CN102361989B - 醇的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过微生物发酵生产例如醇和酸的产物，特别是微生物发酵包含CO的底物。更特别地涉及改善微生物发酵产物效率的方法和系统。在具体实施方式中，本发明提供一种包括通过确定CO转变为CO2的比例的步骤从而获得所需产物最佳生产的方法。

Description

醇的生产方法
技术领域
本发明涉及提高通过微生物发酵气态底物的微生物生长效率以及产物产量的方法。更特别地，本发明涉及通过微生物发酵包含一氧化碳的气体生产醇尤其是乙醇的方法。在具体实施方式中，本发明涉及确定在微生物发酵中CO至产物的总净转化的方法。
背景技术
乙醇正迅速成为全球主要的富氢液体运输燃料。2005年，全球乙醇消费量约为122亿加仑。因为欧洲、日本、美国和多个发展中国家对乙醇的需求增长，预计乙醇燃料工业的全球市场在未来会继续急剧增长。
例如，在美国，乙醇被用于生产E10，其是含有10％乙醇的汽油混合物。在E10混合物中，乙醇成分作为补氧剂，以提高燃烧效率并降低空气污染物的产生。在巴西，乙醇作为汽油中混合的补氧剂以及单独作为纯燃料满足了约30％的运输燃料需求。此外，在欧洲，对温室气体(GHG)排放后果的环境方面的关注已促使欧盟(EU)对其成员国制订了消费可持续运输燃料例如生物乙醇的强制性目标。
绝大多数燃料乙醇通过传统的基于酵母的发酵工艺生产，所述工艺使用农作物来源的碳水化合物(例如甘蔗中提取的蔗糖或谷物中提取的淀粉)作为主要碳源。然而，这些碳水化合物原料的成本受其作为人类粮食或动物饲料的价格影响，并且种植产淀粉或产蔗糖的作物用于生产乙醇并非在所有地域都是经济上可持续的。因此，需要开发将低成本和/或更充足碳源转化成燃料乙醇的技术。
CO是有机材料例如煤炭或石油和石油衍生产品不完全燃烧时产生的主要的、免费的、富含能量的副产品。例如，据报道澳大利亚钢铁工业每年产生并向空气中释放超过500,000吨CO。
催化工艺可用于将主要由CO和/或CO和氢气(H2)组成的气体转化为多种燃料和化学品。也可以用微生物将这些气体转化为燃料和化学品。这些生物工艺虽然通常比化学反应慢，但与催化工艺相比具有多种优势，包括更高的特异性、更高的产量、更低的能量消耗和更大的耐毒性。
微生物以CO作为唯一碳源生长的能力于1903年首次发现。这后来被确定为利用自养生长的乙酰辅酶A(乙酰CoA)生化路径(也称为Woods-Ljungdahl路径和一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合成酶(CODH/ACS)路径)的生物的一种特性。已经表明，很多厌氧生物，包括一氧化碳营养生物、光合作用生物、产甲烷生物和产乙酸生物，均将CO代谢成多种最终产物，即CO2、H2、甲烷、正丁醇、乙酸盐和乙醇。当使用CO作为唯一碳源时，所有此类生物产生至少两种此类最终产物。
已证实厌氧细菌，例如梭菌属的细菌，通过乙酰CoA生化路径从CO、CO2、和H2生成乙醇。例如，从气体生成乙醇的达梭状杆菌(Clostridium ljungdahlii)的多个菌株在WO 00/68407、EP 117309、美国专利5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO 98/00558和WO 02/08438中有描述。也已知细菌菌种Clostridium autoethanogenum sp从气体生成乙醇(Abrini等，Archives of Microbiology 161，第345-351页(1994))。
但是，通过气体的微生物发酵制备乙醇的方法通常与乙酸盐和/或乙酸的副生产有关。由于可利用的一些碳被转化为乙酸盐/乙酸而不是乙醇，利用这种发酵方法制备乙醇的效率并不令人满意。除非乙酸盐/乙酸副产品可以被用于其他用途，否则这可能造成废物处理的问题。乙酸盐/乙酸通过微生物被转化成甲烷，可能形成温室气体(GHG)排放。
已知一些酶与微生物使用一氧化碳作为它们的唯一碳源和能量的能力有关，这些酶的活性需要金属辅助因子。活性需要金属辅助因子的重要的酶的例子包括一氧化碳脱氢酶(CODH)、以及乙酰-CoA合成酶(ACS)。
WO2007/117157、WO2008/115080、WO2009/022925、WO2009/058028、WO2009/064200、WO2009/064201和WO2009/113878的公开内容在此引作参考，它们公开了通过厌氧发酵用包含一氧化碳的气体生产醇特别是乙醇的方法。WO2007/117157中公开了将发酵方法副产物的乙酸盐转化为氢气和二氧化碳气体，氢气和二氧化碳之一或两者都可以用在厌氧发酵的方法中。WO2009/022925公开了pH和ORP在将包含CO的底物通过发酵转化为例如酸和醇的产物的方法中的作用。WO2009/058028公开了利用发酵工业废气生产例如醇的产物的方法。WO2009/064201公开了CO的载体以及在发酵中CO的使用。WO2009/113878公开了包含CO的底物在发酵中由酸至醇的转化。
已知，与常规的依赖糖生长的微生物相比，能够在含CO的气体中生长的微生物以更低的速率生长。从商业前景来看，在发酵方法中，以经济可行水平合成所要的产物，使微生物群体生长至有效的高细胞密度所需的时间，是影响该方法利润的重要操作成本。能够提高培养物的生长速度并因此减少细胞群体达到高细胞密度所需时间的技术可以帮助提高整个方法的商业可行性。
在发酵气体原料生产醇的方法中，确保对微生物生长和/或醇生产的合适条件，对保持最佳微生物生产和/或醇的生产率非常重要。例如，在发酵的最初起始，主要目的可能是微生物的生长。但是，当达到所需的微生物密度时，主要目的可能是醇的生产。理解整个发酵过程中产物谱是如何改变的，一旦发生改变，尤其是对应于操作件的改变能够允许操作者优化生产率。
满足特定的需求，例如快速生长和/或醇的生产，以最优水平或者在具体要求的最佳范围内提供包含CO和任选H2的底物也是挑战。例如，像在US7,285,402(该文献在此作为参考充分引用)中所公开的，CO过多导致CO抑制。此外，CO过少导致微生物生成和醇生产的代谢速率降低。
本发明的一个目的是提供一种方法，其以克服至少上述缺点的一种方式进行，或者至少向公众提供了一种有用的选择。
发明概述
本发明涉及经微生物发酵包含CO的底物，生产包括酸和/或醇的产物的方法，其中至少一部分微生物培养物中：
至少部分包含CO的底物转化为微生物生物质；和/或
至少部分包含CO的底物转化为酸；和/或
至少部分包含CO的底物转化为醇；和/或
酸和至少部分包含CO的底物转变为醇。
在一个实施方式中，所述微生物培养物中：
至少部分包含CO的底物转化为酸；和
至少部分包含CO的底物转化为醇。
在另一个实施方式中，所述微生物培生物中：
至少部分包含CO的底物转化为酸；和
至少部分包含CO的底物转化为醇；和
酸和至少部分包含CO的底物转化为醇。
在本发明的具体实施方式中，所述底物包含CO和H2。但是，根据本发明，在含有不充足的H2的情况下，总碳固定为细胞物质和/或产物的过程继续进行。在具体实施方式中，提供H2使得小于2∶1的H2∶CO通过培养物转变，例如大约1∶1；或者大约1∶2；或者大约1∶3；或者大约1∶4；或者大约1∶5；或者大约1∶10。在具体实施方式中，不提供H2。
在本发明的第一个方面，提供了一种改进包含CO和任选H2的底物的微生物发酵的效率的方法，该方法包括向微生物培养物提供所述底物使得第一部分的CO固定为一种或多种包括酸和/或醇的所需产物，并且使第二部分的CO转变为CO2。在具体实施方式中，确定CO转变为CO2的比例以确定用于生产一种或多种所需产物的底物供应速率。
在具体实施方式中，所述底物供应速率分别是：
i.如果确定CO转变为CO2的比例低于最佳值或者范围，提高底物供应速率；或者
ii如果确定CO转变为CO2的比例高于最佳值或者范围，降低底物供应速率；或者
iii.如果确定CO转变为CO2的比例基本处在最佳值或者范围，保持底物供应速率。
在具体实施方式中，所述底物供应速率自动调节使得CO转变CO2的比例基本维持在最佳值或者最佳范围。
在具体实施方式中，可以基于所需的发酵产物，实验性地确定最佳值和最佳范围。在具体实施方式中，其中醇是所需产物，提供底物使得至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％，或至少90％的碳固定为醇。同时或可选地，其中所需的产物是乙酸盐，可以提供底物使得至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％的固定的碳以乙酸盐固定。
在具体实施方式中，以所需产物固定的碳的比例能够基本保持不变。在具体实施方式中，以所需产物固定的碳的比例偏离预定范围，控制底物的供应使得所述比例回到预定范围。在具体实施方式中，所述预定范围是约1％、或者约±2％、或者约±3％、或者约±4％、或者约±5％。
在具体实施方式中，底物供应根据偏移预定范围的量而自动调节。
在本发明的第二个方面，提供了一种提高微生物发酵包含CO和任选H2的底物生产一种或多种酸和/或醇的效率的方法，其中至少部分微生物培养物通过以下转化而变化：
至少部分包含CO的底物转化为酸；或者
至少部分包含CO的底物转化为醇；或者
酸和至少部分包含CO的底物至醇；
将：
至少部分包含CO的底物转化为酸；或者
至少部分包含CO的底物转化为醇；或者
酸和至少部分包含CO的底物转化为醇。
在本发明的具体实施方式中，至少部分微生物培养物可以通过对微生物培养物和/或底物流作出调整而转变。在某些实施方式中，厌氧发酵在生物反应器中进行，其中微生物培养物至少部分悬浮在含有液体营养介质的发酵液中。在具体实施方式中，通过对发酵液和/或液体营养介质作出调整，至少部分微生物培养物能够被转变。
在某些实施方式中，调整包括下面的一种或多种：改变发酵液的pH；改变发酵液的氧化还原电势；改变发酵液的CO的浓度；改变底物流的组成；或者改变底物流的压力；调整发酵液的振荡速率；产物移出；改变发酵液中酸和/或醇的浓度；改变液体营养介质中的一种或多种营养物质；改变一种或多种营养物质的供应速率。
在本发明的具体实施方式中，包含CO的底物还含有H2。在一些实施方式中，所述调整可以包括改变发酵液中的H2的浓度和/或改变发酵液的CO∶H2比例。在某些实施方式中，包含CO和任选H2的底物是气态的。在某些实施方式中，所述调整包括改变生物反应器中的CO和H2的分压。
在本发明的具体实施方式中，所述方法包括确定CO转变为CO2的比例，使得能够确定微生物培养物的净转化。在具体实施方式中，微生物发酵的总的净转化是：
至少部分包含CO的底物转化为酸；或者
至少部分包含CO的底物转化为醇；或者
酸和至少部分包含CO的底物转化为醇。
在第三个方面，提供了一种在预定操作参数下，提高微生物发酵包含CO的底物以生产一种或多种酸和/或醇的效率的方法，该方法包括确定直接转化为一种或多种产物的碳的比例，并且根据确定的比例：
i.对一种或多种操作参数作出调整，使得固定为所需产物的碳的比例得到提高；或者
ii.保持操作参数，使得固定为所需产物的碳的比例保持充分不变。
在某些实施方式中，所述调整包括改变一种或多种以下操作参数：改变发酵液的pH；改变发酵液的氧化还原电势；改变发酵液的CO的浓度；改变底物供应的速率；改变底物流的组成；改变底物流的压力；警告发酵液的振荡速率；产物移出；改变发酵液中酸和/或醇的浓度；改变液体营养介质中的一种或多种营养物质；改变一种或多种营养物质的供应速率。
在本发明的具体实施方式中，包含CO的底物还含有H2。在某些实施方式中，所述调整可以包括改变发酵液中的H2的浓度和/或改变发酵液中的CO∶H2比例。在某些实施方式中，包含CO和任选H2的底物是气态的。在一些实施方式中，所述调整包括改变在生物反应器中的CO和H2的分压。
在第一个、第二个、第三个方面的具体实施方式中，所述提高效率的方法包括提高一种或者多种产物例如醇特别是乙醇的生成速率。
在本发明的第四个方面，提供了一种确定包含CO的底物的微生物发酵中的总净转化的方法，该方法包括确定被微生物营养物以具体产物固定的碳的比例。
在具体实施方式中，可以通过确定CO氧化为CO2的比例来确定以具体产物固定的碳的比例。
在具体实施方式中，在微生物发酵中的总净转化是：
至少部分包含CO的底物转化为酸；或者
至少部分包含CO的底物转化为醇；或者
酸和至少部分包含CO的底物转化为醇。
在具体实施方式中，CO转变为CO2的比例通过测量被微生物培养物消耗的CO和任选的H2以及微生物培养物生成的CO2来确定。
在第一个、第二个、第三个或者第四个方面的某些实施方式中，可以连续或者在离散的时间点，例如在作出调整之前或之后，充分地监测进入和/或排出生物反应器的CO、H2和/或CO2。在一些实施方式中，进入或排出生物反应器的CO、CO2和/或H2的量可以使用气相色谱进行监测。在具体实施方式中，气相色谱被用于确定CO转变为CO2的比例。在一个实施方式中，气相色谱采用微型GC操作。
应当了解部分微生物培养物可以涉及其它转化，但可以确定通过整个培养物的总净转化。在本发明的具体实施方式中，其中H2是非常有限的，例如其中底物流包含小于5％H2的实施方式；或者小于4％H2；或者小于3％H2；或者小于2％H2；或者小于1％H2。CO2生成/CO消耗的比例为0.5，表示包含CO的底物转化为酸和任选微生物细胞的净转化。CO2生成/CO消耗的比例为0.667，表明包含CO的底物转化为醇的净转化。CO2生成/CO消 耗为0.5-0.667，表明包含CO的底物转化为酸和醇和任选的微生物细胞的净转化。CO2生成/CO消耗的比例大于0.667，表明包含CO和酸的底物转化为醇的净转化。
应当了解在上述方面的大量实施方式中，至少部分微生物培养物可以使醇转化为酸和一氧化碳。但是，在具体实施方式中，厌氧发酵的结果导致包含CO的底物至产物的净转化。在其它实施方式中，其中CO2生成/CO消耗小于0.5，所述净转化是醇至酸以及CO2和/或H2O的还原，这是不希望看到的。
在本发明的第五个方面，提供一种使包含CO的底物流的微生物发酵生产产物例如酸和/或醇的系统，其包括含有微生物培养液的生物反应器；适于确定以具体产物固定的碳的比例的测量装置，以及至少一种适于对微生物培养物和/或底物流作出一种或多种调整的调节装置。
在具体实施方式中，所述测量装置包括至少一种适于确定排出生物反应器的排出流以及任选进入生物反应器的底物流的组成的装置。所述测量装置可以任选与处理装置相连以使以所需产物固定的碳的比例得以确定。在具体实施方式中，测量装置是气相色谱。
在某些实施方式中，如果测量装置确定以所需产物固定的碳的比例偏离预定值和范围时，所述调节装置被设定以作出一种或多种调整。在具体实施方式中，所述调节装置通过以下调整而设定：改变发酵液的pH；改变发酵液的氧化还原电势；改变发酵液的CO的浓度；改变发酵液的H2的浓度；改变底物流的组成；改变底物流的压力；发酵液的振荡速率；产物移出；改变发酵液中酸和/或醇的浓度；改变液体营养介质中的一种或多种营养物质；改变一种或多种营养物质的供应速率。
在具体实施方式中，所述系统包括适于控制一种或多种调节装置的操作装置，使得如果以所需产物固定的碳的比例被确定为偏离预定值和范围，一种或多种调节装置能够对微生物培养物和/或底物流作出一种或多种调整。在另一个实施方式中，所述系统可以包括对操作者的视觉或听觉的回馈，使得操作者能够人工控制调节装置。
在多个方面的具体实施方式中，所述底物包括作为工业工艺副产物的气体。在一些实施方式中，所述工业工艺选自由黑色金属产品生产、有色金属产品生产、石油炼制工艺、生物质气化、煤气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产组成的组中的工艺。在一个具体实施方式中，所述气体底物含有获自钢厂的气体。
在某些实施方式中，所述底物包含20％至100％体积的CO，例如40％至95％体积的CO，例如60％至90％体积的CO，例如70％至90％体积的CO。在具体实施方式中，所述底物包含25％，或者30％，或者35％，或者40％，或者45％，或者50％体积的CO。
底物中没有必要含有任何氢气，根据本发明的方法，H2的存在对产物的生成并无害处。在具体实施方式中，H2的存在导致改进的醇生产的总效率。所述气态底物也可以含有一些CO2，举例来说，例如大约1％至大约80％体积的CO2，或者1％至30％体积的CO2。
在多个方面的具体实施方式中，包含CO的底物是气态的。
在具体实施方式中，通过发酵方法生产的醇是乙醇。该发酵方法中也可以生产乙酸盐。
在具体实施方式中，发酵反应通过一种或多种一氧化碳营养细菌的菌株进行。优选地，所述一氧化碳营养细菌选自梭状芽胞杆菌(Clostridium)、穆尔氏菌(Moorella)、Carboxydothermus，例如Clostridiumautoethanogenum、Clostridium ljungdahlii、Clostridium ragsdalei、Clostridium carboxydivorans和Moorella thermoacetica。在具体实施方式中，所述一氧化碳营养细菌是Clostridium autoethanogenum。
虽然本发明已经大体上如上所定义，但是并不限于此并且也包括下面提供实施例的说明书中的实施方式。
附图的简要说明
本发明参考附图将会详细描述：
图1：是显示分批发酵包含CO的底物生产包括醇在内的产物时乙酸盐和乙醇生产以及CO2生成/CO消耗的变化的图。
图2：是显示分批发酵包含CO的底物生产包括醇在内的产物时乙酸盐和乙醇生产以及CO2生成/CO消耗的变化的图。
图3：根据本发明某些实施方式的包括确定CO2生成/CO消耗的比例的装置的系统示意图。
图4：显示实施例3中通过微生物培养物消耗的CO和H2的量的图。
图5：显示实施例3中代谢物的生成和微生物培养物的生长的图。
图6：显示实施例4中的微生物消耗的CO的量的图。
图7：显示实施例4中代谢物的生成和微生物培养物的生长的图。
图8：显示实施例5中的连续发酵的代谢物的生产。
发明详细描述
一氧化碳营养细菌例如Clostridium autoethanogenum通过大量不同的机理，同时地出乎意料地通过微生物发酵包含CO和任选H2的底物生产例如酸和醇的产物。已经令人出乎意料的意识到利用一氧化碳营养的微生物能够生成酸和醇而不伴随水的生成。在之前报道的包含CO和H2的底物的发酵，生成产品例如醇和/或酸的被认为伴随水的生成。但是，出乎意料的意识到，当提供的H2对于将碳完全固定为细胞物质和产物例如醇和/或酸是不足的时，发酵进行而不伴随水的生成。在具体实施方式中，当H2和CO被微生物培养物以小于2∶1的H2∶CO比例消耗时，提供的H2对于将碳完全固定是不足的；例如大约1∶1；或者大约1∶2；或者大约1∶3；或者大约1∶4；或者大约1∶5；或者大约1∶10。在具体实施方式中，在微生物培养物中基本没有H2。
不希望被理论所束缚，产物例如乙酸盐和乙醇的生产同时通过下面至少一种，或者至少两种，或者至少三种或者所有机理：
1.一氧化碳至乙酸的固定
2CO+2H2→CH3COOH
2.一氧化碳至乙醇的固定
3CO+3H2→CH3CH2OH+CO2
3.乙酸至乙醇的还原
CH3COOH+H2→CH3CH2OH+CO2
4.乙醇至乙酸的氧化
CH3CH2OH+H2O→CH3COOH+2H2
合成代谢或者微生物细胞聚集的发生通常至少伴随机理1。但是，认为与其它代谢产物相比仅有小部分的碳是直接代谢。
此外，通过水-气变换反应(CO+H2O→CO2+H2)，微生物能有效的产生它们自己的H2。因此，根据A-C，也生产包括乙酸盐和乙醇的代谢产物：
A)4CO+2H2O→CH3COOH+2CO2
B)6CO+3H2O→CH3CH2OH+4CO2
C)CH3COOH+2CO+H2O→CH3CH2OH+2CO2
认识到微生物培养物是动态的，并且并不希望被理论所束缚，认为所述微生物培养物同时根据一种或多种1-3和A-C将包含CO和任选H2的底物的至少一部分转化为产物。因此，在动态的微生物培养物中，在系统中可能发生一些不同的机理导致CO至醇和/或酸的总净转化。为了确定CO如何代谢，需要确定H2的影响以及方程1-3相对于A-C的影响。一旦确定，通过确定生成的CO2和消耗的H2与CO，可以建立每个方程1-3和A-C的相对影响。
根据本发明的一个方面，提供通过微生物发酵包含CO的底物以生产例如酸和/或醇的产物的方法，其中至少部分微生物培养物中：
至少部分包含CO的底物转化为酸和微生物细胞；和/或
至少部分包含CO的底物转化为酸；和/或
至少部分包含CO的底物转化为醇；和/或
酸和至少部分包含CO的底物转化为醇。
令人惊奇的发现通过确定CO转化为CO2的比例，能够建立预测CO代谢细菌的产物谱(例如醇和/或酸)的模型系统。因为，产物的总氧化程度的不同取决于是否所述细菌是合成有机酸或醇，基于下面的化学步骤的化学计量比，可以预测细菌贡献于有机溶剂生成(例如醇的生产)的碳的比例。
理解体系中产物性质如何变化，使得可以调整或者改变体系的操作条件来加速所需产出，例如提高的醇生产。此外，在具体实施方式中，本发明提供一种提高微生物发酵包含CO的底物以生产包括醇和/或酸的产物的效率的方法，所述方法包括在最佳水平或者处在最佳范围提供底物。
在具体实施方式中，提供不含H2或有限量H2的CO，将会使1-3的影响最小化。当在底物流中的H2份额小于5％，例如小于4％，例如小于3％，例如小于2％，例如小于1％时，认为获得的H2是限量的。因此，根据y＝2/3x+0.5通过计算的CO2生成/CO消耗的比例，能够评价方程A-C的相对影响。在这样的实施方式中，方程A将给出0.5的比值，方程B将给出0.667的比值，方程C将给出＞0.667的比值，而方程4将给出＜0.5的比值。通过所述的计算值，可以确定每个方程的影响。
本发明也提供通过微生物发酵包含CO的底物以生产一种或者多种酸和/或醇的方法，其中至少部分微生物培养物通过以下转化被转变：
至少部分包含CO的底物转化为酸和微生物细胞；或者
至少部分包含CO的底物转化为酸；或者
至少部分包含CO的底物转化为醇；或者
酸和至少部分包含CO的底物转化为醇；
以将：
至少部分包含CO的底物转化为酸和微生物细胞；或者
至少部分包含CO的底物转化为酸；或者
至少部分包含CO的底物至醇；或者
酸和至少部分包含CO的底物至醇。
定义
除非另有定义，贯穿本说明书始末使用的下面术语定义如下：
术语“提高效率”，“提高的效率”等，当用于发酵方法时，包括但是并不限于，提高以下的一种或多种：催化发酵的微生物的生长率，消耗单位体积底物(例如一氧化碳)生成的期望产品(例如醇)的体积，所期望产品的生成速率或者生成水平，以及生成的产品与发酵的其他副产物的相对比例。
术语“包含一氧化碳的底物”及其类似用语应该理解为包括其中一氧化碳可被一种或多种细菌菌株生长和/或发酵所利用的任何底物，例如。
“包含一氧化碳的气态底物”包括任何包含一氧化碳的气体。气态底物通常含有相当比例的CO，优选至少约5％至约100％体积的CO。
在发酵产物的上下文中，此处所用的术语“酸”不仅包括羧酸也包括等同的羧酸盐，例如存在此处描述的发酵液中的游离的乙酸和乙酸盐混合物。发酵液中酸与羧酸盐的分子比例取决于体系的pH。术语“乙酸盐”不仅包括乙酸盐本身也包括游离的乙酸和乙酸盐分子的混合物，例如在这里描述的发酵液中乙酸盐与游离乙酸的混合物。在发酵液中的乙酸与乙酸盐的分子比例取决于体系的pH。
术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道设置组成的发酵设备，其包括连续搅拌反应釜(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气举发酵罐、膜反应器如中空纤维膜生物反应器(HFMBR)、静态混合器、或其它适合气液接触的容器或设备。
除非本文另有规定，本文所用的短语“发酵”、“发酵方法”或“发酵反应”等等，旨在强调包括该方法中的生长阶段和产品生物合成阶段。就像本文下面进行的描述，在一些实施方式中，生物反应器可以包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，向发酵反应中加入金属或组分应理解为包括向这些反应器中的一种或者二种同时加入。
本文所用的术语“总的净转化”等，表示在特定时间点，通过微生物培养物，使底物例如CO转化为产物包括酸和/或醇的转化。应当意识到在特定时间点微生物培养物的各部分可以对不同的参数有贡献，可以生成多种产物。此外，存在于发酵液中的一种或多种产物可以转化为其它产物。因此，总的净转化包括在任何特定时间点由微生物培养物生成的所有产物。
虽然下面的说明书描述了本发明的优选实施方式，即用CO作为初始底物生产乙醇和/或乙酸盐，应考虑到本发明可以适用于可选的醇和或酸的生产并且可选的底物的使用对于本领域普通技术人员来说是熟知的。例如，可以使用包含一氧化碳的气态底物和氢气。进一步地，本发明可以适于发酵以生产丁酸盐、丙酸盐、己酸盐、乙醇、丙醇和丁醇。该方法也可以用于生产氢气。作为例子，这些产品可以采用选自穆尔氏菌属(Moorella)、梭状芽胞杆菌属(Clostridia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、丁酸杆菌属(Butyribacterium)、醋菌属(Oxobacter)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、和脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)的微生物通过发酵进行生产。
本发明的某些实施方式适于使用在一种或多种工业工艺产生的气体流。所述工艺包括钢铁生产工艺，尤其生产具有高CO含量或者高于预定水平(即，5％)含量的CO的工艺。根据这样的实施方式，在一个或多个生物反应器中，产乙酸的细菌优选用于生产酸和/或醇，尤其是乙醇或者丁醇。本领域技术人员应该知道依据直接的公开，本发明可以应用在多种工业或者废气流中，包括那些使用内燃机的交通工具。而且，根据现有技术公开本领域技术人员知道，本发明可以应用在其它发酵反应包括那些使用相同或不同微生物的发酵反应。由此表示本发明的范围并不限于具体实施方式和/或申请所描述的，而是应该以更宽的意义上来理解本发明；例如，对于气体流的来源并没有限制，除此职位，至少一种组成适于给料至发酵反应。本发明对于从气态底物例如汽车排放尾气以及其它高体积CO含量的工业废气中提高总碳捕捉和/或乙醇和其它醇的生产具有特别的实用性。
发酵
由气态底物制备乙醇和其他醇的方法是已知的。示例性的方法包括WO2007/117157、WO2008/115080、US 6,340,581、US 6,136,577、US 5,593,886、US 5,807,722和US 5,821,111中所公开的，它们中的每个均引入本文作为参考。
已知多种厌氧细菌能够进行CO至醇类(包括正丁醇和乙醇)、以及CO至乙酸的发酵，且适用于本发明的方法。适用于本发明的这些细菌的例子包括梭菌属(Clostridium)的细菌，如Clostridium ljungdahlii菌株，包括那些在WO00/68407、EP 117309、美国专利5,173,429、5,593,88和6,368,819、WO 98/00558和WO 02/08438中公开的菌株；Clostridium carboxydivorans菌株(Liou等，International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33：第2085-2091页)，Clostridium ragsdalei(WO 2008/028055)和Clostridium autoethanogenum菌株(Abrini等，Archives of Microbiology 161：第345-351页)。其它适合的细菌包括穆尔氏菌属(Moorella)的细菌，包括穆尔氏菌属HUC22-1种(Sakai等，Biotechnology Letters 29：第1607-1612页)，以及氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus)的细菌(Svetlichny，V.A.等(1991)，Systematic and Applied Microbiology 14：第254-260页)。进一步的例子包括热乙酸菌(Moorella thermoacetica)、热自养梭菌(Moorellathermoautotrophica)、产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、Oxobacter pfennigii、Methanosarcina barken、Methanosarcina acetivorans、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)(Simpa等，Critical Reviews inBiotechnology，2006第26卷.第41-65页)。此外，本领域技术人员可将其它一氧化碳营养厌氧细菌用于本发明的方法。基于本发明的公开内容，还应该知道，两种或多种细菌的混合培养物可用于本发明的方法。
适用于本发明的一种示例性微生物为Clostridium autoethanogenum。在一个实施方式中，Clostridium autoethanogenum为具有德国生物材料资源中心(DSMZ)保藏号19630菌株的识别特征的Clostridium autoethanogenum。在另一个实施方式中，Clostridium autoethanogenum为具有DSMZ保藏号DSMZ 10061识别特征的Clostridium autoethanogenum。
对本发明方法中所用细菌的培养可采用任意数量的本领域已知的用于厌氧细菌培养和发酵底物的方法来进行。示例的技术在以下“实施例”部分提供。通过进一步举例的方式，可以使用在下述文章中一般性描述的利用气态底物进行发酵的方法：(i)K.T.Klasson等，(1991).Bioreactors for synthesis gas fermentatiohs resources.Conservation and Recycling，5；145-165；(ii)K.T.Klasson等，(1991)Bioreactor design for synthesis gas fermentatiohs.Fuel.70.605-614；(iii)K.T.Klasson等，(1992)Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels.Enzyme and Microbial Technology.14；602-608；(iv)J.L.Vega等，(1989)Study of Gaseous Substrate Fermentation：Carbon MonoxideConversion to Acetate.2.Continuous Culture.Biotech.Bioeng.34.6.785-793；(v)J.L.Vega等，(1989)Study of gaseous substrate fermentations：Carbon monoxide conversion to acetate.1.Batch culture.Biotechnology and Bioengineering.34.6.774-784；(vi)J.L.Vega等，(1990)Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations.Conservation and Recycling.3.149-160；所有上述文章通过参考纳入本文。
发酵可在任意合适的生物反应器中进行，例如连续搅拌反应釜(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、气举发酵罐、鼓泡床反应器(BCR)、膜反应器如中空纤维膜生物反应器(HFMBR)、或者滴流床反应器(TBR)。在本发明的某些实施方式中，生物反应器可以包括第一生长反应器，微生物在其中培养；以及第二发酵反应器，生长反应器中的发酵液被供给该发酵反应器并且在该发酵反应器中生成绝大多数发酵产品(例如乙醇和乙酸盐)。
根据本发明的不同实施方式，发酵反应的碳源是含有CO的气态底物。该气态底物可以是作为工业工艺中的副产品得到的含有CO的废气，或者从一些其它来源如汽车尾气中得到的含有CO的废气。在某些实施方式中，所述工业工艺选自黑色金属产品制造(如钢厂中进行的工艺)、有色产品制造、石油精炼工艺、煤炭气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产。在这些实施方式中，含有CO的气体可在其进入大气之前使用任意便捷的方法从工业工艺中捕捉。根据气态含有CO的底物的组成，还可能希望在对底物进行发酵之前对底物进行处理以除去任意不希望的杂质，如尘粒。例如，可采用公知的方法对气态底物进行过滤或洗涤。
可选地，包含CO的气体底物可以源自生物质的气化。气化的方法包括在有限供给的空气和氧气下生物质的不完全燃烧。得到的气体通常主要包含CO和H2，极少体积的CO2、甲醇、乙烯和乙醇。例如，在食品例如来自甘蔗的糖、或者来自玉米或谷物的淀粉的萃取和加工得到的生物质副产品或者林业工业产生的非食品生物质废料能够气化生成适于本发明的含CO的气体。
含有CO的底物通常包含相当比例的CO，如至少为20％到100％体积的CO、或者为40％到95％体积的CO、或者为60％到90％体积的CO、或者为70％到90％体积的CO。在具体实施方式中，底物包含25％，或者30％，或者35％，或者40％，或者45％，或者50％体积的CO。尤其当还存在H2和CO2时，含有更低浓度CO的气态底物，如6％，也是适宜的。
尽管气态底物中不必须含有氢，但在本发明的方法中氢的存在通常不会对产品形成造成不利的影响。在具体实施方式中，氢气的存在提高了醇的生产总效率。例如，在具体实施方式中，所述底物可以包含多至2∶1，或者1∶1，或者1∶2比例的H2∶CO。在其它实施方式中，底物流包括低浓度的H2，例如，少于5％，或者少于4％，或者少于3％，或者少于2％，或者少于1％，或者不含有H2。底物也可含有一些CO2，例如约1％至约80％、或者例如约1％至约30％体积的CO2。
通常，CO是以气态的形式加入到发酵反应中。然而，本发明并不局限于以这种状态加入底物。例如，可以以液体形式提供一氧化碳。例如，液体可以被含一氧化碳的气体饱和，然后将该液体加入生物反应器。这可通过标准方法实现。例如，微泡分布发生器(Hensirisak等，Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation；Applied Biochemistry and Biotechnology，第101卷，第3期，2002年10 月)用于该目的。
应该了解，为了细菌生长和CO至醇类发酵的发生，除了需要向生物反应器提供含有CO的底物气体，还需要提供合适的液体营养介质。营养介质中含有足以使所用微生物生长的维生素和矿物质。适于采用CO作为唯一碳源进行醇类发酵的厌氧介质是本领域已知的。例如，合适的介质在美国专利5,173,429和5,593,886和WO 02/08438、WO2007/115157、WO2008/115080中公开，参见上文。本发明提供一种新颖的介质，其在发酵方法中支持微生物生长和/或醇的生长的效力提高。该介质将在下文作详细描述。
理想地，发酵应在适于发生期望的发酵(例如CO至醇类的发酵)的适当条件下进行。应考虑的反应条件包括压力、温度、气流速率、液流速率、介质pH、介质氧化还原电位、振荡速率(如果使用连续搅拌反应釜)、接种水平、最大气体底物浓度(以确保液相中的CO不会成为限制性条件)、和避免产物抑制的最大产品浓度。合适的条件公开在WO02/08438、WO07/117157和WO08/115080中。
最佳反应条件部分地取决于所用的具体微生物。然而，通常发酵最好在高于环境压力的压力下进行。在提高的压力下进行操作可使CO从气相进入液相的速率显著增加，CO在液相中被微生物吸收作为碳源进行醇类生产。这也就意味着当生物反应器保持升高的压力而不是大气压力下时，能够减少停留时间(定义为生物反应器中的液体体积除以进气流速率)。
而且，因为给定的CO至醇类的转化速率在某种程度上是停留时间的函数，反过来，获得期望的停留时间意味着确定了生物反应器所需的容积，使用加压系统可大大减少生物反应器所需的容积，并因此降低发酵设备的成本。根据美国专利5,593,886中所举的例子，反应器容积可随反应器操作压力的增加呈线性比例减少，即在10个大气压下操作的生物反应器的体积仅为需要在1个大气压下操作的反应器体积的十分之一。
在升高的压力下进行气体至醇的发酵的好处也已在其它地方公开。例如，WO 02/08438公开了在压力30psig和75psig下进行的气体至醇的发酵，分别获得150g/l/天和369g/l/天的醇生产率。然而，发现采用相似的介质和进气组成在大气压下进行的示例性发酵每天每升生成的乙醇减少了10至20倍。
同样希望含有CO的气态底物的进入速率能保证液相中的CO浓度不会成为限制性条件。这是因为CO缺乏的后果是乙醇产品被培养物所消耗。
产品回收
可采用已知方法回收发酵反应的产品。示例的方法包括在W07/117157、WO08/115080、US 6,340,581、US 6,136,577、US 5,593,886、US 5,807,722和US 5,821,111中公开的方法。然而，简要地举例，乙醇可通过诸如分馏或蒸发、以及萃取发酵的方法从发酵液中回收。
对发酵液中的乙醇进行蒸馏产生乙醇和水(即95％醇和5％水)的共沸混合物。随后通过分子筛乙醇脱水技术可得到无水乙醇，该技术也为本领域所熟知。
萃取发酵步骤包括使用对发酵有机物具有低毒风险的水混溶性溶剂，从稀释的发酵液中回收乙醇。例如，油醇是可用于这类萃取工艺的溶剂。在这个工艺中，油醇被连续加入发酵罐，随后该溶剂上升在发酵罐上部形成一个层，该层被连续萃取并被送入离心机。水和细胞可轻易与油醇分离并返回发酵罐，而载有乙醇的溶剂被送入闪蒸单元。大部分乙醇被蒸发并冷凝，而非挥发性的油醇被回收并在发酵中重复使用。
也可用本领域已知的方法从发酵液中回收作为发酵反应副产物的乙酸盐。
例如，可用包括活性炭过滤器的吸附系统。在这种情况下，通常采用合适的分离单元首先从发酵液中去除微生物细胞。本领域已知很多用于形成无细胞发酵液以回收产物的基于过滤的方法。然后使上述无细胞的含有乙醇和乙酸盐的渗透液通过活性炭柱以吸附乙酸盐。乙酸盐在酸形式(乙酸)中比在盐形式(乙酸盐)中更易被活性炭吸附。因此最好在发酵液通过活性炭柱前将其pH降低到约小于3，从而将大部分乙酸盐转化为乙酸形式。
吸附至活性炭的乙酸可采用本领域已知的方法通过洗脱进行回收。例如，可用乙醇洗脱结合的乙酸盐。在某些实施方式中，发酵方法中生成的乙醇本身可用于洗脱乙酸盐。因为乙醇的沸点是78.8℃而乙酸的沸点是107℃，乙醇和乙酸盐可采用基于挥发性的方法(如蒸馏)被容易地彼此分离。
从发酵液中回收乙酸盐的其它方法也是本领域已知的且可用于本发明的方法中。例如，美国专利6,368,819和6,753,170公开了可用于从发酵液中提取乙酸的溶剂和共溶剂体系。如同上述进行乙醇萃取发酵的基于油醇的体系，美国专利6,368,819和6,753,170中描述的体系公开了与水不能混溶的溶剂/共溶剂，其能在发酵微生物存在或不存在下与发酵液混合从而萃取乙酸。然后，含有乙酸的溶剂/共溶剂通过蒸馏从发酵液中分离。接着，采用第二蒸馏步骤从该溶剂/共溶剂体系中纯化乙酸。
可通过如下步骤从发酵液中回收发酵反应的产品(例如乙醇和乙酸盐)：连续地从发酵生物反应器中移走部分发酵液，从发酵液中分离微生物细胞(通过过滤方便地分离)，并同时或之后从发酵液中回收一种或多种产品。采用上述方法，可通过蒸馏方便地回收乙醇，并可通过活性炭吸附回收乙酸盐。分离的微生物细胞优选地返回发酵生物反应器。除去乙醇和乙酸盐后留下的无细胞渗透液也可返回发酵生物反应器。在无细胞渗透液返回生物反应器之前，可向其中加入额外的营养物(如维生素B)以补充营养培养物。而且，在返回生物反应器之前，如果已经如上所述调节过该发酵液的pH以提高活性炭对乙酸的吸附，应重新调节pH至与发酵生物反应器中发酵液相似的pH。
确定在发酵中的碳固定
通过确定CO转化为CO2的比例，设计了一个模型系统来预测CO代谢细菌的产物谱的生产。由于产物氧化程度的改变取决于细菌是否合成有机酸或醇，基于下面的化学进程的化学计量比可以预测参与产生有机溶剂的细菌贡献的碳的比例。有效分析和/或定量氧化副产物(CO2)的程度，提供微生物培养物的总产物转化的实时指示：
所述系统以下面化学计量比计算的一种或多种“理想”状态的复合来模拟反应器的状态。所述模型系统将一个具体的气体样品指派为两个初级状态、模拟状态(取决于可利用的氢该模拟状态产生两个二级混合反应)、以及两个三级状态之间的“最合适”的折衷。
所述初级状态是：
一氧化碳固定为乙酸
2CO+2H2→CH3COOH(CO2/CO的比例为0)
一氧化碳固定为乙醇
3CO+3H2→CH3CH2OH+CO2(CO2/CO的比例为0.3333)
当不存在游离氢气时，这些初级反应都是辅以水-气-转化反应：
CO+H2O→H2+CO2
可以假定当碳固定在没有游离氢气存在的情况下进行时，所述水-气转化与碳固定同时发生。
在不存在游离氢气的情况下，水-气转化与两个一级反应的结合给出了一对二级混合反应的发生。
在不存在游离氢气时，一氧化碳固定为乙酸
4CO+2H2O→CH3COOH+2CO2(CO2/CO的比例为0.5)
不存在游离氢气时，一氧化碳固定为乙醇
6CO+3H2O→CH3CH2OH+4CO2(CO2/CO的比例为0.6667)
此外，还有两个潜在的三级状态：
乙酸至乙醇的还原
CH3COOH+2CO+H2O→CH3CH2OH+2CO2(CO2/CO的比例为1)
乙醇至乙酸的氧化
CH3CH2OH+H2O→CH3COOH+2H2(CO2/CO的比例为0)
通过观察CO2(生成)/CO(消耗)的比例，能够推断出培养物的状态并且得以计算气体产物的产量。在100％氢消耗特征的培养物中，所述比例在0至1/3之间变化。这可以绘制成具有方程y＝1/3x的线性函数。在具有100％水-气转化特性的培养物中，所述比例在1/2和2/3之间变化，这同样可以绘制成具有方程y＝2/3x+0.5的线性函数。
当氢气的消耗可以忽略时，为了模拟的目的，第一个线性函数能够有效地被忽略，并且只需解第二个方程，使用观察到的CO2/CO值，计算的x值是直接转化为乙醇生产的碳的比例。从引入的总碳中减去总释放的CO2得出可用于固定的可利用的碳，用前面计算得到的比例乘以该数得到以乙醇固定的预定的碳。由于固定进入一摩尔乙醇中是两个碳原子，所以该值必须减半以使进入碳的摩尔数转变为产出的乙醇的摩尔数。
当氢气消耗不可忽略但是不足以完成将碳固定进入产物和/或细胞质时，CO2/CO的比例和氢气的用量都不能用于直接推断培养物的状态。由氢生产的乙醇在下面两个方程之间连续：
3CO+3H2→CH3CH2OH+CO2(CO2/CO的比例为0.3333)
2CO+2H2→CH3COOH(CO2/CO的比例为0)
两个方程均以1∶1的比例利用CO和H2。不知道微生物培养物的消耗氢气部分在该连续中所占的点，消耗氢气的微生物的CO2的相对产出是不知道的。当不知道使用潜在的水气转变模式的微生物生成的CO2时，不能计算出准确的总CO2/CO的比例，并且如果无法首先准确得知氢气消耗者的CO2/CO比例以及它们生产的CO2的相对量时，也不能计算该数据。
但是，这可以通过以下方式来避免，在氢气消耗状态下，H2的消耗等于CO的消耗，并且第二个状态方程也可以是CO2/H2比例，以z值而不是x值来表示；
y＝2/3x+0.5
和
y＝1/3z
但是，没有连接x和z的第3个方程，同时发生的方程无法求解。因为培养物的状态可以变化，第三个方程y＝ax+bz事实上是变化的，就像可以预期的在发酵期间培养物生成乙酸盐或者乙醇的程度随着条件而变化。
在培养物全部消耗氢的情况下，因为CO的消耗与氢气的消耗应该为1∶1，CO2/CO和CO2/H2二者的比例应该是相等的。从这点可以推断随着微生物族群的氢气消耗特征的增加，以CO2/CO和CO2/H2的比例计算的点之间所画的线将会趋向水平，并且当该线完全水平时，z轴上的截距应当是直接与固定至乙醇的碳的比例成正比，就像在氢气消耗状态，CO2以基于乙醇的1∶1生成。
从该信息，能够加入近似值以允许计算第三个“混合”方程。
在CO2/CO和CO2/H2之间的线的斜率用于给这条混合线的z截距赋予权重；如果该线是水平的，斜率([CO2/CO]/[CO2/H2])是1，表示纯粹的氢消耗培养物，其中所有乙醇生产来自氢气消耗，意味着唯一考虑的方程是氢气方程。
当这条线从水平移走，其斜率([CO2/CO]/[CO2/H2])将趋向为0。使用这作为乘法的权重值，与z截距相乘，随着CO2/CO和CO2/H2之间的线越来越偏离水平，氢气消耗者生产的CO2(和乙醇)的推算量将会同样趋向于0。
截距z乘以得自权重因数的斜率得到氢气消耗微生物生成的总CO2，并且被氢气消耗者消耗的CO相对于氢气消耗会是1∶1，并且该值随后被代入以解方程y＝1/3x。通过氢消耗微生物消耗的CO和生成的CO2可以从总的消耗和生产中减去，以得出剩余的由水-气-转移模式消耗的CO和生成的CO2，并且该剩余的比例能够被代入以解方程y＝2/3x+0.5。因此，可以确定固定至具体产物例如酸和/或醇的碳的比例。
本领域技术人员了解CO和任选H2的消耗量以及CO2生成能够如希望的那样，连续或在离散的时间点进行监测。本领域可知的任意的方式均可以用于确定CO2、CO和H2的含量；但是在本发明的一个实施方式中，气相色谱被用于测量在排出生物反应器的排气流中的CO2、CO和H2的含量。如果知道进入生物反应器的底物流的组成，可计算以醇和/或酸固定的碳的比例。如果不知道进入生物反应器的底物流的组成，进一步的气相色谱能够用于确定组成。测定生成的CO2和消耗的底物的量的其它方式包括质量色谱法(MS)、GCMS和内嵌传感器。
因此，根据本发明，以具体产物例如乙酸盐和/或乙醇固定的碳的比例可以通过测量生成的CO2、消耗的CO和任选消耗的H2来确定。意识到底物(例如CO和任选的H2)用于微生物培养物的速率能够影响产物(生产它们的)的相对比例以及产物生成的速率。例如，提高乙酸盐产生培养物中的底物供应，能够提高直接转化为醇的碳的比例。
包含CO和任选H2的底物通常以气体形式提供，并且微生物培养物获得的CO与H2取决于发酵体系的质量转移性能。例如，悬浮在发酵液中的微生物培养物获得的CO和/或H2取决于本领域技术人员熟知的因素，包括温度、发酵液组成、气体供应速率、气体组成、CO蒸汽压、H2蒸汽压及它们的混合。因此，提高微生物发酵获得的CO和/或H2需要提高体系的质量转移性能，例如提高底物供应速率和/或提高机械搅拌生物反应器的振荡速率。
根据本发明的方法，通过在或者接近最佳水平或范围提供包含CO和任选H2的底物，可以提高发酵效率。基于期望的发酵产物，可以确定最佳水平。例如，如果希望醇和微生物生长，提供包含CO和任选H2的底物使得碳主要以醇固定，而一部分碳用于微生物生长。例如，可以向微生物培养物中提供包含CO的底物，使得微生物生长和醇的生成。
所述条件尤其是底物供应速率和/或CO和H2的相对浓度可以变化，直到微生物生长与醇的生产最优，达到操作者满意。因为可以确定碳固定至产物的每种途径的影响，在发酵期间，可以调整底物供应达到和/或维持所需的条件。例如，理解底物流可以包括上下波动的CO和/或H2的组成。但是，使用本发明的方法，通过调节底物供应，产物的净产量能够维持在基本不变的比例。
此外或可选地，随着微生物培养物的生长或者微生物密度的波动，基于确定生成的CO2和消耗的CO与H2，根据微生物培养物的要求，可以改变底物供应。
在这方面，尽管底物供应和/或微生物密度不断的变化，直接转化为具体产物的碳的比例能够维持基本不变。在本发明的具体实施方式中，操作者可以选择直接转化为具体产物的碳的比例，并调整保持所述比例基本不变的条件。例如，如果操作者要求90％的固定的碳直接朝向乙醇生产，可以提供底物使得所述比例不偏离预定范围，例如±1％，或者±2％，或者±3％，或者±4％，或者±5％。在具体实施方式中，根据固定为特定产品的碳的比例，控制底物供应。在具体实施方式中，相应于固定至具体产物的碳的比例变化自动调节底物供应。
在具体实施方式中，提供CO，其中不存在可评估量的H2，可以确定CO2生成/CO消耗比例。在本发明的具体实施方式中，当同时生成乙酸盐时，可以优化微生物生产以及醇的生产。这样，可以期望CO2生成/CO消耗的比例＜0.667，例如大约0.66，或者大约0.65，或者大约0.64，或者大约0.63，或者大约0.62，或者大约0.61，或者大约0.60，或者更少。可选择地，当乙酸盐被消耗时，微生物生长和醇的生产可以是最佳的。这样，可以期望CO2生成/CO消耗的比例＞0.667，例如大约0.67，或者大约0.68，或者大约0.69，或者大约0.70，或者更大。
一旦确定最佳水平或者范围，发酵或者未来的发酵能够在相似条件下操作，其中提供底物使得实验确定的固定的碳和/或CO2生成/CO消耗比例被基本保持。包含CO和H2的底物的发酵最佳比例可以被类似的确定和应用。
在一个另外的或者可选的实施方式中，所述方法可以用于指示何时和/或如何一种微生物培养物能够或者应该从一种净的总转化至另一种的转变。例如，如前面所提到的，如果生长是主要目的，那么，可以期望地保持微生物培养物，使得大部分的碳直接定向为乙酸盐的生产。例如，包含CO和少量或者不含H2的底物流，CO2生成/CO消耗比例保持在0.5左右。如果CO2生成/CO消耗比例偏离预定范围或者极限，例如大约0.45-0.55，或者大约0.48-0.52，应对微生物培养物和/或底物流进行调整，以转变至少部分微生物培养物，使得用所有的培养物的总的净转化如所期望的。例如，转变培养物使得CO2/CO的比例为大约0.5。存在H2时，等同的调整可以类似的进行，使得碳固定保持基本不变。
在本发明的具体实施方式中，通过对微生物培养物和/或底物流作出调整，至少部分微生物培养物能够被转变。在某些实施方式中，在生物反应器中进行厌氧发酵，其中微生物发酵液至少部分悬浮在含有液体营养介质的发酵液中。在具体实施方式中，通过对发酵液和/或液体营养介质作出调整，至少部分微生物培养物能够转化。
在某些实施方式中，所述调整包括以下一种或多种：改变发酵液的pH；改变发酵液的氧化还原电势；改变发酵液的CO的浓度；改变发酵液的H2的浓度；改变底物流的组成；改变底物流的压力；调整发酵液的振荡速率；产物移出；改变发酵液中酸和/或醇的浓度；改变液体营养介质中的一种或多种营养物质；改变一种或多种营养物质的供应速率。
此外或可选地，如果醇的生产是主要目的，那么提供底物使得所有的碳充分地固定为乙醇。在具体实施方式中，其中没有H2，CO2生成/CO消耗比例可以期望保持在大约0.667。如果CO2生成/CO消耗比例偏离预定范围或极限，例如0.58-0.73或者0.63-0.7，可以对培养物和/或底物流作出调整使至少部分微生物培养物转化，使得全部培养物的总的净转化如所预期的，例如回到大约0.667的CO2生成/CO消耗比例。
在另一个或者可选的实施方式中，生成醇的培养物保持大约0.667的CO2生成/CO消耗比例，可以具有显著量的不需要的乙酸盐，例如从之前生长相中剩下的残余乙酸盐。通过还原至少一部分乙酸盐至乙醇(方程式3)，乙酸盐可以转化为乙醇。因此，可以调节培养物，直到CO2生成/CO消耗比例增加到大于0.667，直到所需的转化完成。
CO氧化为CO2的比例可以用于确定微生物培养物的总的净转化。培养物所消耗的CO的量也提供了培养物活力(具体摄入：CO摄入率/细胞密度)的指示。因此，本发明的方法能够用于结合具体摄入监测。例如，如果以特定产物固定的碳的比例和/或具体摄入偏离预定极限和范围，可对培养物作出一种或多种调整使得活力和预期转变得到保持。在具体实施方式中，其中H2是有限的或者没有H2，具体的CO摄入希望是至少0.5mmol/克微生物细胞干重/分钟(mmol/g/min)，例如大约0.6mmol/g/min，例如0.7mmol/g/min，例如大约0.8mmol/g/min，例如大约0.9mmol/g/min，例如大约1.0mmol/g/min。
在这方面，以具体产物固定的碳的比例结合CO的具体摄入可以用于确定具体所需代谢产物例如酸和/或醇的以何速率生产。在具体实施方式中，通过优化(即，改进)一种或者多种产物(例如醇)生产的速率，所述方法可以用于提高微生物发酵的效率。例如，当保持大约0.667的CO2生成/CO消耗比例时，可以通过对微生物培养物作出一种或多种调整提高CO的具体摄入，而改进乙醇生产。此外或可选地，可作出一种或多种调整，提高CO摄入以及将的CO2生成/CO消耗比例从0.5(举例)增加至0.667(举例)来改进醇生产的速率。
在本发明的具体实施方式中，包含CO和任选H2的底物的连续发酵能够在至少两天的长时间内得以实现，例如至少3天，或者至少5天，或者至少1周，或者至少1个月。连续发酵包括向发酵液提供新鲜介质和移出含有产物和微生物细胞的发酵液，以保持发酵液体积充分不变。在具体实施方式中，在连续过程中，包含醇和任选酸以及微生物细胞的产物的浓度基本保持不变。在本发明的具体实施方式中，为了维持在长时间内连续发酵，微生物培养物将至少一部分碳固定为酸例如乙酸盐。乙酸盐可以以小于5g/L的浓度生产。但是，根据本发明的方法，大部分碳以超过10g/L或者15g/L固定为的醇例如乙醇。因此，为了维持连续发酵，需要提供底物使得碳固定为乙酸盐、乙醇和生物质。
在一个具体实施方式中，在长时间内，生产乙醇和少量的乙酸盐的发酵连续进行，维持CO2生成/CO消耗比例在大约0.61-0.65的范围内；例如0.62-0.64。这样的CO2生成/CO消耗比例确保大部分固定的碳直接定向于醇的生产，而更小量的定向于乙酸盐和细胞物质来维持微生物生长，从而维持连续的培养物。在具体实施方式中，如此提供底物使得具体CO摄入保持在至少0.8mmol/g/min，例如大约1.0mmol/克干细胞质量/分钟。
根据另一个实施方式，可以进行非连续(离散)发酵使得醇的生产不伴随酸的生产。在这样的实施方式中，底物如此提供使得生产醇和任选的细胞物质(生物质)。根据本发明，提供底物使得CO2/CO比例保持0.667。应了解随着微生物培养物的生长，所需CO(和任选的H2)的用量也增加。但是，根据本发明，当随着底物供应速率增加时，通过保持CO2/CO比例，能够提供CO的最佳用量。
根据本发明的一个实施方式，图1是系统100的图示。底物流1通过相配的导管3进入生物反应器2。底物流1包含CO和任选的CO2和/或H2，并且在某些实施方式中，底物流是来自工业工艺的废气流，例如钢厂的脱碳。底物流1可以是恒定流，即不间断供应，但是底物流的含量会随着时间变化。底物流的组成尤其是CO和CO2的比例是已知的，或者可以选择用任选的监测手段(没有标出)进行确定。
生物反应器2被设定为执行所需的发酵反应以生产产物。根据某些实施方式，生物反应器2被设计为将CO转化为包括一种或多种酸和/或醇的产物。生物反应器2可以包括一个以上的罐，每个罐被设计成进行相同的反应和/或在特定的发酵过程中的不同阶段和/或不同的反应，包括可以包括一种或多种常规阶段的不同发酵的不同反应。
在生物反应器2中生产的产物例如酸和/或醇，可以使用本领域熟知的任意的回收方法来回收。
在发酵反应中未消耗的底物流的组分和发酵反应的任意副产物例如CO2，经由排气口4排出生物反应器2。在本发明的具体实施方式中，测量装置5适于确定从排气口4排出生物反应器2的排出流中的CO、CO2和任选H2的浓度。在具体实施方式中，根据供应给生物反应器2或者从其排出的CO、CO2和H2的量，可以确定定向至酸和/或醇的碳的比例。因此，操作者能够使用调节装置6任选地对生物反应器2中微生物培养物和/或底物流作出调整，以使微生物培养物维持在或者转变至生产所需的培养物状态。维持或者转变培养物的调整包括以下一种或者多种：改变发酵液的pH；改变发酵液的氧化还原电势；改变发酵液的CO的浓度；改变发酵液的H2的浓度；改变底物流的组成；改变底物流的压力；发酵液的振荡速率；产物移出；改变发酵液中酸和/或醇的浓度；改变液体营养介质中的一种或多种营养物质；改变一种或多种营养物质的供应速率。
此外或可选地，系统100包括任选的适于确定定向于具体产物的碳的比例的操作装置7和任选的控制调节装置6，使得培养物能够维持在或者转变至所需的状态。
在具体实施方式中，进入和/或排出生物反应器2的CO2、H2和CO可以连续监测或者在离散的时间点进行监测，并且确定碳固定。此外，调节装置6可以设定为用于连续调节或者如有需要在离散的时间点进行调节。
可以使用用于确定CO2生成/CO消耗比例的任意装置，但是在具体实施方式中，一个或多个气相色谱用于确定排出生物反应器2的流以及任选底物流1中的CO2和CO的浓度。在一个实施方式中，用于确定排出生物反应器2的流中CO和CO2浓度的装置是Varian CP-4900micro GC。
实施例
原料和方法(实施例1和2)：
Figure BDA0000093796730000351
Figure BDA0000093796730000361
介质的制备(实施例1和2)
介质如下制备：将85％H3PO4(20mmol)加入到1L溶液A中。通过加入5M的NaOH溶液调节介质的pH至5.3。随后任选根据溶液B加入金属盐。所述介质溶液通过在121℃下高压灭菌30分钟来杀菌，或者在使用前通过过滤高压灭菌。加入核黄素用作氧化还原指示剂，并且加入10ml维生素B溶液(溶液C)。
Na2Sx的制备
在500ml烧瓶中装入Na2S(93.7g，0.39mol)和200ml H2O。搅拌溶液直到盐溶解，并在恒定氮气流下加入硫(25g，0.1mol)。在室温搅拌2小时后，将现在为清澈的红棕色液体的“Na2Sx”溶液(相对于[Na]，大约4M；相对于[S]，大约5M)转移至用N2吹扫的铝箔包裹的血清瓶中。
实施例3、4和5的原料和方法
Figure BDA0000093796730000371
Cr(II)溶液的制备
1L的三口烧瓶，其安装有气体密闭进口和出口，使得可以在惰性气体下进行操作，并且随后将预期的产品转移至合适的储备烧瓶中。烧瓶中装入CrCl3·6H2O(40g，0.15mol)、锌粒[20目](18.3g，0.28mol)、汞(13.55g，1mL，0.0676mol)和500mL蒸馏水。烧瓶用N2吹扫1小时后，将混合物升温至约80℃以引发反应。接下来在恒定N2流下搅拌2小时，混合物在室温下连续搅拌另外的48小时，直到反应混合物变成深蓝色溶液。将溶液转移至N2吹扫过的血清瓶中并保存在冰箱中以备进一步的使用。
细菌：使用的是具有德国生物材料资源中心(DSMZ)保藏号19630菌株识别特征的Clostridium autoethanogenum。
取样和分析步骤
在长达20天时间内，间隔地从所述CSTR反应器中提取介质样品。介质每次取样时，注意确保没有气体进入或者排出生物反应器。
HPLC：
安捷伦1100系列HPLC系统。流动相：0.0025N硫酸。流量和压力：0.800mL/min。柱子：Alltech IOA；Catalog#9648，150×6.5mm，粒径5μM。柱温：60℃。检测器：示差折光。检测器温度：45℃。
样品制备方法：
将400μL的样品和50μL的0.15M ZnSO4以及50μL的0.15MBa(OH)2加入离心管。4℃、12,000rpm下离心10分钟。将200μL上清液转移至HPLC样品瓶并向HPLC仪器中注射5μL。
顶空间分析：
测量使用双通道CP-4900MicroGC气相色谱仪进行。通道1是在70℃、200kPa氩气和4.2秒反冲洗下运行的10m Mol-Sieve柱。而通道2是在90℃、150kPa氦气、没有反冲洗下运行的10m PPQ柱。两个通道的进样器温度为70℃，运行时间设定为120s，而所有感兴趣的峰通常在100s前流出。
实施例1：在CSTR中的分批发酵
将1.5升含有溶液B的介质溶液无菌并厌氧地转移至2L的CSTR容器中，并连续鼓吹N2。一旦转移至发酵容器中，可以通过探针直接测量转移的介质的还原状态和pH。所述介质加热至37℃并在300rpm下搅拌。通过加入0.3M的Cr(II)氯化物溶液，所述介质随后被降至-130mV。
将多硫化物溶液(0.1％v/v，1.5mL)加入到该溶液中，并且在介质中观察到黑色沉淀。也观察到电压最初降至-300mV，几小时后稳定在-150mV。在加入多硫化物溶液时，持续鼓入N2通过所述溶液。
接种前，将气体转换为预先混合的70％CO、1％H2、15％CO2和14％N2的混合物，在整个实验中，该气体被不断地鼓入发酵液中。活性生长的Clostridium autoethanogenum培养物以大约7.5％(v/v)的水平接种至CSTR中。在实验期间，pH保持在约5.5。
结果：
代谢物的生产与CO2生成/CO消耗比例的比较可以见于附图1。在培养物没有消耗显著数量的气体的滞后阶段后，气体消耗和代谢产物的生产在大约5天之后开始。
对于第一个三天，CO2生成/CO消耗比例保持在0.55-0.62之间，在该值下，模型表示乙醇的生产同时有乙酸盐生成；通过HPLC分析，观察到在同一时间，乙醇和乙酸盐都增加。
在9天时，CO2生成/CO消耗比例增至0.66，该值由模型预计显示几乎所有摄入的碳都定向至乙醇生产，而很少或者没有乙酸盐的生成。同一天的HPLC分析表示通过培养物的连续的乙醇的生产，而乙酸的水平变平。稍高的比例可以预示乙酸盐的消耗，当气体顶空间分析不能进行时，根据HPLC分析，在第11天至第12天的过夜时间段观察到该事件的发生。
在12和13天时，所述比例接近0.6，表示连续乙醇的生产伴随一些乙酸盐的生产；再一次的，观察与HPLC测量相吻合。14-16天，所述比例升到超过0.667，表示通过消耗乙酸盐的醇的生产。这些天的HPLC数据表明连续的乙醇积聚，而乙酸盐的水平上下波动，有小幅增加和减少。在19天时，所述比例显著降至低于0.5，表明乙醇的消耗，对这一时段的HPLC分析表明乙醇浓度的减少。19天后反应器的气体消耗接近为0并且培养物被推定是失活的。
实施例2：在CSTR中的分批发酵
将没有溶液B的1.5升介质溶液被无菌并厌氧地转移至2L的CSTR容器中，并连续鼓入N2。一旦转移至发酵容器中，可以直接通过探针测量转移的介质的还原状态和pH。将介质加热至37℃并在300rpm下搅拌。介质随后通过加入0.3M的Cr(II)氯化物溶液被降低到-130mV。
将多硫化物溶液(3M溶液，1.0mL)加到该溶液中。也观察到电压最初降至-220mV，几个小时后稳定至-100mV。随着12小时连续鼓入N2，将溶液D加入到该溶液中并且通过加入Cr(II)将ORP调整至大约-200mV。
在接种前，将气体转换为预先混合的70％CO、1％H2、15％CO2和14％N2的混合物，其在整个实验中连续鼓入发酵液中。将活性生长的Clostridium autoethanogenum培养物以大约7.5％(v/v)的水平接种至CSTR。实验期间，不从外部控制pH。
结果：
代谢物的生产与CO2生成/CO消耗比例的比较可以见于附图2。在培养物没有消耗显著数量的气体的滞后阶段后，气体消耗和代谢产物的生产在大约3天之后开始。最初，观察到的CO2生成/CO消耗非常高，事实上，超过1∶1。对于超过1∶1的计算值，模型按照等于1∶1来处理。如此高的比例表明乙酸盐的消耗和乙醇的生产。在这个时间段的HPLC分析显示乙酸盐水平的相应降低和乙醇的增加。在5-9天，该比例降至0.6-0.5，表明乙醇的生产伴随乙酸盐的生产，与HPLC的分析相符。在8-11天，CO2生成/CO消 耗比例降至0.5以下，显示乙醇的消耗。在9-10天的HPLC的分析显示乙醇浓度的下降。11天后所述比例升至0.667以上，显示乙酸盐消耗导致的乙醇生产，与HPLC分析观察到的乙酸盐的降低相吻合。该消耗在13和14天变得更显著，相应地比例跳跃至1∶1以上。
在15-18天的时间段里，尽管HPLC分析显示乙醇水平的逐渐降低和乙酸盐的稍许升高，没有进行气体顶空间分析。
在第19天，当恢复顶空间分析，所述比例超过0.667，显示乙醇的生产和乙酸盐的消耗。HPLC分析表明在该时间段(没有进行取样)乙醇的水平已经显著上升，而乙酸盐水平仍然或多或少地静止。20天后，对培养物没有进一步数据的收集。
实施例3：在CSTR中的分批发酵
介质如下制备：将85％H3PO4(45mmol)加到1.5L溶液A的溶液中。通过加入5M的NaOH溶液将介质的pH调至5.3。介质溶液在121℃高压灭菌30分钟以杀菌。加入核黄素作为氧化还原指示剂。将介质溶液无菌并厌氧地转移至1.5L的CSTR容器中，并连续鼓入N2。一旦转移至发酵容器中，可以直接通过探针测量转移的介质的还原态和pH。将介质加热至37℃并在300rpm下搅拌。
加入亚硫酸钠溶液(3.75mL的0.2M溶液)，随后加入次氮基二乙酸(1.5mL的0.1M溶液)、痕量金属溶液B(1.5mL)、Na2WO4(1.5mL的0.01M溶液)、然后维生素-B溶液C(15mL)。用Cr(II)溶液将溶液的ORP调至大约-200mV。
接种前，将气体转换为预先混合的33％H2、23％N2、31％CO、13％CO2的混合物。
将活性生长的Clostridium autoethanogenum培养物以大约10％(v/v)的水平接种至CSTR。在该实验期间，pH保持在约5.3并以约0.16mMol/天的速率加入Na2S溶液。
发酵期间，对应于排出生物反应器的气体流的变化，提高气体供应和振荡。根据本发明的方法，通过保持大于70％小于100％的断裂点，定向至醇的碳的比例维持在高水平。CO、H2的摄入和断裂点在附图4中展示，而微生物生长和代谢产物生产示于图5中。通过在促进醇生产的水平上保持底物供应，没有乙酸盐的生产，而乙醇和生物质加速累积。
实施例4：在CSTR中的分批发酵
介质制备如下：将85％H3PO4(45mmol)加到1.5L溶液A的溶液中。通过加入5M的NaOH溶液将介质的pH调至5.3。介质溶液在121℃高压灭菌30分钟或者在使用前用过滤高压灭菌以杀菌。加入核黄素作为氧化还原指示剂。将介质溶液无菌并厌氧地转移至1.5L的CSTR容器中，并连续鼓入N2。一旦转移至发酵容器中，可以直接通过探针测量转移的介质的还原状态和pH。将介质加热至37℃并在300rpm下搅拌。
加入亚硫酸钠溶液(3.75mL的0.2M溶液)，随后加入次氮基二乙酸(1.5mL的0.1M溶液)、痕量金属溶液B(1.5mL)、Na2WO4(1.5mL的0.01M溶液)、然后维生素B溶液C(15mL)。用Cr(II)溶液将溶液的ORP调至大约-200mV。
接种前，将气体转换为预先混合的50％CO、50％N2的混合物，其在整个实验中连续鼓入发酵液中。将活性生长的Clostridium autoethanogenum培养物以大约10％(v/v)的水平接种至CSTR。在实验期间，pH保持在约5.3并以约0.16mMol/天的速率加入Na2S溶液。
发酵过程期间内，对应于排出生物反应器的气体流的变化，提高气体供应和振荡。根据本发明的方法，CO2生成/CO消耗比例保持在大约0.667，使得基本所有的碳定向于醇的生产。CO摄入和CO2生成/CO消耗比例在附图6中展示，而微生物生长和代谢产物生产示于图7中。通过保持底物供应在促进醇生产的水平，没有乙酸盐的生产，而乙醇和生物质加速累积。
实施例5：在CSTR中的连续发酵
2L的CSTR按照如下条件安装：
介质制备如下：将85％H3PO4(30mM)加到1.5L溶液A的溶液中。通过加入NH4OH将介质的pH调至5.3。介质溶液在121℃高压灭菌30分钟以杀菌，或者在使用前用过滤高压灭菌。加入核黄素作为氧化还原指示剂。将介质溶液无菌并厌氧地转移至1.5L的CSTR容器中，并连续鼓入N2。一旦转移到发酵容器中，可以直接通过探针测量转移的介质的还原状态和pH。将介质加热至37℃并在300rpm下搅拌，然后加入包含0.3Mol/L次氮基二乙酸的痕量金属溶液B，然后加入Na2WO4(1.5mL的0.01M溶液)、然后加入溶液C(15mL)。接种前，将气体转换为预先混合的2％H2、28％N2、48％CO和22％CO2的混合物。将活性生长的Clostridiumautoethanogenum培养物以大约10％(v/v)的水平接种至CSTR。在实验期间，以大约0.16mL/小时的速率加入Na2S(0.2M)溶液。
微生物培养物允许以间歇模式生长大约1天。在1天时，发酵转换至连续操作，其中，提供新鲜介质以实现稀释速率为约1至1.8的速率。相应于微生物培养物的要求，提高底物供应。
发酵的结果示于图8中。在发酵过程期间，对应于CO转化为CO2的比例的变化，底物供应速率和振荡速率或者提高或者降低。根据本发明，通过保持大约0.62-0.64的CO2/CO比例可以实现可接受的连续操作。可接受的连续操作导致大约3g/L的稳定的生物质，大约5g/L基本稳定的乙酸盐浓度和至少10g/L的基本稳定的乙醇的浓度。微生物培养物的具体CO的摄入保持在约1.0mmol/g/min。
实施例6：预言的
通过液体营养介质中包含的一氧化碳营养的微生物培养物来发酵包含CO的底物，其中各种条件(例如本领域所熟知的那些)促进乙醇的生产。在这样的条件下，CO2生成/CO消耗比例最佳保持在约0.5。然而，在某一阶段当操作者希望培养物从乙酸盐生产转变为乙醇生产，可以作出一种或者多种调整。在具体实施方式中，可以降低液体营养物介质的pH使得至少部分微生物培养物转变至生产乙醇的状态。由于进行了所希望的转变，CO2 生成/CO消耗比例将升至0.667。在另一个实施方式中，所述调整是通过停止控制pH使得微生物培养物能够自我调节pH，而不是人工调节pH。
实施例7：预言的
通过在液体营养介质中的一氧化碳营养的微生物培养物来发酵包含CO的底物，其中各种条件(例如本领域所熟知的那些)促进乙醇的生产。在这样的条件下，CO2生成/CO消耗比例最佳保持在约0.667。但是，如果CO2生成/CO消耗比例偏离该值，例如下降至约0.5，可以进行一种或多种调整来提高该比例使之回到最佳值。例如，可以提高气体流中的氢气的组成，使得促进乙醇的生产。
为了使读者无需额外进行实验而能够实现本发明，结合某些优选实施方式对本发明进行了描述。本领域技术人员应该了解，除了具体描述的实施方式，还可以对本发明进行大量的变化和修改。应该理解本发明包括这些变化和修改。此外，题目、标题等是为帮助读者理解本文而提供的，不应该理解成对本发明范围的限制。本文引用的所有申请、专利和出版物的完整公开内容通过参考纳入本文。
在本说明书中对任何现有技术的参考不是、也不应该被认为是承认或任何形式的暗示该现有技术在任何国家构成本领域一般常识的一部分。
在整个说明书和随后的任何权利要求中，除非上下文另有规定，“包括”、“包含”等词语应被解释与排除的意义相对，也就是说，是“包括/包含，但不限于”。

Claims (12)

1.一种提高包含CO和少于5%H2的底物的微生物发酵效率的方法，该方法包括向微生物培养物提供所述底物使得第一部分的CO固定为一种或多种所需产物包括酸和/或醇，并且第二部分的CO转变为CO2，其中CO2产 生/CO消耗之比用于确定生产一种或多种期望产物的底物供应速率。
2.根据权利要求1的方法，其中所述底物供应速率为：
i.如果CO2产生/CO消耗之比低于所述比例值的预定范围，提高底物供应速率；或者
ii.如果CO2产生/CO消耗之比高于所述比例值的预定范围，降低底物供应速率；或者
iii.如果CO2产生/CO消耗之比处在所述比例值的预定范围中，保持底物供应速率。
3.根据权利要求2的方法，其中，自动调节底物供应速率使得CO2产生/CO消耗之比维持在预定范围内。
4.根据权利要求2的方法，其中，CO2产生/CO消耗之比为0.5。
5.根据权利要求2的方法，其中，CO2产生/CO消耗之比为0.667。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述期望的产物是乙醇。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中包含CO的底物是气态的。
8.根据权利要求7的方法，其中所述底物包括作为工业工艺的副产物的气体，所述工业工艺选自黑色金属产品生产、有色金属产品生产、石油炼制工艺、生物质气化、煤气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产组成的组中的工艺。
9.根据权利要求7或者8的方法，其中包含CO的底物，包含至少15%至100%体积的CO。
10.根据权利要求7-9中任一项的方法，其中包含CO的底物，包含至少40%至70%体积的CO。
11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述微生物选自如下微生物组成的组：梭状芽胞杆菌(Clostridium)、穆尔氏菌(Moorella)、火球菌(Pyrococcus)、真杆菌(Eubacterium)、脱硫肠状菌(Desulfobacterium)、碳嗜热菌(Carboxydothermus)、热厌氧杆菌(Acetogenium)、醋酸杆菌(Acetobacterium)、厌氧醋菌(Acetoanaerobium)、丁酸杆菌(Butyribaceterium)和消化链球菌(Peptostreptococcus)。
12.根据权利要求11的方法，其中所述微生物为Clostridiumautoethanogenum。
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