conversão de CO para produto é em parte uma função do tempo de retenção do substrato, e alcançar um tempo de retenção desejado por sua vez dita o volume exigido de um biorreator, o uso de sistemas pressurizados pode grandemente reduzir o volume do biorreator exigido, e consequentemente o custo capital de um equipamento de fermentação. De acordo com exemplos dados na patente de U.S. n° 5.593.886, o volume do reator pode ser reduzido em proporção linear para aumentar a pressão de operação no reator, isto é, biorreatores operados a 10 atmosferas de pressão necessitam apenas um décimo do volume daquelas operadas a 1 atmosfera de pressão.

Os benefícios de condução de fermentação de gás para etanol a pressões elevadas foram também descritos em algum lugar. Por exemplo, a WO 02/08438 descreve fermentações de gás para etanol realizadas sob pressões de 207 kPa e 517 kPa (30 psig e 75 psig), dando produtividades de etanol de 150 g/l/dia e 369 g/l/dia respectivamente. No entanto, fermentações exemplares realizadas usando-se meios similares e composição gasosas de entrada a pressão atmosférica demonstraram produzir entre 10 e 20 vezes menos etanol por litro por dia.

É também desejável que a taxa de introdução do substrato gasoso contendo CO é tal como para assegurar que a concentração de CO na fase líquida não se torna limitante. Isso é porque uma consequência de condições limitadas a CO pode ser que o produto de etanol é consumido pela cultura.

Em concretizações particulares da invenção, etanol é produzido por fermentação microbiana quando o sistema é perturbado nos recipientes fechados. Em vários exemplos providos aqui, o pH da fermentação é des controlado e na conversão de ácido em álcool, o pH aumenta. Em tais exemplos, o pH aumenta para em volta de 6,5 e pode ter um efeito inibitório na conversão; aqueles de habilidade na técnica apreciarão que os métodos da invenção podem incluir controle de pH de um meio de fermentação.

Recuperação de produto

A fermentação de acordo com os métodos da invenção resultará em um caldo de fermentação compreendendo um produto desejável (tal como etanol e/ou butanol) e/ou um ou mais subprodutos (tais como acetato e butirato) bem como células bacterianas, em um meio de nutriente.

Os produtos da reação de fermentação podem ser recuperados usando-se métodos conhecidos. Métodos exemplares incluem aqueles descritos na WO 07/117157, na WO 08/115080, na patente de U.S.n°

6.340.581, na patente de U.S. n° 6.136.577, na patente de U.S.n°

5.593.886, na patente de U.S. n° 5.807.722 e na patente de U.S.n°

5.821.111. No entanto, resumidamente e a título de exemplo apenas etanol pode ser recuperado a partir do caldo de fermentação por métodos tal como evaporação ou destilação fracional, e fermentação extrativa.

Destilação de etanol a partir de um caldo de fermentação fornece uma mistura azeotrópica de etanol e água (isto é, 95% de etanol e 5% de água). Etanol anidro pode subsequentemente ser obtido através do uso de tecnologia de desidratação de etanol de peneira molecular, que é também bem conhecida na técnica.

Procedimentos de fermentação extrativa envolvem o uso de um solvente miscível em água que apresenta um baixo risco de toxicidade para um organismo de fermentação, para recuperar o etanol a partir do caldo de fermentação diluído. Por exemplo, álcool oleílico é um solvente que pode ser usado nesse tipo de processo de extração. Álcool oleílico é continuamente introduzido para dentro de um fermentador, após o que esse solvente se eleva formando uma camada no topo do fermentador que é continuamente extraído e alimentado através de uma centrífuga. Água e células são então prontamente separadas do álcool oleílico e são retornados para o fermentador enquanto o solvente carregado com etanol é introduzido em uma unida de de vaporização rápida. A maior parte do etanol é vaporizada e é condensada enquanto o álcool oleílico não é volátil e é recuperado para o reuso na fermentação.

Acetato, que é produzido como um subproduto na reação de fermentação, pode também ser recuperado a partir do caldo de fermentação usando-se métodos conhecidos na técnica.

Por exemplo, um sistema de adsorção que envolve um filtro de carvão vegetal ativado pode ser usado. Nesse caso, é preferido que células microbianas sejam primeiramente removidas do caldo de fermentação usando-se uma unidade de separação adequada. Numerosos métodos à base de filtração de geração de um caldo de fermentação livre de célula para a recuperação de produto são conhecidos na técnica. O permeato contendo acetato e etanol livre de células é então passado através de uma coluna contendo carvão vegetal ativado para adsorver o acetato. Acetato na forma de ácido (ácido acético) em vez da forma de sal (acetato) é mais prontamente adsorvido por carvão vegetal ativado. É portanto preferido que o pH do caldo de fermentação seja reduzido a menos do que cerca de 3 antes que ele seja passado através da coluna de carvão vegetal ativado, para converter a maioria do acetato na forma de ácido acético. Ácido acético adsorvido no carvão vegetal ativado pode ser recuperado por eluição usando-se métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, etanol pode ser usado para eluir o acetato ligado. Em certas concretizações, etanol produzido pelo próprio processo de fermentação pode ser usado para eluir o acetato. Uma vez que o ponto de ebulição de etanol é de 78,8°C e que de ácido acético é de 107°C, etanol e acetato podem prontamente ser separados entre si usando-se um método à base de volatilidade tal como destilação.

Outros métodos para a recuperação de acetato a partir de um caldo de fermentação são também conhecidos na técnica e podem ser usados nos processos da presente invenção. Por exemplo, as patentes US n°^s6.368,819 e 6.753.170 descrevem um sistema de cossolvente e solvente que pode ser usado para a extração de ácido acético a partir de caldos de fermentação. Como com o exemplo do sistema à base de álcool oleílico descrito para a fermentação extrativa de etanol, os sistemas descritos nas patentes US n⁰³ 6.368.819 e 6.753.170 descrevem um solvente/cossolvente imiscível em água que pode ser misturado com o caldo de fermentação ou na presença ou na ausência dos micro-organismos fermentados a fim de extrair o produto de ácido acético. O solvente/cossolvente contendo o produto de ácido acético é então separado do caldo por destilação. Uma segunda etapa de destilação pode então ser usada para purificar o ácido acético do sistema de solvente/cossolvente.

Os produtos da reação de fermentação (por exemplo, etanol e acetato) podem ser recuperados a partir do caldo de fermentação por remoção contínua de uma porção do caldo a partir de um biorreator de fermentação, separação de células microbianas do caldo (convenientemente por filtração), e recuperação de um ou mais produtos a partir do caldo simultaneamente ou sequencialmente. No caso de etanol pode ser convenientemente recuperado por destilação, e acetato pode ser recuperado por adsorção no carvão vegetal ativado, usando-se os métodos descritos acima. As células microbianas separadas são de preferência retornadas para um biorreator de fermentação. O permeato livre de células que permanece depois que o etanol e o acetato foram removidos é também de preferência retornado para um biorreator de fermentação. Nutrientes adicionais (tais como vitaminas B) podem ser adicionados ao permeato livre de células para reabastecer o meio de nutriente antes que ele retornasse ao biorreator. Também, se o pH do caldo fosse ajustado como descrito acima para aumentar adsorção de ácido acético no carvão vegetal ativado, o pH seria reajustado para um pH similar àquele do caldo no biorreator de fermentação, antes que ele seja retornado ao biorreator.

A invenção agora será descrita em detalhes com referência aos seguintes exemplos não limitantes.

Conversão de ácido(s) em álcool(óis)

Em um amplo aspecto particular, a invenção provê um método de conversão de ácido(s) em álcool(ois) correspondente(s) usando-se uma cultura microbiana. Em concretizações particulares, a cultura microbiana converte o ácido no álcool na presença de um substrato compreendendo CO e/ou H2.

De acordo com os métodos da invenção, uma cultura microbiana compreendendo uma ou mais bactérias carboxidotróficas pode ser perturbada tal que a cultura microbiana converte ácido(s) em álcool(óis). Os métodos da invenção são aplicáveis a uma faixa de reações de fermentação microbiana que utilizam CO como um substrato primário e produzem um ou mais ácidos e/ou alcoóis. Por exemplo, fermentações para produzir acetato, butirato, propionato, caproato, etanol, propanol, e butanol podem ser conduzidas de acordo com os métodos da invenção. Os métodos da invenção podem também ser usados na produção de hidrogênio. Esses produtos podem ser produzidos, por exemplo, por fermentação usando-se micróbios carboxitróficos do gênero Moorella, Clostrídia, Ruminococcus/Peptostreptococcus, Acetobacteríum, Eubacteríum, Butyríbacteríum, Oxobacter, Methanosarcina, Metanossarcina, e Desulfotomaculum.

Em concretizações particulares, a cultura microbiana compreende bactérias acetogênicas, tal como Clostrídium autoethanogenum, que tipicamente utilizam um substrato compreendendo CO para produzir produtos incluindo acetato e/ou etanol. Em tais concretizações, a cultura microbiana pode ser desenvolvida sob condições desejáveis em um caldo de fermentação para promover crescimento e produção de acetato. A fase de crescimento (ou produção) de bactéria acetogênica está tipicamente associada a um aumento em material celular (acúmulo de biomassa) e produção de acetato, com pouca ou nenhuma produção de álcool concomitante. Em concretizações particulares da invenção, a cultura microbiana é perturbada tal que ácidos presentes no caldo de fermentação são convertidos em alcoóis correspondentes (por exemplo, acetato em etanol e/ou butirato em butanol). Conversão de ácidos em alcoóis pode ser chamada da fase de conversão.

Em concretizações particulares da invenção, a cultura microbiana pode ser perturbada tal que ácidos produzidos pela cultura durante a fase de produção são convertidos em alcoóis. Adicionalmente ou alternativamente, a cultura microbiana pode ser perturbada tal que ácidos não produzidos pela cultura durante a fase de produção são convertidos em alcoóis. Por exemplo, alcoóis não produzidos pela cultura microbiana (tais como propionato, butirato, valerato, hexanoato, isovalerato, 2-metilbutirato) podem ser adicionados ao caldo de fermentação e convertidos em alcoóis correspondentes.

Em uma concretização da invenção o ácido é alimentado ou adicionado à reação de fermentação antes ou durante o estágio de conversão. O ácido pode opcionalmente ser adicionado em única ou múltiplas bateladas ou continuamente durante um período de tempo desejado. A quantidade de ácido adicionado ao biorreator pode variar. No entanto, os inventores contemplam a adição de um ácido em uma quantidade que provê uma concentração de cerca de 0,1 a 100 g de ácido por L de caldo de fermentação. Mais de preferência, o ácido é adicionado em uma quantidade para prover uma concentração de desde cerca de 0,1 a 50 g/L, ou de 1 a 20 g/L. Outros exemplos de níveis apropriados de ácido a serem adicionados a uma cultura bacteriana são providos na seção dos Exemplos aqui em seguida.

O ácido pode ser adicionado ao biorreator de um modo por batelada, alimentado por batelada ou contínuo. Em uma concretização o ácido é adicionado de um modo contínuo ou alimentado por batelada de modo a manter uma concentração de ácido no biorreator dentro faixa mencionada acima.

O ácido pode ser adicionado ao biorreator em qualquer forma adequada, incluindo composições contendo o ácido e um ou mais outros ingredientes, veículos ou diluentes. Em uma concretização, o ácido é de preferência preparado e é adicionado ao biorreator como uma solução estoque, tamponado para pH 5,5.

Ácidos de uso na invenção podem ser produzidos por qualquer número de métodos conhecidos, incluindo fermentação microbiana. Em uma concretização, os ácidos são produzidos por fermentação microbiana nos substratos compreendendo carboidratos ou monóxido de carbono, por exemplo. De preferência eles são produzidos por fermentação microbiana em um substrato compreendendo monóxido de carbono, mais de preferência um substrato gasoso compreendendo monóxido de carbono. Exemplos de bactérias de uso na produção dos ácidos incluem aquelas dos gêneros Clostrídia, Moorella e Ruminococcus, Eubacterium, Butyríbacteríum, Oxobacter e Acetobacterium são de uso para esse fim. Em concretizações preferidas as bactérias são escolhidas de Clostrídium autoethanogenum, Clostrídium Ijungdahlii, Clostrídium aceticum, Clostrídium formicaceticum, Clostrídium tetanomorphum, Clostrídium carboxidivorans, Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Ruminococcus productus, Eubacteríum limosum, Butyríbacteríum methylotrophicum, Oxobacter pfennigii, e Acetobacterium woodii. Pessoas versadas podem prontamente apreciar bactérias adicionais de uso na produção de ácidos aplicáveis à presente invenção.

Processos para fermentação microbiana para produzir ácidos de uso na invenção serão prontamente apreciados por pessoas de habilidade na técnica, particularmente tendo relação à informação provida aqui. No entanto, a título de exemplo, butirato pode ser produzido a partir de monóxido de carbono contendo gases como descritos por Grethlein e outros, 1991 (Journal da fermentação e Bioengineering, Vol 72, N° 1, 58-60).

Em uma concretização da invenção o método é um processo alimentado por batelada ou contínuo que liga a produção de um ácido desejado por fermentação microbiana seguida pelo uso daquele ácido para produzir seu álcool correspondente de acordo com os métodos descritos aqui mais abaixo. Nessa concretização, o método compreende pelo menos as etapas de a) em um primeiro biorreator que fermenta um substrato (de preferência um substrato compreendendo monóxido de carbono, mais de preferência um substrato gasoso compreendendo monóxido de carbono) para produzir um ou mais ácidos, b) em um segundo biorreator que cultiva uma ou mais cepas de bactéria na presença de um substrato compreendendo monóxido de carbono, e c) introdução do um ou mais ácidos a partir de (a) no segundo biorreator de uma vez quando a uma ou mais cepas de bactéria estão na fase de conversão para produzir os alcoóis que correspondem ao um ou mais ácidos. Em uma concretização relacionada outros reatores de crescimento podem alimentar bactérias ao primeiro e/ou segundo biorreatores.

Enquanto em concretizações particulares as bactérias são cultivadas na presença de um substrato compreendendo monóxido de carbono, em concretizações alternativas as bactérias podem ser primeiramente desenvolvidas para uma densidade desejada em um substrato alternativo, por exemplo um compreendendo açúcares ou outros carboidratos. As bactérias podem então ser transferidas para um substrato compreendendo monóxido de carbono para a conversão de ácidos em seus alcoóis correspondentes. Essa concretização pode ser conduzida em um sistema de dois reatores como descrito acima.

Reações de fermentação que utlizam um substrato misto, tais como carboidrato e um substrato gasoso compreendendo CO podem ser usadas para produzir alcoóis e/ou ácidos. De acordo com os métodos da invenção, na perturbação de tais reações de fermentação, pelo menos uma porção do ácido é consumida, e a produção de álcool aumenta.

De acordo com os métodos da invenção, alcoóis e/ou ácidos podem ser produzidos por fermentação microbiana de um substrato alternativo tais como carboidratos. Em um ponto de tempo predeterminado, ou no acúmulo de uma quantidade em excesso de ácido, CO pode ser adicionado ao biorreator e a reação de fermentação opcionalmente ulteriormente perturbada para converter pelo menos uma porção do ácido em álcool.

Será apreciado que a fim de suportar o crescimento e a conversão por bactérias de uso na invenção um meio de nutriente adequado será necessário para ser alimentado ao biorreator. Pessoas de habilidade na técnica prontamente apreciarão meios de uso na presente invenção. No entanto, em geral, um meio de nutriente conterá vitaminas, minerais e metais suficientes para permitir crescimento das bactérias nos substratos compreendendo CO. Em particular os meios incluirão um ou mais metais que auxiliam a atividade de enzimas que podem estar envolvidas na conversão de ácidos em seus alcoóis correspondentes; por exemplo, enzimas de CODH (COdesidrogenase) e AOR. Em uma concretização da invenção, o meio de nutriente não contém triptona nem extrato de levedura. O meio anaeróbico adequado para o uso na presente invenção inclui a formulação de meios de

LM23 e de LM33 descrita aqui em seguida sob a seção encabeçada exemplos aqui em seguida.

Enquanto um tipo de meio pode ser usado para suportar formação de produto e crescimento, seria apreciado que mais do que um meio pode ser usado em um processo da invenção. Por exemplo, onde o processo utiliza reatores de fermentação e de crescimento separados, um meio pode ser utilizado no reator de crescimento e meio separado no reator de fermentação.

Cultivo das bactérias seria desejavelmente realizado sob condições apropriadas para permitir que a conversão de ácidos em alcoóis ocorra. Condições de reação que seriam consideradas incluem pressão, temperatura, taxa de fluxo de gás, taxa de fluxo líquido, pH médio, potencial redox do meio, taxa de agitação (se usando-se um reator de tanque agitado contínuo), nível inóculo, máximas concentrações de substrato de gás para assegurar que CO na fase líquida não se torna limitante, e máximas concentrações de produto para evitar inibição de produto. Condições exemplares são providas na seção exemplos aqui em seguida. As ótimas condições de reação dependerão parcialmente da bactéria a ser usada e o álcool a ser produzido.

É também desejável que a taxa de introdução do substrato contendo CO seja tal que assegure que a concentração de CO na fase líquida não se torne limitante. Isso é porque uma consequência de condições limitadas por CO é que o(s) produto(s) é(são) consumido(s) pela cultura.

Será apreciado por pessoas de habilidade geral na consideração da presente revelação que uma variedade de condições de fermentação ou parâmetros pode ser alterada a fim de perturbar a cultura microbiana tal que pelo menos uma porção da cultura microbiana muda de uma fase de produção para a fase de conversão. Por exemplo, um parâmetro de fermentação pode ser alterado tais que ácidos são convertidos em alcoóis pela cultura microbiana. Perturbações adequadas para a mudança de uma cultura microbiana de uma fase de produção para a fase de conversão incluem: mudança de pH e/ou ORP de um meio de fermentação; mudança de concentração de CO em um caldo de fermentação (há múltiplos métodos de alcan çar essa dependência do método de fermentação incluindo alteração de composição gasosa, alteração de pressão de gás, alteração de taxa de fluxo de gás, alteração de velocidade de agitação em um CSTR); adição de agente de redução; adição de um ou mais ácidos. Aqueles versados na técnica apreciarão métodos adequados para alcançar a perturbação desejada e também apreciarão métodos adicionados para a perturbação de uma cultura microbiana de acordo com os métodos da invenção. No entanto, vários métodos exemplares são descritos na seção de Exemplos aqui mais abaixo. Em concretizações particulares da invenção, adição de um ou mais ácidos ao caldo de fermentação provê perturbação adequada para pelo menos uma porção da cultura microbiana para mudar de uma fase de produção para uma fase de conversão. Por exemplo, acetato pode ser adicionado a uma cultura microbiana ativamente se desenvolvendo e produção de acetato e alcoóis e a cultura converte pelo menos uma porção do acetato adicionado em etanol.

Em uma concretização da invenção, acetato adicional pode ser adicionado a uma reação de fermentação continuamente produzindo álcool e acetato a uma taxa de cerca de 15 g/L/dia. Consequentemente, a cultura converterá o acetato em etanol a uma taxa de 6-15 g/L/dia.

Em uma concretização alternativa, ácidos adicionais podem ser adicionados em combinação com pelo menos uma outra perturbação tal como alteração de concentração de CO de caldo de fermentação ou adição de um agente de redução.

Qualquer agente de redução adequado pode ser usado de acordo com os métodos da invenção, no entanto, a título de exemplo, sais de ditionito (tal como ditionito de sódio), sais de sulfeto (tal as sulfeto de sódio) ou cisteína e opcionalmente ácido(s) adicional(ais) podem ser adicionados a uma reação de fermentação tal que pelo menos uma porção da cultura microbiana muda de uma fase de produção para uma fase de conversão, assim convertendo ácido(s) em álcool(óis) correspondente(s). Em concretizações particulares, sulfeto de sódio é adicionado a uma reação de fermentação que predominantemente produz acetato, tal que pelo menos uma porção do acetato é convertida em etanol. Aqueles versados na técnica serão capazes de determinar a quantidade de agente de redução exigida para perturbar o sistema suficientemente para converter ácidos em alcoóis. No entanto, à título de exemplo agentes de redução podem ser adicionados na faixa de concentração de 0,005 mM a 10 mM ou de 0,05 mM a 1 mM. Em concretizações particulares da invenção um mediador de redox tal como metil viologen é adicionado na adição ao agente de reduçãoA adição do mediador de redox tem um efeito nocivo, assim de acordo com concretizações particulares da invenção, o método para a conversão de ácido(s) em álcool(óis) é de preferência conduzido na ausência de um mediador de redox.

Em uma outra concretização da invenção, formiato é adicionado a uma reação de fermentação para mudar a cultura microbiana da fase de produção para a fase de conversão. Em concretizações particulares da invenção, de 2-5 g/L de formiato podem ser adicionados à cultura microbiana tal que acetato produzido pela cultura durante a fase de produção é convertido em etanol.Em concretizações particulares, formiato pode ser adicionado a uma taxa de cerca de 3-6 g/L/dia tal que pelo menos uma porção de acetato produzido pela cultura é convertida em etanol.

Em uma outra concretização da invenção, a cultura microbiana pode ser perturbada por alteração de pH e/ou ORP (potencial de redox aberto) de um meio de fermentação contendo uma cultura microbiana, tal que ácido(s) é(são) convertido(s) em álcool(óis). Aqueles versados na técnica apreciarão meios e/ou métodos para a alteração de pH e/ou ORP de um meio de fermentação. No entanto, atítulo de exemplo, pH de um meio de nutriente líquido contendo uma cultura microbiana pode ser ajustado usando-se ácidos (tal como ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou ácido acético) ou bases (tal como hidróxido de sódio). Similarmente, ORP pode ser ajustado em combinação com pH ou independentemente por adição de agentes de redução.

Em uma concretização particular, pH de um meio de nutriente líquido mantido a pH 5,5 é aumentado para 5,9 por adição de hidróxido de sódio tal que acetato produzido durante uma fase de produção é convertida em etanol. Na mudança do pH, o potencial de redox do meio reduziu de cerca de -430 a -470 mV.

Em uma outra concretização da invenção, aumentando concentração de CO em um biorreator muda pelo menos uma porção da cultura microbiana de uma fase de produção para a fase de conversão. Em certas concretizações, uma cultura microbiana é estabelecida em um meio de nutriente líquido em um biorreator agitado tal como CSTR. É reconhecido de que devido à baixa solubilidade de CO, a alta densidade de célula (por exemplo, de 0,5 - 5 g/L) a concentração de CO no meio de nutriente líquido se aproximará de zero à medida que a cultura microbiana consome o CO a aproximadamente a mesma taxa que é transferido para dentro da solução. Concentração de CO do meio de nutriente líquido pode ser aumentada por aumento de pressão parcial de CO de acordo com lei de Henry. Assim, de acordo com particular concretizações da invenção, a cultura microbiana é perturbada por aumento da pressão parcial de CO em um biorreator.

De acordo com uma concretização da invenção, etanol é produzido por fermentação microbiana quando a concentração de CO no meio de fermentação é aumentada. Pelo menos uma porção do CO pode ser convertida em ácidos e/ou alcoóis durante essa fase de conversão, mas a maioria do etanol pode ser produzido por redução microbiana do ácido acético/acetato. É reconhecido de que aglumas reações de fermentação podem ser operadas pressão parcial de CO elevada. Como tal, a fim de aumentar a concentração de CO no meio de fermentação, a pressão parcial de CO pode ser aumentada por pelo menos 103,4 kPa(15 psi), ou pelo menos 138 kPa (20 psi), ou pelo menos 172,4 kPa (25 psi), ou pelo menos 207 kPa (30 psi), ou pelo menos 241,3 kPa (35 psi), ou pelo menos 275,8 kPa (40 psi) tal que ácido(s) são convertidos em álcool(óis).

Em uma concretização da invenção, uma porção substancial do ácido em um caldo de fermentação é convertido em álcool. Em algumas concretizações da invenção, aumentar a concentração de CO resulta em pelo menos 60% do ácido disponível no caldo de fermentação sendo convertidos em álcool. Em outras concretizações, pelo menos 70% do ácido são convertidos em álcool. Em outras concretizações, pelo menos 80% do ácido são convertidos em álcool.

Em concretizações particulares da invenção, a pressão parcial de CO é aumentada para aproximadamente 109,6 kPa (15.9 psi), ou pelo menos 137,9 kPa (20 psi), ou pelo menos 207 kPa (30 psi), ou pelo menos 275,8 kPa (40 psi), ou pelo menos 344,8 kPa (50 psi) tal que ácidos são convertidos em alcoóis correspondentes. Em tais concretizações, de acordo com a lei de Henry, a concentração de CO no meio de nutriente líquido é esperada como sendo pelo menos 1 mmol, ou pelo menos 1,2 mmol, ou pelo menos 1,4 mmol, ou pelo menos 1,6 mmol, ou pelo menos 1,8 mmol, ou pelo menos 2,2 mmols, ou pelo menos 2,6 mmols, ou pelo menos 3,2 mmols.

Em certas concretizações da invenção, o ácidos são convertidos em alcoóis correspondentes a uma taxa de cerca de pelo menos 12 g/L/dia, ou pelo menos 14 g/L/dia, or pelo menos 16 g/L/dia, ou pelo menos 18 g/L/dia, ou pelo menos 20 g/L/dia, ou pelo menos 22 g/L/dia, ou pelo menos 24 g/L/dia no período depois da perturbação (por exemplo, até 1 hora, ou até 2 h, ou até 3 h, ou até 5 h depois da perturbação). Em concretizações particulares, na presença de hidrogênio na adição a CO, a taxa de conversão de ácido em álcool aumenta até 25 g/L/dia, ou até 26 g/L/dia, ou até 27 g/L/dia após a pertubação. No entanto, a taxa de conversão diminui durante um tempo, tal que em certas concretizações ácido(s) (por exemplo, acetato) pode(m) continuar a acumular durante o curso da reação de fermentação.

Aumentando a concentração (ou pressão parcial) de CO de acordo com os métodos da invenção promovem produção de ácido e crescimento microbiano. No entanto, quando concentração de CO (ou pressão parcial) é aumentada acima da concentração limiar suficiente, produção de ácido e/ou crescimento microbiano são substancialmente inibidos. Correspondentemente, de acordo com os métodos da invenção, crescimento microbiano e/ou produção de ácido podem ser regulados por adição de CO. Assim, a invenção provê um meio para controlar a produção de produtos incluindo alcoóis e/ou ácidos por fermentação microbiana de CO, em que, no acúmulo de um excesso de ácido em um caldo de fermentação, a concen tração de CO pode ser aumentada acima da concentração limiar para converter pelo menos uma porção do ácido em álcool.

Em uma concretização, a invenção provê um método para a produção de alcoóis a partir da fermentação de bactéria anaeróbica de um ácido. Em uma concretização, o método compreende pelo menos a etapa de anaerobicamente fermentando um ácido na presença de substrato compreendendo CO, de preferência um substrato gasoso compreendendo CO, em que a concentração de CO está acima da concentração limiar suficiente.

Em uma concretização da invenção, etanol é produzido por fermentação microbiana de ácido acético/acetato, quando a concentração de CO no meio de fermentação está acima da concentração limiar suficiente. Em uma concretização, um substrato compreendendo CO é provido tal que a concentração de CO em um meio de fermentação está acima da concentração limiar de pelo menos cerca de 2,5 mmols/L. Em outras concretizações, a concentração de CO está acima de um limiar de pelo menos cerca de 2,75 mmols/L, pelo menos cerca de 3 mmols/L ou pelo menos cerca de 3,5 mmols/L.

Em uma concretização da invenção, o substrato compreendendo CO é gasoso e o substrato gasoso é provido tal que o CO tem a pressão parcial pelo menos cerca de 255 kPa (37 psi). Em uma concretização, a pressão parcial de CO é pelo menos cerca de 324 kPa(47 psi).

Em uma outra concretização, é provido um método de produção de alcoóis e/ou ácidos, o método incluindo fermentação anaeróbica de um primeiro substrato em um biorreator para produzir um ou mais produtos incluindo alcoóis e/ou ácidos; em que um segundo substrato compreendendo CO pode ser adicionado em um ponto de tempo desejado tal que a produção de etanol em relação a acetato aumenta. O segundo substrato compreendendo CO é provido tal que a concentração de CO excede a concentração limiar suficiente. Sob tais condições, a produção de álcool aumenta enquanto ácido é consumido e CO pode ser substancialmente não convertido.

Em uma concretização da invenção, o primeiro substrato contém CO; no entanto, o método não é limitado a tal concretização. Por exemplo, em algumas concretizações da invenção, o primeiro substrato pode incluir piruvato ou um ou mais carboidratos. O um ou mais carboidratos podem ser, por exemplo, e sem limitação, celulose, hidrolisado de celulose, amido, hidrolisado de amido, glicose, frutose, xilose, arabinose, ou lactose. Em uma concretização, o carboidrato é frutose ou xilose. Alternativamente, o primeiro substrato pode compreender CO2 e/ou H2 ou quaisquer outros componentes adequados para a produção ácidos e/ou alcoóis por fermentação.

Em uma outra concretização da invenção, é provido um método de produção de alcoóis e/ou ácidos, o método incluindo pelo menos as etapas de:

(a) provisão de um substrato compreendendo CO a uma primeira concentração em um biorreator contendo uma cultura de um ou mais micro-organismos; e (b) fermentação anaeróbica da cultura para produzir um ou mais produtos incluindo alcoóis e/ou ácidos a partir do dito substrato, em que a concentração do substrato provida ao biorreator pode opcionalmente ser aumentada em um ponto de tempo desejado, tal que a produção de alcoóis em relação a ácidos aumenta.

Em uma concretização, o substrato é provido em (a) tal que a concentração de CO no meio de fermentação está abaixo da concentração limiar suficiente. Nessa hora que a concentração de CO é aumentada, o substrato pode ser provido tal que a concentração de CO está acima da concentração limiar suficiente.

Em outra concretização da invenção, o método inclui pelo menos as etapas de:

(a) provisão de um substrato gasoso compreendendo CO a uma primeira pressão parcial de CO em um biorreator contendo uma cultura de um ou mais micro-organismos; e (b) fermentação anaeróbica da cultura para produzir um ou mais produtos incluindo etanol e/ou ácido acético a partir do dito substrato, em que a pressão parcial de CO pode opcionalmente ser aumentada em um ponto de tempo desejado tal que a produção de etanol em relação a acetato aumenta.

Em concretizações particulares, produção do álcool e ácido e/ou crescimento microbiano são monitorados através de todo o processo de fermentação. Sob tais condições, a fermentação pode prontamente ser mudada entre produção de ácido substancial na produção de álcool substancial, quando necessário ou desejado. Em várias concretizações, etapas (c) e (d) podem ser repetidas através de todo o processo de fermentação para manter ótimas condições para a produção de álcool.

Gases residuais industriais compreendendo CO, tal como gás residual de um moinho de aço pode ser usado para converter ácido(s) em álcool(óis) de acordo com os métodos da invenção. Além disso, gases livres de CO compreendendo H2 podem também ser usados para converter ácido(s) em álcool(oóis) de acordo com os métodos da invenção.

A invenção também provê um meio para alternar entre uma fase de produção e uma fase de conversão por mudança de concentrações de CO para mudar da fase de produção para a fase de conversão e reconversão. Por exemplo, e como mostrado nos exemplos, aumentar a concentração de CO acima da concentração limiar resulta em uma porção substancial de ácido acético disponível em um caldo de fermentação sendo consumido com um aumento concomitante na produção de etanol. Redução da concentração de CO abaixo da concentração limiar pode promover crescimento microbiano e produção de ácido como observado na fase de produção. Por exemplo, uma reação de fermentação particular pode operar a uma pressão parcial de CO desejável e produzir produtos incluindo ácido(s). A um ponto de tempo adequado, ou uma concentração de ácido particular (tal como até 20 g/L, ou até 30 g/L, ou até 40 g/L, ou até 50 g/l), a cultura microbiana pode ser perturbada tal que o(s) ácido(s) é(são) convertido(s) em álcool. De acordo com os métodos da invenção, a pressão parcial de CO pode ser aumentada por pelo menos 103,4 kPa(15 psi), ou pelo menos 138 kPa (20 psi), ou pelo menos 172,4 kPa (25 psi), ou pelo menos 207 kPa (30 psi), ou pelo menos 241,3 kPa (35 psi) (1 psi = 0,07 kg/cm²), ou pelo menos 275,8 kPa (40 psi) (1 psi = 0,07 kg/cm²) tal que ácido(s) sejam convertidos em álco ol(ois). Após a conversão, a pressão parcial pode ser reduzida por pelo menos 103,4 kPa (15 psi) (1 psi = 0,07 kg/cm²), ou pelo menos 20 psi (1 psi = 0,07 kg/cm²), ou pelo menos 172,4 kPa(25 psi), ou pelo menos 207 kPa(30 psi), ou pelo menos 241,3 kPa (35 psi) (1 psi = 0,07 kg/cm²), ou pelo menos 275,8 kPa (40 psi), tal que a produção de acetato retome. Esse processo pode ser repetido para prevenir acúmulo de acetato e aumento da concentração de álcool. ]

Em concretizações alternativas, a cultura microbiana pode converter ácido(s) em álcool(óis) por até 1 h, ou até 2 h, ou até 3 h, ou até 5 h após a perturbação. Subsequentemente, como a cultura se ajusta para pressão parcial de CO elevada e/ou consome CO tal que a concentração de CO diminui, a cultura retornará à situação anterior para a produção de ácido. É contemplado que sobre vários ciclos, níveis de álcool aumentarão enquanto níveis de ácido permanecerão à baixa concentração, tal como sob 20 g/L, ou sob 30 g/L, ou sob 40 g/L, ou sob 50 g/L).

Sistema de dois (ou mais) biorreatores

Em algumas concretizações da invenção, as reações de fermentação podem ser realizadas em dois ou mais estágios em um sistema que pode compreender um reator de crescimento (ou produção) em que os micro-organismos são cultivados e opcionalmente ácidos são produzidos, e um reator de conversão, ao qual caldo oriundo do reator de crescimento é alimentado e uma perturbação é aplicada de modo que ácidos produzidos ou adicionados sejam convertidos em alcoóis. Como observado acima, um biorreator de fermentação ajustado por pressão pode ser empregado.

Referindo-se à figura 5, sistema de fermentação 100 compreende um biorreator de crescimento 1, onde condições de fermentação podem ser adaptadas para promover acúmulo ou crescimento de biomassa microbiana e/ou produção de ácido. Por exemplo, condições tais como componentes de meio de nutriente líquido, taxa de alimentação de nutriente, operação de pressão, operação de pH, teor e concentração de substrato, taxa de alimentação de substrato, taxa de agitação do fermentador (se aplicável) e densidade da célula podem ser adaptadas para promover crescimento mi crobiano e/ou produção de ácido. Condições exemplares para a provisão de produção de ácido e biomassa microbiana de estado regular são providas na seção Exemplos abaixo.

O substrato provido ao biorreator de crescimento 1 pode ser selecionado daqueles descritos anteriormente, no entanto, em concretizações particulares o substrato é carboidrato ou CO, ou é uma combinação de carboidrato e CO.

O meio de nutriente líquido pode ser substancialmente retido no biorreator de crescimento 1 por tal tempo que biomassa microbiana e/ou ácidos alcancem níveis desejados e/ou taxas de produção desejadas. A biomassa microbiana e/ou produção de ácido no biorreator de crescimento podem ser monitoradas rotineiramente ou continuamente por meios conhecidos na técnica. Além do mais, condições no biorreator de crescimento podem ser ajustadas para manter substancialmente ótimas condições para o crescimento e/ou produção de ácido.

Será apreciado por aqueles versados na técnica que álcool pode também ser produzido sob certas condições no biorreator de crescimento. No entanto, em concretizações particulares, ácido(s) será(ão) o produto principal no biorreator de crescimento.

Nessa hora quando os níveis ou taxas desejados de biomassa e/ou ácido forem alcançados, pelo menos uma porção do ácido e opcionalmente pelo menos uma porção da biomassa microbiana pode ser passada, por meio de conduto adequado, a partir do reator de crescimento 1 para um reator de conversão 2, continuamente ou em pontos de tempo desejados. Por exemplo, a uma concentração de ácido desejada no biorreator de crescimento 1, tal como pelo menos 5 g/L, ou pelo menos 10 g/L, ou pelo menos 20 g/L, ou pelo menos 30 g/L, ou pelo menos 40 g/L, ou pelo menos 50 g/L, or pelo menos 60 g/L, ou pelo menos 70 g/L, ou pelo menos 80 g/L, ou pelo menos 90 g/L ou pelo menos 100g/L, uma porção do meio de nutriente líquido compreendendo os ditos ácidos e opcionalmente biomassa microbiana pode ser passada para o biorreator de conversão 2, em que uma cultura microbiana pode ser perturbada de modo que ácidos sejam convertidos em alcoóis.

O meio de nutriente líquido que sai do biorreator de crescimento 1 tipicamente é substituído com meio de nutriente líquido fresco para prover condições adequadas para biomassa em estado constante e/ou produção de ácido. A concentração de ácido no biorreator de crescimento 1 seria mantida abaixo de um nível em que a inibição do micróbio particular ocorre. Em concretizações particulares da invenção, um substrato compreendendo CO é provido ao biorreator de conversão 2 tal que a concentração de CO no meio de nutriente líquido é pelo menos cerca de 2,5 mmols/L ou pelo menos cerca de 2,75 mmols/L, ou pelo menos cerca de 3 mmols/L ou pelo menos cerca de 3,5 mmols/L. Em concretizações particulares, o substrato compreendendo CO é gasoso e pode ser provido tal que a pressão parcial de CO é pelo menos cerca de 186 kPa (27 psi) , ou pelo menos cerca de 255 kPa (37 psi) ou pelo menos cerca de 324 kPa (47 psi).

O consumo de ácido e/ou produção de álcool no biorreator de conversão 2 podem ser rotineiramente ou continuamente monitorados por meio conhecidos na técnica. Nessa hora quando o meio de nutriente líquido alcança uma concentração de álcool desejada, tal como pelo menos 5 g/L, ou pelo menos IO g/L, ou pelo menos 20 g/L, ou pelo menos 30 g/L, ou pelo menos 40 g/L, ou pelo menos 50 g/L, ou pelo menos 60 g/L, ou pelo menos 70 g/L, ou pelo menos 80 g/L, ou pelo menos 90 g/L ou pelo menos 100 g/L, uma porção do meio de nutriente líquido compreendendo os ditos alcoóis pode ser passada para um aparelho de recuperação de produto 3. A concentração de álcool no biorreator de conversão seria mantida abaixo de um nível em que inibição da cultura microbiana usada para a produção de álcool ocorre.

Em uma concretização da invenção, o micróbio cultivado e desenvolvido no biorreator de crescimento 1 é um micróbio carboxidotrófico tais como aqueles descritos aqui mais acima, e as condições são otimizadas para o crescimento microbiano e/ou produção de ácido. Um segundo micróbio (também um micróbio carboxidotrófico) pode ser provido ao biorreator de conversão 2 e as condições otimizadas para a produção de álcool. A cultura microbiana provida nos biorreatores de crescimento e de conversão pode ser igual ou diferente. No entanto, em uma concretização particular, o micróbio provido a ambos os biorreatores é Clostrídium autoethanogenum.

Em certas concretizações da invenção, o biorreator de crescimento 1 inclui um sistema de reciclo de célula, em que pelo menos uma porção biomassa microbiana pode se removida do meio de nutriente líquido que sai do biorreator de crescimento e retorna ao biorreator de crescimento 1. Isso promove acúmulo de biomassa no reator de crescimento 1. Alternativamente, a biomassa microbiana não é removida do meio de nutriente líquido que sai do reator de crescimento, mas é passada diretamente no biorreator de conversão 2.

Em concretizações particulares, a cultura microbiana se desenvolve e produz ácidos no reator de crescimento 1. Pelo menos uma porção da mesma cultura microbiana é continuamente ou intermitentemente passada para o biorreator de conversão 2, juntamente com ácidos no meio de nutriente líquido, em que as condições no biorreator de conversão 2 (tal como concentração de CO elevada) promovem a produção de álcool pela mesma cultura microbiana.

O tempo de retenção do meio de nutriente líquido no biorreator de crescimento 1 pode ser regulado para otimizar acúmulo de biomassa e/ou produção de ácido. Por exemplo, na partida, acúmulo de biomassa pode ser desejável e a taxa de fluxo de meios de nutriente líquido que passam para dentro e para fora do biorreator de crescimento 1 pode ser reduzida para aumentar o tempo de retenção do meio no biorreator de crescimento 1 e assim permite que biomassa e/ou ácido alcancem as taxas ou níveis desejados.

Quando a produção de biomassa e/ou de ácido se aproxima ou alcança taxas ou níveis desejados, o tempo de retenção de líquido pode ser reduzido por aumento da taxa de fluxo do meio de nutriente líquido do biorreator de crescimento 1 para o biorreator de conversão 2. Em certas concretizações, os níveis de biomassa microbiana e/ou ácido são monitorados e o tempo de retenção pode ser ajustado para alcançar uma concentração de ácido de estado substancialmente constante. Além do mais, condições podem também ser reguladas para alcançar a concentração de ácido de estado constante desejada de pelo menos 5 g/L, ou pelo menos 10 g/L, ou pelo menos 20 g/L, ou pelo menos 30 g/L, ou pelo menos 40 g/L, ou pelo menos 50 g/L, ou pelo menos 60 g/L, ou pelo menos 70 g/L, ou pelo menos 80 g/L, ou pelo menos 90 g/L ou pelo menos 100 g/L, no biorreator de crescimento 1.

O tempo de retenção de líquido do meio de nutriente líquido pode também ser regulado no biorreator de conversão 2 para alcançar produção de álcool eficaz. Por exemplo, o meio de nutriente líquido pode ser provido continuamente a um volume e a taxa constante do meio de nutriente líquido no biorreator de conversão 2 pode ser ajustada para prover um tempo de retenção adequado para alcançar conversão de álcool desejável. Em concretizações particulares da invenção, a taxa de produção de álcool na fase de conversão álcool a concentrações elevadas de CO é mais rápida do que a taxa de crescimento e/ou produção de ácido. Como tal, o biorreator de conversão 2 pode ser substancialmente menor do que o biorreator de crescimento 1 levando a substancialmente tempo de retenção de líquido menor no biorreator de conversão 2.

Mediante consideração da presente revelação, aqueles versados na técnica apreciarão configurações adequadas ou desejáveis para cada biorreator, no entanto em uma concretização particular, uma porção do meio de nutriente líquido compreendendo uma cultura microbiana, ácido e opcionalmente álcool é passada para um segundo recipiente configurado como um biorreator de fluxo de tampão.

A pressão parcial de CO pode ser elevada no recipiente de fluxo de tampão, de modo que quando uma porção do meio de nutriente líquido passa através do(s) ácido(s) é convertida em álcool(óis). Aqueles versados na técnica apreciarão meios para a manutenção de fluxo através do biorreator, tais como misturadores estáticos. Além do mais, o biorreator pode incluir meios de fornecimento de substrato adicionais completamente a fim de manter a concentração de CO exigida e/ou desejada através de todo o biorrea50 tor.

Em uma outra concretização, a biorreator de produção compreende pelo menos uma cultura microbiana e o biorreator de conversão compreende pelo menos uma cultura microbiana. Enquanto caldo de fermentação contendo ácido(s) e/ou álcool(óis) pode passar a partir de um biorreator de produção para o reator de conversão e a partir do biorreator de conversão para a recuperação de produto, as culturas microbianas respectivas são substancialmente retidas em cada biorreator pelos sistemas de reciclo de célula. Em tais concretizações, as culturas microbianas podem ser diferentes, com a condição de que a cultura na biorreator de produção produza ácido(s) e a cultura no biorreator de conversão converta ácido(s) em álcool(óis). Em concretizações particulares, a cultura microbiana no biorreator de conversão converte ácido(s) em álcool(óis) à pressão parcial de CO elevada.

Em certas concretizações, ácido(s) produzido(s) a partir de outra fermentação e/ou processos industriais pode(m) ser adicionado(s) ao biorreator de conversão quando desejado para converter em álcool(óis).

Em uma outra concretização da invenção, um sistema de fermentação compreendendo múltiplos biorreatores de crescimento, configurados para fornecer um biorreator de conversão simples, com meio de nutriente líquido compreendendo ácidos e opcionalmente biomassa microbiana é provido. Por exemplo, referindo-se à figura 6, sistema de fermentação 101 compreende um primeiro e um segundo biorreator de crescimento Ia e 1b, e cada um pode ser configurado para produzir ácido(s). Meio de nutriente líquido contendo ácidos e opcionalmente biomassa oriundos dos biorreatores de crescimento 1a e b pode ser introduzido no biorreator de conversão 2 para a produção de álcool. Alternativamente, um primeiro biorreator de crescimento 1a pode ser configurado para rápido acúmulo de biomassa (por exemplo alto tempo de retenção de líquido), enquanto o segundo biorreator de crescimento 1b é configurado para a ótima produção de ácido (por exemplo tempo de retenção de líquido mais baixo). Os tempos de retenção de líquido de cada biorreator de crescimento 1a e b podem ser ajustados correspondentemente para manter ótimas condições de produção de álcool a51 través de todo o sistema global.

Em concretizações incluindo múltiplos biorreatores de crescimento, um ou mais biorreatores de crescimento podem ser totalmente paralisados por um período (tal como para a manutenção), sem substancialmen5 te adversamente afetar a produção de álcool.

EXEMPLO:

Preparação de Meio:

Componente do meio	Concentração por 1,01 de meio (LM23)	Concentração por 1,0 I de meio (LM33)
MgCI₂.6H₂O	0,5 g	0,5 g
NaCI	0,2 g	0,2 g
CaCI₂	0,2 g	0,2 g
tampão fosfonato de sódio a 100 mM (pH 6.0)*	160 ml	-
NaH₂PO₄	-	2,04 g
NH₄CI	0,6 g	2,5 g
H₃PO₄ a 85%	0,05 ml	-
KCI	0,15g	0,15 g
Solução de metal em traço de compósito (LSO6)	10 ml	10 ml
Solução de metal de vitamina B de compósito (LSO3)	10 ml	10ml
Resazurina (1000 mg/l de estoque)	1 ml	2 ml
FeCh	0,0025 g	0,01 g
Monoidrato de HCI de cisteína	0,75 g	0,5 g
Agarose (opcional)	15g	15g
Água destilada	Até 1 litro	Até 1 litro

*Combinar NaH₂PO₄ (13,2 g) e NaH₂PO₄, 7 H₂O (1,1 g em H₂O (1 L)

Solução dé metal de vitamina B de compósito (LS03)	Por L de estoque	Solução de metal de vitamina B de compósito (LS06)	Por L de estoque
Biotina	20,0 mg	Ácido nitrilotriacético	1,5 g
Ácido fólico	20,0 mg	MgSO₄.7H₂O	3,0 g
Hidrocloreto de piridoxna	10,0 mg	MnSO₄.H₂O	0,5 g
Tiamina.HCI	50,0 mg	NaCI	1,0g
Riboflavina	50,0 mg	FeSO₄.7H₂O	0,1 g
Ácido nicotícinico	50,0 mg	Fe(SO₄)₂(NH₄)₂.6H₂O	0,8 g
D-(*)-panteonato de cálcio	5,0 mg	CoCI₂.6H₂O	0,2 g
Vitamina B12	50,0 mg	ZnSO₄.7H₂O	0,2 g
Ácido p-aminobenzoico	50,0 mg 50,0 mg Até 1 litro	CuCI₂.2H₂O	0,02 g
Ácido tióctico	Alq(SO₄)₂.12H₂O	0,02 g
H3BO3	0,30 g
NaMoO₄.2H₂O	0,03 g
Na₂SeO₃	0,02 g
NiCI₂.6H₂O	0,02 g
Na₂WO₄.6H₂O	0,02 g
Água destilada	Até 1 litro

Meio foi preparado a pH 5,5 como se segue. Todos os ingredientes com a exceção de Cisteína- HCI foram misturados em 400 ml de água destilada. Essa solução foi feita anaeróbica por aquecimento até ebulir e permiti-la que resfrie para a temperatura ambiente sob um fluxo constante de 95% de gás de CO, 5% de gás de CO2. Uma vez frio, a Cisteína-HCI foi adicionado e o pH da solução ajustado para 5,5 antes levando o volume até 1000 ml; anaerobicidade foi mantida através de toda as experiências.

Bactéria:

Clostrídium autoethanogenum foram obtidas a partir de da German Resource Centre for Biological Material (DSMZ). O número de acesso dado à bactéria é DSMZ 10061. Alternativamente, Clostrídium autoethanogenum usada é aquela depositada na German Resource Centre for Biological Material (DSMZ) e é alocado o número de acesso 19630.

Fermentação contínua no reator de tanque agitado contínuo (CSTR) (instalação típica):

Um biorreator de 5 L foi carregado com 4,9 L de meio de LM23 ou LM33 preparado como descrito acima. O gás foi mudado em 95% de CO, 5% de CO2 à pressão atmosférica antes da inoculação com 100 ml de uma cultura de Clostrídium autoethanogenum. O biorreator foi mantido a 37°C agitado a 200 rpm no início da cultura. Durante a fase de crescimento, a agitação foi aumentada para 400 rpm. O pH foi ajustado para 5,5 e foi mantido por adição automática de NaOH a 5 M. Meio anaeróbico fresco foi continuamente adicionado no biorreator para manter um nível de acetato e biomassa no biorreator.

Fermentação de carga sob pressão na garrafa de soro

Garrafas de soro estéreis foram purgadas três vezes com gás contendo CO (vide os exemplos para a composição) e então foram esvaziadas para um vácuo de -34,4 kPa (-5 psi). 50 ml de biomassa contendo cultura ativa, acetato e traços de etanol sob pressão atmosférica foram transferidos diretamente de um biorreator contínuo para dentro da garrafa de soro de 234 ml. Os 204 ml de espaço de topo foram então enchidos com gás contendo CO na ultrapressão exigida. Uma incubadora de agitação foi usada e a temperatura de reação foi mantida a 37°C.

Densidade de célula:

Para determinar a densidade de célula nessas experiências, a absorbância das amostras foi medida a 600 nm (spectrofotômetro) e a massa seca determinada via cálculo de acordo com os procedimentos publicados. O nível de metabólitos foi caracterizado usando-se cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e em alguns casos cromatografia gasosa (GC).

HPLC:

HPLC System Agilent 1100 Series. Fase móvel: Ácido sulfúrico a 0,0025 N. Fluxo e pressão: 0,800 mL/min. Coluna: Alltech 10A; catálogo # 9648, 150 x 6,5 mm, tamanho de partícula 5 pm. Temperatura da coluna: 60°C. Detector: índice refrativo. Temperatura de detector: 45°C.

Método para a preparação de amostra:

400 μΙ_ de amostra e 50 μί de ZnSO4 a 0,15 M e 50 μί de Ba(OH)2 a 0,5 M são carregados em um tubo loaded Eppendorf. Os tubos são centrifugados por 10 min. a 12.000 rpm, 4°C. 200 μ!_ do sobrenadante são transferidos para dentro de um frasco de HPLC, e 5 μΙ_ são injetados para dentro do instrumento de HPLC.

Cromatografia gasosa:

Cromatógrafo gasoso HP 5890 série II utilizando um detector de ionização de chama. Coluna de GC capilar: EC1000- Alltech EC1000 30m x 0,25 mm x 0,25 um. O Cromatógrafo gasoso foi operado no modo de separação com um fluxo total de hidrogênio de 50 mL/min com 5 mL de fluxo de purga (separação de 1:10), uma pressão de topo de coluna de 69 kPa (10 PSI) resultando em uma velocidade linear de 45 cm/s. O programa de temperatura foi iniciado a 60°C, foi mantido por 1 minuto então se elevou para 215°C a 30°C por minuto, então foi mantido por 2 minutos. Temperatura de injetor era de 210°C e a temperatura do detector era de 225°C.

Método para a preparação da amostra:

500 μί de amostra foram centrifugados por 10 min. a 12.000 rpm, 4°C. 100 μί do sobrenadante é transferido para dentro de um frasco de GC contendo 200 μί de água e 100 μί de solução de adição-padrão interna (10 g/L de propan-1-ol, 5 g/L de ácido iso-butírico, ácido clorídrico a 135 mM). 1 μί da solução é injetado para dentro do instrumento de GC.

Exemplo 1: Conversão de ácido orgânico em álcool correspondente

Exemplo 1A: Conversão de ácido butírico em butanol em um CSTR

Um reator de oito litros foi enchido com 7200 ml do meio LM23 e foi submetido em autoclave por 30 minutos a 121°C. Enquanto se resfriando, o meio foi pulverizado com N2. O gás foi mudado em 95% de CO, 5% de CO2 antes da inoculação com 160 ml de uma cultura de Clostrídium autoethanogenum. O biorreator foi mantido a 37°C foi agitado a 200 rpm no início da cultura. Durante a fase de crescimento, a agitação foi aumentada para

500 rpm. O pH foi ajustado para 5,5 e foi mantido por adição automática de NaOH a 5 Μ. A solução de n-butirato contendo 20 g de ácido butírico tamponado para pH 5,5 foi adicionada diretamente na cultura ativamente em desenvolvimento. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas a 0,24 e 48 horas depois da adição de ácido butírico (vide tabela 1).

Tabela 1: Conversão de 20 q de n-butirato em 1-butanol por 8 litros de cultura de C. autoethanoQenum que produz acetato e etanol em um biorreator mantido a pH 5,5. Condições de partida: cultura ativa de C. autoethanogenum, produção de acetato (8,3 q/l) e etanol (5,4 q/l) pH 5,5 e gás de pulverização contendo 95% de CO em CO2.

Tempo [h]	0	24	48
Butanol produzido (g)	0,0	4,0	8,2

Exemplo 1B: Conversão de acetato e butirato em alcoóis correspondentes:

Frascos de soro foram preparados de acordo com o exposto acima. Uma vez que o crescimento microbiano foi estabelecido (associado a acetato e quantidades pequenas de etanol produzido), os seguintes compostos foram adicionados nos 50 ml de cultura ativa na garrafa de soro: 1 ml de ditionito de sódio 10 g/l de solução, 2 ml de solução de ácido n-butírico 100 g/l (pH ajustado para 5,5 com hidróxido de sódio a 5 Μ). A fase gasosa foi trocada para 172,4 kPa (25 psig) ultrapressão de uma mistura de gás de 95% de CO, 5% de CO2. Depois da adição do ácido, 1 ml de amostra foi tirado para a quantificação dos metabólitos em vários pontos de tempo (vide tabela 2).

Tabela 2: Conversão de n-butirato em 1-Butanol por uma cultura de C. autoethanogenum produzindo acetato e etanol em uma garrafa de soro a pH 5,5 na presença ou na ausência de metilvioloqen a 0,8 mM (MV). Condições de partida: cultura ativa de C. autoethanoqenum, produzindo acetato (4,7 q/l) e etanol (1,2 q/l) pH 5,5, espaço de topo: 172,4 kPa (25 psig) ultrapressão de 95% de CO em CO2.

Tempo [h]	Concentração de mtil vilogen (mM)	Concentração de acetato (g/i)	Concentração de etanol (g/l)	Concentração de butirato (g/i)	Concentração de butanol (g/i)
0	0	4,50	1,26	4,19	0,00
2	0	5,00	1,40	3,93	0,16
4	0	4,19	1,28	3,68	0,30
22	0	4,61	1,44	3,81	0,41
0	0,8	4,72	1,24	3,81	0,00
2	0,8	4,87	1,42	3,66	0,17
4	0,8	4,88	1,49	3,42	0,34
22	0,8	4,15	1,84	2,27	1,35

A presença do mediador metil viologen significativamente inibe a conversão de n- butirato em n-butanol (tabela 2). Além do mais, ácido butírico foi estequiometricamente convertido em butanol (figura 1).

Os resultados ilustram numerosas vantagens significativas sobre métodos anteriormente relatados para a conversão microbiana de ácidos em seus alcoóis correspondentes. Por exemplo, eles demonstram para o primeiro tempo que Clostrídium autoethanogenum (C.auto) pode ser usada para produzir alcoóis que não são conhecidos como sendo capazes de produzir sob condições-padrão de fermentação.

As células bacterianas não precisam ser coletadas antes da adição de ácido para produzir um álcool desejado; a conversão de ácido em álcool é realizada diretamente em um meio de cultura. Isso significativamente reduz manipulação de células, o risco de dano celular que pode ser causado por centrifugação e ressuspensão, e o risco de contaminação de oxigênio. A conversão não exige o uso de um mediador, tal como metil viologen. De fato, a adição de metil viologen foi demontrada inibir ou pelo menos reduzir a taxa de conversão de ácidos em alcoóis. Tais mediadores são frequentemente tóxicos. Remoção da necessidade de um mediador tem a vantagem de reduzir manipulação de produtos químicos tóxicos e redução dos custos associados à produção de alcoóis.

Pelo menos no caso de C. autoethanogenum, as células bacteri anas podem ser mantidas no mesmo pH e temperatura durante a fase de crescimento e a fase de conversão ácido em álcool (37°C e pH 5,5). Isso simplifica o processo e reduz o risco de choque nas células.

Além disso, a adição do ácido quando as bactérias estão na fase de conversão, e a capacidade das células de continuar a consumir monóxido de carbono e produzir acetato e etanol (por exemplo) enquanto eles estão convertendo os ácidos adicionados em alcoóis correspondentes, provê um método em que numeroso produtos valiosos podem ser produzidos simultaneamente.

Exemplo 1C: conversão de vários ácidos em alcoóis correspondentes: frascos de soro foram preparados de acordo com o exposto acima. No entanto, 5 mL de uma solução de ácido aquosa foram adicionados ao frasco vazio e pH foi ajustado para 5,5 com NaOH. Ditionato de sódio (0,5 mL de uma solução aquosa de 10 g/L) ou cisteína (1 mL de uma solução aquosa de 6,25 g/L) foi adicionado antes da inoculação. Cada frasco de soro foi pressurizado a 207 kPa (30 psig) com 95% de gás de CO e foi incubado a 37°C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas a 72 h (vide tabela 3).

Tabela 3: conversão de vários ácidos em alcoóis correspondentes por Clostrídium autoethanogenum.

Agente de redução	Ácido	Concentração de ácido inicial (g/l)	Concentração de álcool a 72 h (g/l)
Ditionato de sódio	Propiônico	0,9	0,14 (propanol)
Ditionato de sódio	Propiônico	1,4	0,38 (propanol)
Ditionato de sódio	Butírico	2,3	0,17 (butanol)
Ditionato de sódio	Butírico	3,1	0,52 (butanol)
Ditionato de sódio	Valérico	1,0	0,14 (pentanol)
Ditionato de sódio	Valérico	1,7	0,24 (pentanol)
Ditionato de sódio	Hexanóico	0,9	0,06 (hexanol)
Ditionato de sódio	Hexanóico	1,7	0,09 (hexanol)
Cisteína	Isovalérico	1,41	0,03 (3-metilbutanol)
Cisteína	2-metilbutírico	1,87	0,06 (2-metilbutanol)

Como pode ser visto acima, Clostrídium autoethanogenum pode ser usado para converter uma variedade de ácidos em seus alcoóis correspondentes na presença de um agente de redução. Novamente, isso é particularmente significativo, as os expostos acima ácidos e alcoóis não são conhecidos como sendo metabólitos naturalmente produzidos de C. auto.

Exemplo 2: efeito de concentração de agente de redução na produção de álcool

Exemplo 2A: efeito de concentração de ditionito de sódio na produção de álcool

Frascos de soro foram preparados de acordo com o exposto acima. No entanto, ditionato de sódio (10 g/L de solução aquosa) foi adicionado antes da inoculação. Cada frasco de soro foi pressurizado para 207 kPa (30 psig) com gás de 70% de CO 15% de CO2, 14% de N2, 1% de H2 e foi incubado a 37°C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas a 48 h (vide tabela 4)

Tabela 4: conversão de acetato em etanol a concentrações de ditionato de sódio diferentes por Clostrídium autoethanogenum.

Concentração de ditionato de sódio (g/l)	Concentração de acetato final (g/l)	Concentração de etanol final (g/l)
0	12,2	0,5
0,1	10,9	0,6
0,15	10,1	1,0
0,2	9,6	1,9
0,3	10,2	1,4
0,4	10,2	1,0
0,5	10,2	1,0

Os resultados significam que enquanto a conversão de ácido em álcool ocorre sobre uma ampla faixa de concentrações de agente de redução, há uma ótima concentração de cerca de 2 g/L

Exemplo 2B: Efeito de concentração de sulfeto de sódio na produção de álcool

Garrafas de soro de 234 ml estéreis foram purgadas com 100% de gás de N2 e então 50 ml de meio (LM33) de acordo com a receita acima foram adicionados e então foram submetidas em autoclave a 121°C por 20 minutos. O meio foi reduzido com solução de Cr(ll) (cerca de 0,4 mM) e solução de sulfeto de sódio aquoso foi adicionada. As garrafas de soro foram inoculadas com 2,5 ml de uma cultura de Clostrídium autoethanogenum ati5 vamente em desenvolvimento oriunda de um biorreator contínuo. Os 184 ml de espaço de topo foram purgados três vezes com gás de 70% de CO, 1% de H2, 15% de CO2, e 14% de N2 e foram esvaziados em um vácuo de 96,5 kPa (-14 psig) para remover a base de N2 e foi então enchido com gás de 70% de CO, 1% de H2, 15% de CO2, e 14% de N2 para 207 kPa (30 psig). A temperatura de reação foi mantida a 37°C. Amostras foram tiradas a intervalos e o espaço de topo foi purgado e resfriado até 207 kPa (30 psi) após a amostragem (vide tabela 5).

Tabela 5: conversão de acetato em etanol a concentrações de sulfeto de sódio diferentes por Clostrídium autoethanogenum. Observa-se: frascos de soro com várias concentrações de sulfeto de sódio foram realizados em duplicata e as médias são pro-

ω CM 05 z E o	EtOH (g/i)	o	o	o	o	o	o	o	o	o
Acet. (g/l)	o	0,89	CM T^-	2,90	CM	4,15		4,20
1 mM Na2S	T —. 2 σ> LU	o	o	o	o	o	o o	0,42	0,50	0,55	0,63	0,66
Acet. (g/l)	0,45	0,42	0,42	0,42	0,50	0,31	0,30	0,20	0,20	0,13	0,14
3 mM Na2S	EtOH (g/i)	o	o	o	o	0,22	0,30	0,30	0,31	0,35	o o	0,51
Acet. (g/l)	τ- ο	0,45	0,49	0,72	09'0	0,56	0,54	0,52	0,53	0,50	0,42
6 mM Na2S	EtOH (g/i)	o	o	o	0,20	0,37	o	0,5	0,56	0,58	0,64	0,66
Acet. (g/l)	0,40 __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________I	0,49	0,54	0,49	0,35	0,25	0,23	0,18	00 o	0,18	0,15
I Na2S	EtOH (g/i)	o	0,09	o	o	0,19	0,29	0,31	0,37	0,4	0,18	0,57
10 mM	Acet. (g/l)	0,46	0,50	0,50	0,51	o	0,39	0,35	0,33	0,33	0,31	0,24
Tempo (h)	IO	23	30	52	77	95	102	00	126	143	166

Os resultados indicam que enquanto há uma fase lag curta associada a um pequeno aumento na concentração de acetato, o acetato em cada um dos frascos contendo sulfeto de sódio é convertido em alcoóis durante o curso de tempo da experiência.

Exemplo 3: Efeito de pressão parcial de CO

Exemplo 3A: Efeito de a pressão parcial de CO na produção de álcool

Frascos de soro foram preparados de acordo com o exposto acima. Cada frasco de soro foi pressurizado para 207 kPa ou 275,8 kPa ou 344,8 kPa (30 ou 40 ou 50 psi) usando-se a 95% de CO em mistura de gás de CO2 e foi incubado a 37°C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas a 18 h (vide tabela 6)

Tabela 6: Efeito de ultraexpressões de espaço de topo diferentes no metabolismo de um substrato gasoso compreendendo 95% de CO em CO2 por uma cultura de C. autoethanogenum em uma garrafa de soro a pH 5,5 depois de 18 horas da fermentação. Condições de partida: cultura contínua de C. autoethanogenum, contendo 3,3 g/l de acetato e 0,0 g/l de etanol a pH 5,5.

Ultrapressão inicial	207 kPa (30 psia)	275,8 kPa (40 psia)	344,8 kPa (50 Psi)
Acetato (g/l)	5,4	5,7	0,2
Etanol (g/l)	0,5	0,8	2,6
Ultrapressão final (psig)	13,8 kPa (2 psig)	55,2 kPa (8 psig)	200 kPa (29 psig)
Queda de pressão (psi)	89,7 kPa (13 psi)	117,2 kPa (17 Psi)	41,3 kPa (6 Psi)

Nas garrafas de biorreator a 207 kPa (30 psi) a 275,8 kPa (40 psi), cerca de 2 g/l de acetato e 0,6 g/l etanol foram produzidos e a queda de pressão no espaço de topo era cerca de 117,2 kPa (17 psi) . Isso indica que uma quantidade substancial do CO foi usada para a produção de acetato.

Surpreendentemente, a 344,8 kPa (50 psi), cerca de 3 g/l de acetato foram consumidos e 2,6 g/l de etanol foram produzidos. Os resultados indicam que há um ótimo limiar de pressão parcial de CO em que acetato em conversão de álcool ocorre por um período prolongado. A concentração de CO é proporcional à pressão parcial de CO, os resultados indicam que há um limiar de concentração de CO em que C. aupara converte ácidos em alcoóis. No entanto, seria observado que sistemas de pressão mais baixos podem também converter ácidos em álcool, mas como CO torna produção de acetato depletado prevalece. Adicionalmente, sob condições particularmente depeltadas de CO (ou H2), a cultura pode reconsumir álcool para produzir acetato (vide exemplo 4).

Exemplo 3B: Efeito de pressão parcial de CO na produção de álcool

Com base nesses resultados, uma fermentação similar foi conduzida usando-se o mesmo substrato gasoso com meio suplementado com fontes de carbono diferentes. Frascos de soro foram preparados de acordo com o exposto acima. Cada frasco de soro foi pressurizado para 275,8 kPa (40 psi) ou 344,8 kPa (50 psia) usando-se a 95% de CO em mistura de gás de CO2 e foi incubado a 37°C com agitação constante. Uma garrafa de biorreator de controle (A) foi não suplementada, enquanto outras garrafas foram suplementadas com alguma frutose (B), xilose (C) ou piruvato (D). Essas garrafas foram incubadas a 37°C com agitação constante. As concentrações de metabólitos e biomassa, bem como a ultraexpressão de espaço de topo e pH, foram medidas no início da fermentação e depois de 40 horas. Resultados a 275,8 kPa (40 psi) são mostrados na tabela 7 e resultados a 344,8 kPa (50 psia) são mostrados na tabela 8.

Tabela 7: metabolismo de ultraexpressão de 275,8 kPa (40 psi) 95% de CO em CO2 de um substrato gasoso compreendendo por uma cultura de C. autoethanoçienum em uma garrafa de soro a pH 5,5 depois de 40 h da fermentação. Condições de partida: cultura contínua de C. autoethanocienum à taxa de diluição = 0,04 h~¹, fluxo contínuo de substrato gasoso compreendendo 95% de CO em CO2 (no ultrapressão), produção de acetato e etanol a pH 5,5. Dados para acetato, etanol, frutose, xilose, piruvato são concentrações em grama por litro. Biomassa é dada como grama de peso seco de célula por litro. Ultrapressão de gás no espaço de topo é mostrada em psig.

A	Acetato	Etanol	Biomassa	Ultrapressão	pH	Suplemento
Inicio	6,3	0,4	0,7	25	5,5
Final	10,0	1,0	0,7	7	4,6	-
Diferença	+3,7	+0,6	+0,0	-18	-0,9
B	Acetato	Etanol	Biomassa	Ultrapressão	PH	Frutose
Inicio	6,3	0,5	0,7	25	5,5	0,9
Final	10,1	1,7	0,7	9	4,6	0,0
Diferença	+3,8	+1,2	+0,0	-16	-0,9	-0,9
C	Acetato	Etanol	Biomassa	Ultrapressão	pH	Xilose
Inicio	6,1	0,4	0,7	25	5,5	0,8
Final	9,8	1,4	0,9	7	4,6	0,1
Diferença	+3,7	+1,0	+0,2	-18	-0,9	-0,7
D	Acetato	Etanol	Biomassa	Ultrapressão	PH	Piruvato
Inicio	7,0	0,0	0,8	25	5,5	0,8
Final	10,1	0,8	0,7	8	4,8	0,0
Diferença	+3,1	+0,8	-0,1	17	-0,7	-0,5

Na totalidade de garrafas de biorreator a 275,8 kPa (40 psi), para todas as condições testadas aqui, cerca de 3,5 g/l acetato e quantidades menores de etanol foram produzidos. A queda de pressão no espaço de to5 po era cerca de 117,2 kPa (17 psig). Isso indica que uma porção substancial do CO foi consumida para a produção de acetato. O pH diminuiu por cerca de 0,9 unidade a 4,6. Em todos os casos, houve crescimento microbiano mínimo.

Tabela 8: Metabolismo de 344,8 kPa (50 psia) de ultrapressão de um subs10 trato gasoso compreendendo 95% de CO em CO2 por uma cultura de C.

autoethanoçienum em uma garrafa de soro a pH 5,5 depois de 40 h da fermentação. Condições de partida: cultura contínua de C. autoethanogenum à taxa de diluição = 0,04 h~¹, fluxo contínuo de substrato gasoso compreendendo 95% CO em CO2 (no ultrapressão), produção de acetato e etanol a pH 5,5. Dados para acetato, etanol, frutose, xilose, piruvato são concentrações em grama por litro. Biomassa é dada como grama de peso seco de 5 célula por litro. Ultrapressão de gás no espaço de topo é mostrada em psig.

A	Acetato	Etanol	Biomassa	Ultrapressão	PH	Suplemento
Inicio	6,3	0,4	0,7	241,3 kPa (35 psig)	5,5	-
Final	1,1	4,3	0,4	172,3 kPa (25 psig)	6,4	-
Diferença	-5,2	+3,9	-0,3	-70 kPa (-10 psig)	+0,9
B	Acetato	Etanol	Biomassa	Ultrapressão	pH	Frutose
Inicio	6,3	0,5	0,7	241,3 kPa (35 psig)	5,5	0,9
Final	1,9	3,9	0,4	193 kPa (28 psig)	6,4	0,0
Diferença	-4,4	+3,4	-0,3	7	+0,9	-0,9
C	Acetato	Etanol	Biomassa	Ultrapressão	pH	Xilose
Inicio	6,1	0,4	0,7	241,3 kPa (35 psig)	5,5	0,8
Final	2,8	3,4	0,4	206,8 kPa (30 psig)	6,4	0,0
Diferença	-3,3	+3,0	-0,3	-34 kPa (-5 psig)	+0,9	-0,8

D	Acetato	Etanol	Biomassa	Ultrapressão	pH	Piruvato
Inicio	7,0	0,0	0,8	241,3 kPa (35 psig)	5,5	0,8
Final	1,5	4,5	0,4	179,2 kPa (26 psig)	6,5	0,0
Diferença	-5,5	+4,5	-0,4	-62 kPa (-9 psig)	+1,0	-0,8

Na totalidade de garrafas de biorreator a 344,8 kPa (50 psia), para todas as condições testadas aqui, quantidades significativas de acetato foram consumidas, e mais do que 3 g/l de etanol foram produzidos. Há uma forte correlação entre o consumo de acetato e produção de etanol. Consumo de acetato/produção de etanol ocorre de tal modo que para cada mol de acetato consumido cerca de um mol de etanol foi produzido (tabela 9). No entanto, o carboidrato suplementado (ou piruvato) foi substancialmente consumido, e os níveis de biomassa, estimados por densidade ótica, diminuída. Em cada caso, a queda de pressão no espaço de topo era abaixo de 69 kPa (10 psi). Em todos os casos, o pH aumentou por cerca de 0,9 unidade para 6,4.

Tabela 9: Razões molares para a fermentação de carga à 241,3 kPa (35 psi) de ultrapressão, com base nos resultados mostrados nas tabelas 2 e 3. Dado o acetato consumido/acetato na partida (fileira 1), pelo menos 50% e em alguns casos acima de 75% do acetato presente no caldo de fermentação são consumidos à pressão elevada. Dado o etanol produzido/acetato na partida (fileira 2), pelo menos 60% e em alguns casos pelo menos 80% do ácido consumido são substituídos por álcool. Dado etanol produzido/acetato consumido (fileira 3), há uma forte correlação entre a guantidade de acetato consumido no processo de fermentação, e o álcool produzido. O nível teórico de CO dissolvido no meio a 40 e 275,8 kPa (40 psi) e 344,8 kPa (50 psia) de espaço de topo ultrapressão era calculado na tabela 10 com base na lei de Henry.

	Gás apenas	Gás e frutose	G[as e xilose	Gás e piruvato
1. acetato consumido/acetato de partida	0,83	0,70	0,54	0,79
2. etanol produzido/acetato de partida	0,81	0,70	0,64	0,84
3. etanol produzido/acetato consumido	0,98	1,01	1,19	1,07

Tabela 10: Cálculo da concentração de CO dissolvido no meio a diferente espaço de topo ultrapressão de um substrato gasoso compreendendo 95% de CO em CO?. Constante de Henry para CO em água a 298 K é 1052,6 L. atm. mol¹

Ultrapressão no espaço do topo	Psia	275,8 kPa (40 psia)	344,8 kPa (50 psia)
Pressão parcial de CO no espaço de topo	Psi	260 kPa (37,7 psi)	325,4 kPa (47,2 psi)
Concentração de CO dissolvido no meio	Mmol/I	2,43	3,05

Os resultados apresentados aqui demonstram que há uma pressão parcial de CO acima da qual o metabolismo de C. autoethanogenum muda substancialmente da produção de acetato e biomassa do substrato de CO na conversão de pelo menos uma porção de acetato em etanol. Assim, para a pressão parcial de CO abaixo de 255 kPa (37 psi), acetato e biomassa são os principais produtos de metabolismo de gás de CO e pH se torna ácido, e outro crescimento é inibidor. Quando a pressão parcial de CO está acima 255 kPa (37 psi), crescimento de biomassa e produção de acetato parecem ser inibidos, e consumo de acetato ocorre. Além do mais, produção de etanol ocorre com menor consumo de CO. Ao mesmo tempo, pH aumenta até que ele alcance 6,5, onde a bactéria parece ser substancialmente inibida e a conversão de acetato em etanol para. Não há efeito de frutose, xilose ou piruvato observável a uma concentração testada.

Exemplo 3C: Efeito de pressão parcial de CO na produção de álcool

Frascos de soro foram preparados de acordo com o exposto acima. Cada frasco de soro foi pressurizado para 172,4 kPa (25 psig (275,8 kPa (40 psi) com o gás indicado e foi incubado a 37°C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas a intervalos de 1 h, 3 h e 5 h (vide Tabela 11).

Tabela 11: conversão de acetato em álcool a vários pressões parciais de CO 5 por Clostrídium autoethanogenum durante 5 horas.

Composição de gás	Tempo	Concentração de acetato (g/l)	Concentração de etanol (g/i)	Pressão (psig)
100% de CO
	0	11,914	0	172,3 kPa (25 psig)
	1	11,273	0,523	173 kPa (25,1 psig)
	3	10,488	1,295	156,5 kPa (22,7 psig)
	5	10,337	1,518	147,5 kPa (21,4 psig)
90% CO; 10% N2
	0	11,914	0	172,3 kPa (25 psig)
	1	11,177	0,548	160,6 kPa (23,3 psig)
	3	10,407	1,3615	146,1 kPa (21,2 psig)
	5	10,12	1,602	134,5 kPa (19,5 psig)
80% CO; 20% N2
	0	11,914	0	172,3 kPa (25 psig)
	1	11,389	0,44	146,1 kPa (23,9 psig)
	3	11,042	1,055	155,1 kPa (22,5 psig)
	5	10,605	1,267	146,8 kPa (21,3 psig)
70% CO; 30% N2

Composição de gás	Tempo	Concentração de acetato (g/l)	Concentração de etanol (g/i)	Pressão (psig)
	0	11,914	0	172,3 kPa (25 psig)
	1	11,341	0,538	177,9 kPa (25,8 psig)
	3	10,51	1,193	161,3 kPa (23,4 psig)
	5	10,579	1,445	150,3 kPa (21,8 psig)
60% CO; 40% N2
	0	11,914	0	172,3 kPa (25 psig)
	1	11,311	0,565	181,3 kPa (26,3 psig)
	3	10,959	1,297	162 kPa(23,5 psig)
	5	10,493	1,5	149 kPa (21,6 psig)
50% CO; 50% N2
	0	11,9	0	172,3 kPa (25 psig)
	1	11,3	0,533	178,5 kPa (25,9 psig)
	3	11,0	1,236	162 kPa (23,5 psig)
	5	10,5	1,448	151 kPa (21,9 psig)

Os resultados indicam que a pressão parcial de limiar suficiente de CO em que ácidos são convertidos em alcoóis é menor do que 138 kPa (20 psia). Durante uma escala de tempo de retenção curto (conforme exemplos 3A-C), acetato é convertido em álcool substancialmente estequiometri5 camente sob qualquer condição de pressões parciais de CO testada.

Correspondentemente, a pressão parcial de CO sobre 138 kPa (20 psia) é suficiente para C.auto para converter ácidos em alcoóis.

Exemplo 4: Efeito de composição gasosa

Exemplo 4A: Efeito de gás puro na conversão de acetato em etanol

Frascos de soro foram preparados de acordo com o exposto a5 cima. Cada frasco de soro foi pressurizado para 172,4 kPa (25 psig) (275,8 kPa (40 psia)) com o gás indicado e foi incubado a 37°C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas a intervalos de 1 h, 3 h e 5 h (vide tabela 12).

Tabela 12: Conversão de acetato em etanol por Clostrídium autoethanoçie10 num usando-se composições gasosas alternativas.

Composição de gás	Tempo	Concentração de acetato (g/l)	Concentração de etanol (g/l)	Pressão (psig)
100% NZ
	0	12,531	0,133	180 kPa (26,1 psig)
	1	12,742	0	189,6 kPa (27,5 psig)
	3	12,394	0	186,8 kPa (27,1 psig)
	5	12,551	0	183,4 kPa (26,6 psig)
100% HZ
	0	12,531	0,133	177,8 kPa (25,8 psig)
	1	11,921	0,384	170,9 kPa (24,8 psig)
	3	11,811	0,527	160,6 kPa (23,3 psig)
	5	11,998	0,546	155,1 kPa (22,5 psig)
Gás residual de moinho de aço (aproximadamente 53% CO; 18% CO2; 26% N2; 3% H1)
	0	12,531	0,133	170,9 kPa (24,8 psig)

Composição de gás	Tempo	Concentração de acetato (g/l)	Concentração de etanol (g/l)	Pressão (psig)
	1	11,256	1,07	162,7 kPa (23,6 psig)
	3	10,668	1,605	142 kPa (20,6 psig)
	5	11,688	1,362	115,1 kPa (16,7 psig)

Os resultados claramente indicam que uma redução de gás, tal como CO ou H2, é necessária na ordem para C.auto para converter ácidos em alcoóis. É considerado que hidrogênio pode ser usado no lugar de CO como a trajetória metabólica de ácidos em alcoóis inclui enzimas de hidro5 genase. É ulteriormente considerado que enquanto H2 é uma fonte de energia adequada para a conversão de ácidos em alcoóis não seria adequado para a biossíntese e/ou produção de acetato, que exigem uma fonte de carbono bem como uma fonte de energia.

Exemplo 4B: Efeito de composição gasosa na produção de eta10 nol

Frascos de soro foram preparados de acordo com o exposto acima. No entanto, antes da inoculação, os frascos foram adicionados com solução de ácido butírico tamponada ao pH 5,5 com NaOH(aq). Concentrações iniciais a t = 0 eram acetato 6,7 g/l e butirato 0,8 g/L (nenhum etanol ou 15 butanol estava presente). Amostras do caldo de fermentação foram tiradas a 24 h (vide tabela 13).

Tabela 13: Conversão de ácidos em alcoóis sob diferentes pressões parciais de CO por Clostrídium autoethanogenum, na presença ou na ausência de hidrogênio.

Composição de gás	Concentração de acetato (g/l)	Concentração de etanol (g/l)	Concentração de butirato (g/l)	Concentração de butanol (g/l)
100% CO (275,8 kPa (40 psia))	4,7	1,8	0,4	0,3

Composição de gás	Concentração de acetato (g/l)	Concentração de etanol (g/l)	Concentração de butirato (g/l)	Concentração de butanol (g/l)
100% CO (344,8 kPa (50 psia))	4,2	1,9	0,3	0,4
75% CO 25% H2 (275,8 kPa (40 Psia))	5,5	1,3	0,5	0,2
60% CO 40% H2 (344,8 kPa (50 Psia))	5,0	1,6	0,5	0,5

Ácidos, tais como ácidos butírico e acético, podem ser convertidos em alcoóis incluindo etanol e butanol na presença de substratos de CO/H2 mistos. Claramente, na ausência de H2, aumento da pressão parcial de CO aperfeiçoa conversão total. No entanto, a presença de H2, particularà pressão parcial elevada também aperfeiçoa a conversão total.

Exemplo 4C: Efeito de composição gasosa na produção de etanol

Frascos de soro foram preparados de acordo com o exposto acima. Cada frasco de soro foi pressurizado a 241,3 kPa (35 psi) (344,8 kPa 10 (50 psia)) com o gás indicado e foi incubado a 37°C com agitação constante.

Amostras do caldo de fermentação foram tiradas a 18 h (vide tabela 14).

Tabela 14: Conversão de acetato em etanol sob diferentes pressões parciais de CO por Clostrídium autoethanogenum, na presença ou na ausência de hidrogênio.

Composição de gás	Mudança na concentração de acetato	Mudança na concentração de álcool	Pressão de gás final (psia)
CO	H2	CO2
100% CO	-1,6	+2,3	255,1 kPa (37 psia)	-	62 kPa (9 psia)
40% CO; 40% H2; 20% N2	-1,2	+2,5	0	55,1 kPa (8 psia)	75,8 kPa (11 psia)

Substratos mistos compreendendo CO e H2 podem ser usados para converter ácidos em alcoóis na presença de C.auto. De modo interessante, durante a escala de tempo da experiência, significativamente mais álcool é produzido do que acetato é consumido. Isso indica que enquanto acetato pode ser estequiometricamente convertido em etanol, acetato adi5 cional se acumula e pode ser convertido em álcool até que CO seja totalmente consumido.

Exemplo 4E: Efeito de pressão parcial de CO e H2 na produção de álcool

Frascos de soro foram preparados de acordo com o exposto a10 cima. Cada frasco de soro foi pressurizado a 241,3 kPa (35 psi) (344,8 kPa (50 psia)) com o gás indicado e foi incubado a 37°C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas a intervalos de 1,5 h, 3 h, 5 h e 24 h (vide tabela 15).

Tabela 15: Conversão de acetato em etanol sob diferentes pressões parciais 15 de CO e H2 por Clostrídium autoethanoqenum

Composição de gás	Tempo	Concentração de acetato (g/l)	Concentração de etanol (g/i)	Pressão (psig)
80% CO; 20% H2
	0	10,8	0,2	241,3 kPa (35 psig)
	1,5	9,5	1,6	240 kPa (34,8 psig)
	3,25	9,3	2,4	222 kPa (32,2 psig)
	4,75	9,2	2,6	208,9 kPa (30,3 psig)
	6,75	9,4	2,5	197,8 kPa (28,7 psig)
	23	13,7	0,8	149 kPa (21,6 psig)
60% CO; 40% H2
	0	10,8	0,2	241,3 kPa (35 psig)

Composição de gás	Tempo	Concentração de acetato (g/l)	Concentração de etanol (g/i)	Pressão (psig)
	1,5	9,5	1,7	235,1 kPa (34,1 psig)
	3,25	9,5	2,6	211 kPa (30,6 psig)
	4,75	9,4	3,0	194,4 kPa (28,2 psig)
	6,75	9,5	3,1	175,1 kPa (25,4 psig)
	23	10,2	3,9	86,8 kPa (12,6 psig)

Os resultados indicam que a níveis elevados de H2, há um aperfeiçoamento nas conversões totais de ácidos em alcoóis. No entanto, é considerado que etanol é reconvertido de volta para acetato quando níveis de H2 depletam durante o curso da experiência, particularmente a baixos níveis 5 de H2 (por exemplo, 20%).

Exemplo 4F: Efeito de pressão parcial de CO em gás residual de moinho de aço

Frascos de soro foram preparados de acordo com o exposto acima. Cada frasco de soro foi pressurizado a 172,4 kPa (25 psig) (275,8 kPa 10 (40 psi)) com gás residual de moinho de aço (cerca de 53% de CO; 18% de

CO2; 26% de N2; 3% de H2) e foi incubado a 37°C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas a intervalos de 1 h, 3 h e 5h (vide tabela 16).

Tabela 16: Conversão de acetato em etanol a diferentes pressões parciais 15 de CO usando-se gás residual de moinho de aço.

Pressão de gás inicial	Tempo	Concentração de acetato (g/l)	Concentração de etanol (g/l)	Pressão (psig)
46 psia
	0	14,217	0,224	213,7 kPa (31 psig)

Pressão de gás inicial	Tempo	Concentração de acetato (g/l)	Concentração de etanol (g/l)	Pressão (psig)
	1	13,335	0,696	215 kPa (31,2 psig)
	3	12,775	1,811	182 kPa (26,4 psig)
	5	13,053	2,197	146,1 kPa (21,2 psig)
40 psia
	0	14,17	0,224	172,3, kPa (25 psig)
	1	13,395	0,665	180 kPa (26,1 psig)
	5	14,012	1,675	107,5 kPa (15,6 psig)
30 psia
	0	14,217	0,224	103,4 kPa (15 psig)
	1	13,485	0,623	109,6 kPa (15,9 psig)
	3	12,909	1,742	82 kPa (11,9 psig)
	5	14,363	1,364	56,5 kPa (8,2 psig)

Gases residuais de moinho de aço podem ser usados para converter ácidos em alcoóis. Aumentar a pressão parcial de CO no gás residual tem um efeito benéfico na conversão de ácido.

Exemplo AG: Efeito de pressão parcial de CO2 na produção de 5 etanol

Frascos de soro foram preparados de acordo com o exposto acima. Cada frasco de soro foi pressurizado a 241,3 kPa (35 psi) (344,8 kPa (50 psia)) com o gás indicado e foi incubado a 37°C com agitação constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas a intervalos de 1 h, 3 h e 5 5 h (vide tabela 17).

Tabela 17: Conversão de acetato em etanol a diferentes pressões parciais de CO2 por Clostrídium autoethanogenum.

Composição de gás	Tempo	Concentração de acetato (g/l)	Concentração de etanol (g/l)	Pressão (psig)
40% CO; 60% N2
	0	9,256	0	241,3 kPa (35 psig)
	1	8,798	0,502	243,3 kPa (35,3 psig)
	3	8,31	1,076	229,5 kPa (33,3 psig)
	5	7,89	1,478	213 kPa (30,9 psig)
40% CO; 50% N2; 10% CO2
	0	9,256	0	241,3 kPa (35 psig)
	1	8,721	0,509	241,3 kPa (35 psig)
	3	8,078	1,092	230,2 kPa (33,4 psig)
	5	7,69	1,511	214,4 (31,1 psig)
40% CO; 40% N2; 20% CO2
	0	9,256	0	241,3 kPa (35 psig)
	1	8,778	0,488	244 kPa (35,4 psig)
	3	8,115	1,057	226,8 kPa (32,9 psig)
	5	7,383	1,461	215,1 kPa (31,2 psig)

Composição de gás	Tempo	Concentração de acetato (g/l)	Concentração de etanol (g/l)	Pressão (psig)
40% CO; 30% N2; 30% CO2
	0	9,256	0	241,3 kPa (35 psig)
	1	8,763	0,473	234,4 kPa (34 psig)
	3	8,12	0,994	226,1 kPa (32,8 psig)
	5	7,769	1,4	213,7 kPa (31 psig)
40% CO; 20% N2; 40% CO2
	0	9,256	0	241,3 kPa (35 psig)
	1	8,761	0,465	234,4 kPa (34 psig)
	3	8,191	0,965	226,8 kPa (32,9 psig)
	5	7,771	1,366	211 kPa (30,6 psig)
40% CO; 60% CO2
	0	9,256	0	241,3 kPa (35 psig)
	1	8,814	0,384	222 kPa (32,2 psig)
	3	8,23	0,737	217,2 kPa (31,5 psig)
	5	8,365	1,046	206,8 kPa (30 psig)

Substratos compreendendo CO contendo uma variedade de constituintes podem ser usados para converter ácidos em alcoóis. No entanto, é observado que níveis aumentados de CO2 têm um leve efeito inibitório na produção de álcool.

Exemplo 5: Efeito de adição de formiato:

Exemplo 5A: Concentração de formiato nos vasos de carga: Frascos de soro foram preparados de acordo com o exposto a cima. No entanto, uma solução de formiato aquosa foi adicionada ao frasco vazio e o pH foi ajustado para 5,5 com NaOH antes da inoculação. Cada frasco de soro foi pressurizado a 172,4 kPa (25 psig) com gás de 50% de CO; 12,5% de CO2; 37,5% de gás N2 e foi incubado a 37°C com agitação 5 constante. Amostras do caldo de fermentação foram tiradas a 72 h (vide tabela 18).

Tabela 18: Conversão de acetato em etanol na presença de formiato a concentrações diferentes usando-se Clostridium autoethanogenum.

Concentração de formiato (g/l)	Tempo	Concentração de acetato (g/l)	Concentração de etanol (g/l)	Pressão (psig)
0 g/l
	0	11,10	0	172,4 kPa (25 psig)
	1	11,36	0	172,4 kPa (25 psig)
	4	10,98	0,25	157,8 kPa (22,9 psig)
	20	13,38	0,158	91,7 kPa (13,3 psig)
	48	13,00	0,16	89,6 kPa(13 psig)
	72	13,70	0,17	87,5 kPa (12,7 psig)
2 g/l
	0	9,6	0	172,4 kPa (25 psig)
	1	8,7	1,02	172,4 kPa (25 psig)
	4	7,3	2,22	157,8 kPa (22,9 psig)
	20	6,4	3,12	138,5 kPa (20,1 psig)
	48	6,1	3,99	137,2 kPa (19,9 psig)

Concentração de formiato (g/l)	Tempo	Concentração de acetato (g/l)	Concentração de etanol (g/l)	Pressão (psig)
	72	5,9	4,28	124,7 kPa (18,1 psig)
5 g/l
	0	9,6	0	172,4 kPa (25 psig)
	1	8,7	0,85	172,4 kPa (25 psig)
	4	7,3	1,92	157,8 kPa (22,9 psig)
	20	6,4	2,65	142,7 kPa (20,7 psig)
	48	6,1	3,44	137,2 kPa (19,9 psig)
	72	5,9	3,76	131,6 kPa (19,1 psig)

Na ausência de formiato, C.auto continua a produzir acetato e uma pequena quantidade de álcool. No entanto, quando formiato é adicionado à reação de fermentação, acetato é convertido em álcool em quantidades substancialmente estequiométricas. A taxa de conversão é mais alta a con5 centrações baixas de formiato (2 g/L), indicando que pode haver um efeito inibitório e/ou tóxico nas concentrações de formiato mais altas.

Exemplo 5B: Adição de formiato em um CSTR:

L de meio de fermentação anaeróbico (preparado como descrito acima) em uma CSTR de 5 litros foram inoculados com uma cultura de 10 Clostrídium autoethanogenum ativamente em desenvolvimento (DSMZ 19630) a um nível de 5% (v/v). O fluxo contínuo de gás de 70% de CO e 15% de CO2 1% de H2 14% de N2 foi introduzido no fundo do vaso do fermentador através de um pulverizador de difusão a uma taxa de fluxo volumétrica de 60 ml/minutos. O pH inicial do fermentador foi mantido a 5,5. A15 pós vários dias de crescimento microbiano, uma cultura contínua foi estabelecida por ligar uma bomba que introduz meio de fermentação pulverizado com N2 no CSTR a uma taxa de fluxo de 2 mL/min. Controladores de nível são empregados para manter o nível correto da cultura dentro do vaso do fermentador, são ajustados por uso de uma sonda de nível e bomba que automaticamente se liga quando nível nos vasos do fermentador se eleva demasiadameente e bombeiam a cultura para forma do vaso até que o nível caia de volta para o nível ajustado, isso permite um fornecimento constante de meio fresco a ser provido à cultura e uma cultura de viabilidade alta em desenvolvimento ativo a ser mantida.

Depois de vários dias de operação contínua, o fornecimento de meio fresco foi parado e o fermentador retornou a uma configuração de carga. Na hora = 0 (figura 2) ácido fórmico (15 mL) foi adicionado e o pH foi ajustado para 5,5 por adição de NaOH. Durante o curso de cerca de 30 minutos, pH de um meio de fermentação se elevou para 6 quando acetato foi consumido pela cultura e etanol foi produzido. Consequentemente, ácido fórmico adicional (3 mL) foi adicionado a pH mais baixos de volta para baixo de 5,5. A cerca de t=60 min, ácido fórmico foi introduzido via uma bomba de administração dosada configurada para automaticamente dosar para dentro do reator quando o pH se elevasse para cima do ponto de ajuste de 5,5. A bomba de administração dosada de formiato foi operada por cerca de 5 horas, tempo esse durante o qual acetato foi consumido pela cultura e etanol foi produzido. Os resultados mostram uma reação de fermentação continuamente produzindo acetato que pode ser mudado de produção de acetato em conversão de acetato em álcool por perturbação do sistema, por exemplo, por adição de formiato. A conversão é substancialmente estequiométrica durante o curso da experiência.

Exemplo 6: Efeito de adição adicional de acetato

Meio de fermentação anaeróbico a 1 L (preparado como descrito acima com as seguintes alterações: uma solução de vitamina de concentração mais baixa [0,4 ml/L de LS03 em ácido pantotênico e 500 ul/L de solução de ácido pantotênico (40 mg/L)] foi adicionado à solução estoque) em um 1 L de CSTR foi inoculado com uma cultura de Clostrídium autoethanogenum ativamente em desenvolvimento (DSMZ 19630) a um nível de 5% (v/v). Um fluxo contínuo de gás de 35% de CO 60% de H2 5% de CH4 foi introduzido no fundo do vaso de fermentador através de um pulverizador de difusão a uma taxa de fluxo volumétrica de 10 ml/minuto. O pH inicial do fermentadorfoi mantido a 5,5. Após vários dias de crescimento microbiano, a taxa de fluxo de gás aumentou para 20 ml/minuto e a agitação aumentou de 200 rpm a 500 rpm. Uma cultura contínua foi estabelecida por introdução de meio fresco (preparado como descrito acima com as seguintes alterações: uma solução de vitamina de concentração mais baixa [0,4 ml/L de LS03 sem ácido pantotênico e I ml/L de solução de ácido pantotênico (40 mg/L)] foi adicionado à solução estoque) enquanto mantendo-se um volume médio constante no fermentador. A taxa de fluxo de meio fresco foi aumentada de 6 ml/hora a 54 ml/hora durante várias semanas. Depois de várias semanas a operação contínua, o fornecimento de gás foi mudado em 35% de CO 45% de H2 15% de CH4 5% de CO2 e foi operado por várias semanas. Produtividade de etanol foi mantida a cerca de 6 g/L/dia. No dia 52, o meio fresco fornecido à cultura contínua foi suplementado com 15 g/L de ácido acético tamponado a pH 5,5 por 2 dias. Durante esse tempo, produtividade de álcool aumentou para cerca de 15 g/L (dia 53 - figura 3) então 12 g/L (dia 54). É considerado que uma grande porção do acetato introduzido para dentro do fermentador foi convertida em álcool.

Os resultados mostram que produtividade de álcool pode ser aperfeiçoada em uma reação de fermentação continuamente produzindo álcool(óis) por adição de ácido(s) adicional(ais). Adição de ácido(s) adicionavais) (por exemplo, acetato) perturba a reação de fermentação tal que uma porção substancial do(s) ácido(s) adicionado(s) é convertida em álcool(óis), tal como etanol.

Exemplo 7: Efeito de pH na produção de etanol usando-se gás contendo CO

L de meio de meio de fermentação de LM33 anaeróbico em um 1 Litro de CSTR foi inoculado com uma cultura de Clostrídium autoethanogenum ativamente em desenvolvimento (DSMZ 19630) a um nível de 5% (v/v). Um fluxo contínuo de gás de 70% de CO e 15% de CO2 1% de H2 14% de N2 foi introduzido no fundo do vaso de fermentador através de um pulverizador de difusão a uma taxa de fluxo volumétrica de 19 ml/minutos. O pH inicial do fermentador foi ajustado para 5,5. Para a maior parte da experiência, a concentração de ácido acético da cultura foi mantida abaixo de 4 g/L por um reciclo de célula e sistema de troca de meio. As células foram passadas através de uma membrana de fluxo cruzada Viva 200, o filtrado foi coletado e as células foram retornadas para o vaso do reator. O filtrado foi substituído com meio fresco para assegurar o volume médio dentro do reator permaneceu constante. No dia 3 o sistema de reciclagem de célula foi desligado e o pH, que tinha sido mantido a cerca de 5,6 por 3 dias, com flutuação de ORP entre -400 e -430 mV foi aumentado. O pH foi ajustado para cerca de 5,9, e o ORP diminuiu para cerca de -470 mV. Esses resultados mostram que, a pH 5,6, acetato e etanol são produzidos simultaneamente, com um excesso de acetato. Referindo-se à figura 4, esse estágio da fermentação está também associado a um período de crescimento microbiano. Quando o pH é aumentado o ORP diminui par cerca de -470 mV e a taxa de produção de álcool aumentou para cerca de 1,2 g/L/dia, enquanto algum acetato foi consumido a uma taxa de cerca de 0,2 g/L/dia.

Correspondentemente, a cultura microbiana pode ser mudada de uma fase de produção onde acetato é produzido, na fase de conversão onde acetato é convertido em etanol por ajuste de pH do meio de nutriente líquido.

A invenção foi descrita aqui com referência a certas concretizações preferidas, a fim de permitir o leitor a praticar a invenção sem experimentação imprópria. Aqueles versados na técnica apreciarão que a invenção é suscetível a variações e modificações diferentes que aquelas especificamente descritas. Deve ser entendido que a invenção inclui todas tais variações e modificações. Além do mais, títulos, cabeçalhos, ou similares são providos para aumentar a compreensão de leitura desse documento, e não seriam lidos como limitante do escopo da presente invenção.

As descrições totais da totalidade desses pedidos, patentes e publicações, citadas acima e abaixo, se existirem, são aqui incorporadas por referência.

A referência a qualquer técnica anterior nesse relatório não é, e não seria tomada como, um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão que a técnica anterior faz parte do conhecimento geral comum em qualquer país no mundo.

Através de todo esse relatório e quaisquer reivindicações que se seguem, a não ser que o contexto exija de outra maneira, as palavras compreender, compreendendo e similares, devem ser interpretadas em um sentido abrangido em oposição a um sentido exclusivo, isto é, no sentido de incluindo, mas não limitado a.

Claims

1. Método para a conversão de ácido(s) em álcool(óis) correspondente(s) usando-se uma cultura microbiana na presença de um substrato compreendendo CO ou CO e H2, dito método caracterizado pelo fato de compreender:

a. cultivar em um biorreator uma ou mais cepas de bactéria do gênero Clostrídium na presença do dito substrato para produzir acetato e opcionalmente etanol;

b. perturbar a cultura microbiana, tal que pelo menos uma porção da cultura microbiana é mudada de uma fase substancialmente de produção para uma fase substancialmente de conversão, por meio da qual pelo menos uma porção de acetato é convertido a etanol; e

c. recuperar pelo menos uma porção do etanol.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de perturbação é realizada por um ou mais de:

i. ajuste do pH de um meio de nutriente líquido contendo a cultura microbiana;

ii. ajuste do potencial de redox aberto de um meio de nutriente líquido contendo a cultura microbiana;

iii. adição de um segundo ácido ao biorreator;

iv. adição de um ou mais agentes de redução ao biorreator;

v. ajuste da concentração de CO em um meio de nutriente líquido contendo a cultura microbiana;

vi. ajuste de pressão parcial de CO no biorreator.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de perturbação compreende a adição de um segundo ácido e o ácido é selecionado do grupo que consiste de formiato, acetato e misturas dos mesmos.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de perturbação compreende a adição de um agente de redução e o agente de redução é selecionado do grupo que consiste de ditionito de sódio, cisteína, sulfeto de sódio e misturas dos mesmos.

Petição 870190049282, de 27/05/2019, pág. 7/9

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de perturbação compreende ajustar a concentração de CO pelo aumento da concentração de CO no meio de nutriente líquido por 1 mmol ou mais.

6. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de perturbação compreende ajustar a pressão parcial de CO pelo aumento da pressão parcial por 15 psi ou mais.

7. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de perturbação compreende ajustar a pressão parcial de CO pelo aumento da pressão parcial acima de um limiar suficiente de 37 psi ou mais.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é conduzida em um primeiro biorreator e a etapa (b) é conduzida em um segundo biorreator.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método é conduzido na ausência de um mediador.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato compreendendo CO compreende 15% a 100% em volume de CO.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Clostrídium autoethanogenum.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de H2 no substrato é menor que 40% em volume.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de H2 no substrato é menor que 5% em volume.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que 0 acetato da etapa (a) é produzido continuamente, e 0 acetato é continuamente convertido a etanol na etapa (b).

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que 0 acetato é produzido na etapa (a) e uma quantidade substancialmente maior de acetato é produzido na etapa (a) em relação à quantidade