BRPI1008162A2

BRPI1008162A2 - Processo de produção de álcool

Info

Publication number: BRPI1008162A2
Application number: BRPI1008162-3A
Authority: BR
Inventors: Sean Dennis Simpson; Joseph Henry Tizard
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Priority date: 2009-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2014-01-07
Also published as: KR101666236B1; AU2010214147B2; US20130280694A1; WO2010093262A8; CN102361989A; CN102361989B; CA2751060A1; JP5726760B2; PL2391724T3; EP2391724B1; KR20110139205A; AU2010214147A1; EP2391724A4; WO2010093262A1; EP2391724A1; JP2012516152A; NZ594329A; CA2751060C; ES2616604T3; US20110275053A1

Description

J

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ÁLCOOL".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se geralmente aos métodos para 5 aumentar a eficiência do crescimento microbiano e produção de produtos por fermentação microbiana em substratos gasosos. Mais particularmente a invenção refere-se aos processos para produção de alcoóis, particularmente etanol, por fermentação microbiana de gases contendo monóxido de carbo- no. Em modalidades particulares, a invenção refere-se aos métodos de de- 10 terminação da conversão líquida total de CO para produtos durante fermen- tação microbiana.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Etanol está rapidamente se tornando um importante combustível de transporte de líquido rico em hidrogênio em todo o mundo. O consumo 15 mundial de etanol em 2005 foi um número estimado de 12,2 bilhões de litros. O mercado global para a indústria de etanol combustível também foi predito continuar crescer bruscamente no futuro, devido a um interesse aumentado em etanol na Europa, Japão, os EUA e várias nações em desenvolvimento.

Por exemplo, nos EUA, o etanol é utilizado para produzir E10, 20 uma mistura a 10% de etanol em gasolina. Em misturas de E10, o compo- nente de etanol age como um agente de oxigenação, melhorando a eficiên- cia de combustão e reduzindo a produção de poluentes do ar. No Brasil, etanol satisfaz aproximadamente 30% da demanda de combustível de trans- porte, tanto como um agente de oxigenação misturado em gasolina, quanto 25 como um combustível puro por sua própria conta. Além disso, na Europa, as questões ambientais que cercam as conseqüências de emissões de Gás do Efeito Estufa (GHG) foram o estímulo para União Européia (EU) definir os países membros de uma meta obrigatória para o consumo de combustíveis de transpote sustentáveis tais como etanol derivado de biomassa.

A vasta maioria de etanol combustível é produzida através de

processos de fermentação com base em levedura tradicionais que usam carboidratos derivados de colheita, tais como sacarose extraída de cana-de- açúcar ou amido extraído de colheitas de grão, como a principal fonte de carbono. Entretanto, o custo destas matérias-primas de alimentação de car- boidrato é influenciado pelo valor como alimento humano ou alimento ani- mal, e o cultivo de colheitas de produção de sacarose ou amido para a pro- 5 dução de etanol não é economicamente sustentável em todas as geografias. Portanto, é de interesse desenvolver tecnologias para converter custo menor e/ou recursos de carbono mais abundantes em etanol combustível.

CO é um subproduto rico em energia, livre, principal da combus- tão incompleta de materiais orgânicos tais como carvão ou óleo ou produtos derivados do óleo. Por exemplo, a indústria de aço na Austrália é reportada produzir e liberar na atmosfera mais de 500.000 toneladas de CO anualmen- te.

Os processos catalíticos podem ser utilizados para converter ga- ses consistindo principalmente em CO e/ou CO e hidrogênio (H2) em uma 15 variedade de combustíveis e substâncias químicas. Os micro-organismos podem também ser utilizados para converter estes gases em combustíveis e substâncias químicas. Estes processos biológicos, embora geralmente mais lentos do que as reações químicas, têm várias vantagens sobre os proces- sos catalíticos, incluindo maior especificidade, produtos mais elevados, cus- 20 tos de energia menores e maior resistência ao envenenamento.

A capacidade de micro-organismos crescerem em CO como uma única fonte de carbono foi primeiro descoberta em 1903. Isto foi mais tarde determinado ser uma propriedade de organismos que usam a série de reações bioquímica de coenzima A acetila (acetila CoA) de crescimento au- 25 totrófico (também conhecido como a série de reações de Woods-Ljungdahl e a série de reações de monóxido de carbono deidrogenase/acetil CoA sintase (CODH/ACS)). Um grande número de organismos anaeróbicos incluindo organismos carboxidotróficos, fotossintéticos, metanogênicos e acetogênicos foram mostrados metabolizar CO para vários produtos finais, isto é, CO2, H2, 30 metano, n-butanol, acetato e etanol. Ao mesmo tempo em que utilizando CO como a única fonte de carbono, todos tais organismos produzem pelo menos dois destes produtos finais. As bactérias anaeróbicas, tais como aquelas do gênero Clostri- dium, foram demonstradas produzir etanol de CO, CO2 e H2 através da série de reações bioquímica de acetila CoA. Por exemplo, várias cepas de Clos- trídium Ijungdahlii que produzem etanol de gases são descritos em WO 5 00/68407, EP 117309, Patentes U.S. Nos. 5.173.429, 5.593.886, e 6.368.819, WO 98/00558 e WO 02/08438. A bactéria Clostridium autoetha- nogenum sp é também conhecida por produzir etanol de gases (Abrini e ou- tros, Archives of Microbiology 161, pp 345-351 (1994)).

Entretanto, a produção de etanol por micro-organismos por fer- 10 mentação de gases é tipicamente associada com a coprodução de acetato e/ou ácido acético. Quando um pouco do carbono disponível é convertido em acetato/ácido acético ao invés de etanol, a eficiência da produção de etanol utilizando tais processos de fermentação pode ser menor do que o desejável. Além disso, o subproduto de acetato/ácido acético pode ser utili- 15 zado para alguns outros propósitos, pode representar um problema de elimi- nação de resíduos. Acetato/ácido acético é convertido par metano por mi- cro-organismos e, portanto tem o potencial de contribuir com as emissões de GHG.

Várias enzimas conhecidas por serem associadas com a capa- 20 cidade de micro-organismos utilizarem monóxido de carbono com sua única fonte de carbono e energia são conhecidas por requererem cofatores de me- tal para sua atividade. Os exemplos de enzimas principais requerendo liga- ção de cofator de metal para atividade incluem monóxido de carbono deidro- genase (CODH), e acetil -CoA sintase (ACS).

W02007/117157, W02008/115080, W02009/022925,

W02009/058028, W02009/064200, W02009/064201 e W02009/113878, a descrição dos quais está incorporada aqui por referência, descrevem pro- cessos que produzem alcoóis, particularmente etanol, por fermentação ana- eróbica de gases contendo monóxido de carbono. O acetato produzido co- 30 mo um subproduto do processo de fermentação descrito em W02007/117157 é convertido em gás de hidrogênio e gás de dióxido de carbono, qualquer um dos dois ou ambos dos quais podem ser utilizados no processo de fermentação anaeróbico. W02009/022925 descreve o efeito de pH e ORP na conversão de substratos compreendendo CO para produtos tais como ácidos e alcoóis por fermentação. W02009/058028 descreve o uso de gases residuais industriais para a produção de produtos, tais como 5 álcool, por fermentação. W02009/064201 descreve veículos para CO e o uso de CO na fermentação. W02009/113878 descreve a conversão de áci- do(s) para álcool(s) durante a fermentação de um substrato compreendendo CO.

Os micróbios capazes de crescer em gases contendo Co são conhecidos por fazê-lo em uma taxa mais lenta do que é tradicionalmente associado com micróbios crescidos nos açúcares. De uma perspectiva co- mercial, em um processo de fermentação o tempo requerido para uma popu- lação microbiana crescer para uma densidade celular suficientemente eleva- da para permitir um nível economicamente viável de produto a ser sintetiza- do, é um custo operacional principal afetando a probabilidade do processo. As tecnologias que agem para realçar as produtividades e/ou taxas de cres- cimento de cultura e, portanto, reduzir o tempo requerido para alcançar o tempo requerido alcançar as densidades de célula desejadas e/ou níveis de produto desejados e podem servir para melhorar a viabilidade comercial de todo o processo.

Em processos de fermentação dedicados à produção de alcoóis de matérias-primas de alimentação gasosas, garantindo as condições apro- priadas para o crescimento microbiano e/ou produção de álcool, pode ser crítico manter o crescimento microbiano ideal e/ou produtividades de álcool. 25 Por exemplo, durante a partida inicial de uma fermentação, o objetivo princi- pal pode ser o crescimento microbiano. Entretanto, quando a densidade microbiana desejada é obtida, o objetivo principal pode ser a produção de álcool. O entendimento como o perfil do produto altera durante o curso de uma fermentação, quando as alterações ocorrem, particularmente em res- 30 posta às alterações em condições operacionais pode permitir um operador otimizar a produtividade. Fornecer um substrato compreendendo CO e op- cionalmente H2 em um nível ideal, ou em uma faixa ideal para requerimentos particulares, tais como crescimento rápido e/ou produção de álcool, pode também ser desafiante. Por exemplo, muito CO pode levar a inibição de CO como descrito em US 7.285.402, que está completamente incorporado aqui por referência. Além disso, pouco CO e taxas metabólicas incluindo cresci- mento microbiano e produção de álcool, podem diminuir.

É um objetivo da presente invenção fornecer um processo que vai pelo menos de algum modo superar as desvantagens acima, ou pelo menos fornecer ao público uma escolha útil.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção geralmente se refere a um método para produzir produtos

incluindo ácidos e/ou alcoóis por fermentação microbiana de um substrato compreendendo CO, onde pelo menos uma porção de uma cultura microbi- ana converte:

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para

biomassa microbiana; e/ou

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para ácido(s); e/ou

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para álcool (s); e/ou

ácido(s) e pelo menos uma porção do substrato compreendendo

CO para álcool(s).

Em uma modalidade, a cultura microbiana converte: pelo menos uma porção do substrato compreendendo

ácido(s); e

pelo menos uma porção do substrato compreendendo

álcool(s).

Em outra modalidade, a cultura microbiana converte: pelo menos uma porção do substrato compreendendo

ácido(s); e

pelo menos uma porção do substrato compreendendo

álcool(s); e

ácido(s) e pelo menos uma porção do substrato compreendendo

CO para CO para

CO para CO para CO para álcool(s).

Em modalidades particulares da invenção, o substrato compre- ende CO e H2. Entretanto, de acordo com a invenção, a conversão prosse- gue com H2 insuficiente para fixação de carbono total em produtos e/ou ma- 5 terial celular. Em modalidades particulares, H2 é fornecido tal que menos do que 2:1 H2:CO seja convertido pela cultura, tal como aproximadamente 1:1; ou aproximadamente 1:2; ou aproximadamente 1:3; ou aproximadamente 1:4; ou aproximadamente 1:5; ou aproximadamente 1:10. Em modalidades particulares, H2 não é fornecido.

Em um primeiro aspecto da invenção, nesse aspecto é fornecido

um método para melhorar a eficiência da fermentação microbiana de um substrato compreendendo CO e opcionalmente H2, o método incluindo for- necer o substrato para uma cultura microbiana tal que uma primeira propor- ção de CO seja fixada como um ou mais produtos desejados incluindo ácido

(s) e/ou álcool(s) e uma segunda proporção de CO é convertida para CO2. Em modalidades particulares, a determinação da proporção de CO converti- do para CO2 é utilizada para determinar uma taxa de fornecimento de subs- trato para a produção do um ou mais produtos desejados.

Em modalidades particulares, a taxa de fornecimento de substra-

to é ou:

i. aumentada se a proporção de CO convertido para CO2 for de- terminado ser abaixo de uma faixa ou valor ideal; ou

ii. diminuída se a proporção de CO convertido para CO2 for deter- minada ser acima de uma faixa ou valor ideal; ou

iii. mantida se a proporção de CO convertido para CO2 for determi-

nada estar substancialmente em uma faixa ou valor ideal.

Em modalidades particulares, a taxa de fornecimento de substra- to é automaticamente ajustada tal que a proporção de CO convertido para CO2 seja mantido substancialmente em uma faixa ou valor ideal.

Em modalidades particulares, a faixa ou valor ideal pode ser ve-

rificada experimentalmente com base nos produtos de fermentação deseja- dos. Em modalidades particulares, onde o álcool é o produto desejado, o substrato pode ser fornecido tal que pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90% de carbono fixo é fixado como álcool. Adicionalmente ou alternativamente, onde o pro- duto desejado é acetato, o substrato pode ser fornecido tal que pelo menos 5 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90% de carbono fixo é fixado como acetato.

Em modalidades particulares, uma proporção de carbono fixado como um produto desejado pode ser substancialmente mantida constante. Em modalidades particulares, onde a proporção de carbono fixo como um 10 produto desejado desvia de uma faixa predeterminada, o fornecimento do substrato é controlado tal que a proporção seja retornada para a faixa prede- terminada. Em modalidades particulares, a faixa predeterminada é cerca de ±1%, ou cerca de ±2%, ou cerca de ±3%, ou cerca de ±4%, ou cerca de ±5%.

Em modalidades particulares, o fornecimento de substrato é au-

tomaticamente ajustado em resposta aos desvios da faixa predeterminada.

Em um segundo aspecto da invenção, nesse aspecto é forneci- do um método para melhorar a eficiência da produção de um ou mais ácidos e/ou alcoóis por fermentação microbiana de um substrato compreendendo CO e opcionalmente H2, onde pelo menos uma porção de uma cultura mi- crobiana é transitada de converter:

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para

ácido(s); ou

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para álcool(s); ou

ácido(s) e pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para álcool(s); para converter:

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para

ácido(s); ou

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para

álcool(s); ou

ácido(s) e pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para álcool(s).

Em modalidades particulares da invenção, pelo menos uma por- ção da cultura microbiana pode ser transitada preparando-se um ajuste à cultura microbiana e/ou à corrente de substrato. Em certas modalidades, a 5 fermentação anaeróbica é realizada em um biorreator, onde a cultura micro- biana é pelo menos parcialmente suspensa em um caldo de fermentação compreendendo um meio nutriente líquido. Em modalidades particulares, pelo menos uma porção da cultura microbiana pode ser transitada preparan- do-se um ajuste ao caldo de fermentação e/ou meio nutriente líquido.

Em certas modalidades, o ajuste inclui um ou mais de: alterar o

pH do caldo de fermentação; alterar o potencial redox do caldo de fermenta- ção; alterar a concentração de CO do caldo de fermentação; alteração da composição da corrente de substrato; alterar a pressão da corrente de subs- trato; alterar a taxa de agitação do caldo de fermentação; remoção de produ-

to; alterar a concentração de ácido e/ou álcool do caldo de fermentação; al- terar um ou mais nutrientes no meio nutriente líquido; alterar a taxa de forne- cimento de um ou mais nutrientes.

Em modalidades particulares da invenção, o substrato compre- endendo CO também compreende H2. Em algumas modalidades, o ajuste

pode incluir alterar a concentração de H2 do caldo de fermentação e/ou alte- rar a relação de CO:H2 no caldo de fermentação. Em certas modalidades, o substrato compreendendo CO e opcionalmente H2 é gasoso. Em algumas modalidades, o ajuste pode incluir alterar a pressão parcial de CO e/ou H2 no biorreator.

Em modalidades particulares da invenção, o método inclui de-

terminar a proporção de CO oxidado para C02, tal que uma conversão líqui- da pela cultura microbiana possa ser determinada. Em modalidades particu- lares, a conversão líquida completa da fermentação microbiana é:

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para

ácido(s); ou

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para álcool(s); ou ácido(s) e pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para álcool(s).

Em um terceiro aspecto, nesse aspeto é fornecido um método para melhorar a eficiência de produção de um ou mais ácidos e/ou alcoóis 5 por fermentação microbiana de um substrato compreendendo CO sob os parâmetros operacionais predeterminados, o método incluindo determinar uma proporção de carbono direcionada para um ou mais produtos e depen- dendo da determinação, ou:

i. fazer um ajuste para um ou mais parâmetros operacionais, tal que a proporção de carbono fixo como um produto desejado aumente; ou

ii. manter os parâmetros operacionais, tal que a proporção de car- bono fixado como um produto desejado se mantenha substancialmente constante.

Em certas modalidades, o ajuste inclui alterar um ou mais dos 15 seguintes parâmetros operacionais: alterar o pH do caldo de fermentação; alterar o potencial redox do caldo de fermentação; alterar a concentração de CO do caldo de fermentação; alterar a taxa de fornecimento de substrato, alterar a composição da corrente de substrato; alterar a pressão da corrente de substrato; alterar a taxa de agitação do caldo de fermentação; remoção 20 do produto; alterar a concentração de ácido e/ou álcool do caldo de fermen- tação; alterar um ou mais nutrientes no meio nutriente líquido; alterar a taxa d fornecimento de um ou mais nutrientes.

Em modalidades particulares da invenção, o substrato compre- endendo CO também compreende H2. Em algumas modalidades, o ajuste 25 pode incluir alterar a concentração de H2 do caldo de fermentação e/ou alte- rar a relação de CO:H2 no caldo de fermentação. Em certas modalidades, o substrato compreendendo CO e opcionalmente H2 é gasoso. Em algumas modalidades, o ajuste pode incluir alterar a pressão parcial de CO e/ou H2 no biorreator.

Em modalidades particulares do primeiro, segundo e terceiro as-

pectos, o método de melhorar a eficiência inclui melhorar uma taxa na qual um ou mais produtos, tal como álcool, em particular etanol, são produzidos. Em um quarto aspecto da invenção, nesse aspecto é fornecido um método para determinar uma conversão líquida total em uma fermenta- ção microbiana de um substrato compreendendo CO, o método incluindo determinar a proporção de carbono fixo como um produto particular por uma cultura microbiana.

Em modalidades particulares, a proporção de carbono fixo como um produto particular pode ser estabelecido determinando-se a proporção de CO oxidado para CO2.

Em modalidades particulares, a conversão líquida total na fer- mentação microbiana é:

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para

ácido(s); ou

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para álcool(s); ou

ácido(s) e pelo menos uma porção do substrato compreendendo

CO para álcool(s);

Em modalidades particulares, a proporção de CO convertido pa- ra C02 é determinada medindo-se CO e opcionalmente H2 consumido pela cultura microbiana e o CO2 produzido pela cultura microbiana.

Em certas modalidades do primeiro, segundo, terceiro ou quarto

aspectos, o CO, H2 e/ou CO2 entrando e/ou saindo do biorreator podem ser monitorados substancialmente continuamente ou em pontos de tempo dis- cretos, tal como antes e/ou após um ajuste ter sido feito. Em algumas mo- dalidades, as quantidades de CO, CO2 e/ou H2 entrando e/ou saindo do bior- 25 reator podem ser determinados utilizando cromatografia de gás. Em modali- dades particulares, a cromatografia de gás é utilizada para determinar uma proporção de CO convertido para CO2. Em uma modalidade, a cromatogra- fia de gás é introduzida utilizando um micro GC.

É reconhecido que as porções da cultura microbiana podem ser envolvidas com conversões alternativas, entretanto a conversão líquida total pela cultura total pode ser determinada. Em modalidades particulares da invenção onde H2 é substancialmente limitado, tal como modalidades onde uma corrente de substrato compreende menos do que 5% de H2; ou menos do que 4% de H2; ou menos do que 3% de H2; ou menos do que 2% H2; ou menos do que 1% de H2; uma relação de C02produzido/C0c0nsumido de 0,5 indi- ca uma conversão de um substrato compreendendo CO para ácido(s) e op- 5 cionalmente células microbianas. Uma relação de C02produzido/COconsumido de 0,667 indica uma conversão líquida de um substrato compreendendo CO para álcool(s). Um C02produzido/C0consumido de 0,5-0,667 indica uma conver- são líquida de um substrato compreendendo CO para ácido(s) e álcool(s) e opcionalmente células microbianas. Uma relação de C02produzido/C0c0nsumido 10 acima de 0,667 indica uma conversão líquida de um substrato compreen- dendo CO e ácido(s) para álcool(s).

É reconhecido que em várias modalidades dos aspectos acima, pelo menos uma porção da cultura microbiana pode converter álcool(s) para ácido(s) e monóxido de carbono. Entretanto, em modalidades particulares, a 15 fermentação anaeróbica resulta em uma conversão total líquida do substrato compreendendo CO para os produtos. Em outras modalidades, onde C02produzido/C0c0nsumido é menor do que 0,5, a conversão líquida é álcool(s) para ácido(s) e redução de CO2 e/ou H2O, o que pode ser indesejável.

Em um quinto aspecto da invenção, nesse aspecto é fornecido 20 um sistema para a fermentação microbiana de uma corrente de substrato compreendendo CO para produtos tais como ácido(s) e/ou álcool(s) com- preendendo um biorreator contendo uma cultura microbiana; meios de medi- ção adaptados para determinar uma proporção de carbono fixo como um produto particular e pelo menos um meio de ajuste adaptado para fazer um 25 ou mais ajustes à cultura microbiana e/ou a corrente de substrato.

Em modalidades particulares, os meios de medição incluem pelo menos um meio adaptado para determinar a composição de uma corrente de exaustão saindo do biorreator e opcionalmente a corrente de substrato entrando no biorreator. Os meios de medição podem opcionalmente ser Ii- 30 gado a um meio de processamento tal que uma proporção de carbono fixo como um produto desejado possa ser determinada. Em uma modalidade, o meio de medição é uma cromatografia de gás. Em certas modalidades, os meios de ajuste são configurados para fazer um ou mais ajustes se os meios de determinação determinam uma proporção de carbono fixo quando um produto desejado desviou de uma faixa ou valor predeterminado. Em modalidades particulares, os meios 5 de ajuste são configurados para fazer ajustes por: alteração de pH do caldo de fermentação; alteração do potencial redox do caldo de fermentação; alte- ração da concentração de CO do caldo de fermentação; alteração da con- centração de H2 do caldo de fermentação; alteração da composição da cor- rente de substrato; alteração da pressão da corrente de substrato; taxa de 10 agitação do caldo de fermentação; remoção do produto; alteração da con- centração de ácido e/ou álcool do caldo de fermentação; alteração de um ou mais nutrientes no meio nutriente líquido; alteração da taxa de fornecimento de um ou mais nutrientes.

Em modalidades particulares, o sistema inclui meios de proces- 15 sarnento adaptados para controlar um ou mais meios de ajuste, tal que um ou mais meios de ajuste, tal que um ou maus ajuste(s) possam ser feitos para a cultura microbiana e/ou corrente de substrato se for determinado que uma proporção de carbono fixo como um produto desejado desviou de uma faixa ou valor predeterminado. Em outras modalidades, o sistema pode in- 20 cluir realimentação visual e/ou aural a um operador, tal que o operador pos- sa manualmente controlar os meios de ajuste.

Em modalidades particulares dos vários aspectos, o substrato compreende um gás obtido como um subproduto de um processo industrial. Em certas modalidades, o processo industrial é selecionado do grupo con- 25 sistindo em fabricação de produtos de metal ferroso, fabricação de produtos não ferrosos, processos de refinamento de petróleo, gasificação de biomas- sa, gasificação de carvão, produção de força elétrica, produção de negro de fumo, produção de amônia, produção de metanol e fabricação de coque. Em uma modalidade particular, o substrato gasoso compreende um gás ob- 30 tido de um moinho de aço.

Em certas modalidades o substrato compreende de 20% de CO a 100% de CO em volume, tal como de 40% a 95% de CO em volume, tal como de 60% a 90% de CO em volume, ou tal como de 70% a 90% de CO em volume. Em modalidades particulares, o substrato compreende 25%, ou 30%, ou 35%, ou 40%, ou 45%, ou 50% de CO em volume. Ao mesmo tem- po em que não é necessário que o substrato contenha qualquer hidrogênio, 5 a presença de H2 não deveria ser prejudicial à formação de produto de acor- do com os métodos da invenção. Em modalidades particulares, a presença de hidrogênio resulta em uma eficiência total melhorada de produção de ál- cool. O substrato gasoso pode também conter algum CO2, por exemplo, tal como cerca de 1% a cerca de 80% de CO2 em volume, ou 1% a cerca de 10 30% de CO2 em volume.

Em modalidades particulares dos vários aspectos, o substrato compreendendo CO é gasoso.

Em modalidades particulares, o álcool produzido pelo processo de fermentação é etanol. A reação de fermentação pode também produzir acetato.

Em modalidades particulares, a reação de fermentação é reali- zada por uma da maioria de cepas de bactérias carboxidotróficas. Preferi- velmente, a bactéria carboxidotrófica é selecionada de Clostrídium, Moorella e Carboxydothermus, tal como Clostrídium autoethanogenum, Clostrídium 20 Ijungdahlii, Clostrídium ragsdalei, Clostrídium carboxydivorans e Moorella thermoacetica. Em uma modalidade, a bactéria carboxidotrófica é Clostridi- um autoethanogenum.

Embora a invenção seja amplamente como definido acima, ela não está limitada a isto e também inclui modalidades das quais a seguinte

descrição fornece os exemplos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção agora será descrita em detalhes com referência às figuras acompanhantes nas quais:

Figura 1: é um gráfico mostrando alterações em produção de acetato e álcool e C02produzido/C0consumido em uma fermentação em batelada de um substrato compreendendo CO para produzir produtos incluindo pro- duzir produtos incluindo álcool. Figura 2: é um gráfico mostrando alterações na produção de a- cetato e alcool e C02produzido/COConsumido em uma fermentação em batelada de um substrato compreendendo CO para produzir produtos incluindo álcool.

Figura 3: é uma representação esquemática de um sistema in- cluindo meios para determinar a relação de C02produzido/COConsumido de acordo com certas modalidades da invenção.

Figura 4: é um gráfico mostrando a quantidade de CO e H2 con- sumido por uma cultura microbiana do exemplo 3.

Figura 5: é um gráfico mostrando a produção de metabólito e crescimento de uma cultura microbiana do exemplo 3.

Figura 6: é um gráfico mostrando a quantidade de CO e consu- mido por uma cultura microbiana do exemplo 4.

Figura 7: é um gráfico mostrando a produção de metabólito e crescimento de uma cultura microbiana do exemplo 4.

Figura 8: é um gráfico mostrando a produção de metabólito em

uma fermentação contínua do exemplo 5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As bactérias carboxidotróficas tais como Clostridium autoetha- nogenum inesperadamente produzem produtos tais como ácido(s) e álco- ol(s) por fermentação anaeróbica de um substrato compreendendo CO e opcionalmente H2, por vários mecanismos diferentes simultaneamente. Foi surpreendentemente reconhecido que a produção de ácido(s) e álcool(s) por micro-organismos carboxidotróficos pode ocorrer sem produção de água concomitante. Em fermentação previamente reportada de substratos com- preendendo CO e H2, produtos tais como alcoóis e/ou ácidos são considera- dos serem produzidos em conjunto com água. Entretanto, foi surpreenden- temente reconhecido que quando H2 insuficiente está disponível para fixação de carbono completa em produtos e materiais celulares, tais como alcoóis e/ou ácidos, a fermentação prossegue sem produção concomitante de água. Em modalidades particulares, H2 insuficiente está disponível para fixação de carbono completa quando H2 e CO são consumidos por uma cultura micro- biana em uma relação de H2:CO menor do que 2:1; tal como aproximada- mente 1:1; ou aproximadamente 1:2; ou aproximadamente 1:3; ou aproxi- madamente 1:4; ou aproximadamente 1:5; ou aproximadamente 1:10. Em modalidades particulares, H2 está substancialmente indisponível para a cul- tura microbiana.

Sem desejar estar preso a teoria, os produtos tais como acetato e etanol são produzidos por pelo menos um, ou pelo menos dois, ou pelo menos três ou todos os seguintes mecanismos simultaneamente:

1. Fixação de monóxido de carbono ao ácido acético

2CO + 2H2 -> CH3COOH

2. Fixação de monóxido de carbono ao etanol

3C0 + 3H2 -► CH3CH2OH + CO2

3. Redução de ácido acético para etanol

CH3COOH + H2 -> CH3CH2OH + CO2

4. Oxidação de etanol para ácido acético

CH3CH2OH + H2O -»■ CH3COOH + 2H2

O acúmulo de massa microbiana de célula ou anabolismo tipi- camente ocorre concomitantemente com pelo menos mecanismo 1., Entre- tanto, é considerado que somente uma pequena proporção de carbono está direcionada ao anabolismo comparado com outros metabólitos.

Além disso, os micro-organismos podem eficazmente produzir seu próprio H2 através de reação de desvio de água a gás (CO + H2O —► CO2 + H2). Desse modo os metabólitos incluindo acetato e etanol são tam- bém produzidos de acordo com A-C:

A) 4C0 + 2H20 -► CH3COOH + 2C02

B) 6C0 + 3H20 -> CH3CH2OH + 4C02

C) CH3COOH +2C0 + H2O -► CH3CH2OH + 2C02

É reconhecido que a cultura microbiana é dinâmica e sem dese- jar estar presa a teoria, é considerado que a cultura microbiana converte pe- lo menos uma porção de um substrato compreendendo CO e opcionalmente H2, para produto de acordo com um ou mais de 1-3 e A-C simultaneamente. Desse modo, na cultura microbiana dinâmica, vários mecanismos diferentes podem estar ocorrendo no sistema para produzir uma conversão líquida total de CO para alcoóis e/ou ácidos. Para determinar como CO é metabolizado, a influência de H2 e a pesagem das equações 1-3 relativo a A-C necessitam ser determinadas. Uma vez determinada, a influência individual relativa das equações 1-3 e A-C pode ser estabelecida determinando-se CO2 produzido, e H2 e CO consumidos.

De acordo com um aspecto da invenção, nesse aspecto é forne- cido um método para produzir produtos incluindo ácidos e/ou alcoóis por fermentação microbiana de um substrato compreendendo CO, onde pelo menos uma porção de uma cultura microbiana converte:

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para

ácido(s) e células microbianas; e/ou

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para ácido(s); e/ou

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para álcool(s); e/ou

Surpreendentemente descobriu-se que aos se determinar uma proporção de CO convertido para CO2, um sistema de modelagem pode ser 20 desenvolvido para predizer o perfil de produção de produtos, tal como álcool e/ou ácidos, para uma bactéria de metabolização de CO. Por que o grau de oxidação nos produtos difere dependendo se as bactérias estão sintetizando ácidos ou alcoóis orgânicos, uma proporção de carbono nas bactérias são devotados para solventogênese (tal como produção de álcool) pode ser pre- 25 dita com base na estequiometria dos processos químicos subjacentes.

O entendimento de como o perfil do produto de um sistema está mudando permite que ajustes ou alterações sejam feitos às condições ope- racionais de um sistema para promover um resultado desejável, tal como produção de álcool aumentada. Além disso, em uma modalidade particular, 30 a invenção fornece um método para melhorar a eficiência de fermentação de um substrato compreendendo CO para produzir produtos incluindo álcool(s) e/ou ácido(s), o método incluindo fornecer um substrato em um nível ideal ou em uma faixa ideal.

Em modalidades particulares onde CO é fornecido na ausência de H2 ou com quantidade limitadas de H2, a influência de 1-3 será mínima. É considerado que quantidades limitadas de H2 estejam disponíveis quando 5 uma proporção de H2 em uma corrente de substrato for menor do que 5%; tal como menor do que 4%; tal como menor do que 3%; tal como menor do que 2%; tal como menor do que 1%. Como tal, a influência relativa de equa- ções A-C pode ser estabelecida calculando-se uma relação de C02Produzido/COconsumio de acordo com y = 2/3x + 0,5. Em tais modalidades, a 10 equação A determinará uma relação de 0,5, a equação B determinará uma relação de 0,667, a equação C determinará um valor de >0,667 e equação 4 determinará um valor de < 0,5. A partir do valor calculado, a influência rela- tiva de cada equação pode ser determinada.

A invenção também fornece um método para fornecer a eficiên- cia da produção de um ou mais ácidos e/ou alcoóis por fermentação micro- biana de um substrato compreendendo CO, onde pelo menos uma porção de uma cultura microbiana é transitada da conversão de:

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para ácido(s) e células microbianas; ou pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para

ácido(s); ou

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para álcool(s); ou

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para ácido(s) e células microbianas; ou

pelo menos uma porção do substrato compreendendo CO para

ácido(s); ou

Definições:

A menos que de outro modo definido, os seguintes termos como 5 utilizado em toda esta especificação são definidos como segue:

Os termos "aumentando a eficiência", "eficiência aumentada" e similares, quando utilizado em relação a um processo de fermentação, inclui, porém não está limitado ao aumento de um ou mais: da taxa de crescimento de micro-organismos catalisando a fermentação, do volume de produto de- 10 sejado (tal como alcoóis) produzido por volume de substrato (tal como mo- nóxido de carbono) consumido, a taxa de produção ou nível de produção do produto desejado, e a proporção relativa do produto desejado produzido comparado com outros subprodutos da fermentação.

O termo "substrato compreendendo monóxido de carbono" e outros termos deveriam ser entendidos incluírem qualquer substrato no qual monóxido de carbono esteja disponível para uma ou mais cepas de bacté- rias para o crescimento e/ou fermentação, por exemplo.

"Substrato gasoso compreendendo monóxido de carbono" inclui qualquer gás que contenha monóxido de carbono. O substrato gasoso tipi- camente conterá uma proporção significante de CO, preferivelmente pelo menos cerca de 5% a cerca de 100% de CO em volume.

No contexto de produtos de fermentação, o termo "ácido" como utilizado aqui inclui tanto os ácidos carboxílicos quanto o ânion de carboxila- to associado, tal como a mistura de ácido acético livre e acetato presente em 25 um caldo de fermentação como descrito aqui. A relação de ácido molecular para carboxilato no caldo de fermentação é dependente do pH do sistema. O termo "acetato" inclui tanto sal de acetato sozinho quanto uma mistura de ácido acético molecular ou livre e sal de acetato, tal como a mistura de sal de acetato e ácido acético livre presente em um caldo de fermentação como 30 pode ser descrito aqui. A relação de ácido acético molecular para acetato no caldo de fermentação é dependente do pH do sistema.

O termo "biorreator" inclui um dispositivo de fermentação consis- tindo em um ou mais vasos e/ou torres ou arranjos de tubulação, que inclui o Reator de Tanque Agitado Contínuo (CSTR), Reator de Célula Imobilizado (ICR), Reatorde Leito de Escoamento (TBR), Coluna de Bolha, Fermentador de Sustentação de Gás, Reator de Membrana tal como Biorreator de Mem- 5 brana de Fibra Oco (HFMBR), Misturador Estático, ou outro vaso ou outro dispositivo adequado para contato de gás-líquido.

A menos que o contexto requeira de outro modo, as frases "fer- mentação", "processo de fermentação" ou "reação de fermentação" e simila- res, como utilizado aqui, são pretendidas abranger tanto a fase de cresci- 10 mento quanto a fase de biossíntese de produto do processo. Como será descrito também aqui, em algumas modalidades o biorreator pode compre- ender um primeiro reator de crescimento e um segundo reator de fermenta- ção. Como tal, a adição de metais ou composições a uma reação de fer- mentação deveria se entendida incluir a adição a um desses ou ambos os 15 reatores.

O termo "conversão líquida total" e similares, como utilizado a- qui, é pretendido descrever a conversão de substratos, tais como CO, para produtos incluindo ácido(s) e/ou álcool(s) por uma cultura microbiana em um ponto de tempo particular. É reconhecido que as porções de uma cultura 20 microbiana podem ser dedicadas a diferentes funções em um ponto de tem- po particular e vários produtos podem ser produzidos. Além disso, um ou mais dos produtos presentes no caldo de fermentação podem convertidos em outros produtos. Consequentemente, a conversão líquida total inclui to- dos os produtos produzidos pela cultura microbiana em qualquer ponto parti- 25 cular no tempo.

Ao mesmo tempo em que a seguinte descrição foca em modali- dades da invenção particulares, isto é a produção de etanol e/ou acetato utilizando CO como o substrato primário, deve ser apreciado que a invenção pode ser aplicável à produção de alcoóis e/ou ácidos alternativos e o uso de 30 substratos alternativos como será conhecido por pessoas de experiência ordinária na técnica a qual a invenção refere-se. Por exemplo, os substratos gasosos contendo dióxido de carbono e hidrogênio podem ser utilizados. Além disso, a invenção pode ser aplicável a fermentação para produzir buti- rato, propionato, caproato, etanol, propanol, e butanol. Os métodos podem também ser de uso na produção de hidrogênio. Por modo de exemplo, es- tes produtos podem ser produzidos por fermentação utilizando micróbios dos 5 gêneros Moorella, Clostridia, Ruminococcus, Acetobacterium, Eubacterium, Butyribacterium, Oxoba^r, Methanosarcina, Methanosarcina, e Desulfoto- maculum.

Certas modalidades da invenção são adaptadas ao uso de cor- rentes de gás produzidas por um ou mais processos industriais. Tais pro- 10 cessos incluem processos de fabricação de aço, particularmente processos que produzem uma corrente de gás tendo um teor de CO elevado ou um teor de CO acima do nível predeterminado (isto é, 5%). De acordo com tais modalidades, as bactérias acetogênicas são preferivelmente utilizadas para produzir ácidos e/ou alcoóis, particularmente etanol ou butanol, em um ou 15 mais biorreatores. Aqueles versados na técnica estarão cientes consideran- do a presente descrição que a invenção pode ser aplicada a várias indústrias ou correntes de gás residual, incluindo aquelas de veículos com um motor de combustão interno. Além disso, aqueles versados na técnica estarão ci- entes considerando a presente descrição que a invenção pode ser aplicada 20 a outras reações de fermentação incluindo aquelas utilizando os mesmos ou micro-organismos diferentes. É, portanto, pretendido que o escopo da in- venção não esteja limitado às modalidades e/ou aplicações particulares des- critas, porém é em vez disso para ser entendido em um sentido mais amplo; por exemplo, a fonte da corrente de gás não é limitante, exceto que pelo 25 menos um componente do mesmo seja utilizável para alimentar uma reação de fermentação. A invenção tem aplicabilidade particular para melhorar a captura de carbono total e/ou produção de etanol e outros alcoóis de subs- tratos gasosos tais como gases de exaustão de automóvel e gases de com- bustível industrial contendo CO em volume elevado.

Fermentação

Os processos para a produção de etanol e outros alcoóis de substratos gasosos são conhecidos. Os processos exemplares incluem a- queles descritos, por exemplo, em W02007/117157, W02008/115080, US 6.340.581, US 6.136.577, US 5.593.886, US 5.807.722 e US 5.821.111, ca- da dos quais está incorporado aqui por referência.

Várias bactérias anaeróbicas são conhecidas por serem capazes de realizar a fermentação de CO para alcoóis, incluindo n-butanol e etanol, e ácido acético, e são adequadas para uso no processo da presente invenção. Os exemplos de tais bactérias que são adequadas para uso na invenção incluem aquelas do gênero Clostridium, tais como cepas de Clostridium Ijungdahlii, incluindo aquelas descritas em WO 00/68407, EP 117309, Paten- tes dos Estados Unidos Nos. 5.173.429, 5.593.886, e 6.368.819, WO 98/00558 e WO 02/08438, Clostridium carboxydivorans (Liou e outros, Inter- national Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: pp 2085- 2091), Clostridium ragsdalei (W0/2008/028055) e Clostridium autoethano- genum (Abrini e outros, Archives of Mierobiology 161: pp 345-351). Outras bactérias adequadas incluem aquelas do gênero Moorella, incluindo Moorel- Ia sp HUC22-1, (Sakai e outros, Biotechnology Letters 29: pp 1607-1612), e aquelas do gênero Carboxydothermus (Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G. e outros (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260). Outros exemplos incluem Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Ruminococcus produetus, Acetobaeterium woodii, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Oxobacter pfennigii, Methanosarcina bar- keri, Methanosarcina acetivorans, Desulfotomaculum kuznetsovii (Simpa e outros, Criticai Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26. Pp41-65). Além dis- so, deve ser entendido que outras bactérias anaeróbicas acetogênicas pos- sam ser aplicáveis à presente invenção como seria entendido por uma pes- soa de experiência na técnica. Também será apreciado que a invenção possa ser aplicada a uma cultura misturada de duas ou mais bactérias.

Um micro-organismo exemplar adequado para uso na presente invenção é Clostridium autoethanogenum. Em uma modalidade, o Clostridi- um autoethanogenum é um Clostridium autoethanogenum tendo as caracte- rísticas de identificação na cepa depositada no Centro de Recursos Alemão para Material Biológico (DSMZ) sob o número de depósito de identificação 19630. Em outra modalidade, o Clostridium autoethanogenum é um Clostri- dium autoethanogenum tendo as características de identificação de DSMZ número de depósito DSMZ 10061.

A cultura das bactérias utilizadas nos métodos da invenção pode ser conduzida utilizando qualquer número de processos conhecidos na téc- nica para cultivar e fermentar substratos utilizando bactérias anaeróbicas. As técnicas exemplares são fornecidas na seção de "Exemplos" abaixo. Por modo de outros exemplos, aqueles processos geralmente descritos nos se- guintes artigos utilizando substratos gasosos para fermentação podem ser utilizados: (i) Κ. T. Klasson, e outros (1991). Biorreators for synthesis gas fermentaçãos resources. Conservation and Recycling, 5; 145-165; (ii) Κ. T. Klasson, e outros (1991). Biorreator design for synthesis gas fermentaçãos. Fuel. 70. 605-614; (iii) Κ. T. Klasson, e outros (1992). Bioconversion of syn- thesis gas into Iiquid or gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J. L. Vega, e outros (1989). Study of Gaseous Substrate Fermentação: Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Cultu- re. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793; (v) J. L Vega, e outros (1989). Study of Gaseous Substrate fermentaçãos: Carbon Monoxide conversion to acetate. 1. Batch culture. Biotechnology and Bioengineering. 34. 6. 774-784; (vi) J. L Vega, e outros (1990). Design of Biorreators for Coal Synthesis Gas Fermen- taçãos. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160; todos dos quais estão incorporados aqui por referência.

A fermentação pode ser realizada em qualquer biorreator ade- quado, tal como um reator de tanque agitado contínuo (CSTR), um reator de 25 célula imobilizado, um reator de sustentação de gás, um reator de coluna de bolha (BCR), um reator de membrana, tal como um Biorreator de Membrana de Fibra Oco (HFMBR) ou um reator de leito de escoamento (TBR). Além disso, em algumas modalidades da invenção, o biorreator pode compreen- der um primeiro, fator de crescimento no qual os micro-organismos são culti- 30 vados, e um segundo, reator de fermentação, ao qual o caldo de fermenta- ção do reator de crescimento é alimentado e no qual a maioria do produto de fermentação (por exemplo, etanol e acetato) é produzida. De acordo com várias modalidades da invenção, a fonte de car- bono para a reação de fermentação é um substrato gasoso contendo CO. O substrato pode ser um gás residual contendo CO obtido como um subprodu- to de um processo industrial, ou de alguma outra fonte tal como de fumaças 5 de escape de automóvel. Em certas modalidades, o processo industrial é selecionado do grupo consistindo em fabricação de produtos de metal ferro- so, tal como moinho de aço, fabricação de produtos não ferrosos, processos de refinamento de petróleo, gaseificação de carvão, produção de força elé- trica, produção de negro de fumo, produção de amônia, produção de meta- 10 nol e fabricação de coque. Nestas modalidades, o substrato contendo CO pode ser capturado do processo industrial antes de ser emitido na atmosfe- ra, utilizando qualquer método conveniente. Dependendo da composição do substrato contendo CO, pode também ser desejável tratá-la para remover qualquer impureza indesejada, tal como partículas de poeira antes de intro- 15 duzi-la na fermentação. Por exemplo, o substrato gasoso pode ser filtrado ou esfregado utilizando métodos conhecidos.

Alternativamente, os substratos contendo CO podem ter origem da gaseificação de biomassa. O processo de gaseificação envolve combus- tão parcial de biomassa em um fornecimento restrito de ar ou oxigênio. O 20 gás resultante tipicamente compreende principalmente CO e H2, com volu- mes mínimos de CO2, metano, etileno e etano. Por exemplo, os subprodu- tos de biomassa obtidos durante a extração e processamento de gêneros alimentícios tal como açúcar de cana de açúcar, ou amido de milho e grãos, ou resíduos de biomassa não alimentícios gerados pela indústria florestal 25 podem ser gaseificados para produzir um gás contendo CO adequado para uso na presente invenção.

O substrato contendo CO tipicamente conterá uma proporção principal de CO, tal como pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% de CO em volume, de 40% a 95% de CO em volume, de 60% a 90% de CO em vo- 30 lume, e de 70% a 90% de CO em volume. Em modalidades particulares, o substrato compreende 25%, ou 30%, ou 35%, ou 40%, ou 45%, ou 50% de CO em volume. Os substratos tendo concentrações menores de CO, tal como 6%, podem também ser apropriados, particularmente quando H2 e CO2 estão também presentes.

Ao mesmo tempo em que não é necessário para o substrato conter qualquer hidrogênio, a presença de H2 não deveria ser prejudicial a 5 formação de produto de acordo com os métodos da invenção. Em modali- dades particulares, a presença de hidrogênio resulta em uma eficiência total melhorada de produção de álcool. Por exemplo, em modalidades particula- res, o substrato pode compreender relação de até 2:1, ou 1:1, ou 1:2 de H2:C0. Em outras modalidades, a corrente de substrato compreende con- 10 centrações baixas de H2, por exemplo, menor do que 5%, ou menos do que 4%, ou menos do que 3%, ou menos do que 2%, ou menos do que 1%, ou é substancialmente livre de hidrogênio. O substrato pode também conter al- gum CO2, por exemplo, tal como cerca de 1 % a cerca de 80% de CO2 em volume, ou 1 % a cerca de 30% de CO2 em volume.

Tipicamente, o monóxido de carbono será adicionado à reação

de fermentação em um estado gasoso. Entretanto, os métodos da invenção não estão limitados a adição do substrato neste estado. Por exemplo, o mo- nóxido de carbono pode ser fornecido em um líquido. Por exemplo, um líqui- do pode ser saturado com um gás contendo monóxido de carbono e aquele 20 líquido adicionado ao biorreator. Isto pode ser obtido utilizando tecnologia padrão. Por modo de exemplo um gerador de dispersão de microbolha (Hensirisak e outros Scale-up of microbubble dispersion generator for aero- bicfermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Nú- mero 3 / Outubro, 2002) pode ser utilizado para este propósito.

Será apreciado que para crescimento das bactérias e fermenta-

ção de CO para álcool ocorrer, além do substrato contendo gás CO, um meio nutriente líquido adequado necessitará ser alimentado pelo biorreator. Um meio nutriente contém vitaminas e minerais suficientes para permitir o crescimento do micro-organismo utilizado. Os meios anaeróbicos adequa- 30 dos para a fermentação de etanol utilizando CO como a única fonte de car- bono são conhecidos na técnica. Por exemplo, os meios adequados são descritos nas Patentes US Nos. 5.173.429 e 5.593.886 e WO 02/08438, W02007/115157 e W02008/115080 referidos acima. A presente invenção fornece um novo meio que aumentou a eficácia no apoio ao crescimento dos micro-organismos e/ou produção de álcool no processo de fermentação. Este meio será descrito em maiores detalhes a seguir.

A fermentação desejavelmente deve ser realizada sob condições

apropriadas para que a fermentação desejada ocorra (por exemplo, CO para etanol). As condições de reação que devem ser consideradas incluir pres- são, temperatura, taxa de fluxo de gás, taxa de fluxo de líquido, pH médio, potencial redox médio, taxa de agitação (se utilizando um reator de tanque 10 agitado contínuo), nível de inóculo, concentrações de substrato de gás má- ximas para garantir que CO na fase líquida não fique limitante, e concentra- ções máximas do produto para evitar a inibição do produto. As condições adequadas são descritas em W002/08438, W007/117157 e W008/115080.

As condições de reação ideais dependerão parcialmente do mi- 15 cro-organismo particular utilizado. Entretanto, em geral, é preferido que a fermentação seja realizada em pressão maior do que a pressão ambiente. A operação em pressões aumentadas permite um aumento significante na taxa de transferência de CO da fase de gás para a fase líquida onde ele pode ser absorvido pelo micro-organismo como uma fonte de carbono para a produ- 20 ção de etanol. Isto sucessivamente significa que o tempo de retenção (defi- nido como o volume líquido no biorreator dividido pela taxa de fluxo de gás de influxo) pode ser reduzido quando os biorreatores são mantidos em pres- são elevada exceto pressão atmosférica.

Além disso, uma vez que uma taxa de conversão de CO para 25 etanol é em parte uma função do tempo de retenção do substrato, e obtendo um tempo de retenção desejado sucessivamente dita o volume requerido de um biorreator, o uso de sistemas pressurizados pode grandemente reduzir o volume do biorreator requerido, e consequentemente o custo de capital do equipamento de fermentação. De acordo com os exemplos dados na Paten- 30 te U.S. No. 5.593.886, o volume do reator pode ser reduzido na proporção linear para aumentar na pressão operacional do reator, isto é biorreatores operados em 10 atmosferas de pressão necessitam ser somente um décimo do volume daqueles operados em 1 atmosfera da pressão.

Os benefícios de conduzir uma fermentação de gás para etanol em pressões elevadas também foram descritos em outro lugar. Por exem- plo, WO 02/08438 descreve fermentações de gás para etanol realizadas sob 5 pressões de 206,85 kPa (30 psig) e 517,1 IkPa (75 psig), determinando pro- dutividades de etanol de 150 g/l/dia e 369 g/l/dia respectivamente. Entretan- to, descobriu-se que as fermentações exemplares realizadas utilizando mei- os similares e composições de gás de influxo em pressão atmosférica pro- duzem entre 10 e 20 vezes menos etanol por litro por dia.

É também desejável que a taxa de introdução do substrato con-

tendo CO gasoso seja tal como para garantir que a concentração de CO na fase líquida não fique limitante. Isto é porque uma conseqüência de condi- ções limitadas a CO pode ser que o produto de etanol é consumido pela cul- tura. Recuperação do Produto Os produtos da reação de fermentação podem ser recuperados

utilizando métodos conhecidos. Os métodos exemplares incluem aqueles descritos em W007/117157, W008/115080, US 6.340.581, US 6.136.577, US 5.593.886, US 5.807.722 e US 5.821.111. Entretanto, resumidamente e por modo de exemplo somente o etanol pode ser recuperado do caldo de 20 fermentação por métodos tal como evaporação ou destilação fracional, e fermentação extrativa.

A destilação de etanol de um caldo de fermentação produz uma mistura azeotrópica de etanol e água (isto é, 95% de etanol e 5% de água). O etanol anidroso pode subsequentemente ser obtido através do uso de tec- nologia de desidratação de etanol de peneira molecular, que é também bem conhecido na técnica.

Os procedimentos de fermentação extrativa envolvem o uso de um solvente miscível em água que apresenta um baixo risco de toxicidade ao organismo de fermentação, para recuperar o etanol do caldo de fermen- 30 tação diluído. Por exemplo, o álcool de oleíla é um solvente que pode ser utilizado neste tipo de processo de extração. O álcool de oleíla é continua- mente introduzido em um fermentador, no qual este solvente enxagua for- mando uma camada no topo do fermentador que é continuamente extraído e alimentado através de uma centrífuga. A água e as células são então facil- mente separadas do álcool de oleíla e retornadas para o fermentador ao mesmo tempo em que o solvente carregado de etanol é alimentado em uma 5 unidade de vaporização rápida. A maioria do etanol é vaporizada e conden- sada ao mesmo tempo em que o álcool de oleíla não é volátil e é recuperado para reutilização na fermentação.

Acetato, que é produzido como um subproduto na reação de fermentação, pode também ser recuperado do caldo de fermentação utili- zando os métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um sistema de ab- sorção envolvendo um filtro de carvão ativado pode ser utilizado. Neste ca- so, é preferido que as células microbianas sejam primeiro removidas do cal- do de fermentação utilizando uma unidade de separação adequada. Nume- rosos métodos com base em filtração de geração de um caldo de fermenta- ção livre de célula para recuperação de produto são conhecidos na técnica. O permeado contendo etanol e acetato livre de célula é em seguida passado através de uma coluna contendo carvão ativado para absorver o acetato. Acetato na forma de ácido (ácido acético) em vez da forma de sal (acetato) é mais facilmente absorvido por carvão ativado. É, portanto, preferido que o pH do caldo de fermentação seja reduzido para menos do que cerca de 3 antes de ser passado através da coluna de carvão ativado, para converter a maioria do acetato para a forma de ácido acético.

O ácido acético absorvido pelo carvão ativado pode ser recupe- rado por eluição utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o 25 etanol pode ser utilizado para eluir o acetato ligado. Em certas modalidades, o etanol produzido pelo processo de fermentação propriamente dito pode ser utilizado para eluir o acetato. Por que o ponto de ebulição de etanol é 78,8 0C e aquele do ácido acético é 107 0C, o etanol e o acetato podem facilmen- te ser separados de cada outro utilizando um método com base na volatili- 30 dade tal como destilação.

Outros métodos para recuperar o acetato de um caldo de fer- mentação são também conhecidos na técnica e podem ser utilizados nos processos da presente invenção. Por exemplo, as Patentes dos U.S. Nos. 6.368.819 e 6.753.170 descrevem um sistema de solvente e cossolvente que pode ser utilizado para extração de ácido acético de caldos de fermen- tação. Assim como com o exemplo do sistema com base em álcool de oleíla 5 descrito para a fermentação extrativa de etanol, os sistemas descritos nas Patentes U.S. Nos. 6.368.819 e 6.753.170 descrevem um solven- te/cossolvente imiscível em água que podem ser misturados com o caldo de fermentação ou na presença ou na ausência dos micro-organismos fermen- tados para extrair o produto de ácido acético. O solvente/cossolvente con- 10 tendo o produto de ácido acético é em seguida separado do caldo por desti- lação. Uma segunda etapa de destilação pode em seguida ser utilizada para purificar o ácido acético do sistema de solvente/cossolvente.

Os produtos da reação de fermentação (por exemplo, etanol e acetato) podem ser recuperados do caldo de fermentação continuamente 15 removendo-se uma porção do caldo do biorreator de fermentação, separan- do-se as células microbianas do caldo (convenientemente por filtração), e recuperando-se um ou mais produtos do caldo simultaneamente ou seqüen- cialmente. No caso de etanol, ele pode ser convenientemente recuperado por destilação, e acetato pode ser recuperado por adsorção em carvão ati- 20 vado, utilizando os métodos descritos acima. As células microbianas sepa- radas são preferivelmente retornadas para o biorreator de fermentação. O permeado livre de célula restante após o etanol e acetato ter sido removido é também preferivelmente retornado para o biorreator de fermentação. Os nutrientes adicionais (tal como vitaminas B) podem ser adicionados ao per- 25 meado livre de célula para substituir o meio de nutriente antes de ser retor- nado para o biorreator. Além disso, se o pH do caldo foi ajustado como des- crito acima para realçar a absorção de ácido acético pelo carvão ativado, o pH deve ser reajustado para um pH similar para aquele do caldo no biorrea- tor de fermentação, antes e ser retornado para o biorreator.

Determinação de Fixação de Carbono na Fermentação

Ao determinar uma proporção de CO convertido para C02, um sistema de modelagem foi concebido para prever o perfil de produção de produtos para uma bactéria de metabolização de CO. Uma vez que o grau de oxidação nos produtos difere dependendo se as bactérias estão sinteti- zando alcoóis ou ácidos orgânicos, a proporção de carbono nas bactérias que estão se dedicando à solventogênese pode ser prevista com base na 5 estequiometria dos processos químicos subjacentes. A análise e/ou quanti- ficação do grau de subprodutos oxidados (C02) eficazmente fornece uma indicação em tempo real da conversão de produto total por uma cultura mi- crobiana:

O sistema modela o estado do reator como sendo um compósito 10 de um ou mais estados "ideais" com calculado da estequiometria subjacente. O sistema de modelagem designa uma amostra de gás específica em um compromisso de "melhor ajuste" entre dois estados primários e uma condi- ção de modificação que gera duas reações híbridas secundárias dependen- do do hidrogênio disponível, e dois estados terciários.

Os estados primários são:

Fixação de monóxido de carbono ao ácido acético 2CO + 2H2 —> CH3COOH (uma relação de C02/C0 de O)

Fixação de monóxido de carbono para etanol

3C0 + 3H2 —► CH3CH2OH + CO2 (uma relação de C02/C0 de

0,3333)

Na ausência de gás de hidrogênio livre, ambas destas reações primárias são suplementadas por uma reação de desvio de água-gás;

CO + H2O -> H2+ CO2

Pode-se assumir que este desvio de água-gás ocorre simultane- amente com fixação de carbono quando a fixação de carbono é realizada na ausência de hidrogênio livre.

A combinação do desvio de água-gás com as duas reações pri- márias produz um par de rações híbridas secundárias que ocorrem na au- sência de gás de hidrogênio livre.

Fixação de monóxido de carbono ao ácido acético na ausência

ou hidrogênio livre

4C0 + 2H20 —> CH3COOH + 2C02 (uma relação de C02/C0 de 0,5)

Fixação de monóxido de carbono ao etanol na ausência de hi- drogênio livre

6CO + 3H20 —» CH3CH2OH + 4C02 (uma relação de C02/C0 de

0,6667).

Adicionalmente houve dois estados terciários potenciais;

Redução de ácido acético pata etanol

CH3COOH + 2CO + H2O —> CH3CH2OH + 2C02 (uma relação de C02/C0 de 1)

Oxidação de etanol para ácido acético

CH3CH2OH + H2O -»· CH3COOH + 2H2 (uma relação de C02/C0

de 0)

Ao observar a relação de C02(produzido)/C0{consumido), o estado da cultura pode ser deduzido e seu rendimento do produto calculado. Em uma 15 cultura com 100% de carácter de consumo de hidrogênio, a relação vai vari- ar entre Oe 1/3. Isto pode ser representado graficamente como uma função linear com a equação y = 1/3x. Em uma cultura com 100% de desvio de ca- rácter de água-gás, a relação variará entre 1/2 e 2/3, que pode provavelmen- te ser representado graficamente como uma função linear com a equação y 20 = 2/3x + 0,5.

Quando o consumo de hidrogênio é insignificante, a primeira função linear pode eficazmente ser ignorada para propósitos de modelagem e resolvendo-se somente a segunda equação, utilizando o valor de C02/C0 observado, o valor x calculado será uma proporção de carbono direcionada 25 na produção de etanol. A subtração do CO2 total liberado do carbono total absorvido determinará o carbono disponível para fixação, multiplicando-se isto pela proporção previamente calculada determina o carbono fixo previsto como etanol. Uma vez que dois átomos de carbono são fixados em uma molécula de etanol, este valor deve ser reduzido na metade para converter o 30 Mol de entrada de carbono em Mol de saída de etanol.

Quando o consumo de hidrogênio não é insignificante, porém é insuficiente para completar fixação de carbono em produtos e/ou material celular, nem relação de C02/C0 nem a quantidade de hidrogênio podem ser utilidades para diretamente inferir no estado da cultura. A produção de eta- nol de hidrogênio ocupa uma continuidade entre

3CO + 3H2 -» CH3CH2OH + CO2 (uma relação de C02/C0 de 5 0,3333) e 2CO + 2H2 CH3COOH (uma relação de C02/C0 de 0)

Ambos utilizam CO e H2 em uma relação de 1:1. Sem saber a posição nesta continuidade ocupada pela porção de consumo de hidrogênio da cultura microbiana, o influxo relativo de CO2 pelos micro-organismos de consumo de hidrogênio é desconhecido. Uma relação de CO2ZCO total pre- cisa não pode ser calculada sem saber o CO2 produzido pelo desvio de á- gua-gás subjacente utilizando a população, e cuja figura não pode ser calcu- lada sem primeiro precisamente saber a relação de CO2ZCO dos consumido- res de hidrogênio e a quantidade relativa de CO2 que eles estão produzindo. Entretanto, isso pode ser contornado considerando-se que em um estado de consumo de hidrogênio, o consumo de H2 eqüivale ao consumo de CO e a segunda equação do estado pode também ser uma relação de C02/H2, re- presentada como um valor z exceto um valor x; y = 2/3x + 0,5 e

y= 1/3z

Entretanto, sem uma terceira equação para ligar x e z, a equa- ção simultânea não pode ser resolvida. Porque o estado da cultura pode alterar, esta terceira equação; y = ax + bz é de fato, variável, como é para ser esperado dado que o grau ao qual uma cultura produz acetato ou etanol durante o urso de uma fermentação, altera com as condições.

Na circunstância que uma cultura estava totalmente consumindo hidrogênio, ambas as relações de C02/C0 e C02/H2 seriam iguais, uma vez que o consumo de CO seria 1:1 com o consumo de hidrogênio. A partir disto pode ser inferido que uma linha traçada entre um ponto calculado com a re- 30 lação de CO2ZCO e a relação de C02/H2 tenderá para horizontal quando o carácter de consumo de hidrogênio da população microbiana aumenta, e que a intercepção de z do eixo seria diretamente proporcional a uma propor- ção de carbono sendo fixo em etanol quando a linha ficou totalmente hori- zontal, como em um estado de alimentação de hidrogênio, CO2 é produzido em uma base de 1:1 com etanol.

A partir desta informação, uma aproximação pode ser adiciona- 5 da para permitir que a terceira equação "híbrida" seja calculada.

O gradiente de uma linha entre a relação de C02/C0 e C02/H2 é utilizado para designar uma pesagem para a intercepção z desta linha híbri- da; se esta linha for horizontal, o gradiente ([C02/C0]/[C02/H2]) seria 1, indi- cando uma cultura de consumo de hidrogênio puro, na qual toda a produção 10 de etanol foi proveniente de consumidores de hidrogênio, significando que a única equação a se considerar é a equação de hidrogênio.

Como esta linha se move para longe da horizontal, seu gradiente ([C02/C0]/[C02/H2]) tenderá para zero. Utilizando isto como um valor de pesagem multiplicativo para multiplicar pela intercepção z, a quantidade infe- 15 rida de CO2 (e etanol) produzida pelos consumidores de hidrogênio prova- velmente tenderá para zero quando as linhas entre as relações C02/C0 e C02/H2 se movem para cada vez mais longe da horizontal.

A intercepção z multiplicada com o fator de pesagem derivado de gradiente produz uma aproximação do CO2 total produzido pelos micro- 20 organismos de consumo de hidrogênio, e o CO consumido pelos consumido- res de hidrogênio serão 1:1 com o consumo de hidrogênio, e este valor pode então ser substituído em para resolver a equação y = 1/3x. O CO consumi- do e CO2 produzido por micro-organismos de consumo de hidrogênio podem ser subtraídos da produção e consumo total para produzir o CO e CO2 res- 25 tante que a população de desvio de água-gás é responsável por, e a relação deste restante pode ser substituída em para resolver a equação y = 2/3x + 0,5. Desse modo a proporção de carbono fixo em um produto particular, tal como ácido(s) e/ou álcool(s) pode ser determinada.

Aqueles versados na técnica apreciarão que uma quantidade de CO e opcionalmente H2 consumido e C02 produzido pode ser monitorada continuamente ou em pontos de tempo discretos como desejado. Qualquer meio conhecido na técnica pode ser utilizado para determinar uma quantida- de de C02, CO e H2; entretanto em uma modalidade da invenção, a croma- tografia de gás (GC) é utilizada para medir a quantidade de C02, CO e H2 presente em uma corrente de exaustão saindo de um biorreator. A propor- ção de carbono fixo como álcool e/ou ácido pode ser calculada se a compo- 5 sição da corrente de substrato que entra no biorreator for conhecida. Se a composição da corrente de substrato for desconhecida, uma outra cromato- grafia de gás pode ser utilizada para determinar a composição. Outros mei- os para determinar a quantidade de C02 produzido e o substrato consumido inclui espectroscopia de massa (MS), GCMS sensores internos.

Desse modo, de acordo com a invenção, a proporção de carbo-

no fixo como um produto particular tal como acetato e/ou etanol pode ser determinada medindo-se o C02 produzido, CO consumido e opcionalmente H2 consumido. É reconhecido que a taxa na qual o substrato (por exemplo, CO e opcionalmente H2) se torna disponível para uma cultura microbiana 15 pode afetar a proporção relativa de produtos bem como a taxa na qual eles são produzidos. Por exemplo, o aumento de fornecimento de substrato para uma cultura de produção de acetato pode aumentar a proporção de carbono direcionada para a produção de álcool.

Um substrato compreendendo CO e opcionalmente H2 é tipica- mente fornecido na forma gasosa e a disponibilidade de CO e H2 para uma cultura microbiana será dependente das propriedades de transferência de massa do sistema de fermentação. Por exemplo, a disponibilidade de CO e/ou H2 para uma cultura microbiana suspensa em um caldo de fermentação é dependente de fatores conhecidos por aqueles versados na técnica inclu- indo temperatura, composição do caldo, taxa de fornecimento de gás, com- posição de gás, pressão de vapor de CO, pressão de vapor de H2, mistura. Desse modo, o aumento da disponibilidade de CO e/ou H2 para uma fer- mentação microbiana requer a melhora das propriedades de transferência de massa do sistema, tal como o aumento da taxa de fornecimento de subs- trato e/ou aumento da agitação de um biorreator mecanicamente agitado.

De acordo com os métodos da invenção, a eficiência da fermen- tação pode ser melhorada fornecendo-se o substrato compreendendo CO e opcionalmente H2 em ou para uma faixa ou nível ideal. Um nível ideal pode ser verificado com base no produto desejado da fermentação. Por exemplo, se álcool e crescimento microbiano são desejados, o substrato compreen- dendo CO e opcionalmente H2 pode ser fornecido tal que o carbono seja 5 predominantemente fixado como álcool, ao mesmo tempo em que uma por- ção é disponível para o crescimento microbiano. Por exemplo, um substrato compreendendo CO pode ser fornecido para uma cultura microbiana, tal que o crescimento microbiano e produção de álcool ocorram.

As condições, particularmente a taxa de fornecimento de subs- 10 trato e/ou concentrações de CO e H2 relativas, podem ser variadas até que o crescimento microbiano e produção de álcool sejam otimizados para a sa- tisfação do operador. Uma vez que a influência de cada série de reações de fixação de carbono em produtos pode ser determinada, o fornecimento de substrato pode ser ajustado para prender e/ou manter as condições desejá- 15 veis durante a fermentação. Por exemplo, é reconhecido que uma corrente de substrato pode compreender componentes de CO e/ou H2 flutuantes. Entretanto, utilizando os métodos da invenção, a produção líquida de produ- tos pode ser mantida em uma relação substancialmente constante ajustan- do-se o fornecimento de substrato.

Adicionalmente ou alternativamente, quando uma cultura micro-

biana cresce, ou a densidade microbiana flutua, o fornecimento de substrato pode ser alterado de acordo com os requerimentos de culturas microbianas com base na determinação de C02 produzido e CO e H2 consumido.

Neste respeito, a proporção de carbono direcionada para um 25 produto particular pode ser mantida substancialmente constante indepen- dente das alterações para o fornecimento de substrato e/ou densidade mi- crobiana. Em modalidades particulares da invenção, uma proporção de car- bono direcionado para um produto particular pode ser selecionado por um operador e as condições ajustadas para manter a proporção substancial- 30 mente constante. Por exemplo, se um operador requer 90% do carbono fi- xado ser direcionado para produção de etanol, o substrato pode ser forneci- da tal que a proporção não desvie para fora da faixa predeterminada, tal co- mo ±1%, ou ±2%, ou ±3%, ou ±4%, ou ±5%. Em modalidades particulares, o fornecimento de substrato pode ser controlado em resposta a determina- ção de uma proporção de carbono direcionado para um produto particular. Em modalidades particulares, o fornecimento de substrato é automaticamen- 5 te ajustado em resposta às alterações em uma proporção de carbono dire- cionado para um produto particular.

Em modalidades particulares, onde CO é fornecido na ausência de quantidades apreciáveis de H2, a relação de C02pr0duzido/C0consumido pode ser determinada. Em modalidades particulares da invenção, o crescimento 10 microbiano e produção de álcool podem ser otimizados quando o acetato é concomitantemente produzido. Como tal uma relação de C02produzido/C0consumido de <0,667, tal como aproximadamente 0,66, ou apro- ximadamente 0,65, ou aproximadamente 0,64, ou aproximadamente 0,63, ou aproximadamente 0,62, ou aproximadamente 0,61, ou aproximadamente 15 0,60, ou menos seria esperada. Alternativamente, o crescimento microbiano e produção de álcool podem ser ideais quando acetato é consumido. Como tal, uma relação de C02Produzido/COConSumido de >0,667, tal como aproximada- mente 0,67, ou aproximadamente 0,68, ou aproximadamente 0,69, ou apro- ximadamente 0,70, ou maior seria esperado.

Uma vez que uma faixa ou nível ideal foi determinado, a fer-

mentação, ou fermentações futuras podem ser operadas sob condições simi- lares, onde o substrato é fornecido tal que o carbono fixo experimentalmente determinado e/ou relação de C02produzido/C0c0nsumido é substancialmente mantido. Uma relação ideal de fermentação de um substrato compreenden- do CO e H2 pode ser similarmente determinada e aplicada.

Em uma modalidade adicional ou alternativa, o método pode ser utilizado para indicar quando e/ou como uma cultura microbiana pode ou deve ser transitada de uma conversão total líquida para outra. Por exemplo, como observado anteriormente, se o crescimento é o objetivo principal, en- 30 tão a cultura microbiana pode ser desejavelmente mantida tal que a maioria do carbono seja direcionada para a produção de acetato. Por exemplo, a corrente de substrato compreendendo CO e mínimo ou nenhum H2, a rela- ção de C02produzido/C0consumido é mantida em cerca de 0,5. Se a relação de C02Produzido/COConsumido desvia além da faixa predeterminada ou limiar, tal como aproximadamente 0,45-0,55, ou aproximadamente 0,48-0,52, um ajus- te pode ser feito à cultura e/ou a corrente de substrato para transição pelo 5 menos uma porção da cultura microbiana tal que a conversão líquida total pela cultura total seja como desejado. Por exemplo, transição da cultura tal que a relação de C02/C0 seja aproximadamente 0,5. Na presença de H2, ajustes equivalentes podem similarmente ser feito, tal que a fixação de car- bono permaneça substancialmente constante.

Em modalidades particulares da invenção, pelo menos uma por-

ção da cultura microbiana pode ser transitada fazendo-se um ajuste à cultura microbiana e/ou à corrente de substrato. Em certas modalidades, a fermen- tação anaeróbica é realizada em um biorreator, onde a cultura microbiana é pelo menos parcialmente suspensa em um caldo de fermentação compreen- 15 dendo um meio nutriente líquido. Em modalidades particulares, pelo menos uma porção da cultura microbiana pode ser transitada fazendo-se um ajuste ao caldo de fermentação e/ou meio nutriente líquido.

Em certas modalidades, o ajuste inclui um ou mais de: alterar o pH do caldo de fermentação; alterar o potencial redox do caldo de fermenta- 20 ção; alterar a concentração de CO do caldo de fermentação; alterar a con- centração de H2 do caldo de fermentação; alterar a composição da corrente de substrato; alterar a pressão da corrente de substrato; alterar a taxa de agitação do caldo de fermentação; remoção do produto; alterar a concentra- ção de ácido e/ou álcool do caldo de fermentação; alterar um ou mais nutri- 25 entes no meio nutriente líquido; altera a taxa de fornecimento de um ou mais nutrientes.

Adicionalmente ou alternativamente, se a produção de álcool for o objetivo principal então o substrato pode ser fornecido tal que substancial- mente todo o carbono seja fixado como etanol. Em modalidades particulares 30 onde nenhum H2 está disponível, a relação de C02produzido/COCOnsumido pode ser desejavelmente mantida em aproximadamente 0,667. Se a relação de C02pr0duzido/C0consumido desviar além de uma faixa predeterminada ou limiar, tal como 0,58-0,73 ou 0,63-0,7, um ajuste pode ser feito à cultura e/ou à cor- rente de substrato para a transição de pelo menos uma porção do cultura microbiana tal que a conversão líquida total pela cultura total seja como de- sejado, por exemplo, retornado para uma relação de C02pr0duzido/C0consumido 5 de aproximadamente 0,667.

Em uma modalidade adicional ou alternativa, uma cultura de produção de álcool mantida com uma relação de C02produzido/C0consumido de aproximadamente 0,667 pode ter quantidades significantes de acetato inde- sejado, por exemplo, acetato residual deixado de uma de crescimento ante- 10 rior. O acetato pode ser convertido para álcool por transição de pelo menos uma porção da redução de acetato para álcool (equação 3). Como tal, a cultura pode ser ajustada até que a relação de CO2pr0duzido/COC0nsumido au- mente acima de 0,667 até que a conversão desejada esteja completa.

A proporção de CO oxidado para C02 pode ser utilizada para 15 determinar a conversão líquida total de uma cultura microbiana. A quantida- de de CO consumido pela cultura também fornece um indicação da viabili- dade da cultura (captação específica: taxa de captação de CO/densidade de célula). Consequentemente, os métodos da invenção podem ser utilizados em combinação com o monitoramento de captação específico. Por exemplo, 20 se uma proporção de carbono fixo como um produto particular e/ou a capta- ção específica desviam de faixas ou limiares predeterminados, um ou mais ajustes podem ser feitos à cultura tal que a viabilidade e conversão desejada sejam mantidas. Em modalidades particulares, onde H2 é limitado ou está substancialmente indisponível, a captação de CO específica é esperada ser 25 pelo menos 0,5 mmol/grama de células microbianas de peso seco/minuto (mmol/g/min), tal como aproximadamente 0,6 mmol/g/min, tal como aproxi- madamente 0,7 mmol/g/min, tal como aproximadamente 0,8 mmol/g/min, tal como aproximadamente 0,9 mmol/g/min, tal como aproximadamente 1,0 mmol/g/min.

Neste respeito, uma proporção de carbono fixo como um produto

particular em combinação com a captação específica de CO pode ser utili- zada para determinar a taxa na qual os metabólitos desejados particulares, tais como ácidos e/ou alcoóis, são produzidos. Em modalidades particula- res, o método pode ser utilizado para melhorar a eficiência da fermentação microbiana otimizando-se (isto é, melhorando) a taxa na qual um ou mais produtos (tais como alcoóis) são produzidos. Por exemplo, a produção de 5 etanol pode ser melhorada fazendo-se um ou mais ajustes à cultura microbi- ana que aumenta a captação específica de CO ao mesmo tempo em que mantendo uma relação de C02pr0duzido/COConsumido de aproximadamente 0,667. Adicionalmente ou alternativamente, um ou mais ajustes podem ser feitos para aumentar a captação de CO e relação de C02pr0duzido/C0consumido 10 de (por exemplo) 0,5 a (por exemplo) 0,667 para melhorar a taxa de produ- ção de álcool.

Em modalidades particulares da invenção, a fermentação conti- nua de substratos compreendendo CO e opcionalmente H2 pode ser obtida durante períodos prolongados de pelo menos 2 dias, tais como pelo menos 3 15 dias, ou pelo menos 5 dias, ou pelo menos 1 semana, ou pelo menos 1 mês. A fermentação contínua inclui fornecer meios frescos a um caldo de fermen- tação e remover o caldo de fermentação contendo os produtos e células mi- crobianas para manter um volume caldo de fermentação substancialmente constante. Em modalidades particulares, as concentrações de produtos, 20 incluindo álcool(s) e opcionalmente ácido(s) e as células microbianas são mantidas substancialmente constantes no processo contínuo. Em modali- dades particulares da invenção, para manter uma fermentação contínua du- rante um período prolongado, a cultura microbiana fixa pelo menos uma por- ção de carbono como ácido, tal como acetato. O acetato pode ser produzido 25 em concentração menor do que 5g/L. Entretanto, de acordo com os métodos da invenção, a maioria do carbono fixado como álcool, tal como etanol, em excesso de 10g/L, ou 15g/L. Desse modo, para manter operação contínua, o substrato necessita ser fornecido tal que o carbono seja fixado como ace- tato, etanol e biomassa.

Em uma modalidade particular, a fermentação produzindo etanol

e pequenas quantidades de acetato continuamente durante um período pro- longado é mantida em uma faixa de relação de C02pr0duzido/C0consumido de aproximadamente 0,61-0,65; tal como entre 0,62-0,64. Uma tal relação de C02produzido/O0consumido garante que uma maioria de carbono fixado seja dire- cionado para a produção de álcool, ao mesmo tempo em que uma quantida- de menor está direcionada para acetato e material celular para manter o 5 crescimento microbiano, desse modo prolongando uma cultura contínua. Em modalidades particulares, o substrato é fornecido tal que a captação de CO específica seja mantida pelo menos 0,8mmol/g/min, tal como aproxima- damente 1,0 mmol/grama de massa de célula seca/minuto.

De acordo com outra modalidade, a fermentação não contínua 10 (batelada) pode ser conduzida tal que o álcool seja produzido sem produção de ácido concomitante. Em tais modalidades, o substrato é fornecido tal que o álcool e opcionalmente o material de célula (biomassa) sejam produzidos. De acordo com a invenção, o substrato é fornecido tal que uma relação de C02/C0 de aproximadamente 0,667 seja mantida. É reconhecido que 15 quando uma cultura microbiana cresce, uma quantidade de CO (e opcional- mente H2) exigiu aumentos. Entretanto, de acordo com a invenção, uma quantidade ideal de CO pode ser fornecida mantendo-se uma relação de C02/C0 quando a taxa de fornecimento de substrato aumenta.

Figura 1 é uma representação esquemática de um sistema 100, 20 de acordo com uma modalidade da invenção. A corrente de substrato 1 en- tra no biorreator 2 através de um conduto adequado 3. A corrente de subs- trato 1 compreende CO e opcionalmente C02 e/ou H2 e em certas modali- dades, a corrente de substrato é uma corrente de gás residual de um pro- cesso industrial, tal como a descarburização de aço. A corrente de substrato 25 1 pode ser uma corrente constante no sentido que é constantemente forne- cido, porém o teor da corrente pode variar com o passar do tempo. A com- posição da corrente de substrato, particularmente a concentração de CO e C02 pode ser conhecida, ou pode alternativamente ser determinada por meios de determinação opcionais (não mostrados).

Biorreator 2 é configurado para realizar a reação de fermentação

desejada para produzir os produtos. De acordo com certas modalidades, o biorreator 2 é configurado para converter CO em produtos incluindo um ou mais ácidos e/ou alcoóis. O biorreator 2 pode compreender mais do que um tanque, cada tanque configurado para realizar a mesma reação e/ou está- gios diferentes em um processo de fermentação particular e/ou reações dife- rentes, incluindo reações diferentes para fermentações diferentes que po- 5 dem incluir um ou mais estágios comuns.

Os produtos produzidos no biorreator 2, tais como ácidos e/ou alcoóis, podem ser recuperados por qualquer processo de recuperação co- nhecido na técnica.

Os componentes da corrente de substrato que são não consu- midos na reação de fermentação e qualquer subproduto da reação de fer- mentação, tal como C02, sai do biorreator 2 através da saída de escapa- mento 4. Em modalidades particulares da invenção, os meios de medição 5 são adaptados para determinar a concentração de CO, C02 e opcionalmen- te H2 na corrente exaurida que sai do biorreator 2 através da saída de esca- pamento 4. Em modalidades particulares, a proporção de carbono direcio- nado para ácido(s) e/ou álcool(s) pode ser determinada de uma quantidade de CO, C02 e H2 fornecido para e a quantidade que sai do biorreator 2. Consequentemente, um operador pode opcionalmente fazer ajustes a cultu- ra microbiana no biorreator 2 e/ou à corrente de substrato 1 utilizando meios de ajuste 6 para manter a cultura microbiana em, ou transição da cultura pa- ra um estado desejado de produção. Os ajustes para manter ou transitar a cultura incluem um ou mais de: alterar o pH do caldo de fermentação; alterar o potencial redox do caldo de fermentação; alterar a concentração de CO do caldo de fermentação; alterar a concentração de H2 do caldo de fermenta- ção; alterar a composição da corrente de substrato; alterar a pressão da cor- rente de substrato; taxa de agitação do caldo de fermentação; remoção do produto; alterar a concentração de ácido e/ou álcool do caldo de fermenta- ção; alterar um ou mais nutrientes no meio nutriente líquido; alterar a taxa de fornecimento de um ou mais nutrientes. Adicionalmente ou alternativa- mente, o sistema 100 inclui meios de processamento opcionais 7 adaptados para determinar uma proporção de carbono direto para os produtos particu- lares e controlar os meios de ajuste 6, tal que a cultura possa ser mantida em ou transitada para um estado desejado.

Em modalidades particulares, o C02, H2 e CO que entra e/ou que sai do biorreator 2 podem ser monitorados continuamente ou em ponto de tempo discreto e a fixação de carbono determinada. Além disso, os mei- os de ajuste 6 podem ser configurados para fazer ajustes contínuos ou ajus- tes em pontos de tempo discretos se necessário.

Qualquer meio para determinar a relação de C02produzido/C0c0nsumido pode ser utilizado, entretanto em modalidades parti- culares, uma ou mais cromatografia de gás é utilizada para determinar as 10 concentrações de C02 e CO da corrente que sai do biorreator 2 e opcional- mente corrente de substrato 1. Em uma modalidade, os meios para deter- minar as concentrações de CO e C02 na corrente que sai do biorreator 2 é um Varian micro GC CP-4900.

EXEMPLOS

Materiais e Métodos (Exemplos 1 e 2):_

Solução A NH4Ac 3,083g KCI 0,15g MgCI2.6H20 0,61g NaCI 0,12g CaCI2.2H20 0,294g Água Destilada Upa 1L Solução(ões) B Componente/ Solu¬ Quantidade/ml Componente/ Solu¬ Quantida¬ ção a 0,1 M (aq) em meios de ção a 0,1 M (aq) de/ml em 1L meios de 1L FeCI3 10 ml Na2MoO4 1ml CoCI2 5 ml Na2WO4 1ml NiCI2 5 ml ZnCI2 1ml H3BO3 1 ml MnCI2 1ml Na2SeO3 1 ml Solução C Biotina 20,0 mg Cálcio D-O- 50,0 mg Ácido Fólico 20,0 mg Piridoxina.HCI 10,0 mg Vitamina B12 50,0 mg Tiamina.HCI 50,0 mg Ácido p- 50,0 mg Aminobenzoico Riboflavina 50,0 mg Ácido Tióctico 50,0 mg Ácido nicotínico 50,0 mg água destilada Para 1 Litro Solução(ões) D Componen¬ Quantida¬ Componen¬ Quantida¬ te/solução a 0,1 M de/m L em 1L te/solução a 0,1 M de/ml em 1L (aq) de meio (aq) de meio FeCI3 2,5 ml Na2MoO4 0,25 ml CoCI2 1,25 ml Na2WO4 0,25 ml NiCI2 1,2 ml ZnCI2 0,25 ml H3BO3 0,25 ml MnCI2 0,25 ml Na2SeO3 0,25 ml Preparação de Meios (Exemplo 1 e 2):

O meio foi preparado como segue: 85% de H3PO4 (20mmols) foi adicionado a uma solução de 1L de solução A. O pH do meio foi ajustado para 5,3 pela adição de uma solução a 5M de NaOH. Os sais de metal fo- 5 ram em seguida opcionalmente adicionados de acordo com a solução(s) B. A solução do veículo foi esterilizada por autoclavagem durante 30 minutos a 1210C, ou por esterilização do filtro antes do uso. Resazurina foi adicionado como um indicador redox e 10ml de Solução e vitamina-B (solução C) foi adicionado.

Preparação de Na2Sx

Um frasco de 500ml foi carregado com Na2S (93,7g, 0,39mol) e 200ml de H2O. A solução foi agitada até que o sal tenha dissolvido e enxo- fre (25g, 0,1 mol) tenha sido adicionado sob fluxo de N2 constante. Após 2 horas de agitação em temperatura ambiente, a solução de "Na2Sx" (aproxi- 15 madamente 4M com respeito a [Na] e aproximadamente 5M com respeito a [S]), agora um líquido marrom avermelhado claro, foi transferido em garrafas de soro purgadas de N2, embrulhado em folha de alumínio. Materiais e Métodos Exemplos 3,4 e 5:

Solução A NH4Ac 3,083g CaCI2.2H20 0,294g MgCI2.6H20 0,61g KCI 0,15g Água Destilada Upa 1L Solução(ões) B Componente Mol/L de H20 Componente Mol/L de H20 FeCI3 0,1 Na2SeO3 0,01 CoCI2 0,05 Na2MoO4 0,01 NiCI2 0,05 ZnCI2 0,01 H3BO3 0,01 MnCI2 0,01 Solução C Biotina 20,0 mg Ácido nicotínico 50,0 mg Ácido Fólico 20,0 mg Cálcio D-O- 50,0 mg pantotenato Piridoxina.HCI 10,0 mg Vitamina B12 50,0 mg Tiamina.HCI 50,0 mg Ácido p- 50,0 mg Aminobenzoico Riboflavina 50,0 mg Ácido Tióctico 50,0 mg Água destilada Para 1 Litro Preparação de solução de Cr (II)

Um frasco de três gargalos de 1 L foi equipado com uma entrada e saída estreita de gás para permitir o funcionamento sob gás inerte e trans- 5 ferência subsequente do produto desejado em um frasco de armazenamento adequado. O frasco foi carregado com CrCI3.6H20 (40g, 0,15 mol), de grâ- nulos de zinco [20 malha] (18,3g, 0,28 mol), mercúrio (13,55g, 1mL, 0,0676 mol) e 500 mL de água destilada. Em seguida ao estímulo com N2 durante uma hora, a mistura foi aquecida a cerca de 80°C para iniciar a reação. Em 10 seguida a duas horas de agitação sob um fluxo de N2 constante, a mistura foi resfriada em temperatura ambiente e continuamente agitada durante ou- tras 48 horas tempo pelo qual a mistura de reação se transformou em uma solução azul intenso. A solução foi transferida em garrafas de soro purgado com N2 e armazenada na geladeira para uso futuro.

Bactérias: Clostridium autoethanogenum utilizado é aquele depositado no Centro de Recurso Alemão para Material Biológico (DSMZ) e alocado o nú- mero de acessão DSMZ 19630.

Amostra e Procedimentos Analíticos

As amostras do veículo foram tomadas do reator CSTR em in- tervalos durante períodos de até 20 dias. Cada vez que o veículo foi amos- trado cuidado foi tomado para garantir que nenhum gás fosse permitido en- tra ou escapar do reator.

HPLC:

Sistema de HPLC Agilent 1100 Series. Fase Móvel: Ácido Sulfú- rico a 0,0025N. Fluxo e pressão: 0,800 mL/min. Coluna: Alltech 10A; Catá- logo No. 9648, 150 x 6,5 mm, tamanho de partícula 5 μηη. Temperatura da coluna: 60°C. Detector: índice Refrativo. Temperatura do detector: 45°C.

Método para preparação de amostra:

400 pL da amostra e 50 pL de ZnSO4 a 0,15M e 50 pL de Ba(OH)2 a 0,15M são carregados em um tubo Eppendorf. Os tubos são cen- trifugados durante 10 min em 12.000rpm, 4°C. 200 pL do sobrenadante são transferidos em um frasco de HPLC, e 5pL são injetados no instrumento de HPLC.

Análise de Topo Livre:

As medições foram realizadas em um micro GC Varian CP-4900 com dois canais instalados. Canal 1 foi uma coluna de peneira molecular de 10m funcionando a 70°C, 200kPa de argônio e um tempo de contrafluxo de 25 4,2s, ao mesmo tempo em que o canal 2 foi uma coluna PPQ de 10m fun- cionando a 90°C, 150kPa de hélio e nenhum contrafluxo. A temperatura do injetor para ambos canais foi 70°C. Os tempos de funcionamento foram fi- xados para 120s, porém todos os picos de interesse geralmente eluiriam antes de 100s.

Exemplo 1: Fermentação em batelada em CSTR

1,5 litros da solução do veículo contendo solução(s) B foi assep- ticamente e anaerobicamente transferidos em um vaso de CSTR de 2 L, e continuamente pulverizado com N2. Uma vez transferido para o vaso de fermentação, o estado de redução e pH do veículo transferido pode ser me- dido diretamente através das sondas. O veículo foi aquecido a 37°C e agi- tado em 300rpm. O veículo foi em seguida reduzido também para -130mV pela adição de solução de Cr(ll)cloreto a 0,3M.

Solução de polissulfeto (0,1% v/v, 1,5mL) foi adicionada à solu- ção, e um precipitado preto foi observado no veículo. Uma queda inicial no potencial para -300mV foi também observada, que estabeleceu para -150mV durante várias horas. N2 foi continuamente pulverizado através da solução em seguida a adição da solução de polissulfeto.

Antes da inoculação, o gás foi comutado para uma mistura pré- misturada de 70% de CO, 1% de H2, 15% de C02, e 14% de N2, que foi con- tinuamente pulverizada no caldo de fermentação por todo o experimento. Uma cultura de Clostridium autoethanogenum ativamente crescente foi ino- 15 culada no CSTR em um nível de aproximadamente 7,5% (v/v). Durante este experimento, o pH foi mantido em aproximadamente 5,5.

Resultados:

Uma comparação entre a produção de metabólito e a relação de C02pr0duzido/COconsumido pode ser vista na figura 1. Após um longo período durante o qual a cultura consumiu nenhuma quantidade significante de gás, consumo de gás e produção de metabólito começou após cerca de 5 dias.

Durante os primeiros três dias a relação de C02produzido/C0consumido permaneceu entre 0,55 e 0,62, um valor no qual o modelo implica etanol será produzido cocorrentemente com acetato; um au- mento em ambos etanol e acetato é observado através de análise de HPLC ao mesmo tempo.

No dia nove C02produzido/C0consumido apontaram para 0,66, um valor projetado pelo modelo para ser indicativo de quase toda a captação de carbono sendo direcionada na produção de etanol com pouca ou nenhuma 30 produção de acetato. A análise de HPLC deste mesmo dia mostra produção de etanol contínua pela cultura, porém o nivelamento dos níveis de acetato. Uma relação ligeiramente mais elevada indicaria o consumo de acetato, um evento observado ter ocorrido no período durante a noite entre os dias 11 e 12 de análise de HPLC quando a análise de topo livre de gás não foi realiza- da.

Nos dias 12 e 13, a relação se move mais próxima a 0,6, indi- 5 cando produção de etanol continuada com alguma produção de acetato; no- vamente, uma observação equiparada pelas medições de HPLC. A partir dos dias 14 até 16, a relação aumenta em mais de 0,667, indicando a produ- ção de etanol de consumo de acetato. Os dados de HPLC destes dias mos- tram acúmulo de etanol continuado, porém os níveis de acetato flutuantes, 10 com diminuições e aumentos menores. No dia 19 a relação caiu drastica- mente para menos de 0,5, sugerindo o consumo de etanol, com análise de HPLC durante o período mostrando uma redução em concentração de eta- nol. Após o dia 19 o consumo de gás pelo reator foi próximo de zero e a cultura foi prevista ser inativa.

Exemplo 2: Fermentação em batelada em CSTR

1,5 litros da solução do veículo sem a solução(s) B,foi assepti- camente e anaerobicamente transferido em um vaso de CSTR de 2L, e con- tinuamente pulverizado com N2. Uma vez transferidos para o vaso de fer- mentação, o estado de redução e pH do veículo transferido pode ser medido 20 diretamente através das sondas. O veículo foi aquecido a 37°C e agitado em 300rpm. O veículo foi em seguida reduzido também para -130mV pela adição de solução de Cr(ll)cloreto de 0,3M.

A solução de polissulfeto (solução a 3M, 1,0mL) foi adicionada a solução. Uma queda inicial no potencial para -220mV foi também observa- da, que estabeleceu para -IOOmV durante várias horas. Em seguida as 12 horas de pulverização contínua com N2, a solução(s) D foi adicionada à so- lução e o ORP ajustado para aproximadamente -200mV por adição de Cr(II).

Antes da inoculação, o gás foi comutado para uma mistura pré- misturada de 70% de CO, 1% de H2, 15% de C02, e 14% de N2, que foi con- tinuamente pulverizada no caldo de fermentação em todo o experimento. Uma cultura de Clostridium autoethanogenum ativamente crescente foi ino- culada no CSTR em um nível de aproximadamente 7,5% (v/v). Durante este experimento, o pH foi não externamente controlado.

Resultados:

Uma comparação entre a produção de metabólito e a relação de C02produzido/C0consumido pode ser vista na figura 2. Após um longo período durante o qual a cultura consumiu nenhuma quantidade significante de gás, o consumo de gás e produção de metabólito começou por volta do dia 3. Inicialmente o C02Produzido/COConsumido © observado ser muito elevado, na rea- lidade, acima de 1:1. Os valores calculados acima de 1:1 são tratados pelo modelo como sendo igual a 1:1. Uma relação desta sugere o consume ele- vado de acetato e produção de etanol. A análise de HPLC neste período de tempo mostrou uma diminuição correspondente nos níveis de acetato e um aumento em etanol. Entre o dia 5 e 9, a relação cai entre 0,6 e 0,5, indican- do que a produção de etanol cocorrente com a produção de acetato, de a- cordo com a análise de HPLC. Entre os dias 8 e 11 a relação de C02produzido/C0consumido cai para abaixo de 0,5, indicando o consumo de eta- nol. Nos dias 9 e 10 a análise de HPLC mostra uma queda na concentração de etanol. Após o dia 11 a relação aumenta para acima de 0,667, indicando que a produção de etanol do consumo de acetato, de acordo com a diminui- ção observada em acetato de análise de HPLC. Este consumo fica mais pronunciado nos dias 13 e 14, com um salto correspondente na relação aci- ma 1:1.

Durante o período do dia 15 ao dia 18, nenhum topo livre de gás foi realizado, embora a análise de HPLC mostre uma diminuição gradual nos níveis de etanol e um ligeiro aumento em acetato.

No dia 19 quando a análise de topo livre foi resumida, a relação

foi acima de 0,667, indicando a produção de etanol e consumo de acetato. A análise de HPLC mostrou que os níveis de etanol aumentaram acentua- damente durante o período onde nenhuma amostragem foi realizada, porém os níveis de acetato continuaram mais ou menos estáticos. Nenhuma outra coleção de dados foi realizada na cultura após o dia 20.

Exemplo 3: Fermentação em batelada em CSTR

O veículo foi preparado como segue: 85% de H3PO4 (45mmols) ο

foi adicionado a uma solução de 1,5L da solução A. O pH do veículo foi a- justado para 5,3 pela adição de uma solução a 5M de NaOH. A solução de veículo foi esterilizada por autoclavagem durante 30 minutos a 121 °C, ou por esterilização do filtro antes do uso. Resazurina foi adicionada como um indi- 5 cador redox. A solução do veículo foi assepticamente e anaerobicamente transferida em um vaso de CSTR de 1,5 L, e continuamente pulverizada com N2. Uma vez transferido para o vaso de fermentação, o estado de redução e o pH do veículo transferido pode ser medido diretamente através de sondas. O veículo foi aquecido a 37°C e agitado em 300rpm.

A solução de sulfeto de sódio (3,75mL de uma solução a 0,2M)

foi adicionada, seguida por ácido nitriloacético (1,5ml_ de uma solução a 0,1M), a solução B de metal de traço (1,5mL) Na2W04 (1,5ml_ de uma solu- ção a 0,01 M) em seguida a Solução C de vitamina B (15ml_). ORP da solu- ção foi ajustado para aproximadamente -200mV utilizando a solução de Cr(II).

Antes da inoculação, o gás foi comutado para uma mistura de 33% de H2, 23% de N2, 31% de CO, 13% de C02.

Uma cultura de Clostridium autoethanogenum ativamente cres- cente foi inoculada no CSTR em um nível de aproximadamente 10% (v/v). Durante este experimento, o pH foi mantido em aproximadamente 5,3 e a solução de Na2S foi adicionada em uma taxa de aproximadamente

0,16mMol/dia.

A agitação e fornecimento de gás foram aumentados durante o curso de tempo da fermentação em resposta às alterações na corrente de 25 gás que sai do biorreator. De acordo com os métodos da invenção, a pro- porção de carbono direcionada para álcool foi mantida em um nível elevado mantendo-se um ponto de ruptura maior do que 70% porém menor do que 100%. A captação de CO, H2 e ponto de ruptura são exibidos na figura 4, ao mesmo tempo em que o crescimento microbiano e produção de metabóli- 30 to são mostrados na figura 5. Mantendo-se o fornecimento de substrato de um nível para promover a produção de álcool, nenhum acetato é produzido, ao mesmo tempo em que o etanol e a biomassa se acumulam rapidamente. Exemplo 4: Fermentação em batelada em CSTR

0 veículo foi preparado como segue: 85% de H3PO4 (45mmols) foi adicionado a uma solução de 1,5L da solução A. O pH do veículo foi a- justado para 5,3 pela adição de uma solução a 5M de NaOH. A solução do 5 veículo foi esterilizada por autoclavagem durante 30 minutos a 121 °C, ou por esterilização de filtro antes do uso. Resazurina foi adicionado como um indi- cador redox. A solução de veículo foi assepticamente e anaerobicamente transferida para dentro de um vaso CSTR de 1,5 L, e continuamente pulveri- zada com N2. Uma vez transferido para o vaso de fermentação, o estado de 10 redução e pH do veículo transferido podem ser medidos diretamente através das sondas. O veículo foi aquecido a 37°C e agitado em 300rpm.

A solução de sulfeto de sódio (3,75mL de uma solução a 0,2M) foi adicionada, seguido por ácido nitriloacético (1,5mL de uma solução a

0,1M), solução B de metal traço B (1,5mL) Na2W04 (1,5ml_ de uma solução a 0,01 M) em seguida solução C de Vitamina B (15ml_). ORP da solução foi ajustado para aproximadamente -200mV utilizando a solução de Cr(II).

Antes da inoculação, o gás foi comutado para uma mistura de 50% de CO e 50% de N2, que foi continuamente pulverizado no caldo de fermentação em todo o experimento. Uma cultura de Clostridium autoetha- 20 nogenum ativamente crescente foi inoculada no CSTR em um nível de apro- ximadamente 10% (v/v). Durante a fermentação, o pH foi mantido em apro- ximadamente 5,3 e a solução de Na2S foi adicionada em uma taxa de apro- ximadamente 0,16mMol/dia.

A agitação e o fornecimento de gás foram aumentados durante o 25 curso de tempo da fermentação em resposta às alterações na corrente de gás que sai do biorreator. De acordo com os métodos da invenção, a rela- ção de C02produzido/C0consumido foi mantida em aproximadamente 0,667 tal que substancialmente todo o carbono seja direcionado para a produção de álcool. A captação de CO e relação de C02produzido/C0c0nsumido são exibidas 30 na figura 6, ao mesmo tempo em que o crescimento microbiano e produção de metabólito são mostrados na figura 7. Mantendo-se o fornecimento de substrato em um nível para promover a produção de álcool, nenhum acetato é produzido, ao mesmo tempo em que o etanol e a biomassa se acumulam rapidamente.

Exemplo 5: Fermentação Contínua em CSTR

Um CSTR de 2L foi configurado sob as seguintes condições: Ve- ículo foi preparado como segue: 85% de H3PO4 (30 mM) foi adicionado a 1,5 de solução A. O pH do veículo foi ajustado para 5,3 pela adição de NH40H. A solução de veículo foi esterilizada por autoclavagem durante 30 minutos a 121 °C, ou por esterilização do filtro antes do uso. Resazurina foi adicionada como um inicador redox. A solução de veículo foi assepticamente e anaero- bicamente transferida em um vaso de CSTR de 1,5 L, e continuamente pul- verizada com N2. Uma vez que transferido para o vaso de fermentação, o estado de redução e o pH do veículo transferido podem ser medidos direta- mente através de sondas. O veículo foi aquecido a 37°C e agitado a 300rpm, em seguida a solução B de metal traço incluindo 0,3Mol/L de ácido nitriloacético (1,5mL), em seguida Na2W04 (1,5ml_ de uma solução a

0,01 M) m seguida Solução C (15mL) foram adicionados. Antes da inocula- ção, o gás foi comutado para 2% de H2, 28% de N2, 48% de CO, e 22% de C02. Uma cultura de Clostridium autoethanogenum ativamente crescente foi inoculado no CSTR em um nível de aproximadamente 10% (v/v). Duran- 20 te este experimento, a solução de Na2S (0,2M) foi adicionada em uma taxa de aproximadamente 0,3ml/hora.

A cultura microbiana foi permitida crescer no modo de batelada durante aproximadamente 1 dia. No dia 1, a fermentação foi comutada para operação contínua onde o veículo fresco foi fornecido para obter uma taxa de diluição de aproximadamente 1 a 1,8. O fornecimento de substrato foi aumentado em resposta aos requerimentos da cultura microbiana.

Os resultados da fermentação são mostrados na figura 8. A taxa de fornecimento de substrato e taxa de agitação foram aumentados ou dimi- nuídos durante o curso de tempo da fermentação em resposta às alterações 30 na proporção de CO convertido para C02. De acordo com a invenção, a operação contínua sustentável foi obtida mantendo-se uma relação de C02/C0 de aproximadamente 0,62-0,64. A operação continua sustentável resultou em uma biomassa estável de aproximadamente 3g/L, concentração de acetato substancialmente estável de aproximadamente 5g/L e concentra- ção de etanol substancialmente estável de pelo menos 10g/L. A captação de CO específico pela cultura microbiana foi mantida aproximadamente 5 1,0mmol/g/min.

Exemplo 6: Profético

A fermentação de um substrato compreendendo CO por uma cultura microbiana carboxidotrófica compreendida em meio nutriente líquido, onde as condições (tal como aquelas bem conhecidas na técnica) promovem o crescimento rápido da cultura com produção concomitante de acetato. Sob tais condições, a relação de C02pr0duzido/C0consumido idealmente será mantida em aproximadamente 0,5. Entretanto, em um estágio quando um operador deseja comutar a cultura de produção de acetato para produção de álcool, um ou ajustes podem ser feitos. Em modalidades particulares, o pH do meio nutriente líquido pode ser diminuído tal que pelo menos uma porção da cultura microbiana seja transitada para um estado onde o álcool é produ- zido. Quando a transição desejada é feita a relação de C02Produzido/COconsumido aumentará para aproximadamente 0,667. Em outra modalidade, no lugar de manualmente alterando o pH, o ajuste pode ser rea- Iizado cessando-se o controle do pH tal que a cultura microbiana pudesse sozinha regular o pH.

Exemplo 7: Profético

A fermentação de um substrato compreendendo CO por uma cultura microbiana carboxidotrófica em meio nutriente líquido, onde as con- 25 dições (tais como aquelas bem conhecidas na técnica) promovem a produ- ção de álcool. Sob tais condições, a relação de C02Produzido/COConsumido ide- almente será mantida em aproximadamente 0,667. Entretanto, se a relação de C02pr0duzido/C0consumido desvia deste valor, por exemplo caindo para apro- ximadamente 0,5, um ou mais ajustes podem ser feitos para aumentar a re- 30 lação de volta para o valor ideal. Por exemplo, o componente de hidrogênio da corrente de gás pode ser aumentado tal que a produção de álcool seja promovida. A invenção foi descrita aqui com referência a certas modalidades preferidas, para permitir que o leitor pratique a invenção sem experimenta- ção indevida. Aqueles versados na técnica apreciarão que a invenção seja susceptível às variações e modificações diferentes daquelas especificamen- 5 te descritas. Deve ser entendido que a invenção inclui todas tais variações e modificações. Além disso, títulos, cabeçalhos, ou similares são fornecidos para melhorar a compreensão do leitor deste documento, e não deve ser interpretado como limitando o escopo da presente invenção. A descrição total de todos os pedidos, patentes e publicações citados acima e abaixo, se 10 algum, está aqui incorporada por referência.

A referência a qualquer técnica anterior nesta especificação não é, e não deve ser tomada como, um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão que aquela técnica anterior forma parte do conhecimento geral comum no campo de tentativa em qualquer país no mundo.

Em toda esta especificação e qualquer reivindicação que segue,

a menos que o contexto requeira de outro modo, as palavras "compreende", "compreendendo" e similares, devem ser consideradas em um sentido inclu- sivo quando opostas a um sentido exclusivo, isto é, no sentido de "incluir, porém não limitado a".

20

Claims

1. Método para melhorar a eficiência da fermentação microbiana de um substrato compreendendo CO e opcionalmente H2, o método incluin- do fornecer o substrato para uma cultura microbiana tal que uma primeira proporção de CO seja fixa como um ou mais produtos desejados incluindo ácido(s) e/ou álcool(s) e uma segunda proporção de CO é convertida para C02, onde a determinação da proporção de CO convertido para C02 é utili- zada para determinar a taxa de fornecimento de substrato para produção de um ou mais produtos desejados.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a taxa de fornecimento de substrato é ou: i. aumentado se a proporção de CO convertido para C02 for de- terminada ser abaixo de um faixa ou valor ideal; ou ii. diminuído se a proporção de CO convertido para C02 for de- terminada ser acima de uma faixa ou valor ideal; ou iii. mantido se a proporção de CO convertido para C02 for de- terminada ser substancialmente em uma faixa ou valor ideal.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que a taxa de fornecimento de substrato é automaticamente ajustada tal que a proporção de CO convertido para C02 seja mantida substancialmente em uma faixa ou valor ideal.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que H2 é substancialmente limitado (<5%).

5.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 4, em que o produto desejado é etanol.

6. Método para melhorar a eficiência da produção de um ou mais ácidos e/ou alcoóis por fermentação microbiana de um substrato compreen- dendo CO sob parâmetros operacionais predeterminados, o método incluin- do determinar uma proporção de carbono direcionada para um ou mais pro- dutos e dependendo da determinação, ou: i. fazendo um ajuste a um ou mais parâmetros operacionais, tal que uma proporção de carbono fixo como um produto desejado aumente; ou ii. mantendo os parâmetros operacionais, tal que uma proporção de carbono fixo como um produto desejado se manter substancialmente constante.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o parâme- tro operacional é selecionado de: pH do caldo de fermentação; potencial de redox do caldo de fermentação; concentração de CO do caldo de fermenta- ção; taxa de fornecimento de substrato, composição da corrente de substra- to; pressão da corrente de substrato; taxa de agitação do caldo de fermenta- ção; taxa de remoção do produto; concentração de ácido e/ou álcool do cal- do de fermentação; um ou mais nutrientes no meio nutriente líquido; taxa de fornecimento de um ou mais nutrientes.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que o pa- râmetro operacional é a taxa de fornecimento de substrato.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, em que a proporção de carbono fixo como um ou mais produtos é estabe- lecida determinando-se a proporção de CO convertido para C02.

10. Método, de acordo com as reivindicações 6 a 9, em que a proporção de carbono fixo como etanol é otimizada.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que etanol é produzido continuamente.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que e- tanol é produzido sem a produção de acetato concomitante.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 12, em que o substrato compreendendo CO é gasoso.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que o subs- trato compreendendo um gás obtido como um subproduto de um processo industrial selecionado do grupo consistindo em fabricação de produtos de metal ferroso, fabricação de produtos não ferrosos, processo de refinamento de petróleo, gaseificação de biomassa, gaseificação de carvão, produção de 30 força elétrica, produção de negro de fumo, produção de amônia, produção de metanol e fabricação de coque.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, em que o substrato compreendendo CO, compreende pelo menos cerca de 15% a cerca de 100% de CO em volume.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, em que o substrato compreendendo CO, compreende pelo menos cer- ca de 40% a cerca de 70% de CO em volume.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que os micro-organismos são selecionados do grupo consistindo em Clostridium, Moorella, Pyrococcus, Eubacterium, Desulfobacteríum, Car- boxydothermus, Acetogenium, Acetobacterium, Acetoanaerobium, Butyriba- eeterium and Peptostreptococcus.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que o micro- organismo é Clostridium autoethanogenum.

19. Sistema para a fermentação microbiana de uma corrente de substrato compreendendo CO para produtos tais como ácido(s) e/ou álco- ol(s) compreendendo um biorreator contendo, em uso, uma cultura microbi- ana; meios de medição adaptados para determinar uma proporção de car- bono fixo como um produto particular e pelo menos um meio de ajuste adap- tado para fazer um ou mais ajustes à cultura microbiana e/ou à corrente de substrato.

20. Sistema, de acordo com a reivindicação 19, em que os mei- os de medição incluem pelo menos um meio adaptado para determinar a composição de uma corrente de escapamento que sai do biorreator e opcio- nalmente a corrente de substrato que entra no biorreator.

21. Sistema, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, em que os meios de ajuste são configurados para fazer um ou mais ajustes se os meios de determinação que determinam a proporção de carbono fixo como um produto desejado, desviaram de uma faixa ou valor predeterminado.

22. Sistema, de acordo com a reivindicação 21, em que os mei- os de ajuste são configurados para fazer ajustes por: alterar pH do caldo de fermentação; ou alterar o potencial redox do caldo de fermentação; ou alte- rar a concentração de CO do caldo de fermentação; ou alterar a concentra- ção de H2 do caldo de fermentação; ou alterar a composição da corrente de substrato; ou alterar a pressão da corrente de substrato; ou taxa de agitação do caldo de fermentação; ou remoção de produto; ou alterar a concentração de ácido e/ou álcool do caldo de fermentação; ou alterar um ou mais nutrien- tes no meio nutriente líquido; ou alterar a taxa de fornecimento de um ou mais nutrientes.

23. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, em que o sistema inclui meios de processamento adaptados para con- trolar um ou mais meios de ajuste, tal que um ou mais ajuste(s) possam ser feitos à cultura microbiana e/ou corrente de substrato se for determinado que a proporção de carbono fixo como um produto desejado desviou de uma fai- xa ou valor predeterminado.