JP2011512869A - 微生物によるアルコール製造プロセス - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
a.バイオリアクター内でCOを含む基質の存在下、一つ又は複数のカルボキシド栄養性(carboxydotrophic)細菌株を培養し、一つ又は複数の酸及び場合により一つ又は複数のアルコールを製造し;そして
b.少なくとも一つの酸が少なくとも一つのアルコールに変換されるように微生物培養物を撹乱(perturbing)する
ことを含む。
・微生物培養物を含有する液体栄養培地のpHを変えること;
・微生物培養物を含有する液体栄養培地のORPを変えること;
・一つ又は複数の酸をバイオリアクターに添加すること;
・一つ又は複数の還元剤をバイオリアクターに添加すること;
・微生物培養物を含有する液体栄養培地中のCO濃度を変えること;
・バイオリアクター内のCO分圧を変えること、この場合、COを含む基質はガス状である;
の一つ又は複数を含む。
別の広い側面において、本発明は、アルコールの製造法を提供し、該方法は、少なくとも、
(a)バイオリアクター内で一酸化炭素を含む基質の存在下、一つ又は複数の細菌株を培養し;
(b)前記一つ又は複数の細菌株が変換相にあるときにバイオリアクターに酸を添加し、その酸の対応するアルコールを製造させ;ここで、製造されるアルコールは、前記一つ又は複数の細菌株が前記酸の不在下で前記基質上で増殖した場合に製造することができるアルコールではない;
ステップを含む。
一態様においては、二つ以上の酸をバイオリアクターに添加して、二つ以上の対応アルコールを製造する。
(a)バイオリアクター内で一酸化炭素を含む基質の存在下、ブタノール以外のアルコールを製造するように適合された一つ又は複数の細菌株を培養し;
(b)前記一つ又は複数の細菌株がブタノール以外のアルコールを活発に製造しているときにバイオリアクターにブチレートを添加することによってブタノールを製造させる;
ステップを含む。
(a)バイオリアクター内で一酸化炭素を含む基質の存在下、エタノールを製造するように適合された一つ又は複数の細菌株を培養し;
(b)前記一つ又は複数の細菌株がエタノールを活発に製造しているときにバイオリアクターにブチレートを添加することによってブタノールを製造させる;
ステップを含む。
(a)バイオリアクター内で一酸化炭素を含む基質の存在下、クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)を培養し;
(b)クロストリジウム・オートエタノゲナムが変換相にあるときにバイオリアクターに酸を添加し、その酸の対応するアルコールを製造させ;ここで、製造されるアルコールは、クロストリジウム・オートエタノゲナムが前記酸の不在下で前記基質上で増殖した場合に製造することができるアルコールではない;
ステップを含む。
(a)バイオリアクター内で一酸化炭素を含む基質の存在下、クロストリジウム・オートエタノゲナムを培養し;
(b)クロストリジウム・オートエタノゲナムが変換相にあるときにバイオリアクターにブチレートを添加してブタノールを製造させる;
ステップを含む。
特定の態様において、本発明の方法に従ってバイオリアクターに添加される酸は、一酸化炭素を含む基質の微生物発酵によって製造される。
(a)第一のバイオリアクターにおいて、基質を発酵させて一つ又は複数の酸を製造させ;
(b)第二のバイオリアクターにおいて、一酸化炭素を含む基質の存在下、一つ又は複数の細菌株を培養し;
(c)(a)からの一つ又は複数の酸を、前記一つ又は複数の細菌株が溶媒生成相(solventogenic phase)にあるときに第二のバイオリアクターに導入して、前記一つ又は複数の酸に対応するアルコールを製造させる;ここで、製造されるアルコールは、前記一つ又は複数の細菌株が前記酸の不在下で前記基質上で増殖した場合に製造することができるアルコールではない;
ステップを含む。
一定の態様において、第二のバイオリアクター内の一つ又は複数の細菌株は上記定義の通りである。
一態様において、基質は、酸からアルコールへの変換が促進されるようなCO濃度で供給される。
本発明の様々な態様において、該方法は、発酵によって生成した一つ又は複数のアルコールを捕捉及び回収するステップを含む。
本発明の別の側面において、アルコール及び/又は酸の製造法を提供し、該方法は、
(a)COを含む基質を第一の濃度で一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクターに供給し;そして
(b)バイオリアクター内の培養物を嫌気的に発酵して前記基質からアルコール及び/又は酸を含む一つ又は複数の生成物を製造する
ステップを含み、バイオリアクターに供給される基質の濃度は、酸に比してアルコールの生成が増大するように、所望の時点で場合により増大させることができる。
本発明の別の側面において、アルコール及び/又は酸の製造法を提供し、該方法は、
(a)COを含むガス状基質を第一のCO分圧で一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクターに供給し;そして
(b)バイオリアクター内の培養物を嫌気的に発酵して前記基質からエタノール及び/又は酢酸を含む一つ又は複数の生成物を製造する
ステップを含み、CO分圧は、アセテートに比してエタノールの生成が増大するように、所望の時点で場合により増大させることができる。
本発明の別の側面に従って、微生物の増殖及び/又は酸の生成の調節法を提供し、該方法は、
(a)COを含むガス状基質を第一のCO分圧で一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクターに供給し;そして
(b)バイオリアクター内の培養物を嫌気的に発酵して前記基質からエタノール及び/又は酢酸を含む一つ又は複数の生成物を製造する
ステップを含み、CO分圧は、微生物の増殖及び/又は酸の生成が削減又は実質的に阻害されるように、所望の時点で増大させることができる。
様々な態様において、該方法は、発酵によって生成したアルコールを捕捉及び回収するステップを含む。
(a)COを含むガス状基質を第一のCO分圧で一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクターに供給し;
(b)バイオリアクター内の培養物を嫌気的に発酵して前記基質からエタノール及び/又は酢酸を含む一つ又は複数の生成物を製造し;
(c)CO分圧を、酸の少なくとも一部がエタノールに変換されるように、十分な閾値より高く増大させ;そして
(d)場合により、その後、CO分圧を、微生物増殖及び酸生成が促進されるように閾値未満に低下させる
ステップを含む。
特に断りのない限り、本明細書全体にわたって使用される下記の用語は以下のように定義される。
“CO分圧”などの用語は、CO及び任意の追加のガスを含むガス状基質中のCOによって系にかけられる相対圧力を含む。
(a)バイオリアクター内で一酸化炭素を含む基質の存在下、一つ又は複数の細菌株を培養し、一つ又は複数の酸及び場合により一つ又は複数のアルコールを製造し;そして
(b)少なくとも一つの酸が少なくとも一つのアルコールに変換されるように培養細菌を撹乱する
ことを含む。
(a)バイオリアクター内で一酸化炭素を含む基質の存在下、一つ又は複数の細菌株を培養し、ここで前記細菌はアルコールを生成しており;そして
(b)前記培養細菌に、前記培養物の少なくとも一部がアルコールを製造するための変換相にあるときに酸を添加する;
ステップを含む。
・微生物培養物を含有する液体栄養培地のpHを変える;
・微生物培養物を含有する液体栄養培地のORPを変える;
・一つ又は複数の酸をバイオリアクターに添加する;
・一つ又は複数の還元剤をバイオリアクターに添加する;
・微生物培養物を含有する液体栄養培地中のCO濃度を変える;
・バイオリアクター内のCO分圧を変える、この場合、COを含む基質はガス状である;
の一つ又は複数を含む。
発酵
ガス状基質からのエタノール及びその他のアルコールの製造法は知られている。例示的方法は、例えば、WO2007/117157、WO2008/115080、米国特許第6,340,581号、米国特許第6,136,577号、米国特許第5,593,886号、米国特許第5,807,722号及び米国特許第5,821,111号に記載されているものなどである。前記特許はそれぞれ引用によって本明細書に援用する。
細菌の増殖及びCOから生成物への発酵を起こすためには、CO含有基質ガスの他に適切な液体栄養培地もバイオリアクターに供給する必要があることは分かるであろう。栄養培地は、使用される微生物の増殖を可能にするための十分なビタミン及びミネラルを含有している。COを唯一の炭素源として使用するエタノールの発酵に適切な嫌気性培地は当該技術分野で公知である。例えば、適切な培地は、上述の米国特許第5,173,429号及び5,593,886号並びにWO02/08438、WO2007/115157及びWO2008/115080に記載されている。本発明は、微生物の増殖及び/又は発酵プロセスにおけるアルコール生成を支持するのに増大した効率を有する新規培地を提供する。この培地については以下でさらに詳細に説明する。
本発明の方法による発酵は、栄養培地中に、所望生成物(例えばエタノール及び/又はブタノール)及び/又は一つ又は複数の副産物(例えばアセテート及びブチレート)、並びに細菌細胞を含む発酵ブロスをもたらす。
例えば、活性炭フィルターを含む吸着システムが使用できる。この場合、適切な分離装置を用いてまず微生物細胞を発酵ブロスから除去するのが好ましい。生成物回収のために無細胞発酵ブロスを作り出す多数のろ過ベースの方法が当該技術分野で知られている。次に、無細胞エタノール−及びアセテート−含有透過物を活性炭含有カラムに通してアセテートを吸着させる。酸形のアセテート(酢酸)の方が塩(酢酸塩)形よりも活性炭に容易に吸着される。そこで、活性炭カラムに通す前に発酵ブロスのpHを約3未満に下げてアセテートの大部分を酢酸形に変換するのが好適である。
酸からアルコールへの変換
特定の広い側面において、本発明は、微生物培養物を用いて酸を対応するアルコールに変換する方法を提供する。特定の態様において、微生物培養物は、CO及び/又はH2を含む基質の存在下で酸をアルコールに変換する。
本発明の方法に従って任意の適切な還元剤が使用できるが、例を挙げると、亜ジチオン酸塩(例えば亜ジチオン酸ナトリウム)、硫化物塩(例えば硫化ナトリウム)又はシステイン及び場合により追加の酸を発酵反応に添加して、微生物培養物の少なくとも一部を生成相から変換相に切り替えることができる。こうして酸が対応するアルコールに変換される。特定の態様において、主としてアセテートを生成する発酵反応に硫化ナトリウムを加えると、該アセテートの少なくとも一部がエタノールに変換される。当業者であれば、酸をアルコールに変換するために系を十分撹乱するのに必要な還元剤の量を決定することはできるであろう。しかしながら、例を挙げると、還元剤は0.005mM〜10mM又は0.05mM〜1mMの濃度範囲で添加することができる。本発明の特定の態様においては、還元剤のほかにメチルビオロゲンのような酸化還元メディエーターを添加する。酸化還元メディエーターの添加は有害作用があるので、本発明の特定の態様によれば、酸からアルコールへの変換法は、好ましくは酸化還元メディエーターの不在下で実施される。
(a)COを含む基質を第一の濃度で一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクターに供給し;そして
(b)培養物を嫌気的に発酵して前記基質からアルコール及び/又は酸を含む一つ又は複数の生成物を製造する
ステップを含み、バイオリアクターに供給される基質の濃度は、酸に比してアルコールの生成が増大するように、所望の時点で場合により増大させることができる。
(a)COを含むガス状基質を第一のCO分圧で一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクターに供給し;そして
(b)培養物を嫌気的に発酵して前記基質からエタノール及び/又は酢酸を含む一つ又は複数の生成物を製造する
ステップを含み、CO分圧は、アセテートに比してエタノールの生成が増大するように、所望の時点で場合により増大させることができる。
本発明の一部の態様において、発酵反応は、微生物が培養され、場合により酸が製造される増殖(又は生成)リアクターと、増殖リアクターからのブロスが供給され、製造された又は添加された酸がアルコールに変換されるように撹乱を適用される変換リアクターとを含みうるシステムで、二つ以上の段階で実施することができる。前述のように、圧力定格発酵バイオリアクターが採用されうる。
液体栄養培地は、微生物バイオマス及び/又は酸が所望のレベル及び/又は所望の生成速度に達するような時間、増殖バイオリアクター1内で実質的に維持されうる。増殖バイオリアクター内の微生物バイオマス及び/又は酸生成は、当該技術分野で公知の手段によって定期的又は連続的にモニターできる。さらに、増殖バイオリアクター内の条件は、増殖及び/又は酸生成にとって実質的に最適な条件を維持するように調整されうる。
本発明の別の態様において、複数の増殖バイオリアクターを含み、酸及び場合により微生物バイオマスを含む液体栄養培地を単一の変換バイオリアクターに供給するように構成された発酵システムを提供する。例えば図6を参照すると、発酵システム101は、第一及び第二の増殖バイオリアクター1a及び1bを含み、それぞれ酸を生成するように構成されうる。増殖バイオリアクター1a及びbからの酸と場合によりバイオマスとを含有する液体栄養培地は、アルコール生成のために変換バイオリアクター2に供給できる。あるいは、第一の増殖バイオリアクター1aを迅速なバイオマス蓄積用に構成し(例えば長い液体リテンションタイム)、第二の増殖バイオリアクター1bを最適な酸生成用に構成してもよい(例えば短い液体リテンションタイム)。各増殖バイオリアクター1a及びbの液体リテンションタイムは、システム全体にわたって最適なアルコール生成条件を維持するためにしかるべく調整することができる。
クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)をGerman Resource Centre for Biological Material(DSMZ)から得た。該細菌に付与された受入番号はDSMZ10061である。あるいは、使用されたクロストリジウム・オートエタノゲナムは、German Resource Centre for Biological Material(DSMZ)に寄託され、受入番号19630を割り当てられたものである。
5リットル入りのバイオリアクターに、前述のように調製されたLM23又はLM33培地4.9Lを入れた。ガスを大気圧の95%CO、5%CO2に切り替えた後、100mlのクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を植菌した。バイオリアクターを37℃に維持し、培養開始時200rpmで撹拌した。増殖相の間、撹拌を400rpmに上げた。pHは5.5に調整され、5MのNaOHの自動添加によって維持された。新鮮な嫌気性培地をバイオリアクターに連続的に添加し、バイオリアクター内における規定のバイオマス及びアセテートレベルを維持した。
無菌の血清ボトルをCO含有ガス(組成については実施例参照)で3回パージした後、排気して−5psiの真空にした。バイオマス、アセテート及び微量のエタノールを含有する大気圧下の活性培養物50mlを連続バイオリアクターから234ml入り血清ボトルに直接移した。次に204mlの上部空間を必要な過剰圧になるまでCO含有ガスで満たした。振盪培養器を使用し、反応温度は37℃に維持した。
これらの実験における細胞密度を測定するためにサンプルの吸光度を600nmで測定し(分光光度計)、乾燥質量を公表手順に従って計算することによって決定した。代謝産物のレベルは高速液体クロマトグラフィー(HPLC)及び場合によってはガスクロマトグラフィー(GC)を用いて特徴付けした。
HPLCシステム Agilent 1100シリーズ。移動相:0.0025N 硫酸。流速及び圧力:0.800mL/分。カラム:Alltech IOA;カタログ番号9648、150×6.5mm、粒径5μm。カラム温度:60℃。検出器:屈折率。検出器の温度:45℃。
400μLのサンプル及び50μLの0.15M ZnSO4及び50μLの0.15M Ba(OH)2をエッペンドルフ管に入れる。該管を12,000rpm、4℃で10分間遠心分離する。200μLの上清をHPLCバイアルに移し、5μLをHPLC機器に注入する。
炎イオン化検出器を利用するガスクロマトグラフHP 5890シリーズII。キャピラリーGCカラム:EC1000−Alltech EC1000 30m×0.25mm×0.25um。ガスクロマトグラフは、水素の総流速50mL/分及び5mLのパージフロー(1:10スプリット)のスプリットモードで運転され、カラムヘッド圧10PISの結果、45cm/秒の線速度が得られた。温度プログラムは60℃で開始し、1分間保持した後、30℃/分で215℃に上昇させ、2分間保持した。注入器(インジェクター)温度は210℃、検出器温度は225℃であった。
500μLのサンプルを12,000rpm、4℃で10分間遠心分離する。100μLの上清を、200μLの水と100μLの内部標準スパイク溶液(10g/Lのプロパン−1−オール、5g/Lのイソ酪酸、135mMの塩酸)入りのGCバイアルに移す。該溶液1μLをGC機器に注入する。
実施例1A:CSTRでの酪酸からブタノールへの変換
8リットルのリアクターに7200mlの培地LM23を入れ、121℃で30分間オートクレーブした。冷却中、培地にN2を散布した。ガスを95%CO、5%CO2に切り替えた後、160mlのクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を植菌した。バイオリアクターを37℃に維持し、培養開始時200rpmで撹拌した。増殖相の間、撹拌を500rpmに上げた。pHは5.5に設定し、5MのNaOHの自動添加によって維持した。20gの酪酸を含有し、pH5.5に緩衝されたn−ブチレート溶液を活発に増殖中の培養物に直接添加した。発酵ブロスのサンプルを酪酸添加後0、24及び48時間の時点で採取した(表1参照)。
血清バイアルを上記に従って準備した。微生物増殖が確立されたら(生成したアセテート及び少量のエタノールを伴う)、下記化合物を血清ボトル中の50mlの活性培養物に加えた。すなわち、1mlの亜ジチオン酸ナトリウム10g/l溶液、2mlのn−酪酸溶液100g/l(pHは5Mの水酸化ナトリウムで5.5に調整)である。気相を25psig過剰圧の95%CO、5%CO2ガス混合物と交換した。酸の添加後、代謝産物定量のために1mlのサンプルを様々な時点で採取した(表2参照)。
血清バイアルを上記に従って準備した。ただし、5mLの酸水溶液を空のバイアルに加え、NaOHでpHを5.5に調整した。亜ジチオン酸ナトリウム(10g/L水溶液0.5mL)又はシステイン(6.25g/L水溶液1mL)を植菌の前に加えた。各血清バイアルを95%COガスで30psigに加圧し、常に振盪しながら37℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを72時間時点で採取した(表3参照)。
実施例2A:アルコール生成に及ぼす亜ジチオン酸ナトリウム濃度の効果
血清バイアルを上記に従って準備した。ただし、亜ジチオン酸ナトリウム(10g/L水溶液)を植菌の前に加えた。各血清バイアルを70%CO、15%CO2、14%N2、1%H2ガスで30psigに加圧し、常に振盪しながら37℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを48時間時点で採取した(表4参照)。
実施例2B:アルコール生成に及ぼす硫化ナトリウム濃度の効果
無菌の234ml入り血清ボトルを100%N2ガスでパージした後、上記処方による50mlの培地(LM33)を加え、121℃で20分間オートクレーブした。培地をCr(II)溶液(約0.4mM)で還元し、硫化ナトリウム水溶液を加えた。血清ボトルに、活発に増殖中のクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物2.5mlを連続バイオリアクターから植菌した。N2のバックグラウンドを除去するために、184mlの上部空間を70%CO、1%H2、15%CO2、及び14%N2ガスで3回パージし、排気して−14psigの真空にし、その後70%CO、1%H2、15%CO2、及び14%N2ガスを満たして30psigにした。反応温度は37℃に維持した。サンプルを時々採取した。上部空間はサンプル採取後パージし、リフレッシュして30psigにした(表5参照)。
実施例3A:アルコール生成に及ぼすCO分圧の効果
血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルをCO2中95%COのガス混合物を用いて30又は40又は50psiaに加圧し、常に振盪しながら37℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを18時間時点で採取した(表6参照)。
これらの結果に基づいて、類似の発酵を、同じガス状基質を用い、異なる炭素源を補給した培地で実施した。血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルをCO2中95%COのガス混合物を用いて40又は50psiaに加圧し、常に振盪しながら37℃でインキュベートした。対照バイオリアクターボトル(A)は未補給であったが、他のボトルにはいくらかのフルクトース(B)、キシロース(C)又はピルベート(D)を補給した。これらのボトルを常に撹拌しながら37℃でインキュベートした。代謝産物及びバイオマス濃度のほか、上部空間の過剰圧及びpHを発酵開始時及び40時間後に測定した。40psiaでの結果を表7に、50psiaでの結果を表8に示す。
血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルを指定のガスで25psig(40psia)に加圧し、常に振盪しながら37℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを1時間、3時間及び5時間の間隔で採取した(表11参照)。
実施例4A:アセテートからエタノールへの変換に及ぼす純ガスの効果
血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルを指定のガスで25psig(40psia)に加圧し、常に振盪しながら37℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを1時間、3時間及び5時間の間隔で採取した(表12参照)。
血清バイアルを上記に従って準備した。ただし、植菌前に、NaOH(水溶液)でpH5.5に緩衝された酪酸溶液をバイアルに添加(スパイク)した。t=0における初期濃度は、アセテート6.7g/l及びブチレート0.8g/Lであった(エタノールもブタノールも存在せず)。発酵ブロスのサンプルを24時間時点で採取した(表13参照)。
血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルを指定のガスで35psig(50psia)に加圧し、常に振盪しながら37℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを18時間時点で採取した(表14参照)。
血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルを指定のガスで35psig(50psia)に加圧し、常に振盪しながら37℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを1.5時間、3時間、5時間及び24時間の間隔で採取した(表15参照)。
血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルを製鋼所の廃ガス(約53%CO;18%CO2;26%N2;3%H2)で25psig(40psia)に加圧し、常に振盪しながら37℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを1時間、3時間及び5時間の間隔で採取した(表16参照)。
実施例4G:エタノール生成に及ぼすCO2分圧の効果
血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルを指定のガスで35psig(50psia)に加圧し、常に振盪しながら37℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを1時間、3時間及び5時間の間隔で採取した(表17参照)。
実施例5A:バッチ容器中のホルメート濃度:
血清バイアルを上記に従って準備した。ただし、ホルメート水溶液を空のバイアルに加え、NaOHでpHを5.5に調整した後、植菌した。各血清バイアルを50%CO;12.5%CO2;37.5%N2ガスで25psigに加圧し、常に振盪しながら37℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを72時間時点で採取した(表18参照)。
5リットル入りCSTR中の5Lの嫌気性発酵培地(上記のようにして調製)に、活発に増殖中のクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物(DSMZ19630)を5%(v/v)のレベルで植菌した。70%COと15%CO2 1%H2 14%N2ガスの連続流を拡散スパージャーによって60ml/分の体積流速で発酵容器の底部に導入した。発酵槽の初期pHは5.5に維持した。数日間の微生物増殖後、N2を散布した新鮮な発酵培地を2mL/分の流速でCSTRに導入するポンプのスイッチを入れることによって連続培養を確立した。高さ制御装置(level controller)を使用して発酵容器内の培養物の正確な高さを維持する。これは、発酵容器内の高さが高くなりすぎたら自動的にスイッチが入り、高さが設定の高さに下がるまで容器から培養物を汲み出すレベルプローブとポンプを使用することによって行われる。こうすることによって、新鮮培地を培養物に安定供給し、活発に増殖する高生存性培養物を維持することが可能になる。
1L入りCSTR中の1Lの嫌気性発酵培地(上記のように調製、ただし下記の変更あり:低濃度ビタミン溶液[0.4ml/Lのパントテン酸非含有LS03及び500ul/Lのパントテン酸溶液(40mg/L)]をストック溶液に添加した)に、活発に増殖中のクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物(DSMZ19630)を5%(v/v)のレベルで植菌した。35%COと60%H2 5%CH4ガスの連続流を拡散スパージャーによって10ml/分の体積流速で発酵容器の底部に導入した。発酵槽の初期pHは5.5に維持した。数日間の微生物増殖後、ガス流速を20ml/分に上げ、撹拌を200rpmから500rpmに増大した。新鮮培地(上記のように調製、ただし下記の変更あり:低濃度ビタミン溶液[0.4ml/Lのパントテン酸非含有LS03及び1ml/Lのパントテン酸溶液(40mg/L)]をストック溶液に添加した)を、発酵槽内の培地体積を一定に維持しながら導入することによって連続培養を確立した。新鮮培地の流速を数週間かけて6ml/時間から54ml/時間に上げた。数週間の連続運転後、ガス供給を35%CO 45%H2 15%CH4 5%CO2に変え、数週間運転した。エタノールの生産性は約6g/L/日に維持された。52日目、連続培養に供給されている新鮮培地に、pH5.5に緩衝された15g/Lの酢酸を2日間補給した。この間、アルコールの生産性は約15g/Lに増大し(53日目−図3)、その後12g/L(54日目)になった。発酵槽に導入されたアセテートの多くの部分がアルコールに変換されたと考えられる。
1リットル入りCSTR中の1Lの嫌気性LM33発酵培地に、活発に増殖中のクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物(DSMZ19630)を5%(v/v)のレベルで植菌した。70%COと15%CO2 1%H2 14%N2ガスの連続流を拡散スパージャーによって19ml/分の体積流速で発酵容器の底部に導入した。発酵槽の初期pHは5.5に設定した。大部分の実験で、培養物の酢酸濃度は、細胞リサイクル及び培地交換システムによって4g/L未満に維持された。細胞をクロスフロー膜Viva 200に通してろ液を回収し、細胞を発酵容器に戻した。ろ液は新鮮培地と交換して、反応器内の培地体積が一定に保たれるよう確保した。3日目、細胞リサイクルシステムのスイッチを切り、3日間約5.6に維持されていたpH(ORPは−400〜−430mVの間で変動)を上げた。pHは約5.9に調整され、ORPは約−470mVに低下した。
本明細書におけるいずれの先行技術への言及も、その先行技術が世界中のあらゆる国において共通の一般的知識の一部を形成していることの承認又は何らかの形態の示唆ではなく、そのように受け取られるべきでもない。
1a 増殖バイオリアクター
1b 増殖バイオリアクター
2 変換バイオリアクター
3 生成物回収装置
100 発酵システム
101 発酵システム
Claims (22)
- CO及び/又はH2を含む基質の存在下、微生物培養物を使用して酸を対応するアルコールに変換するための方法。
- 前記方法が、
a.バイオリアクター内でCOを含む基質の存在下、一つ又は複数のカルボキシド栄養性細菌株を培養し、一つ又は複数の酸及び場合により一つ又は複数のアルコールを製造し;そして
b.少なくとも一つの酸が少なくとも一つのアルコールに変換されるように微生物培養物を撹乱する
ことを含む、請求項1に記載の方法。 - ステップ(a)で製造された酸の少なくとも一部がステップ(b)でアルコールに変換される、請求項2に記載の方法。
- 前記酸がアセテートであり、前記アルコールがエタノールである、請求項2又は3に記載の方法。
- 少なくとも一つの追加の酸をステップ(a)及び/又はステップ(b)の最中にバイオリアクターに添加でき、少なくとも一つのアルコールに変換することができる、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酸がモノ又はジ−カルボン酸である、請求項2〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 微生物培養物の撹乱が、
・微生物培養物を含有する液体栄養培地のpHを変えること;
・微生物培養物を含有する液体栄養培地のORPを変えること;
・一つ又は複数の酸をバイオリアクターに添加すること;
・一つ又は複数の還元剤をバイオリアクターに添加すること;
・微生物培養物を含有する液体栄養培地中のCO濃度を変えること;
・バイオリアクター内のCO分圧を変えること、この場合、COを含む基質はガス状である;
の一つ又は複数を含む、請求項2〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 添加される酸がホルメート及び/又はアセテートである、請求項7に記載の方法。
- 添加される還元剤が、亜ジチオン酸ナトリウム、システイン及び/又は硫化ナトリウムである、請求項7又は8に記載の方法。
- CO濃度を変えるステップが、液体栄養培地中のCO濃度を少なくとも1mmol増加させることを含む、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
- CO分圧を増大させるステップが、分圧を少なくとも15psi増大させることを含む、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
- CO分圧を増大させるステップが、分圧を少なくとも37psiの十分な閾値より上に増大させることを含む、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)が実質的に第一の増殖バイオリアクターで実施され、ステップ(b)が実質的に第二の変換バイオリアクターで実施される、請求項2〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 一つ又は複数のアルコールの製造法であって、前記方法は、少なくとも、
・第一のバイオリアクターにおいて、基質を発酵させて一つ又は複数の酸を製造させ;
・第二のバイオリアクターにおいて、一酸化炭素を含む基質の存在下、一つ又は複数の細菌株を培養し;
・第一のバイオリアクターからの一つ又は複数の酸を、前記一つ又は複数の細菌株が変換相にあるときに第二のバイオリアクターに導入して、前記一つ又は複数の酸に対応するアルコールを製造させる;ここで、製造されるアルコールは、前記一つ又は複数の細菌株が前記酸の不在下で前記基質上で増殖した場合に製造することができるアルコールではない;
ステップを含む方法。 - 前記方法がメディエーターの不在下で実施される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- COを含む基質がガス状基質である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- COを含む基質が、少なくとも約15%〜約100体積%のCOを含む、請求項16に記載の方法。
- COを含む基質が、少なくとも約40%〜約70体積%のCOを含む、請求項16又は17に記載の方法。
- 基質が製鋼所から得られたガスを含む、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 細菌が、クロストリジウム(Clostridium)、ムーレラ(Moorella)、ピロコッカス(Pyrococcus)、真正細菌(Eubacterium)、デスルホバクテリウム(Desulfobacterium)、カルボキシドサーマス(Carboxydothermus)、アセトゲニウム(Acetogenium)、アセトバクテリウム(Acetobacterium)、アセトアナエロビウム(Acetoanaerobium)、ブチリバクテリウム(Butyribacterium)及びペプトストレプトコッカス(Peptostreptococcus)からなる群から選ばれる、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 細菌がクロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)である、請求項20に記載の方法。
- 発酵システムであって、
・COを含む基質の微生物発酵によって酸及び場合によりアルコールを製造するように適合された少なくとも一つのバイオリアクター;及び
・酸がアルコールに変換されるように微生物発酵を撹乱するための手段
を含む発酵システム。
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