ES2616604T3

ES2616604T3 - Método para mejorar la eficacia de la fermentación microbiana

Info

Publication number: ES2616604T3
Application number: ES10741458.3T
Authority: ES
Inventors: Sean Dennis Simpson; Joseph Henry TIZARD
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Current assignee: Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2009-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2030-01-29
Also published as: PL2391724T3; JP2012516152A; US9624512B2; AU2010214147A1; KR101666236B1; JP5726760B2; US20130280694A1; WO2010093262A8; EP2391724A4; NZ594329A; EP2391724B1; AU2010214147B2; WO2010093262A1; US20110275053A1; CA2751060C; KR20110139205A; CA2751060A1; CN102361989B; BRPI1008162A2; CN102361989A

Abstract

Un método para mejorar la eficiencia de la fermentación microbiana de un sustrato que comprende CO, comprendiendo el método: a) proporcionar el sustrato a un cultivo microbiano para producir productos seleccionados del grupo que consiste en ácidos, alcoholes y mezclas de los mismos y CO2 como un subproducto; b) medir la cantidad total de CO consumido y la cantidad de CO2 producido y calcular la relación de CO2 producido/COconsumido; c) ajustar la velocidad de suministro de sustrato para mantener la relación de CO2 producido/COconsumido dentro de un intervalo predeterminado; d) repetir los pasos b y c para mantener la relación de CO2 producido/COconsumido dentro del intervalo predeterminado.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Aunque la siguiente descripción se centra en realizaciones particulares de la invención, a saber, la producción de etanol y/o acetato utilizando CO como el sustrato primario, se debe apreciar que la invención puede ser aplicable a la producción de alcoholes alternativos y/o ácidos y el uso de sustratos alternativos como será conocido por las personas de experiencia ordinaria en la técnica a la que se refiere la invención. Por ejemplo, se pueden usar sustratos gaseosas que contienen dióxido de carbono e hidrógeno. Además, la invención puede ser aplicable a la fermentación para producir butirato, propionato, caproato, etanol, propanol, y butanol. Los métodos también pueden ser de uso en la producción de hidrógeno. A modo de ejemplo, estos productos pueden ser producidos por fermentación con microorganismos del género Moorella, Clostridia, Ruminococcus, Acetobacterium, Eubacterium, Butyribacterium, Oxobacter, Methanosarcina, Methanosarcina, y Desulfotomaculum.

Ciertas realizaciones de la invención se adaptan para usar corrientes de gas producidas por uno o más procesos industriales. Tales procesos incluyen los procesos de fabricación de acero, en particular, los procesos que producen una corriente de gas que tiene un alto contenido de CO o un contenido de CO por encima de un nivel predeterminado (es decir, 5%). De acuerdo con tales realizaciones, las bacterias acetogénicas se utilizan preferiblemente para producir ácidos y/o alcoholes, en particular etanol o butanol, dentro de uno o más biorreactores. Los expertos en la técnica serán conscientes tras la consideración de la presente descripción que la invención se puede aplicar a varias industrias o corrientes de gas de desecho, incluidos los de los vehículos con un motor de combustión interna. Además, los expertos en la técnica serán conscientes tras la consideración de la presente descripción que la invención puede aplicarse a otras reacciones de fermentación, incluyendo las que utilizan los mismos o diferentes microorganismos.

La fuente de la corriente de gas no es limitante, con excepción de que al menos un componente del mismo sea utilizable para alimentar a una reacción de fermentación. La invención tiene aplicabilidad particular a la mejora de la captura del carbono en general y/o la producción de etanol y otros alcoholes a partir de sustratos gaseosos tales como gases de escape de los automóviles y los gases de combustión industriales que contienen CO en alto volumen.

Fermentación

Se conocen procedimientos para la producción de etanol y otros alcoholes a partir de sustratos gaseosos. Los procesos ejemplares incluyen los descritos, por ejemplo, en los documentos WO2007/117157, WO2008/115080, la patente de EE.UU. No. 6.340.581, la patente de EE.UU. No. 6.136.577, la patente de EE.UU. No. 5.593.886, la patente de EE.UU. No. 5.807.722 y la patente de EE.UU. No. 5.821.111.

Se conoce un cierto número de bacterias anaeróbicas que son capaces de llevar a cabo la fermentación de CO a alcoholes, incluyendo n-butanol y etanol, y ácido acético, y que son adecuadas para su uso en el procedimiento de la presente invención. Ejemplos de tales bacterias que son adecuadas para su uso en la invención incluyen las del género Clostridium, tales como cepas de Clostridium Ijungdahlii, incluyendo las descritas en los documentos WO 00/68407, EP 117309, las patentes de EE.UU. Nos. 5.173.429, 5.593.886, y 6.368.819, los documentos WO 98/00558 y WO 02/08438, Clostridium carboxydivorans (Liou et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 33: pp. 2085-2091), Clostridium ragsdalei (documento WO/2008/028055) y Clostridium autoethanogenum (Abrini et al, Archives of Microbiology 161: pp 345-351). Otras bacterias adecuadas incluyen las del género Moorella, incluyendo Moorella sp HUC22-1, (Sakai et al, Biotechnology Letters 29: pp 1607-1612), y las del género Carboxydothermus (Svetlichny, VA, Sokolova, TG et al (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260). Otros ejemplos incluyen Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Ruminococcus productus, acetobacterium woodii, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Oxobacter pfennigii, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina acetivorans, Desulfotomaculum kuznetsovii (Simpa et. Al. Critical Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26. pp. 41-65). Además, se debe entender que otras bacterias anaeróbicas acetogénicas pueden ser aplicables a la presente invención tal como se comprendería por cualquier persona de experiencia en la técnica. También se apreciará que la invención se puede aplicar a un cultivo mixto de dos o más bacterias.

Un ejemplo de microorganismo adecuado para uso en la presente invención es Clostridium autoethanogenum. En una realización, el Clostridium autoethanogenum es un Clostridium autoethanogenum que tiene las características identificativas de la cepa depositada en el Centro de Recursos Alemán para el Material Biológico (DSMZ) bajo el número de depósito identificable 19630. En otra realización, el Clostridium autoethanogenum es un Clostridium autoethanogenum que tiene las características de identificación del número de depósito DSMZ DSMZ 10061.

El cultivo de las bacterias utilizadas en los métodos de la invención se puede realizar usando cualquier número de procedimientos conocidos en la técnica para el cultivo y la fermentación de sustratos utilizando bacterias anaerobias. Se proporcionan técnicas ejemplares en la sección "Ejemplos" más abajo. A modo de ejemplo adicional, pueden ser utilizados aquellos procedimientos descritos en general en los siguientes artículos utilizando sustratos gaseosos para la fermentación: (i) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recycling, 5; 145-165; (ii) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations. Fuel. 70. 605-614; (iii) K. T. Klasson, et al. (1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J. L. Vega, et al. (1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Culture. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785793; (v) J. L. Vega, et al. (1989). Study of gaseous substrate fermentations: Carbon monoxide conversion to acetate.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

1. Batch culture. Biotechnology and Bioengineering. 34. 6. 774-784; (vi) J. L. Vega, et al. (1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160.

La fermentación puede llevarse a cabo en cualquier biorreactor adecuado, tal como un reactor continuo de tanque agitado (CSTR), un reactor de células inmovilizadas, un reactor por aspersión, un reactor de columna de burbujas (BCR), un reactor de membrana, tal como un biorreactor de membrana de fibra hueva (HFMBR) o un reactor de lecho percolador (TBR). Además, en algunas realizaciones de la invención, el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento en el que los microorganismos se cultivan, y un segundo reactor, reactor fermentador, al que el caldo de fermentación del reactor de crecimiento se alimenta y en el que se produce la mayor parte del producto de fermentación (por ejemplo, etanol y acetato).

De acuerdo con diversas realizaciones de la invención, la fuente de carbono para la reacción de fermentación es un sustrato gaseoso que contiene CO. El sustrato puede ser un gas residual que contiene CO obtenido como un subproducto de un proceso industrial, o de alguna otra fuente, tal como de los gases de escape de los automóviles. En ciertas realizaciones, el proceso industrial se selecciona del grupo que consiste en fabricación de productos de metales ferrosos, tales como las fábricas de acero, la fabricación de los productos no ferrosos, los procesos de refino del petróleo, la gasificación del carbón, la producción de energía eléctrica, la producción de negro de carbono, la producción de amoníaco, la producción de metanol y la fabricación de coque. En estas realizaciones, el sustrato que contiene CO puede ser capturado desde el proceso industrial antes de que se emita a la atmósfera, usando cualquier método conveniente. Dependiendo de la composición del sustrato que contiene CO, también puede ser deseable tratar para eliminar las impurezas no deseadas, tales como las partículas de polvo antes de introducirlo a la fermentación. Por ejemplo, el sustrato gaseoso puede ser filtrado o limpiado usando métodos conocidos.

Como alternativa, el sustrato que contiene CO puede proceder de la gasificación de la biomasa. El proceso de gasificación implica la combustión parcial de la biomasa en un suministro limitado de aire u oxígeno. El gas resultante típicamente comprende principalmente CO y H2, con volúmenes mínimos de CO2, metano, etileno y etano. Por ejemplo, los subproductos de la biomasa obtenidos durante la extracción y el procesamiento de productos alimenticios tales como el azúcar de la caña de azúcar o el almidón de maíz o granos, o residuos de biomasa no alimentaria generados por la industria forestal, pueden gasificarse para producir un gas que contiene CO adecuado para su uso en la presente invención.

El sustrato que contiene CO contendrá típicamente una proporción importante de CO, tal como al menos de aproximadamente 20% a aproximadamente 100% de CO en volumen, del 40% al 95% de CO en volumen, del 60% al 90% de CO en volumen, y del 70% al 90% de CO en volumen. En realizaciones particulares, el sustrato comprende 25%, o 30%, o 35%, o 40%, o 45%, o 50% de CO en volumen. Los sustratos que tienen concentraciones más bajas de CO, tal como 6%, también pueden ser apropiados, particularmente cuando H2 y CO2 también están presentes.

Si bien no es necesario que el sustrato contenga ningún hidrógeno, la presencia de H2 no debe ser perjudicial para la formación de producto de acuerdo con los métodos de la invención. En realizaciones particulares, la presencia de hidrógeno da como resultado una mejora de la eficiencia general de la producción de alcohol. Por ejemplo, en realizaciones particulares, el sustrato puede comprender hasta una relación de 2:1, o 1:1, o 1: 2 de H2:CO. En otras realizaciones, la corriente de sustrato comprende concentraciones bajas de H2, por ejemplo, menos de 5%, o menos del 4%, o menos de 3%, o menos del 2%, o menos de 1%, o está sustancialmente libre de hidrógeno. El sustrato también puede contener algo de CO2, por ejemplo, tal como de aproximadamente 1% a aproximadamente 80% de CO2 en volumen, o de 1% a aproximadamente 30% de CO2 en volumen.

Típicamente, el monóxido de carbono se añade a la reacción de fermentación en estado gaseoso. Sin embargo, los métodos de la invención no se limitan a la adición del sustrato en este estado. Por ejemplo, el monóxido de carbono se puede proporcionar en un líquido. Por ejemplo, un líquido puede estar saturado con un gas que contiene monóxido de carbono y aquel líquido añadido al biorreactor. Esto se puede conseguir usando la metodología estándar. A modo de ejemplo, un generador de dispersión de microburbujas (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3/October, 2002) podría utilizarse para este propósito.

Se apreciará que para que ocurra el crecimiento de las bacterias y la fermentación de CO en alcohol, además del gas sustrato que contiene CO, tendrá que ser alimentado al biorreactor un medio nutriente líquido adecuado. Un medio nutriente contiene vitaminas y minerales suficientes para permitir el crecimiento del microorganismo utilizado. Los medios anaerobios adecuados para la fermentación de etanol utilizando CO como única fuente de carbono son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los medios adecuados se describen en las patentes de EE.UU. Nos. 5.173.429 y 5.593.886 y en los documentos WO 02/08438, WO2007/115157 y WO2008/115080 mencionados anteriormente. Se describen en este documento un nuevo medio que ha incrementado la eficacia para apoyar el crecimiento de los microorganismos y/o la producción de alcohol en el proceso de fermentación. Este medio se describirá con más detalle más adelante.

La fermentación deseablemente debe llevarse a cabo en condiciones apropiadas para que se produzca la fermentación deseada (por ejemplo, de CO a etanol). Las condiciones de reacción que se deben considerar incluyen

imagen9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

El ácido acético adsorbido en el carbón activado se puede recuperar mediante elución usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el etanol puede ser utilizado para eluir el acetato ligado. En ciertas realizaciones, el etanol producido por el proceso de fermentación en sí mismo puede ser utilizado para eluir el acetato. Debido a que el punto de ebullición del etanol es 78,8°C y el del ácido acético es 107°C, el etanol y el acetato pueden ser separados fácilmente uno del otro mediante un método basado en la volatilidad, tal como por destilación.

Otros métodos para recuperar el acetato del caldo de fermentación son también conocidos en la técnica y pueden ser utilizados en los procesos de la presente invención. Por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 6.368.819 y

6.753.170 describen un sistema de disolventes y co-disolventes que se puede utilizar para la extracción de ácido acético a partir de caldos de fermentación. Al igual que con el ejemplo del sistema de base de alcohol oleílico descrito para la fermentación extractiva de etanol, los sistemas descritos en las patentes de EE.UU. Nos. 6.368.819 y 6.753.170 describen un disolvente inmiscible en agua/co-disolvente que se puede mezclar con el caldo de fermentación, ya sea en presencia o ausencia de los microorganismos fermentados con el fin de extraer el producto de ácido acético. El disolvente/co-disolvente que contiene el producto de ácido acético se separa entonces del caldo por destilación. Una segunda etapa de destilación puede entonces ser utilizada para purificar el ácido acético a partir del sistema disolvente/co-disolvente.

Los productos de la reacción de fermentación (por ejemplo, etanol y acetato) se pueden recuperar del caldo de fermentación mediante la eliminación continua de una parte del caldo del biorreactor de fermentación, separando las células microbianas del caldo (convenientemente por filtración), y recuperando uno o más productos del caldo de forma simultánea o secuencial. En el caso del etanol, puede ser convenientemente recuperado por destilación, y el acetato puede ser recuperado por adsorción sobre carbón activado, utilizando los métodos descritos anteriormente. Las células microbianas separadas se devuelven preferiblemente al biorreactor de fermentación. El permeado exento de células restantes, después de que el etanol y el acetato se hayan eliminado, también se devuelve preferiblemente al biorreactor de fermentación. Se pueden añadir nutrientes adicionales (tales como vitaminas del grupo B) al permeado exento de células para reponer el medio de nutrientes antes de que se devuelva al biorreactor. Además, si el pH del caldo se ajustó como se describió anteriormente para mejorar la adsorción de ácido acético por el carbón activado, el pH se debe volver a ajustar a un pH similar al del caldo en el biorreactor de fermentación, antes de ser devuelto al biorreactor.

Determinación de la fijación de carbono en la fermentación

Mediante la determinación de la proporción del CO convertido en CO2, se ha diseñado un sistema de modelado para predecir el perfil de producción de los productos para una bacteria que metaboliza CO. Dado que el grado de oxidación de los productos difiere dependiendo de si las bacterias están sintetizando ácidos orgánicos o alcoholes, la proporción de carbono que las bacterias están dedicando a solventogenesis se puede predecir sobre la base de la estequiometria de los procesos químicos subyacentes. El análisis y/o la cuantificación del grado de los subproductos oxidados (CO2) proporcionan efectivamente una indicación en tiempo real de la conversión total del producto por un cultivo microbiano:

El sistema modela el estado del reactor como un compuesto de uno o más estados "ideales" tal como se calcula a partir de la estequiometria subyacente. El sistema de modelado asigna una muestra de gas específica en un compromiso del "mejor ajuste" entre dos estados primarios y una condición de modificación que genera dos reacciones secundarias híbridas dependiendo del hidrógeno disponible, y dos estados terciarios.

Los estados principales son:

Fijación de monóxido de carbono en ácido acético

2CO + 2H2 → CH3COOH (una proporción CO2/CO de 0)

Fijación de monóxido de carbono en etanol

3CO + 3H2 → CH3CH2OH + CO2 (una relación de CO2/CO de 0,3333)

En ausencia de gas hidrógeno libre, ambas de estas reacciones primarias se completan con una reacción de desplazamiento de agua-gas;

CO + H2O → H2 + CO2

Se puede suponer que este desplazamiento de agua-gas se produce simultáneamente con la fijación de carbono cuando la fijación de carbono se lleva a cabo en ausencia de hidrógeno libre.

Combinando el desplazamiento de agua-gas con las dos reacciones primarias da un par de reacciones secundarias híbridas que se producen en ausencia de gas hidrógeno libre.

Fijación de monóxido de carbono en ácido acético en ausencia o libre de hidrógeno

4CO + 2H2O → CH3COOH + 2CO2 (relación de CO2/CO de 0,5)

imagen10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

intersección z de esta línea híbrida; si esta línea era horizontal, la pendiente ([CO2/CO]/[CO2/H2]) sería de 1, lo que indica un cultivo de consumo de hidrógeno puro, en el que toda la producción de etanol viene de los consumidores de hidrógeno, es decir, la única ecuación que tiene que tenerse en cuenta es la ecuación de hidrógeno.

A medida que se desplace esta línea de horizontal, su pendiente ([CO2/CO]/[CO2/H2]) tenderá hacia cero. Usando esto como un valor de ponderación multiplicativo para multiplicar por la intersección z, la cantidad deducida de CO2 (y etanol) producida por los consumidores de hidrógeno tenderá asimismo a cero a medida que la línea entre las relaciones de CO2/CO y CO2/H2 se mueve más y más lejos desde la horizontal.

La intersección z multiplicada con el factor de ponderación derivado de la pendiente da una aproximación del CO2 global producido por los microorganismos que consumen hidrógeno y el CO consumido por los consumidores de hidrógeno será de 1:1 con el consumo de hidrógeno, y este valor a continuación, puede ser sustituido para resolver la ecuación y = 1/3x. El CO consumido y el CO2 producido por los microorganismos que consumen hidrógeno puede restarse del consumo y de la producción para dar el CO restante y el CO2 del que la población de desplazamiento de agua-gas es responsable, y la relación de este resto puede ser sustituida para resolver la ecuación y = 2/3x + 0,5. Así, se puede determinar la proporción de carbono fijado en un producto particular, tal como ácido(s) y/o alcohol(es).

Los expertos en la técnica apreciarán que la cantidad de CO y opcionalmente H2 consumidos y el CO2 producido se pueden monitorizar de forma continua o en puntos de tiempo discretos, cuando se desee. Cualquier medio conocido en la técnica puede ser usado para determinar la cantidad de CO2, CO y H2; sin embargo, en una realización de la invención, la cromatografía de gases (GC) se utiliza para medir la cantidad de CO2, CO y H2 presente en una corriente de escape que sale de un biorreactor. La proporción de carbono fijado como alcohol y/o ácido se puede calcular si se conoce la composición de la corriente de sustrato que entra en el biorreactor. Si la composición de la corriente de sustrato es desconocida, se puede utilizar un cromatógrafo de gases adicional para determinar la composición. Otros medios para determinar la cantidad de CO2 producido y el sustrato consumido incluyen la espectroscopia de masas (MS), GC-MS y sensores en línea.

Así, de acuerdo con la invención, la proporción de carbono fijado como un producto particular, tal como acetato y/o etanol se puede determinar mediante la medición del CO2 producido, el CO consumido y el H2 opcionalmente consumido. Se reconoce que la velocidad a la que el sustrato (por ejemplo CO y, opcionalmente, H2) se pone a disposición en un cultivo microbiano puede afectar a la proporción relativa de los productos, así como a la velocidad a la que se producen. Por ejemplo, el aumento del suministro de sustrato a un cultivo productor de etilo puede aumentar la proporción de carbono dirigida a la producción de alcohol.

Un sustrato que comprende CO y opcionalmente H2 se proporciona típicamente en forma gaseosa y la disponibilidad de CO y H2 a un cultivo microbiano será dependiente de las propiedades de transferencia de masa del sistema de fermentación. Por ejemplo, la disponibilidad de CO y/o H2 de un cultivo microbiano en suspensión en un caldo de fermentación depende de factores conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo la temperatura, la composición de caldo, la tasa de suministro de gas, la composición del gas, la presión de vapor de CO, la presión de vapor de H2, la mezcla. Por lo tanto, el aumento de la disponibilidad de CO y/o H2 a una fermentación microbiana requiere mejorar las propiedades de transferencia de masa del sistema, tales como el aumento de la tasa de suministro de sustrato y/o el aumento de la agitación de un biorreactor agitado mecánicamente.

De acuerdo con los métodos de la invención, la eficiencia de la fermentación puede mejorarse proporcionando el sustrato que comprende CO y opcionalmente H2 en, o hacia, un nivel óptimo o intervalo. Un nivel óptimo puede determinarse sobre la base de los productos deseados de la fermentación. Por ejemplo, si se desean alcohol y crecimiento microbiano, el sustrato que comprende CO y opcionalmente H2 se puede suministrar de tal manera que el carbono sea fijado predominantemente como alcohol, mientras que una parte está disponible para el crecimiento microbiano. Por ejemplo, un sustrato que comprende CO puede ser suministrado a un cultivo microbiano, de manera que se producen el crecimiento microbiano y la producción de alcohol.

Las condiciones, en particular la tasa de suministro de sustrato y/o las concentraciones de CO y H2 relativas, pueden ser variadas hasta que el crecimiento microbiano y la producción de alcohol se hayan optimizado según convenga al operador. Dado que se puede determinar la influencia de cada vía de fijación de carbono en los productos, el suministro de sustrato se puede ajustar para alcanzar y/o mantener las condiciones deseables durante la fermentación. Por ejemplo, se reconoce que una corriente de sustrato puede comprender la fluctuación de los componentes de CO y/o H2. Sin embargo, usando los métodos de la invención, la producción neta de los productos se puede mantener en una relación sustancialmente constante mediante el ajuste del suministro de sustrato.

Adicional o alternativamente, cuando un cultivo microbiano crece, o la densidad microbiana fluctúa, el suministro de sustrato puede ser alterado de acuerdo con los requisitos de los cultivos microbianos basado en la determinación del CO2 producido y del CO y H2 consumidos.

En este sentido, la proporción de carbono dirigida a un producto particular se puede mantener sustancialmente constante a pesar de los cambios del sustrato de alimentación y/o de la densidad microbiana. En realizaciones particulares de la invención, la proporción de carbono dirigido a un producto particular puede ser seleccionada por un operador y las condiciones ser ajustadas para mantener la proporción sustancialmente constante. Por ejemplo, si

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

un operador requiere un 90% del carbono fijado dirigido hacia la producción de etanol, el sustrato se puede suministrar de tal manera que la proporción no se desvíe fuera de un intervalo predeterminado, tal como ± 1%, o ± 2%, o ± 3 % o ± 4%, o ± 5%. En realizaciones particulares, el suministro de sustrato puede ser controlado en respuesta a la determinación de la proporción del carbono dirigido a un producto particular. En realizaciones particulares, el suministro de sustrato se ajusta automáticamente en respuesta a los cambios en la proporción de carbono dirigido a un producto particular.

En realizaciones particulares, en las que se suministra CO en ausencia de cantidades apreciables de H2, se puede determinar la relación CO2producido/COconsumido. En realizaciones particulares de la invención, el crecimiento microbiano y la producción de alcohol se pueden optimizar cuando se produce acetato al mismo tiempo. Como tal, se esperaría una relación CO2producido/COconsumido de <0,667, tal como aproximadamente 0,66, o aproximadamente 0,65, o aproximadamente 0,64, o aproximadamente 0,63, o aproximadamente 0,62, o aproximadamente 0,61, o aproximadamente 0,60, o menos. Alternativamente, el crecimiento microbiano y la producción de alcohol pueden ser óptimos cuando se consume acetato. Como tal, se espera una proporción CO2producido/COconsumido de >0,667, tal como aproximadamente 0,67, o aproximadamente 0,68, o aproximadamente 0,69, o aproximadamente 0,70 o mayor.

Una vez que se ha determinado el nivel óptimo o intervalo, la fermentación, o las fermentaciones futuras pueden ser operadas en condiciones similares, en las que el sustrato se suministra de tal manera que el carbono determinado experimentalmente fijado y/o la relación CO2producido/COconsumido se mantiene sustancialmente. La proporción óptima de la fermentación de un sustrato que comprende CO y H2 puede ser determinada y se aplica de manera similar.

En una realización adicional o alternativa, puede ser usado un método para indicar cuándo y/o cómo un cultivo microbiano puede o debe ser llevado a transición de una conversión global neta a otra. Por ejemplo, como se señaló anteriormente, si el crecimiento es el objetivo principal, entonces el cultivo microbiano puede mantenerse deseablemente de tal manera que la mayoría del carbono se dirige hacia la producción de acetato. Por ejemplo, una corriente de sustrato que comprende CO y H2 mínimo o ninguno, la relación CO2producido/COconsumido se mantiene alrededor de 0,5. Si la relación CO2producido/COconsumido se desvía más allá de un intervalo o umbral predeterminado, tal como aproximadamente 0,45-0,55, o aproximadamente 0,48-0,52, se puede hacer un ajuste al cultivo y/o a la corriente de sustrato para pasar al menos una parte del cultivo microbiano de tal manera que la conversión neta global por todo el cultivo sea como se desee. Por ejemplo, una transición de cultivo tal que la relación CO2/CO sea de aproximadamente 0,5. En presencia de H2, se pueden hacer ajustes equivalentes de manera similar, de manera que la fijación de carbono permanezca sustancialmente constante.

En realizaciones particulares, al menos una parte del cultivo microbiano puede ser llevado a transición haciendo un ajuste en el cultivo microbiano y/o la corriente de sustrato. En ciertas realizaciones, la fermentación anaeróbica se lleva a cabo en un biorreactor, en el que el cultivo microbiano es al menos parcialmente suspendido en un caldo de fermentación que comprende un medio nutriente líquido. En realizaciones particulares, al menos una parte del cultivo microbiano puede ser llevado a transición al hacer un ajuste en el caldo de fermentación y/o en el medio nutriente líquido.

En ciertas realizaciones, el ajuste incluye uno o más de: cambio de pH del caldo de fermentación; cambio de potencial redox del caldo de fermentación; cambio de la concentración de CO del caldo de fermentación; cambio de la concentración de H2 del caldo de fermentación; cambio de la composición de la corriente de sustrato; cambio de presión de la corriente de sustrato; alteración de la velocidad de agitación del caldo de fermentación; retirada del producto; cambio de la concentración del ácido y/o alcohol del caldo de fermentación; cambio de uno o más nutrientes en el medio nutriente líquido; cambio de la tasa de suministro de uno o más nutrientes.

Adicional o alternativamente, si la producción de alcohol es el objetivo primario entonces el sustrato se puede proporcionar de tal manera que sustancialmente todo el carbono se fije como etanol. En realizaciones particulares, en las que no hay ningún H2 disponible, la relación CO2producido/COconsumido puede ser mantenida de manera deseable a aproximadamente 0,667. Si la relación CO2producido/COconsumido se desvía más allá de un intervalo predeterminado o umbral, tal como de 0,58 a 0,73 o de 0,63 a 0,7, se puede hacer un ajuste al cultivo y/o la corriente de sustrato para llevar la transición a al menos una parte del cultivo microbiano de tal manera que la conversión neta global por todo el cultivo sea como se desee, por ejemplo, devuelta a una relación CO2producido/COconsumido de aproximadamente 0,667.

En una realización adicional o alternativa, un cultivo productor de alcohol mantenido con una relación CO2producido/COconsumido de aproximadamente 0,667 puede tener cantidades significativas de acetato no deseado, por ejemplo, el acetato residual que queda de una fase de crecimiento anterior. El acetato se puede convertir en alcohol por la transición de al menos una parte de la reducción de acetato a alcohol (ecuación 3). Como tal, el cultivo se puede ajustar hasta que la relación CO2producido/COconsumido aumente por encima de 0,667 hasta que la conversión deseada se haya completado.

La proporción de CO oxidado en CO2 se puede utilizar para determinar la conversión neta global de un cultivo microbiano. La cantidad de CO consumido por el cultivo también proporciona una indicación de la viabilidad del cultivo (captación específica: velocidad de absorción de CO/densidad de las células). En consecuencia, los métodos

imagen11

En realizaciones particulares de la invención, los medios de medición 5 están adaptados para determinar la concentración de CO, CO2 y opcionalmente H2 en la corriente agotada que sale del biorreactor 2 a través de la salida de escape 4. En realizaciones particulares, la proporción de carbono dirigido a ácido(s) y/o alcohol(es) se puede determinar a partir de la cantidad de CO, CO2 y H2 suministrada y la cantidad que sale del biorreactor 2. Por 5 consiguiente, un operador puede hacer opcionalmente ajustes en un cultivo microbiano en el biorreactor 2 y/o en la corriente de sustrato 1 usando los medios de ajuste 6 para mantener el cultivo microbiano, o realizar la transición del cultivo, en un estado deseado de la producción. Los ajustes para mantener o realizar la transición del cultivo incluyen uno o más de: cambio del pH del caldo de fermentación; cambio del potencial redox del caldo de fermentación; cambio de la concentración de CO del caldo de fermentación; cambio de la concentración de H2 del

10 caldo de fermentación; cambio de la composición de la corriente de sustrato; cambio de presión de la corriente de sustrato; velocidad de agitación del caldo de fermentación; retirada del producto; cambio de la concentración de ácido y/o alcohol del caldo de fermentación; cambio de uno o más nutrientes en el medio nutriente líquido; cambio de la tasa de suministro de uno o más nutrientes.

Adicional o alternativamente, el sistema 100 incluye medios de procesamiento opcionales 7 adaptados para

15 determinar la proporción del carbono dirigido hacia productos específicos y medios de ajustes de control 6, de manera que el cultivo pueda mantenerse, o llevarse a transición, en un estado deseado.

En realizaciones particulares, el CO2, H2 y CO que entra y/o sale del biorreactor 2 se puede monitorizar de forma continua o en un punto de tiempo discreto y la fijación de carbono ser determinada. Además, los medios de ajuste 6 se pueden configurar para hacer ajustes o ajustes continuos en puntos de tiempo discretos, si es necesario.

20 Cualquier medio para la determinación de la relación CO2producido/COconsumido se puede utilizar, sin embargo, en realizaciones particulares, uno o más cromatógrafos de gases se utilizan para determinar las concentraciones de CO2 y CO de la corriente que sale del biorreactor 2 y, opcionalmente, la corriente de sustrato 1. En una realización, el medio para determinar las concentraciones de CO y CO2 en la corriente que sale del biorreactor 2 es un micro GC Varian CP-4900.

25 Ejemplos

Materiales y métodos (Ejemplo 1 y 2):

Solución A

NH4Ac: 3,083 g KCl 0,15 g

MgCl2 • 6H2O: 0,61 g NaCl 0,12 g

CaCl2 • 2H2O: 0,294 Agua destilada Hasta 1 l

Solución(es) B

Componente/solución 0,1 M (ac): Cantidad/ml en 1 L de medio Componente/solución 0,1 M (ac) Cantidad/ml en 1 L de medio

FeCl3: 10 ml Na2MoO4 1 ml

CoCl2: 5 ml Na2WO4 1 ml

NiCl2: 5 ml ZnCl2 1 ml

H3BO3: 1 ml MnCl2 1 ml

Na2SeO3: 1 ml

Solución C

Biotina: 20,0 mg D-(*)-pantotenato de calcio 50,0 mg

Ácido fólico: 20,0 mg

Piridoxina • HCl: 10,0 mg Vitamina B12 50,0 mg

Tiamina • HCl: 50,0 mg ácido p-aminobenzoico 50,0 mg

Riboflavina: 50,0 mg Ácido tióctico 50,0 mg

Ácido nicotínico: 50,0 mg Agua destilada Hasta 1 Litro

Solución(es) D

FeCl3: 2,5 ml Na2MoO4 0,25 ml

CoCl2: 1,25 ml Na2WO4 0,25 ml

NiCl2: 1,2 ml ZnCl2 0,25 ml

H3BO3: 0,25 ml MnCl2 0,25 ml

Na2SeO3: 0,25 ml

Preparación de los medios (Ejemplo 1 y 2)

El medio se prepara como sigue: se añadió 85% de H3PO4 (20 mmol) a una solución de 1 L de solución A. El pH del medio se ajustó a 5,3 mediante la adición de una solución 5M de NaOH. Las sales metálicas se añadieron entonces

5 opcionalmente de acuerdo con la solución(s) B. La solución del medio se esterilizó en autoclave durante 30 minutos a 121°C, o por esterilización por filtración antes de su uso. Se añadió resazurina como indicador redox y se añadieron 10 ml de solución de vitamina B (solución C).

Preparación de Na2Sx

Un matraz de 500 ml se cargó con Na2S (93,7 g, 0,39 mol) y 200 ml de H2O. La solución se agitó hasta que la sal se

10 hubo disuelto y se añadió azufre (25 g, 0,1 mol) en corriente de N2 constante. Después de 2 horas de agitación a temperatura ambiente, la solución "Na2Sx" (aproximadamente 4 M con respecto a [Na] y aproximadamente 5M con respecto a [S]), ahora un líquido de color marrón rojizo claro, se transfirió a botellas de suero purgadas con N2, envueltas en papel de aluminio.

Materiales y métodos Ejemplos 3, 4 y 5:

Solución A

NH4Ac: 3,083 g CaCl2 • 2H2O 0,294 g

MgCl2 • 6H2O: 0,61 g KCl 0,15 g

Agua destilada: Hasta 1 L

Solución(s) B

Componente: Mol/L de H2O Componente Mol/L de H2O

FeCl3: 0,1 Na2SeO3 0,01

CoCl2: 0,05 Na2MoO4 0,01

NiCl2: 0,05 ZnCl2 0,01

H3BO3: 0,01 MnCl2 0,01

Solución C

Biotina: 20,0 mg Ácido nicotínico 50,0 mg

Ácido fólico: 20,0 mg D-(*)-pantotenato de calcio 50,0 mg

Piridoxina • HCl: 10,0 mg Vitamina B12 50,0 mg

Tiamina • HCl: 50,0 mg Ácido p-aminobenzoico 50,0 mg

Riboflavina: 50,0 mg Ácido tióctico 50,0 mg

Agua destilada: Hasta 1 Litro

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

Claims

imagen1