JP2011512869A - 微生物によるアルコール製造プロセス - Google Patents

Abstract

本発明は、微生物発酵によるアルコールの製造、特にＣＯを含む基質の微生物発酵によるアルコールの製造に関する。さらに詳しくは、ＣＯを含む基質の存在下でアルコールをそれらの対応酸から製造するプロセスに関する。特定の態様において、酸及び場合によりアルコールを製造する発酵反応は、一つ又は複数の酸の少なくとも一部がアルコールに変換されるように撹乱される。
【選択図】なし

Description

本発明は、微生物発酵によるアルコールの製造、特にＣＯを含む基質の微生物発酵によるアルコールの製造に関する。さらに詳しくは、アルコールをそれらの対応する酸から製造するプロセスに関する。

アルコールは、香料、製薬及び燃料産業を含む多くの産業で利用されている。例えば、エタノール及びブタノールは、世界中で急速に主要な液体輸送用燃料になりつつある。様々なアルコールの製造法は知られている。工業的なアルコール製造は大部分は石油化学プロセスに由来する合成法である。しかしながら、微生物発酵も、アルコール、例えばバイオ燃料の製造に使用でき、人気上昇中である。

輸送用のバイオ燃料はガソリンの魅力的な代替品であり、低濃度ブレンドとして燃料市場に急速に浸透してきている。天然植物源由来のバイオ燃料は化石資源由来の燃料（例えばガソリン）よりも環境的に持続可能で、それらの使用は、燃料燃焼の結果大気中に放出されるいわゆる化石二酸化炭素（ＣＯ_２）ガスのレベルの低減を可能にする。その上、バイオ燃料は多くの地域で地元生産できるので、輸入化石エネルギー資源への依存を削減するのにも役立つ。バイオ燃料として使用するのに適切なアルコールは、とりわけエタノール、ブタノール及び２，３−ブタンジオールなどである。

エタノールは急速に世界中で主要な水素豊富液体輸送用燃料になりつつある。２００５年におけるエタノールの世界的消費は推定１２２億ガロンであった。燃料エタノール産業に関する世界市場も、ヨーロッパ、日本、米国、及びいくつかの発展途上国でエタノールへの関心が高まっているため、将来的に急成長を続けると予測されている。

例えば、米国では、エタノールは、エタノール１０％混合ガソリンであるＥ１０の製造に使用されている。Ｅ１０ブレンドでは、エタノール成分は酸素化剤として作用し、燃焼効率を改良し、大気汚染物質の生成を削減する。ブラジルでは、エタノールは、ガソリンにブレンドされる酸素化剤として又はそれ自体でも純燃料として輸送用燃料需要の約３０％を満たしている。ヨーロッパでも、温室効果ガス（ＧＨＧ）排出の結果を取り巻く環境的懸念が刺激となり、欧州連合は、加盟国に対して持続可能な輸送用バイオ燃料の消費に関する義務的目標を設定している。

ブタノールも内燃機関の燃料として使用できる。ブタノールは、いくつかの点でエタノールよりもガソリンに類似している。環境的に持続可能な燃料の製造及び応用への関心の高まりにつれて、ブタノール（バイオブタノールと呼ばれることも多い）を製造するための生物学的プロセスへの関心も高まっている。ブタノールは、砂糖大根、トウモロコシ、小麦及びサトウキビのような作物由来のバイオマスの微生物発酵によって製造できる。しかしながら、これらの炭水化物原料のコストは、人間の食料又は動物飼料としてのそれらの価値によって影響され、また、ブタノール製造用のデンプン又はショ糖生産作物の耕作は、すべての地域で経済的に持続可能とは限らない。そこで、より低コスト及び／又はより豊富な炭素資源を燃料ブタノールに変換するための技術開発に関心が寄せられている。

嫌気性細菌、例えばクロストリジウム属(genus Clostridium)の細菌は、アセチルＣｏＡ生化学的経路を介してＣＯ、ＣＯ_２及びＨ_２からエタノールを生成することが示されている。例えば、ガスからエタノールを生成する様々なクロストリジウム・リュングダリイ(Clostridium ljungdahlii)株が、ＷＯ００／６８４０７、ＥＰ１１７３０９、米国特許第５，１７３，４２９号、５，５９３，８８６号及び６，３６８，８１９号、ＷＯ９８／００５５８及びＷＯ０２／０８４３８に記載されている。細菌のクロストリジウム・オートエタノゲナム種(Clostridium autoethanogenum sp)もガスからエタノールを生成することが知られている（Ａｂｒｉｎｉら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １６１，ｐｐ３４５−３５１（１９９４））。

しかしながら、微生物によるガスの発酵によるエタノール生成は通常アセテート及び／又は酢酸の同時生成を伴う。利用可能な炭素の一部はエタノールではなくアセテート／酢酸に変換されてしまうので、そのような発酵プロセスを用いるエタノールの製造効率は望ましいとは言い難い。また、アセテート／酢酸の副産物が何か他の目的に使用できない限り、それは廃棄物処理問題を提起しうる。アセテート／酢酸は微生物によってメタンに変換されるので、ＧＨＧ排出に寄与する可能性もある。酪酸／ブチレートなどのその他の廃棄物も、よく使用される発酵プロセス中に製造されうる。

さらに、典型的には酵母又は細菌を利用する生物学的発酵プロセスは、特定の微生物がそれが増殖する基質（例えば炭水化物又は一酸化炭素を含むガス）から製造可能な１種類又は２種類のアルコールの製造に限定されうる。異なるアルコールを製造したければ、異なる微生物の供給が必要とされうる。多くの場合、所望のアルコールを生成可能な細菌を調達することはできない。そこで、より低コスト及び／又はより豊富な炭素資源、例えば有機酸を燃料エタノールのような所望生成物に変換するための技術開発に関心が寄せられている。

酸をそれらの対応アルコールに微生物変換するための方法は、これまでに米国特許第４，８５１，３４４号；Ｗｈｉｔｅ及びＳｉｍｏｎ，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９２）１５８：８１−８４；Ｈｕｂｅｒら，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９５）１６４：１１０−１１８に記載されている。しかしながら、これらの方法もいくつかの不利益に苦しんでいる。例えば、それらは化学メディエーターの使用を必要とし、その多くは有毒及び／又は高価である。さらに、それらの方法は、酸からアルコールへの変換前に遠沈及び緩衝液への再懸濁が必要な、休眠状態の細胞抽出物、又は単離細胞を使用する。これらの加工ステップは労働集約的であり（大きな労働を必要とし）、また微生物が酸素に暴露され、溶解され、又はその他の損傷を受けるリスクを増大する。

ＷＯ００／６８４０７ ＥＰ１１７３０９ 米国特許第５，１７３，４２９号 米国特許第５，５９３，８８６号 米国特許第６，３６８，８１９号 ＷＯ９８／００５５８ ＷＯ０２／０８４３８ 米国特許第４，８５１，３４４号

Abrini et al., Archives of Microbiology 161, pp345-351(1994) White and Simon, Arch Microbiol (1992) 158:81-84 Huber et al, Arch Microbiol (1995) 164:110-118

本発明は、当該技術分野で知られている方法の一定の不利益を克服する、又は少なくとも公衆に有用な選択肢を提供する嫌気的細菌発酵による有益なアルコールの製造プロセスを提供する。

一つの広い側面において、本発明は、一酸化炭素及び／又は水素を含む基質上で増殖する代謝的に活性な細菌を用いて酸をその対応するアルコールに変換するための方法を提供する。

特定の態様において、該方法は、
ａ．バイオリアクター内でＣＯを含む基質の存在下、一つ又は複数のカルボキシド栄養性(carboxydotrophic)細菌株を培養し、一つ又は複数の酸及び場合により一つ又は複数のアルコールを製造し；そして
ｂ．少なくとも一つの酸が少なくとも一つのアルコールに変換されるように微生物培養物を撹乱(perturbing)する
ことを含む。

典型的には、ステップ（ａ）で製造された酸の少なくとも一部は、ステップ（ｂ）でアルコールに変換される。さらに又は代替的に、追加の酸をステップ（ａ）及び／又はステップ（ｂ）の最中にバイオリアクターに加えて、少なくとも一つのアルコールに変換することもできる。

一定の態様において、微生物培養物の撹乱(perturbing)とは、
・微生物培養物を含有する液体栄養培地のｐＨを変えること；
・微生物培養物を含有する液体栄養培地のＯＲＰを変えること；
・一つ又は複数の酸をバイオリアクターに添加すること；
・一つ又は複数の還元剤をバイオリアクターに添加すること；
・微生物培養物を含有する液体栄養培地中のＣＯ濃度を変えること；
・バイオリアクター内のＣＯ分圧を変えること、この場合、ＣＯを含む基質はガス状である；
の一つ又は複数を含む。

特定の態様において、ＣＯ濃度を変えるステップは、液体栄養培地中のＣＯ濃度を少なくとも１ｍｍｏｌ増加させることを含む。
別の広い側面において、本発明は、アルコールの製造法を提供し、該方法は、少なくとも、
（ａ）バイオリアクター内で一酸化炭素を含む基質の存在下、一つ又は複数の細菌株を培養し；
（ｂ）前記一つ又は複数の細菌株が変換相にあるときにバイオリアクターに酸を添加し、その酸の対応するアルコールを製造させ；ここで、製造されるアルコールは、前記一つ又は複数の細菌株が前記酸の不在下で前記基質上で増殖した場合に製造することができるアルコールではない；
ステップを含む。

上記側面の特定の態様において、該方法はメディエーターの不在下で実施される。
一態様においては、二つ以上の酸をバイオリアクターに添加して、二つ以上の対応アルコールを製造する。

一定の態様において、一つ又は複数の細菌は、酸をその対応するアルコールに還元するのにアルデヒドオキシド−レダクターゼ（ＡＯＲ）経路を使用することができる細菌である。適切な細菌は、クロストリジウム(Clostridia)、ムーレラ(Moorella)、真正細菌(Eubacterium)、アセトバクテリウム(Acetobacteria)、ブチリバクテリウム(Butyribacterium)及びデスルホバクテリウム(desulfobacterium)属の種などである。特定の態様において、細菌はクロストリジウム・オートエタノゲナム (Clostridium autoethanogenum)である。

典型的には、前記酸はモノカルボン酸又はジカルボン酸である。特定の態様において、前記酸は、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、ｎ−ペンタン酸、ｎ−ヘキサン酸、及び安息香酸から選ばれる。

特定の態様において、製造されるアルコールは、エタノール、１−プロパノール、１−ブタノール、１−ペンタノール、１−ヘキサノール、及びベンジルアルコールから選ばれる。

別の広い側面において、本発明は、ブタノールの製造法を提供し、該方法は、少なくとも、
（ａ）バイオリアクター内で一酸化炭素を含む基質の存在下、ブタノール以外のアルコールを製造するように適合された一つ又は複数の細菌株を培養し；
（ｂ）前記一つ又は複数の細菌株がブタノール以外のアルコールを活発に製造しているときにバイオリアクターにブチレートを添加することによってブタノールを製造させる；
ステップを含む。

別の広い側面において、本発明は、ブタノールの製造法を提供し、該方法は、少なくとも、
（ａ）バイオリアクター内で一酸化炭素を含む基質の存在下、エタノールを製造するように適合された一つ又は複数の細菌株を培養し；
（ｂ）前記一つ又は複数の細菌株がエタノールを活発に製造しているときにバイオリアクターにブチレートを添加することによってブタノールを製造させる；
ステップを含む。

別の広い側面において、本発明は、アルコールの製造法を提供し、該方法は、少なくとも、
（ａ）バイオリアクター内で一酸化炭素を含む基質の存在下、クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)を培養し；
（ｂ）クロストリジウム・オートエタノゲナムが変換相にあるときにバイオリアクターに酸を添加し、その酸の対応するアルコールを製造させ；ここで、製造されるアルコールは、クロストリジウム・オートエタノゲナムが前記酸の不在下で前記基質上で増殖した場合に製造することができるアルコールではない；
ステップを含む。

好適な広い側面において、本発明は、ブタノールの製造法を提供し、該方法は、少なくとも、
（ａ）バイオリアクター内で一酸化炭素を含む基質の存在下、クロストリジウム・オートエタノゲナムを培養し；
（ｂ）クロストリジウム・オートエタノゲナムが変換相にあるときにバイオリアクターにブチレートを添加してブタノールを製造させる；
ステップを含む。

本発明の方法は典型的にはメディエーターの不在下で実施される。
特定の態様において、本発明の方法に従ってバイオリアクターに添加される酸は、一酸化炭素を含む基質の微生物発酵によって製造される。

一定の態様において、細菌は、酵母エキス及び／又はペプトンの不在下、液体培地中で培養される。一態様において、前記培地は、以下に記載されるＬＭ２３又はＬＭ３３である。

別の広い側面において、本発明は、一つ又は複数のアルコールの製造法を提供し、該方法は、少なくとも、
（ａ）第一のバイオリアクターにおいて、基質を発酵させて一つ又は複数の酸を製造させ；
（ｂ）第二のバイオリアクターにおいて、一酸化炭素を含む基質の存在下、一つ又は複数の細菌株を培養し；
（ｃ）（ａ）からの一つ又は複数の酸を、前記一つ又は複数の細菌株が溶媒生成相(solventogenic phase)にあるときに第二のバイオリアクターに導入して、前記一つ又は複数の酸に対応するアルコールを製造させる；ここで、製造されるアルコールは、前記一つ又は複数の細菌株が前記酸の不在下で前記基質上で増殖した場合に製造することができるアルコールではない；
ステップを含む。

特定の態様において、前記方法はメディエーターの不在下で実施される。
一定の態様において、第二のバイオリアクター内の一つ又は複数の細菌株は上記定義の通りである。

本発明の別の側面において、ＣＯを含む基質の存在下、バイオリアクター内での酸の嫌気的細菌発酵によるアルコールの製造法を提供する。
一態様において、基質は、酸からアルコールへの変換が促進されるようなＣＯ濃度で供給される。

一態様において、ＣＯの濃度は、酸からアルコールへの変換が促進されるように、十分な閾値濃度より高い。この十分な閾値濃度より高いＣＯを発酵に供給することは、酸からアルコールへの変換は促進しながらも、酸の生成を削減又は防止及び／又は微生物増殖を削減又は防止する。

一態様において、基質は、少なくとも約２．５ｍｍｏｌ／Ｌの発酵培地中ＣＯ濃度で供給される。一態様において、ＣＯ濃度は少なくとも約２．７５ｍｍｏｌ／Ｌである。一態様において、ＣＯ濃度は少なくとも約３ｍｍｏｌ／Ｌである。一態様において、該濃度は少なくとも約３．５ｍｍｏｌ／Ｌである。

当業者であれば、本開示を考慮すると、発酵培地中のＣＯの溶解度を増大するための多くの方法があることは分かるであろう。例えば、温度変化及び／又はオイルなどの可溶化剤の添加などであるが、これらに限定されない。そのような方法は、発酵培地中の特定のＣＯ濃度を達成するために、必要に応じて又は所望に応じて、本発明の実施において採用できる。

一態様において、ＣＯを含む基質はガス状基質であり、発酵培地中に溶解されるＣＯの量は発酵におけるＣＯ分圧に比例する。従って、発酵培地中の十分な閾値濃度は、ＣＯ分圧を増大させることによって達成できる。一態様において、ガス状基質は、ＣＯ分圧が少なくとも約３７ｐｓｉであるように供給される。別の態様において、ＣＯ分圧は少なくとも約４７ｐｓｉである。

本発明の方法に従って、追加の酸をバイオリアクターに供給し、アルコールに変換することができる。
本発明の様々な態様において、該方法は、発酵によって生成した一つ又は複数のアルコールを捕捉及び回収するステップを含む。

本発明の別の側面において、アルコール及び／又は酸の製造法を提供し、該方法は、バイオリアクター内で第一の基質を嫌気的に発酵してアルコール及び／又は酸を含む一つ又は複数の生成物を製造することを含み、該方法においては、ＣＯを含む第二の基質を所望の時点で添加して、エタノールのようなアルコールの生成がアセテートのような酸に比して増大するようにする。

一態様において、ＣＯを含む第二の基質の添加は、得られる溶解ＣＯ濃度が該発酵の十分な閾値濃度であるか又はそれを上回れば、酸の少なくとも一部のアルコールへの変換をもたらす。

一態様においては、第一の基質もＣＯを含む。しかしながら、該方法はそのような態様に限定されない。例えば、一部の態様において、第一の基質は一つ又は複数の炭水化物又はピルベートを含みうる。適切な炭水化物は、セルロース、セルロース加水分解物、デンプン、デンプン加水分解物、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、又はラクトースなどでありうるが、これらに限定されない。一部の態様において、炭水化物はフルクトース又はキシロースである。他の態様において、第一の基質はＣＯ_２及び／又はＨ_２又は発酵によって酸及び／又はアルコールを製造するのに適切な何らかのその他の成分を含みうる。

様々な態様において、該方法は、発酵によって生成した一つ又は複数のアルコールを捕捉及び回収するステップを含む。
本発明の別の側面において、アルコール及び／又は酸の製造法を提供し、該方法は、
（ａ）ＣＯを含む基質を第一の濃度で一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクターに供給し；そして
（ｂ）バイオリアクター内の培養物を嫌気的に発酵して前記基質からアルコール及び／又は酸を含む一つ又は複数の生成物を製造する
ステップを含み、バイオリアクターに供給される基質の濃度は、酸に比してアルコールの生成が増大するように、所望の時点で場合により増大させることができる。

様々な態様において、基質の濃度の増大は、酸の少なくとも一部のアルコールへの変換をもたらす。及び／又は基質の濃度を、酸の少なくとも一部がアルコールに変換される十分な閾値より高く増大させることができる。

様々な態様において、該方法は、発酵によって生成した一つ又は複数の生成物を捕捉及び回収するステップを含む。
本発明の別の側面において、アルコール及び／又は酸の製造法を提供し、該方法は、
（ａ）ＣＯを含むガス状基質を第一のＣＯ分圧で一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクターに供給し；そして
（ｂ）バイオリアクター内の培養物を嫌気的に発酵して前記基質からエタノール及び／又は酢酸を含む一つ又は複数の生成物を製造する
ステップを含み、ＣＯ分圧は、アセテートに比してエタノールの生成が増大するように、所望の時点で場合により増大させることができる。

一態様において、該方法は、微生物の増殖及び／又は一つ又は複数の生成物の濃度及び／又はＣＯ濃度をモニターすることを含み、所望の生成物及び／又はＣＯ濃度でＣＯ分圧を増大させることができる。一態様において、ＣＯ分圧は約２７ｐｓｉより上に増大できる。

様々な態様において、ＣＯ分圧の増大は、酸の少なくとも一部のアルコールへの変換をもたらす。及び／又はＣＯ分圧を、酸の少なくとも一部がアルコールに変換される十分な閾値より高く増大させることができる。

様々な態様において、該方法は、発酵によって生成したアルコールを捕捉及び回収するステップを含む。
本発明の別の側面に従って、微生物の増殖及び／又は酸の生成の調節法を提供し、該方法は、
（ａ）ＣＯを含むガス状基質を第一のＣＯ分圧で一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクターに供給し；そして
（ｂ）バイオリアクター内の培養物を嫌気的に発酵して前記基質からエタノール及び／又は酢酸を含む一つ又は複数の生成物を製造する
ステップを含み、ＣＯ分圧は、微生物の増殖及び／又は酸の生成が削減又は実質的に阻害されるように、所望の時点で増大させることができる。

様々な態様において、ＣＯ分圧の増大は、酸の少なくとも一部のアルコールへの変換をもたらす。及び／又はＣＯ分圧を、酸の少なくとも一部がアルコールに変換される十分な閾値より高く増大させることができる。

一態様において、微生物の増殖及び／又は酸の生成は、ＣＯ分圧が低下すると、増大／促進（又は再開）されうる。
様々な態様において、該方法は、発酵によって生成したアルコールを捕捉及び回収するステップを含む。

本発明の別の側面に従って、アルコール生成の調節法を提供し、該方法は、
（ａ）ＣＯを含むガス状基質を第一のＣＯ分圧で一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクターに供給し；
（ｂ）バイオリアクター内の培養物を嫌気的に発酵して前記基質からエタノール及び／又は酢酸を含む一つ又は複数の生成物を製造し；
（ｃ）ＣＯ分圧を、酸の少なくとも一部がエタノールに変換されるように、十分な閾値より高く増大させ；そして
（ｄ）場合により、その後、ＣＯ分圧を、微生物増殖及び酸生成が促進されるように閾値未満に低下させる
ステップを含む。

様々な態様において、アルコール及び酸の生成及び／又は微生物の増殖は、発酵の間ずっとモニターできる。及び／又はステップ（ｃ）及び（ｄ）は少なくとも１回繰り返される。

本発明の態様は、ＣＯを含むガス状基質の存在下における酸の発酵に特に応用される。該基質は、産業プロセスの副産物として得られたガスを含みうる。一定の態様において、産業プロセスは、鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製プロセス、バイオマスのガス化、石炭のガス化、発電、カーボンブラック製造、アンモニア製造、メタノール製造及びコークス製造からなる群から選ばれる。本発明の一態様において、ガス状基質は合成ガスである。一態様において、ガス状基質は、製鋼所から得られるガスを含む。

ＣＯ含有基質は典型的には主要割合のＣＯを含有する。例えば、少なくとも約２０％〜約１００体積％のＣＯ、４０％〜９５体積％のＣＯ、４０％〜６０体積％のＣＯ、及び４５％〜５５体積％のＣＯである。特定の態様において、該基質は、約２５％、又は約３０％、又は約３５％、又は約４０％、又は約４５％、又は約５０％のＣＯ、又は約５５％のＣＯ、又は約６０体積％のＣＯを含む。６％といった低いＣＯ濃度を有する基質も、特にＨ_２及びＣＯ_２も併存している場合、適切なこともある。

様々な態様において、発酵は、一つ又は複数のカルボキシド栄養性細菌株を用いて実施される。様々な態様において、該カルボキシド栄養性細菌は、クロストリジウム(Clostridium)、ムーレラ(Moorella)、オキソバクター(Oxobacter)、ペプトストレプトコッカス(Peptostreptococcus)、アセトバクテリウム(Acetobacterium)、真正細菌(Eubacterium)又はブチリバクテリウム(Butyribacterium)から選ばれる。一態様において、カルボキシド栄養性細菌はクロストリジウム・オートエタノゲナム (Clostridium autoethanogenum)である。

本発明の方法は、一酸化炭素を含有する基質、特にガス状基質の存在下、酸の嫌気的発酵によって、これらに限定されないが、エタノール及び／又はブタノールを含む様々なアルコールのいずれかを製造するのに使用できる。本発明の方法は、好気的発酵、これに限定されないがイソプロパノールを含むその他の生成物の嫌気的又は好気的発酵、及び炭素含有ガス以外の基質の発酵にも適用できる。

本発明は、本願の明細書において言及又は指示された部品、構成要素及び特徴を、個別にも又は集団的にも、前記部品、構成要素又は特徴の二つ以上のいずれか及びすべての組合せでも含みうる。また、本明細書中で特定の整数が言及され、それが本発明の関連する技術分野で公知の等価物を有している場合、そのような公知の等価物もあたかも個別に示されたかのごとく本明細書に組み込まれると見なされる。

あらゆる新規側面において考慮されるべき本発明のこれら及びその他の側面は、添付の図面に関する下記説明を読むことによって明らかになるであろう。下記説明はほんの一例として示されたものである。
図１は、血清ボトル中でのＣ．オートエタノゲナムによるブチレートからブタノールへの変換を示す。出発条件：アセテート（４．７ｇ／ｌ）及びエタノール（１．２ｇ／ｌ）を生成しているＣ．オートエタノゲナムの活性培養物。ｐＨ５．５。上部空間：ＣＯ_２中９５％ＣＯの２５ｐｓｉｇ過剰圧。終末条件：ｐＨ６．３５、アセテート（４．７ｇ／ｌ）、エタノール（３．２ｇ／ｌ）、上部空間：１４ｐｓｉｇ過剰圧。 図２は、アセテート及び最小のエタノールを生成しているクロストリジウム・オートエタノゲナムのバッチ培養物へのホルメート添加の効果を示す。ホルメート溶液をｔ＝０及びｔ＝３０分（約）に添加し、その後ｔ＝６０分（約）に連続的に添加されるようにした。 図３は、約６ｇ／Ｌ／日のエタノール及び１ｇ／Ｌ／日のアセテートを生成しているクロストリジウム・オートエタノゲナムの連続培養物へのアセテート添加の効果を示す。５２日目からアセテート（１５ｇ／Ｌ／日）を連続的に添加した。 図４は、アセテート及びエタノールを生成しているクロストリジウム・オートエタノゲナムを含む微生物培養物に及ぼすｐＨ変化の効果を示す。約ｔ＝３日に、細胞リサイクルを開始して約２時間した後、ｐＨを５．９に調整した。ｐＨ変化後、アセテートが消費され、増量したエタノールが生成した。 図５は、本発明の特定の態様による増殖バイオリアクターと変換バイオリアクターを含むシステムを示す。 図６は、本発明の特定の態様による複数の増殖バイオリアクターと変換バイオリアクターを含むシステムを示す。

以下は、本発明を、その様々な態様を含め、概括的な言葉で記載したものである。本発明はさらに、本発明を支持する実験データ、本発明の側面の具体的実施例、及び本発明を実施するための例示的手段を提供する以下の“実施例”の項目の下に与えられた開示の中でも例証される。

酸及びアルコールを含む生成物は、ＣＯを含む基質から微生物培養物によって製造できる。本発明の方法によれば、微生物培養物を撹乱すると、驚くべきことに、微生物培養物による酸の消費と同時にアルコールの生成をもたらす。この結果は、発酵ブロス中に存在する酸の少なくとも一部が直接又は間接的にアルコール、特にエタノールに還元されるためであろうと考えられる。これは、発酵反応の“変換相”と呼ぶことができる。本発明の方法によれば、発酵反応は、微生物増殖が促進され、アルコール及び／又は酸が生成する生成（又は増殖）相から、微生物培養物を撹乱することによって変換相に切り替えることができる。

微生物培養物の少なくとも一部は生成相にあるとしても、少なくとも一部は変換相にあると認識されている。しかしながら、撹乱により、生成相にある微生物培養物の少なくとも一部は変換相に切り替わり、その結果、酸に比してアルコールの生成が増大する。特定の態様において、酸の総正味消費及びアルコール生成がある。

本発明の一態様によれば、ＣＯを含む基質からアセテート及び場合によりエタノールなどの生成物を生成する微生物培養物を撹乱すると、微生物発酵によってエタノールが生成する。撹乱の後、ＣＯの少なくとも一部は酸及び／又はアルコールに変換されうるが、エタノールの大部分は、酢酸／アセテートの微生物的還元によって生成する（‘変換’）。

ＣＯを含む基質を用いてアルコール及び／又は酸を同時に生成する発酵反応の例は多数ある。しかしながら、そのような例では、生成物比は一般的に酸（すなわち酢酸／アセテート）の方がアルコール（エタノール）よりも優位である。本発明の別の態様において、特定の発酵条件は酸生成よりもアルコール生成に優位に働く。そのような条件下では、発酵槽に添加された追加の酸を、微生物培養物によって対応するアルコールに変換させることができる。例えば、酪酸のような酸を発酵反応に添加して、ブチレートのようなアルコールに変換させることができる。

本発明の方法によれば、驚くべきことに、酸からアルコールへの変換を補助するのにメチルビオロゲンのようなメディエーターが必要ないことが見出された。実際、メチルビオロゲンは、Ｃ．オートエタノゲナムによるブタノール生成に悪影響を及ぼすことが確認されている。このことは、酸からそれらの対応アルコールへの微生物変換にはメディエーターが必要であるという報告とは対照をなす。

何らかの特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明の方法によるクロストリジウム・オートエタノゲナムによる酸のアルコールへの変換は、酵素のアルデヒドオキシド−レダクターゼ（ＡＯＲ）が関与する生化学的経路によって起こると考えられる。ＡＯＲは、非活性化カルボン酸をアルデヒドに還元できる独特のタングステン含有酵素である。アルデヒドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼによってアルコールにさらに還元できる。ＡＯＲは溶媒生成(solventogenesis)経路の重要な分枝である。タングステン補因子は酵素活性に極めて重要であることが示されている。これらの酵素は、クロストリジウム、デスルフィトバクテリウム(Desulfitobacterium)、及びピロコッカス(Pyrococcus)のような発酵性微生物に見出すことができる。最も良く特徴付けされたＡＯＲはピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)に属する。そのゲノムは５個を含有し、そのうちの４個が特徴付けされている。Ｐ．フリオサスの第一のＡＯＲは広い基質範囲を有しているが、アミノ酸から誘導されたアルデヒドを好む。その結晶構造から、モリブドプテリンに基づくタングステン結合部位の存在が明らかになった。第二のＡＯＲは、グリセルアルデヒド−３−リン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）で、グリセルアルデヒド−３−リン酸のみを利用する。第三のＡＯＲ、ホルムアルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＦＯＲ）は１〜３炭素アルデヒドを好む。第四のＡＯＲであるＷＯＲ５は、広い基質範囲を有する。ＡＯＲは、クロストリジウム・フォルミコアセチカム(Clostridium formicoaceticum)及びサーモアセチカム(thermoaceticum)からも精製されている。

クロストリジウム・オートエタノゲナムは、Ｐ．フリオサスのＡＯＲと〜５６％及びボツリヌス菌(Clostridium botulinum)と〜８０％の同一性を共有する二つの推定ＡＯＲ遺伝子を含有している。ＡＯＲ遺伝子は、Ｃ．オートエタノゲナムの最も近い配列類縁体クロストリジウム・クルイベリ(Clostridium kluyveri)とは著しい相違をなす。このゲノムはＡＯＲ遺伝子を含有せず、アルコール生成はアセチル−ＣｏＡを介して進行する。得られた結果は、クロストリジウム・オートエタノゲナム又はＡＯＲ経路を利用できるあらゆるその他の細菌を用いて任意のアルコールをその対応酸から製造するのに適用できると考えられる。

このように、その広い側面において、本発明は、微生物培養物を用いて酸をその対応するアルコールに変換するための方法を提供する。特定の態様において、微生物培養物は、ＣＯ及び／又はＨ_２を含む基質の存在下で酸をアルコールに変換する。

定義
特に断りのない限り、本明細書全体にわたって使用される下記の用語は以下のように定義される。

本明細書において“変換相”という用語は、細菌が一つ又は複数の酸を発酵して一つ又は複数のアルコールを生成している期間のことを言うものとする。典型的には、細菌集団の少なくとも一部はそのような相にある。しかしながら、集団中の全細菌が活発にアルコールを生成している必要はない。変換相は、発酵ブロス中のアルコールレベルの存在によって特徴付けられる。

微生物培養物に関して本明細書中で使用される“撹乱する”、“撹乱”という用語は、微生物培養物に直接的又は間接的に影響する、なされるあらゆる変更を含むものとする。微生物培養物に対してなされる変更は、ｐＨ、ＣＯ濃度、ＯＲＰなどの発酵運転条件の変更、又は培養物を含有する液体栄養培地の組成の変更などである。

本明細書において“微生物培養物”という用語は、増殖及び／又は代謝産物産生を促進するのに適切な栄養培地中及び／又は上に支持された少なくとも一つの微生物を含むものとする。

本明細書中で述べたように、本発明の方法によって“製造されたアルコール”は、一つ又は複数の細菌株が対応する酸の不在下で基質上で増殖している場合に製造できるアルコールではない。しかしながら、当該方法は、追加の生成物、例えば細菌がそれが培養されている基質から発酵する酸又はアルコールも製造しうることは理解されるはずである。当該方法によって“製造されたアルコール”は、“一次アルコール”又は“一次生成物”と呼ばれ、何らかの追加的生成物は“副産物”と呼ばれうる。“一次”という用語の使用は、副産物と比べた特定レベルの生成物を意味すると取るべきではない。

本明細書において“酸化還元メディエーター”等は、可逆的な電子供与体及び／又は電子受容体として作用する電子シャトルのことを言うものとする。メディエーターは、ビオロゲン染料（例えばメチルビオロゲン）、アントラキノン及びその他のキノン染料、トリフェニルメタン染料、フタロシアニム(phthalocyanimes)、メチン染料、ピロール染料、ポルフィリン染料、プテリジン、プテリドン、フラビン、及び二次的VI、VII及びVIII族の金属複合体などである。

本発明に従って培養物又はバイオリアクターに“酸”を添加すると言うときに使用される用語“酸（一つ又は複数）”は、あらゆるモノカルボン酸及びジカルボン酸を含めて広く解釈されるべきである。さらに、“酸”の添加への言及は、等価の塩又は塩と酸の混合物への言及も含むと解釈されるべきである。同様に、本明細書において特定の酸への言及は、等価の塩への言及も含むと解釈されるべきである（例えば酪酸とブチレート）（逆も同様）。発酵ブロス中の分子酸対カルボキシレートの比率は系のｐＨに依存する。酸の例は、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、ｎ−ペンタン酸、ｎ−ヘキサン酸、及び安息香酸などである。

“バイオリアクター”という用語は、一つ又は複数の容器及び／又は塔又は配管からなる発酵装置を含み、連続撹拌槽リアクター（Continuous Stirred Tank Reactor, ＣＳＴＲ）、固定化細胞リアクター（Immobilized Cell Reactor, ＩＣＲ）、細流床リアクター（Trickle Bed Reactor, ＴＢＲ）、バブルカラム(Bubble Column)、ガスリフト発酵槽(Gas Lift Fermenter)、膜リアクター(Membrane Reactor)、例えば中空繊維膜バイオリアクター（Hollow Fiber Membrane Bioreactor，ＨＦＭＢＲ）、静的ミキサー(Static Mixer)、又は気液接触に適切なその他の容器又はその他の装置を含む。

本明細書中でさらに説明するように、一部の態様において、バイオリアクターは第一の増殖リアクターと第二の発酵リアクターを含みうる。従って、一つ又は複数の炭水化物をバイオリアクター又は発酵反応に添加すると言う場合、必要に応じてこれらのリアクターのいずれか又は両方に添加することを含むと理解されるべきである。

“一酸化炭素を含む基質”という用語は、発酵のためにバイオリアクターに導入できるＣＯを含有する何らかの固体、液体又は気体材料を含む。“一酸化炭素を含むガス状基質”は、一酸化炭素を含有するあらゆるガスを含む。ガス状基質は、典型的には、相当割合のＣＯ、例えば、少なくとも約１５％〜約９５体積％のＣＯを含有する。

“溶解ＣＯ濃度”という用語は、発酵ブロス／培地中に存在するＣＯの、体積の関数としての量を含む。
“ＣＯ分圧”などの用語は、ＣＯ及び任意の追加のガスを含むガス状基質中のＣＯによって系にかけられる相対圧力を含む。

“閾値濃度”、“十分な閾値濃度”などの語句は定量的に定義できるが、異なる微生物に応じて使用されるような異なる発酵条件下で変動しうる。前記用語は、微生物が、基質からの実質的なアルコール及び／又は酸生成から、長期間のアルコール生成及び酸消費に切り替わる濃度又は濃度範囲を含む。

文脈上他の意味に解すべき場合を除き、“発酵する”、“発酵プロセス”又は“発酵反応”などの語句は、本明細書中では、増殖／及び又は微生物による生成物の生合成が関与するプロセスの増殖相及び生成物生合成相の両方を包含するものとする。

本発明の方法によれば、酸及びアルコールを含む生成物は、ＣＯを含む基質、例えばＣＯを含むガス状基質から微生物発酵によって製造される。本発明の特定の態様において、酸及び場合によりアルコールなどの生成物を生成している活発に増殖中の微生物培養物を撹乱すると、微生物培養物の少なくとも一部が一つ又は複数の酸を消費し、一つ又は複数の対応するアルコールを生成するようにすることができる。この結果は、発酵ブロス中に存在する酸の少なくとも一部が直接又は間接的にアルコール、特にエタノールに還元されることによるものであろう。これを発酵反応の“変換相”と呼ぶことができる。本発明の特定の態様によれば、発酵反応は、微生物増殖が促進されアルコール及び／又は酸が製造される実質的生成相から、発酵反応におけるＣＯ濃度を増大する変換相に切り替えることができる。

本発明の別の態様において、活発に増殖中の培養物の少なくとも一部はアルコールを生成中であってよく、撹乱は一つ又は複数の酸を培養物に前記一つ又は複数の酸の少なくとも一部が一つ又は複数のアルコールに変換されるように添加することを含む。

一般的に、本発明の方法は、少なくとも、
（ａ）バイオリアクター内で一酸化炭素を含む基質の存在下、一つ又は複数の細菌株を培養し、一つ又は複数の酸及び場合により一つ又は複数のアルコールを製造し；そして
（ｂ）少なくとも一つの酸が少なくとも一つのアルコールに変換されるように培養細菌を撹乱する
ことを含む。

特定の態様において、ステップ（ａ）の間に細菌によって製造される酸の少なくとも一部はステップ（ｂ）で対応するアルコールに変換される。しかしながら、特定の態様において、追加の酸をバイオリアクターに添加して、ステップ（ｂ）で前記追加された酸の少なくとも一部がアルコールに変換されるようにすることができる。そのような態様において、製造されるアルコールは、一つ又は複数の細菌株が前記酸の不在下で基質上で増殖する場合に製造できるアルコールでなくてもよい。当該方法は好ましくはメディエーターの不在下で実施される。

特定の態様において、該方法は、少なくとも、
（ａ）バイオリアクター内で一酸化炭素を含む基質の存在下、一つ又は複数の細菌株を培養し、ここで前記細菌はアルコールを生成しており；そして
（ｂ）前記培養細菌に、前記培養物の少なくとも一部がアルコールを製造するための変換相にあるときに酸を添加する；
ステップを含む。

ＣＯを含む基質を用いてアルコール及び／又は酸を同時に生成する発酵反応の例は多数ある。しかしながら、そのような例では、生成物比は一般的に酸（すなわち酢酸／アセテート）の方がアルコール（エタノール）よりも優位である。

微生物培養物を生成相から変換相に切り替えるための適切な撹乱は、発酵培地のｐＨ及び／又はＯＲＰの変更；発酵ブロス中のＣＯ濃度の変更（当業者であれば、発酵法に応じてこれを達成するための多数の方法があることは分かるであろう。例えばガス組成の変更、ガス圧の変更、ガス流速の変更、ＣＳＴＲ中の撹拌速度の変更などである）；還元剤の添加；一つ又は複数の酸の添加などであるが、これらに限定されない。

従って、本発明の特定の態様において、微生物培養物の撹乱は、
・微生物培養物を含有する液体栄養培地のｐＨを変える；
・微生物培養物を含有する液体栄養培地のＯＲＰを変える；
・一つ又は複数の酸をバイオリアクターに添加する；
・一つ又は複数の還元剤をバイオリアクターに添加する；
・微生物培養物を含有する液体栄養培地中のＣＯ濃度を変える；
・バイオリアクター内のＣＯ分圧を変える、この場合、ＣＯを含む基質はガス状である；
の一つ又は複数を含む。

以下の記載は、本発明の特定の態様に焦点を合わせるが、本発明は代替のアルコールをそれらの対応する酸から製造するのにも適用可能であることは理解されるべきである。アルコールの例は、エタノール、１−プロパノール、１−ブタノール、１−ペンタノール、１−ヘキサノール、及びベンジルアルコールなどである。対応する酸の例は、それぞれ、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、ｎ−ペンタン酸、ｎ−ヘキサン酸、及び安息香酸などである。本発明に従って製造できる更なるアルコールの例は、香料、製薬及び燃料産業で使用されるものなどである。

さらに、当該方法は、Ｃ．オートエタノゲナム以外の細菌を用いて実施することもできる。例えば、クロストリジウム(Clostridia)、ムーレラ(Moorella)、真正細菌(Eubacteria)、アセトバクテリウム(Acetobacteria)、ブチリバクテリウム(Butyribacterium)及びデスルホバクテリウム(Desulfobacterium)属の細菌種が使用できる。さらに詳しくは、クロストリジウム・リュングダリイ(Clostridium ljungdahlii) 、クロストリジウム・アセチカム(Clostridium aceticum)、クロストリジウム・フォルミカセチカム(Clostridium formicaceticum)、ムーレラ・サーモアセチカ(Moorella thermoacetica)、ムーレラ・サーモオートトロフィカ(Moorella thermoautotrophica)、ユーバクテリウム・リモサム(Eubacterium limosum)、アセトバクテリウム・ウーディイ(Acetobacterium woodii)、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム(Butyribacterium methylotrophicum)、及びデスルホバクテリウム・オートトロフィカム(Desulfobacterium autotrophicum)が使用できる。

本発明の一定の態様は、一つ又は複数の産業プロセスによって生成したガスストリームを使用するように適合されている。そのようなプロセスは、製鋼プロセス、特に高ＣＯ含有量又は所定濃度（すなわち５％）より高いＣＯ含有量を有するガスストリームを生成するプロセスなどである。そのような態様に従って、好ましくはカルボキシド栄養性細菌が、酸及び／又はアルコール、特にエタノール又はブタノールを一つ又は複数のバイオリアクター内で製造するのに使用される。当業者は本開示を考慮すれば、本発明は、様々な産業又は廃ガスストリーム、例えば内燃機関を有する自動車のそれにも適用できることは分かるであろう。また、当業者は本開示を考慮すれば、本発明は、同じ又は異なる微生物を使用するものを含むその他の発酵反応にも適用できることは分かるであろう。従って、本発明の範囲は、記載された特定の態様及び／又は用途に限定されず、それどころか広義に理解されるものとする。例えば、ガスストリームの供給源は、その少なくとも一つの成分が発酵反応に供給するのに使用可能であるという以外の制限はない。本発明は、自動車の排ガス及び高容量のＣＯ含有産業煙道ガスなどのガス状基質からの総体的炭素捕捉及び／又はエタノール及びその他のアルコール製造の改良に特に適用可能性がある。
発酵
ガス状基質からのエタノール及びその他のアルコールの製造法は知られている。例示的方法は、例えば、ＷＯ２００７／１１７１５７、ＷＯ２００８／１１５０８０、米国特許第６，３４０，５８１号、米国特許第６，１３６，５７７号、米国特許第５，５９３，８８６号、米国特許第５，８０７，７２２号及び米国特許第５，８２１，１１１号に記載されているものなどである。前記特許はそれぞれ引用によって本明細書に援用する。

いくつかの嫌気性細菌が、ＣＯの、ｎ−ブタノール及びエタノールを含むアルコール、及び酢酸のような酸への発酵を実行できるとして知られており、本発明のプロセスに使用するのに適している。本発明に使用するのに適しうるそのような細菌の例は、クロストリジウム属の細菌、例えばクロストリジウム・リュングダリイ(Clostridium ljungdahlii)（ＷＯ００／６８４０７、ＥＰ１１７３０９、米国特許第５，１７３，４２９号、５，５９３，８８６号、及び６，３６８，８１９号、ＷＯ９８／００５５８及びＷＯ０２／０８４３８に記載のものを含む）、クロストリジウム・カルボキシジボランス(Clostridium carboxydivorans)（Ｌｉｏｕら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３３：ｐｐ２０８５−２０９１）、クロストリジウム・ラグスダレイ(Clostridium ragsdalei)（ＷＯ／２００８／０２８０５５）及びクロストリジウム・オートエタノゲナム (Clostridium autoethanogenum) （Ａｂｒｉｎｉら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １６１：ｐｐ３４５−３５１）の株などである。その他の適切な細菌は、ムーレラ属の細菌、例えばムーレラ種ＨＵＣ２２−１(Moorella sp HUC22-1)（Ｓａｋａｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９：ｐｐ１６０７−１６１２）、及びカルボキシドサーマス(Carboxydothermus)属の細菌（Ｓｖｅｔｌｉｃｈｎｙ，Ｖ．Ａ．，Ｓｏｋｏｌｏｖａ，Ｔ．Ｇ．ら（１９９１），Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４：２５４−２６０）などである。更なる例は、ムーレラ・サーモアセチカ(Moorella thermoacetica)、ムーレラ・サーモオートトロフィカ(Moorella thermoautotrophica)、ルミノコッカス・プロダクタス(Ruminococcus productus)、アセトバクテリウム・ウーディイ(Acetobacterium woodii)、ユーバクテリウム・リモサム(Eubacterium limosum)、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム(Butyribacterium methylotrophicum)、オキソバクター・フェニギイ(Oxobacter pfennigii)、メタノサルシナ・バルケリ(Methanosarcina barkeri)、メタノサルシナ・アセチボランス(Methanosarcina acetivorans)、デスルホトマクルム・クズネツォビイ(Desulfotomaculum kuznetsovii)（Ｓｉｍｐａら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６ Ｖｏｌ．２６．ｐｐ４１−６５）などである。さらに、当業者には分かる通り、その他のカルボキシド栄養性嫌気性細菌も本発明に適用可能であることは理解されるはずである。また、本発明は、二つ以上の細菌の混合培養物に適用できることも分かるであろう。

本発明に使用するのに適切な一つの微生物の例はクロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)である。一態様において、クロストリジウム・オートエタノゲナムは、Ｇｅｒｍａｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＤＳＭＺ）に識別寄託番号１９６３０で寄託された株の識別特徴を有するクロストリジウム・オートエタノゲナムである。別の態様において、クロストリジウム・オートエタノゲナムは、ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭＺ１００６１の識別特徴を有するクロストリジウム・オートエタノゲナムである。

本発明の方法に使用される細菌の培養は、嫌気性細菌を用いる基質の培養及び発酵のための当該技術分野で公知の様々なプロセスを用いて実施できる。例示的技術は以下の“実施例”の項に提供されている。更なる例として、発酵にガス状基質を用いる下記文献に一般的に記載されたプロセスも利用できる。（ｉ）Ｋ．Ｔ．Ｋｌａｓｓｏｎら，（１９９１）．Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇａｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ，５；１４５−１６５；（ii）Ｋ．Ｔ．Ｋｌａｓｓｏｎら，（１９９１）．Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇａｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｆｕｅｌ．７０．６０５−６１４；（iii）Ｋ．Ｔ．Ｋｌａｓｓｏｎら，（１９９２）．Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇａｓ ｉｎｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｏｒ ｇａｓｅｏｕｓ ｆｕｅｌｓ．Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１４；６０２−６０８；（iv）Ｊ．Ｌ．Ｖｅｇａ，ら（１９８９）．Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｇａｓｅｏｕｓ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ：Ｃａｒｂｏｎ Ｍｏｎｏｘｉｄｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｏ Ａｃｅｔａｔｅ．２．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．３４．６．７８５−７９３；（ｖ）Ｊ．Ｌ．Ｖｅｇａ，ら（１９８９）．Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｇａｓｅｏｕｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ：Ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｏ ａｃｅｔａｔｅ．１．Ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．３４．６．７７４−７８４；（vi）Ｊ．Ｌ．Ｖｅｇａ，ら（１９９０）．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃｏａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇａｓ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ．３．１４９−１６０；これらはすべて引用によって本明細書に援用する。

発酵は任意の適切なバイオリアクターで実施できる。例えば、連続撹拌槽リアクター（ＣＳＴＲ）、固定化細胞リアクター、ガスリフトリアクター、バブルカラムリアクター（ＢＣＲ）、膜リアクター、例えば中空繊維膜バイオリアクター（ＨＦＭＢＲ）又は細流床リアクター（ＴＢＲ）などである。また、本発明の一部の態様において、バイオリアクターは、微生物が培養される第一の増殖リアクター、及び増殖リアクターからの発酵ブロスが供給され、ほとんどの発酵生成物（例えばエタノール及びアセテート）が製造される第二の発酵リアクターを含んでいてもよい。

基質がガス状である一部の態様においては、生成及び／又は変換相を高めた圧力で実施するのが望ましいであろう。これは少なくとも数気圧であろう。そのような系は、高めた圧力に耐えるように適合されたバイオリアクターの使用を採用することになる。多くのタイプのバイオリアクターが高圧に耐えるように適合できる。そのようなバイオリアクターの例は、Ｂｕｃｈｉ ＡＵＴＯＫＬＡＶ（登録商標）リアクターである。

本発明の一部の態様において、バイオリアクターは、微生物が培養され、場合により酸が製造される第一の増殖リアクター、及び増殖リアクターからのブロスが供給され、ほとんどではないにせよ追加のアルコール発酵生成物（例えばエタノール）が製造される第二の発酵リアクターを含んでいてもよい。前述のように、圧力定格の発酵バイオリアクターが採用されうる。

本発明の様々な態様に従って、発酵反応用の炭素源は、ＣＯを含有するガス状基質である。該基質は、産業プロセスの副産物として、又は自動車の排ガスのような何らかの別の供給源から得られるＣＯ含有廃ガスでありうる。一定の態様において、産業プロセスは、製鋼所のような鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、発電、カーボンブラック製造、アンモニア製造、メタノール製造及びコークス製造からなる群から選ばれる。これらの態様において、ＣＯ含有基質は、それが大気中に放出される前に何らかの好都合な方法を用いて産業プロセスから捕捉されうる。ＣＯ含有基質の組成によっては、それを発酵に導入する前に何らかの望まざる不純物、例えばダスト粒子を除去するために処理するのも望ましいであろう。例えば、ガス状基質を公知の方法を用いてろ過又はスクラブすることができる。

あるいは、ＣＯ含有基質はバイオマスのガス化から供給することもできる。ガス化のプロセスは、限られた空気又は酸素の供給下でバイオマスを部分燃焼することを含む。得られるガスは典型的には、主にＣＯ及びＨ_２と、少量のＣＯ_２、メタン、エチレン及びエタンを含む。例えば、サトウキビから砂糖、又はトウモロコシや穀物からデンプンといった食料の抽出及び加工中に得られるバイオマス副産物、又は林業によって生じる非食料バイオマス廃棄物をガス化すると、本発明で使用するのに適切なＣＯ含有ガスを製造することができる。

ＣＯ含有基質は典型的には主要割合のＣＯ、例えば、少なくとも約２０％〜約１００体積％のＣＯ、４０％〜９５体積％のＣＯ、４０％〜６０体積％のＣＯ、及び４５％〜５５体積％のＣＯを含有する。特定の態様において、該基質は、約２５％、又は約３０％、又は約３５％、又は約４０％、又は約４５％、又は約５０％のＣＯ、又は約５５％のＣＯ、又は約６０体積％のＣＯを含む。６％といった低いＣＯ濃度を有する基質も、特にＨ_２及びＣＯ_２も併存している場合、適切なこともある。

基質が何らかの水素を含有することは必要ではないが、本発明の方法による生成物の形成にとってＨ_２の存在は無害であるべきである。特定の態様において、水素の存在はアルコール生成の総体的効率の改良をもたらす。例えば、特定の態様において、基質は約２：１、又は１：１、又は１：２の比率のＨ_２：ＣＯを含んでいてよい。他の態様では、基質ストリームは低濃度のＨ_２、例えば５％未満、又は４％未満、又は３％未満、又は２％未満、又は１％未満の水素を含むか、又は実質的に水素を含まない。基質はまた、いくらかのＣＯ_２、例えば約１％〜約８０体積％のＣＯ_２、又は１％〜約３０体積％のＣＯ_２を含有することもある。

典型的には、一酸化炭素は発酵反応にガス状態で添加される。しかしながら、本発明の方法は、この状態での基質の添加に限定されない。例えば、一酸化炭素は液体で供給することもできる。例えば、液体を一酸化炭素含有ガスで飽和し、その液体をバイオリアクターに添加すればよい。これは標準的な方法論を用いて達成できる。一例を挙げると、マイクロバブル分散物発生装置（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋら、Ｓｃａｌｅ−ｕｐ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ ｆｏｒ ａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １０１，Ｎｕｍｂｅｒ ３／Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００２）をこの目的のために使用することができる。

本発明の一態様において、生成物は第一の基質及び第二の基質の発酵によって製造される。本発明の一特定の態様において、ピルベート又は炭水化物、例えばフルクトース又はキシロースなどの第一の基質、及びＣＯを含む基質のような第二の基質が供給された場合、アルコール及び／又は酸が製造される。発酵を撹乱すると、少なくとも酸（酢酸／アセテート）の一部はアルコール（エタノール）に変換される。本開示を考慮すれば、当該技術分野で公知の、発酵に適切な多数の炭水化物の例、及び本発明の方法に適用可能な、炭水化物の基質を発酵するのに使用される多数のプロセスタイプの例があることは分かるであろう。例を挙げると、適切な基質は、グルコース及びフルクトースのような単糖類、スクロース又はラクトースのようなオリゴ糖類、セルロース又はデンプンのような多糖類などを含みうるが、これらに限定されない。これらすべての炭水化物基質（及びそれらの混合物）は本発明の様々な態様において使用するのに適切であるが、より一般的に使用されうる炭水化物基質は、グルコース、フルクトース、キシロース及びスクロース（及びそれらの混合物）などである。

当業者は、本開示を考慮すれば、本方法に使用するのに適切な発酵可能な糖は、例えば米国特許出願公開第２００７／００３１９１８号に記載されているように、セルロース及びリグノセルロース系バイオマスから前処理及び糖化のプロセスを通じて得られることは分かるであろう。バイオマスは、あらゆるセルロース又はリグノセルロース系材料のことを言い、セルロースを含む材料、及び場合によりさらにヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖及び／又は単糖を含む材料を含む。バイオマスは、バイオエネルギー作物、農業廃棄物、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙由来のスラッジ、庭ゴミ、木くず及び林業廃棄物などであるが、これらに限定されない。

本発明の一態様では、市販されているフルクトース又はキシロースが発酵のための任意の炭素及びエネルギー源として使用される。
細菌の増殖及びＣＯから生成物への発酵を起こすためには、ＣＯ含有基質ガスの他に適切な液体栄養培地もバイオリアクターに供給する必要があることは分かるであろう。栄養培地は、使用される微生物の増殖を可能にするための十分なビタミン及びミネラルを含有している。ＣＯを唯一の炭素源として使用するエタノールの発酵に適切な嫌気性培地は当該技術分野で公知である。例えば、適切な培地は、上述の米国特許第５，１７３，４２９号及び５，５９３，８８６号並びにＷＯ０２／０８４３８、ＷＯ２００７／１１５１５７及びＷＯ２００８／１１５０８０に記載されている。本発明は、微生物の増殖及び／又は発酵プロセスにおけるアルコール生成を支持するのに増大した効率を有する新規培地を提供する。この培地については以下でさらに詳細に説明する。

発酵は、望ましくは、所望の発酵（例えばＣＯからエタノール）が起こるのに適切な条件下で実施されるべきである。考慮されるべき反応条件は、圧力、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地の酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽リアクターを使用する場合）、植菌量、液相中のＣＯが制限的にならないような最大のガス基質濃度、及び生成物抑制を回避するための最大の生成物濃度などである。適切な条件は、ＷＯ０２／０８４３８、ＷＯ０７／１１７１５７及びＷＯ０８／１１５０８０に記載されている。

最適な反応条件は、一部は使用される特定の微生物に左右される。しかしながら、一般的に、発酵は周囲圧力より高い圧力で実施されるのが好適である。高めた圧力での運転は、気相から液相へのＣＯ移動速度を著しく増加させる。ＣＯは液相で微生物にエタノール生成のための炭素源として取り込まれる。このことは、ひいては、バイオリアクターが大気圧ではなく高い圧力に維持された場合、リテンションタイム（バイオリアクター中の液量÷流入ガス流速として定義される）を削減できることを意味している。

また、所定のＣＯ−生成物変換速度は一部は基質のリテンションタイムの関数であり、所望のリテンションタイムの達成はバイオリアクターの必要容量を決定するので、加圧システムの使用は必要なバイオリアクターの容量を大きく削減でき、その結果、発酵装置の資本コストも削減できる。米国特許第５，５９３，８８６号に示されている実施例によれば、リアクターの容量はリアクターの運転圧力の増加に線形比例して削減できる。すなわち、１０気圧の圧力で運転されるバイオリアクターは、１気圧の圧力で運転されるリアクターの容量の１０分の１ですむ。

ガスからエタノールへの発酵を高圧で実施することの利益は他の場所でも記載されている。例えば、ＷＯ０２／０８４３８には、３０ｐｓｉｇ及び７５ｐｓｉｇの圧力下で実施されたガス−エタノール発酵で、それぞれ１５０ｇ／ｌ／日及び３６９ｇ／ｌ／日のエタノール生産性が得られたことが記載されている。しかしながら、類似の培地及び流入ガス組成を用いて大気圧で実施された発酵例では、１日あたり１リットルにつき１０〜２０分の１のエタノールしか生産されないことが分かった。

ＣＯ含有ガス状基質の導入速度は、液相中のＣＯ濃度が決して制限的にならないようなものであることも望ましい。なぜならば、ＣＯが制限された条件だと、エタノール生成物が培養物によって消費されるという結果になりうるからである。

本発明の特定の態様において、エタノールは、系が密閉容器内で撹乱されると、微生物発酵によって製造される。本明細書中に提供されているいくつかの実施例において、発酵のｐＨは制御されず、酸からアルコールへの変換でｐＨは増大する。そのような例では、ｐＨは６．５付近に増大し、変換に対して阻害作用を有しうる。当業者であれば、本発明の方法は発酵培地のｐＨ制御を含みうることは分かるであろう。

生成物回収
本発明の方法による発酵は、栄養培地中に、所望生成物（例えばエタノール及び／又はブタノール）及び／又は一つ又は複数の副産物（例えばアセテート及びブチレート）、並びに細菌細胞を含む発酵ブロスをもたらす。

発酵反応の生成物は公知の方法を用いて回収できる。方法の例は、ＷＯ０７／１１７１５７、ＷＯ０８／１１５０８０、米国特許第６，３４０，５８１号、米国特許第６，１３６，５７７号、米国特許第５，５９３，８８６号、米国特許第５，８０７，７２２号及び米国特許第５，８２１，１１１号に記載されている。しかしながら、手短に、単なる例として述べると、エタノールは発酵ブロスから、分別蒸留又は蒸発、及び抽出発酵などの方法によって回収できる。

発酵ブロスからエタノールの蒸留によってエタノールと水の共沸混合物（すなわちエタノール９５％及び水５％）が得られる。無水エタノールは、その後、当該技術分野で周知の分子ふるいエタノール脱水技術を用いて得ることができる。

抽出発酵法は、発酵生体に対する毒性リスクの低い水混和性溶媒を使用して、エタノールを希釈発酵ブロスから回収する方法である。例えば、オレイルアルコールは、このタイプの抽出プロセスに使用できる溶媒である。オレイルアルコールを発酵槽に連続的に導入すると、この溶媒が上昇し、発酵槽の上部に層を形成する。これを連続的に抽出し、遠心分離機に供給する。すると、水と細胞は該オレイルアルコールから容易に分離されて発酵槽に戻されるが、エタノールを含んだ溶媒はフラッシュ蒸発装置に送り込まれる。ほとんどのエタノールは蒸発し凝結するが、オレイルアルコールは非揮発性なので、発酵での再使用のために回収される。

発酵反応の副産物として生成するアセテートも、当該技術分野で公知の方法を用いて発酵ブロスから回収できる。
例えば、活性炭フィルターを含む吸着システムが使用できる。この場合、適切な分離装置を用いてまず微生物細胞を発酵ブロスから除去するのが好ましい。生成物回収のために無細胞発酵ブロスを作り出す多数のろ過ベースの方法が当該技術分野で知られている。次に、無細胞エタノール−及びアセテート−含有透過物を活性炭含有カラムに通してアセテートを吸着させる。酸形のアセテート（酢酸）の方が塩（酢酸塩）形よりも活性炭に容易に吸着される。そこで、活性炭カラムに通す前に発酵ブロスのｐＨを約３未満に下げてアセテートの大部分を酢酸形に変換するのが好適である。

活性炭に吸着された酢酸は、当該技術分野で公知の方法を用いて溶離によって回収できる。例えば、結合したアセテートの溶離にエタノールを使用することができる。一定の態様において、発酵プロセスそのものから生成したエタノールをアセテートの溶離に使用してもよい。エタノールの沸点は７８．８℃で酢酸のそれは１０７℃であるので、エタノールとアセテートは、蒸留のような揮発性ベースの方法を用いて容易に相互分離できる。

発酵ブロスからアセテートを回収するためのその他の方法も当該技術分野では公知であり、本発明のプロセスに使用できる。例えば、米国特許第６，３６８，８１９号及び６，７５３，１７０号は、発酵ブロスから酢酸の抽出に使用できる溶媒及び共溶媒系について記載している。エタノールの抽出発酵で記載したオレイルアルコールベースの系の例と同様、米国特許第６，３６８，８１９号及び６，７５３，１７０号に記載の系は、酢酸生成物を抽出するために発酵微生物の存在下でも不在下でも発酵ブロスと混合できる水非混和性の溶媒／共溶媒を表している。次いで、酢酸生成物を含有する溶媒／共溶媒は蒸留によってブロスから分離される。次に、酢酸を溶媒／共溶媒系から精製するために第二の蒸留ステップを使用することもできる。

発酵反応の生成物（例えばエタノール及びアセテート）は、発酵ブロスから、ブロスの一部を発酵バイオリアクターから連続的に除去し、微生物細胞をブロスから分離し（都合よくはろ過によって）、そして一つ又は複数の生成物をブロスから同時又は逐次回収することによって回収することができる。エタノールの場合、上記の方法を用いて、蒸留によって都合よく回収でき、アセテートは活性炭上への吸着によって回収できる。分離された微生物細胞は発酵バイオリアクターに戻すのが好ましい。エタノール及びアセテートの除去後に残った無細胞透過物も発酵バイオリアクターに戻すのが好ましい。バイオリアクターに戻す前に追加の栄養素（例えばビタミンＢ類）を無細胞透過物に加えて栄養培地を補充してもよい。また、酢酸の活性炭への吸着を増強するために上記のようにブロスのｐＨを調整した場合、そのｐＨは、バイオリアクターに戻す前に発酵バイオリアクターのブロスのｐＨと類似したｐＨに再調整されるべきである。

次に、本発明を以下の非制限的実施例を参照しながらさらに詳細に説明する。
酸からアルコールへの変換
特定の広い側面において、本発明は、微生物培養物を用いて酸を対応するアルコールに変換する方法を提供する。特定の態様において、微生物培養物は、ＣＯ及び／又はＨ_２を含む基質の存在下で酸をアルコールに変換する。

本発明の方法によれば、一つ又は複数のカルボキシド栄養性細菌を含む微生物培養物を、該微生物培養物が酸をアルコールに変換するように撹乱することができる。本発明の方法は、ＣＯを主要基質として利用し、一つ又は複数の酸及び／又はアルコールを生成する様々な微生物発酵反応に適用可能である。例えば、アセテート、ブチレート、プロピオネート、カプロエート、エタノール、プロパノール、及びブタノールを製造するための発酵が本発明の方法に従って実施できる。本発明の方法は水素の製造にも使用できる。これらの生成物は、例えば、ムーレラ(Moorella)、クロストリジウム(Clostridia)、ルミノコッカス／ペプトストレプトコッカス(Ruminococcus/Peptostreptococcus)、アセトバクテリウム(Acetobacterium)、真正細菌(Eubacterium)、ブチリバクテリウム(Butyribacterium) 、オキソバクター(Oxobacter)、メタノサルシナ(Methanosarcina)、メタノサルシナ(Methanosarcina)、及びデスルホトマクルム(Desulfotomaculum)属のカルボキシド栄養性微生物を用いる発酵によって製造できる。

特定の態様において、微生物培養物は、典型的にはＣＯを含む基質を利用してアセテート及び／又はエタノールを含む生成物を生成するクロストリジウム・オートエタノゲナム (Clostridium autoethanogenum)のような酢酸生成菌を含む。そのような態様においては、微生物培養物は、増殖及びアセテート生成を促進するために、発酵ブロス中で望ましい条件下で増殖させることができる。酢酸生成菌の増殖（又は生成）相は、典型的には細胞物質の増加（バイオマス蓄積）とアセテート生成を伴い、アルコールの同時生成はほとんど又は全くない。本発明の特定の態様では、微生物培養物は、発酵ブロス中に存在する酸が対応するアルコールに変換されるように（例えばアセテートからエタノール及び／又はブチレートからブタノール）撹乱される。酸からアルコールへの変換は変換相と呼ぶことができる。

本発明の特定の態様において、微生物培養物は、生成相にある培養物によって製造された酸がアルコールに変換されるように撹乱することができる。追加的に又は代替的に、微生物培養物は、生成相にある培養物によって製造されない酸がアルコールに変換されるように撹乱することもできる。例えば、微生物培養物によって製造されないアルコール（例えばプロピオネート、ブチレート、バレレート、ヘキサノエート、イソバレレート、２−メチルブチレート）を発酵ブロスに加えて対応するアルコールに変換することができる。

本発明の一態様において、酸は、まず、変換段階の前又は最中の発酵反応に供給又は添加される。酸は、場合により、所望期間にわたって単回又は複数回のバッチで添加しても連続的に添加してもよい。バイオリアクターに添加される酸の量は変動しうる。しかしながら、発明者らは、発酵ブロス１Ｌあたり約０．１〜１００ｇの酸の濃度を提供するような量の酸の添加を想定している。さらに好ましくは、酸は、約０．１〜５０ｇ／Ｌ、又は１〜２０ｇ／Ｌの濃度を提供する量で添加される。細菌培養物に添加される酸の適切なレベルの更なる例は以下の“実施例”の項に提供する。

酸は、バイオリアクターに回分（バッチ）方式、半回分方式(fed-batch)又は連続方式で添加できる。一態様において、酸は、バイオリアクター内の酸の濃度を上記範囲内に維持するために半回分方式又は連続方式で添加される。

酸は、酸と一つ又は複数のその他の成分、担体、又は希釈剤を含有する組成物などの任意の適切な形態でバイオリアクターに添加できる。一態様において、酸は、好ましくはｐＨ５．５に緩衝されたストック溶液として調製され、バイオリアクターに添加される。

本発明で有用な酸は、微生物発酵を含む様々な公知法によって製造できる。一態様において、酸は、例えば炭水化物又は一酸化炭素を含む基質上での微生物発酵によって製造される。好ましくは、それらは一酸化炭素を含む基質上、さらに好ましくは一酸化炭素を含むガス状基質上での微生物発酵によって製造される。該酸の製造に有用な細菌の例は、クロストリジウム、ムーレラ及びルミノコッカス属の細菌を含み、真正細菌、ブチリバクテリウム、オキソバクター及びアセトバクテリウムがこの目的のために有用である。好適な態様において、細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム (Clostridium autoethanogenum)、クロストリジウム・リュングダリイ(Clostridium ljungdahlii)、クロストリジウム・アセチカム(Clostridium aceticum)、クロストリジウム・フォルミカセチカム(Clostridium formicaceticum)、クロストリジウム・テタノモルファム(Clostridium tetanomorphum)、クロストリジウム・カルボキシジボランス(Clostridium carboxidivorans)、ムーレラ・サーモアセチカ(Moorella thermoacetica)、ムーレラ・サーモオートトロフィカ(Moorella thermoautotrophica)、ルミノコッカス・プロダクタス(Ruminococcus productus)、ユーバクテリウム・リモサム(Eubacterium limosum)、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム(Butyribacterium methylotrophicum)、オキソバクター・フェンニギイ(Oxobacter pfennigii)、及びアセトバクテリウム・ウーディイ(Acetobacterium woodii)から選ばれる。当業者であれば、本発明に適用可能な、酸の製造に有用な追加の細菌は容易に分かるであろう。

本発明に有用な酸を製造するための微生物発酵法は、当業者には、特に本明細書中に提供されている情報を考慮すれば、容易に分かるであろう。しかしながら、例を挙げると、ブチレートは、Ｇｒｅｔｈｌｅｉｎら、１９９１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ ７２、Ｎｏ １，５８−６０）に記載のように、一酸化炭素含有ガスから製造できる。

本発明の一態様において、方法は、前述の方法に従って微生物発酵により所望酸を製造後、該酸を使用してその対応アルコールを製造することをつなぐ半回分(batch-fed)又は連続プロセスである。この態様において、方法は、少なくとも、ａ）第一のバイオリアクター内で、基質（好ましくは一酸化炭素を含む基質、さらに好ましくは一酸化炭素を含むガス状基質）を発酵して一つ又は複数の酸を製造し、ｂ）第二のバイオリアクター内で、一酸化炭素を含む基質の存在下、一つ又は複数の細菌株を培養し、そしてｃ）（ａ）からの一つ又は複数の酸を第二のバイオリアクターに、前記一つ又は複数の細菌株が変換相にあるときに導入して前記一つ又は複数の酸に対応するアルコールを製造するというステップを含む。関連の態様においては、更なる増殖リアクターが第一及び／又は第二のバイオリアクターに細菌を供給してもよい。

特定の態様では細菌は一酸化炭素を含む基質の存在下で培養されるが、代替の態様では細菌を最初に代替基質、例えば糖又はその他の炭水化物を含む基質上で所望密度に増殖させることもできる。その後、細菌を一酸化炭素を含む基質に移して、酸をそれらの対応するアルコールに変換すればよい。この態様は、前述のような二つのリアクターシステムで実施できる。

炭水化物とＣＯを含むガス状基質のような混合基質を利用する発酵反応を使用してアルコール及び／又は酸を製造することができる。本発明の方法によれば、そのような発酵反応を撹乱すると、酸の少なくとも一部が消費されて、アルコール生成が増大する。

本発明の方法によれば、アルコール及び／又は酸は、炭水化物のような代替基質の微生物発酵によって製造することもできる。所定の時点で、又は過剰量の酸が蓄積したら、ＣＯをバイオリアクターに添加し、場合により発酵反応をさらに撹乱して、酸の少なくとも一部をアルコールに変換することができる。

本発明に有用な細菌の増殖及び該細菌による変換を支持するために、適切な栄養培地をバイオリアクターに供給する必要があることは分かるであろう。当業者であれば、本発明に有用な培地は容易に分かるであろう。しかしながら、一般的に、栄養培地は、ＣＯを含む基質上での細菌の増殖を可能にするのに足るビタミン、ミネラル及び金属を含有する。特に、該培地は、酸からそれらの対応アルコールへの変換に関与しうる酵素、例えばＣＯＤＨ（ＣＯ−デヒドロゲナーゼ）及びＡＯＲ酵素の活性を補助する一つ又は複数の金属を含む。本発明の一態様において、該栄養培地はトリプトンも酵母エキスも含有しない。本発明での使用に適切な嫌気性培地は、以下の“実施例”の項で後述するＬＭ２３及びＬＭ３３培地の配合処方を含む。

単一タイプの培地を使用して増殖及び生成物の形成を支持してもよいが、二つ以上の培地を本発明のプロセスに使用できることは理解されるはずである。例えば、プロセスが別個の増殖及び発酵リアクターを利用する場合、一つの培地を増殖リアクターに利用し、別の培地を発酵リアクターに利用することができる。

細菌の培養は、望ましくは、酸からアルコールへの変換を起こさせる適切な条件下で実施されるべきである。考慮されるべき反応条件は、圧力、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地の酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽リアクターを使用する場合）、植菌量、液相中のＣＯが制限的にならないような最大のガス基質濃度、及び生成物抑制を回避するための最大の生成物濃度などである。条件の例は以下の“実施例”の項に提供する。最適な反応条件は、一部は使用される細菌及び生成するアルコールに依存する。

ＣＯ含有基質の導入速度は、液相中のＣＯ濃度が決して制限的にならないようなものであることも望ましい。なぜならば、ＣＯが制限された条件だと、生成物が培養物によって消費されるという結果になりうるからである。

通常技能を有する者には、本開示を考慮すれば、微生物培養物を撹乱して微生物培養物の少なくとも一部が生成相から変換相に切り替わるようにするために、様々な発酵条件又はパラメーターを変更できることは分かるであろう。例えば、発酵パラメーターを、酸が微生物培養物によってアルコールに変換されるように変更することができる。微生物培養物を生成相から変換相に切り替えるための適切な撹乱は、発酵培地のｐＨ及び／又はＯＲＰの変更；発酵ブロス中のＣＯ濃度の変更（発酵法に応じてこれを達成するための多数の方法がある。例えば、ガス組成の変更、ガス圧の変更、ガス流速の変更、ＣＳＴＲ中の撹拌速度の変更など）；還元剤の添加；一つ又は複数の酸の添加などである。当業者であれば、所望の撹乱を達成するための適切な方法は分かるであろうし、本発明の方法に従って微生物培養物を撹乱するための追加の方法も分かるであろう。しかしながら、いくつかの例示的方法を以下の“実施例”の項に記載する。本発明の特定の態様において、一つ又は複数の酸を発酵ブロスに添加することは、微生物培養物の少なくとも一部が生成相から変換相に切り替わるための適切な撹乱を提供する。例えば、活発に増殖し、アセテート及びアルコールを生成している微生物培養物にアセテートを添加すると、培養物は添加されたアセテートの少なくとも一部をエタノールに変換することができる。

本発明の一態様において、追加のアセテートは、連続的にアルコール及びアセテートを生成している発酵反応に約１５ｇ／Ｌ／日の速度で添加できる。その結果、培養物は、該アセテートをエタノールに６〜１５ｇ／Ｌ／日の速度で変換する。

代替の態様では、追加の酸を、発酵ブロスのＣＯ濃度の変更又は還元剤の添加といった少なくとも一つのその他の撹乱と併せて添加することもできる。
本発明の方法に従って任意の適切な還元剤が使用できるが、例を挙げると、亜ジチオン酸塩（例えば亜ジチオン酸ナトリウム）、硫化物塩（例えば硫化ナトリウム）又はシステイン及び場合により追加の酸を発酵反応に添加して、微生物培養物の少なくとも一部を生成相から変換相に切り替えることができる。こうして酸が対応するアルコールに変換される。特定の態様において、主としてアセテートを生成する発酵反応に硫化ナトリウムを加えると、該アセテートの少なくとも一部がエタノールに変換される。当業者であれば、酸をアルコールに変換するために系を十分撹乱するのに必要な還元剤の量を決定することはできるであろう。しかしながら、例を挙げると、還元剤は０．００５ｍＭ〜１０ｍＭ又は０．０５ｍＭ〜１ｍＭの濃度範囲で添加することができる。本発明の特定の態様においては、還元剤のほかにメチルビオロゲンのような酸化還元メディエーターを添加する。酸化還元メディエーターの添加は有害作用があるので、本発明の特定の態様によれば、酸からアルコールへの変換法は、好ましくは酸化還元メディエーターの不在下で実施される。

本発明の別の態様において、微生物培養物を生成相から変換相に切り替えるために、発酵反応にホルメートを添加する。本発明の特定の態様において、生成相の間に培養物によって製造されたアセテートがエタノールに変換されるように、２〜５ｇ／Ｌのホルメートを微生物培養物に添加することができる。特定の態様において、ホルメートは、培養物によって製造されたアセテートの少なくとも一部がエタノールに変換されるように、約３〜６ｇ／Ｌ／日の速度で添加できる。

本発明の別の態様において、微生物培養物は、微生物培養物を含有する発酵培地のｐＨ及び／又はＯＲＰ(open redox potential)を変更することによって撹乱することもでき、その結果、酸がアルコールに変換される。当業者であれば、発酵培地のｐＨ及び／又はＯＲＰを変更するための手段及び／又は方法は分かるであろう。しかしながら、例を挙げると、微生物培養物を含有する液体栄養培地のｐＨは、酸（例えば塩酸、硫酸又は酢酸）又は塩基（例えば水酸化ナトリウム）を用いて調整できる。同様に、ＯＲＰは、ｐＨと組み合わせて、又は還元剤の添加によって独自に調整できる。

特定の態様において、ｐＨ５．５に維持された液体栄養培地のｐＨは、生成相の間に製造されたアセテートがエタノールに変換されるように水酸化ナトリウムを添加することによって５．９に上昇する。ｐＨが変わると、培地の酸化還元電位は約−４３０から−４７０ｍＶに低下する。

別の態様において、バイオリアクター内のＣＯ濃度の増大は、微生物培養物の少なくとも一部を生成相から変換相に切り替える。一定の態様において、微生物培養物は、ＣＳＴＲのような撹拌バイオリアクター内の液体栄養培地中に確立される。ＣＯの溶解度が低いため、高細胞密度（例えば０．５〜５ｇ／Ｌ）では、液体栄養培地中のＣＯ濃度は、微生物培養物がＣＯを、それが溶液中に移動するのとほぼ同じ速度で消費するにつれてゼロに近づくことが認められている。液体栄養培地のＣＯ濃度は、ヘンリーの法則に従ってＣＯ分圧の増加によって増大させることができる。従って、本発明の特定の態様に従って、微生物培養物は、バイオリアクター内のＣＯ分圧を増加させることによって撹乱される。

本発明の一態様によれば、エタノールは、発酵培地中のＣＯ濃度が増大すると、微生物発酵によって製造される。この変換相の間にＣＯの少なくとも一部は酸及び／又はアルコールに変換されうるが、大部分のエタノールは、酢酸／アセテートの微生物的還元によって製造されうる。一部の発酵反応は、高めたＣＯ分圧で運転できることが認められている。従って、発酵培地中のＣＯ濃度を増大させるために、ＣＯ分圧を、酸がアルコールに変換されるように、少なくとも１５ｐｓｉ、又は少なくとも２０ｐｓｉ、又は少なくとも２５ｐｓｉ、又は少なくとも３０ｐｓｉ、又は少なくとも３５ｐｓｉ、又は少なくとも４０ｐｓｉ増加させることができる。

本発明の一態様において、発酵ブロス中の酸のかなりの部分はアルコールに変換される。本発明の一部の態様において、ＣＯ濃度の増大は、発酵ブロス中で利用可能な酸の少なくとも６０％をアルコールに変換する。他の態様では、酸の少なくとも７０％がアルコールに変換される。他の態様では、酸の少なくとも８０％がアルコールに変換される。

本発明の特定の態様において、ＣＯ分圧は、酸が対応するアルコールに変換されるように、約１５．９ｐｓｉａ、又は少なくとも２０ｐｓｉａ、又は少なくとも３０ｐｓｉａ、又は少なくとも４０ｐｓｉａ、又は少なくとも５０ｐｓｉａに増大される。そのような態様においては、ヘンリーの法則に従って、液体栄養培地中のＣＯ濃度は、少なくとも１ｍｍｏｌ、又は少なくとも１．２ｍｍｏｌ、又は少なくとも１．４ｍｍｏｌ、又は少なくとも１．６ｍｍｏｌ、又は少なくとも１．８ｍｍｏｌ、又は少なくとも２．２ｍｍｏｌ、又は少なくとも２．６ｍｍｏｌ、又は少なくとも３．２ｍｍｏｌになることが期待される。

本発明の一定の態様において、酸は対応するアルコールに、撹乱後の期間（例えば撹乱後１時間まで、又は２時間まで、又は３時間まで、又は５時間まで）、およそ少なくとも１２ｇ／Ｌ／日、又は少なくとも１４ｇ／Ｌ／日、又は少なくとも１６ｇ／Ｌ／日、又は少なくとも１８ｇ／Ｌ／日、又は少なくとも２０ｇ／Ｌ／日、又は少なくとも２２ｇ／Ｌ／日、又は少なくとも２４ｇ／Ｌ／日の速度で変換される。特定の態様において、ＣＯの他に水素の存在下で、酸からアルコールへの変換速度は、撹乱後２５ｇ／Ｌ／日まで、又は２６ｇ／Ｌ／日まで、又は２７ｇ／Ｌ／日まで増大する。しかしながら、変換速度は時間が経つにつれて低下するので、一定の態様においては酸（例えばアセテート）は発酵反応の過程中、蓄積を続けることができる。

本発明の方法に従ってＣＯの濃度（又は分圧）を増大させることは、酸の生成及び微生物の増殖を促進する。しかしながら、ＣＯ濃度（又は分圧）が十分な閾値濃度を超えて増大すると、酸の生成及び／又は微生物の増殖は実質的に抑制される。従って、本発明の方法によれば、微生物の増殖及び／又は酸の生成をＣＯの添加によって調節することができる。従って、本発明は、アルコール及び／又は酸を含む生成物の製造をＣＯの微生物発酵によって制御するための手段を提供する。すなわち、発酵ブロス中に過剰の酸が蓄積したら、ＣＯ濃度を閾値濃度より上に増大させて、酸の少なくとも一部をアルコールに変換することができる。

一態様において、本発明は、酸の嫌気性細菌発酵からアルコールを製造するための方法を提供する。一態様において、該方法は、少なくとも、ＣＯを含む基質、好ましくはＣＯを含むガス状基質の存在下で、酸を嫌気的に発酵するステップを含み、前記ＣＯの濃度は十分な閾値濃度より高い。

本発明の一態様において、発酵培地中のＣＯ濃度が十分な閾値濃度より高い場合、酢酸／アセテートの微生物発酵によってエタノールが製造される。一態様において、ＣＯを含む基質は、発酵培地中のＣＯ濃度が少なくとも約２．５ｍｍｏｌ／Ｌの閾値濃度を上回るように供給される。他の態様において、ＣＯ濃度は少なくとも約２．７５ｍｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約３ｍｍｏｌ／Ｌ又は少なくとも約３．５ｍｍｏｌ／Ｌの閾値を上回る。

本発明の一態様において、ＣＯを含む基質はガス状で、該ガス状基質は、ＣＯが少なくとも約３７ｐｓｉの分圧を有するように供給される。一態様において、ＣＯ分圧は少なくとも約４７ｐｓｉである。

別の態様において、アルコール及び／又は酸の製造法を提供する。該方法は、バイオリアクター内で第一の基質を嫌気的に発酵してアルコール及び／又は酸を含む一つ又は複数の生成物を製造することを含み、ＣＯを含む第二の基質を、アセテートに比してエタノールの生成が増大するように所望の時点で添加することができる。ＣＯを含む第二の基質は、ＣＯ濃度が十分な閾値濃度を上回るように供給される。そのような条件下ではアルコールの生成が増大する一方、酸は消費され、ＣＯは実質的に未変換でありうる。

本発明の一態様において、第一の基質はＣＯを含有する。しかしながら、該方法はそのような態様に限定されない。例えば、本発明の一部の態様において、第一の基質はピルベートあるいは一つ又は複数の炭水化物を含みうる。前記一つ又は複数の炭水化物は、例えば、セルロース、セルロース加水分解物、デンプン、デンプン加水分解物、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、又はラクトースでありうるが、これらに限定されない。一態様において、炭水化物はフルクトース又はキシロースである。あるいは、第一の基質は、ＣＯ_２及び／又はＨ_２又は発酵によって酸及び／又はアルコールを製造するのに適切な何らかのその他の成分を含んでいてもよい。

本発明の更なる態様において、アルコール及び／又は酸の製造法を提供し、該方法は、少なくとも、
（ａ）ＣＯを含む基質を第一の濃度で一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクターに供給し；そして
（ｂ）培養物を嫌気的に発酵して前記基質からアルコール及び／又は酸を含む一つ又は複数の生成物を製造する
ステップを含み、バイオリアクターに供給される基質の濃度は、酸に比してアルコールの生成が増大するように、所望の時点で場合により増大させることができる。

一態様において、基質は、（ａ）で発酵培地中のＣＯ濃度が十分な閾値濃度を下回るように供給される。ＣＯ濃度を増大させる時点では、基質はＣＯ濃度が十分な閾値濃度を上回るように供給できる。

本発明の更なる態様において、該方法は、少なくとも、
（ａ）ＣＯを含むガス状基質を第一のＣＯ分圧で一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクターに供給し；そして
（ｂ）培養物を嫌気的に発酵して前記基質からエタノール及び／又は酢酸を含む一つ又は複数の生成物を製造する
ステップを含み、ＣＯ分圧は、アセテートに比してエタノールの生成が増大するように、所望の時点で場合により増大させることができる。

特定の態様において、アルコール及び酸の生成及び／又は微生物の増殖は、発酵プロセス全体を通してモニターされる。そのような条件下で、発酵は、実質的な酸生成から実質的なアルコール生成の間で、必要に応じて又は場合により容易に変更することができる。様々な態様において、ステップ（ｃ）及び（ｄ）は、アルコール製造の最適条件を維持するために発酵プロセス全体を通じて繰り返すことができる。

本発明の方法に従って酸をアルコールに変換するのに、ＣＯを含む産業廃ガス、例えば製鋼所からの廃ガスを用いることができる。さらに、本発明の方法によれば、Ｈ_２を含みＣＯを含まないガスも、酸をアルコールに変換するのに使用することができる。

本発明は、生成相から変換相、変換相から生成相に切り替えるために、ＣＯ濃度を変えることによって生成相と変換相を交互に繰り返すための手段も提供する。例えば、実施例に示されているように、ＣＯ濃度を閾値濃度より高くすると、発酵ブロス中で利用可能な酢酸のかなりの部分が消費され、同時にエタノール生成が増加する。ＣＯ濃度を閾値濃度未満に下げると、生成相で観察されるような微生物の増殖及び酸生成が促進されうる。例えば、特定の発酵反応を望ましいＣＯ分圧で実施し、酸を含む生成物を製造する。適切な時点で、又は特定の酸濃度で（例えば２０ｇ／Ｌまで、又は３０ｇ／Ｌまで、又は４０ｇ／Ｌまで、又は５０ｇ／Ｌまで）、微生物培養物を撹乱して、酸がアルコールに変換されるようにすることができる。本発明の方法に従って、ＣＯ分圧は、酸がアルコールに変換されるように、少なくとも１５ｐｓｉ、又は少なくとも２０ｐｓｉ、又は少なくとも２５ｐｓｉ、又は少なくとも３０ｐｓｉ、又は少なくとも３５ｐｓｉ、又は少なくとも４０ｐｓｉ増加させることができる。変換後、アセテート生成が再開されるように、分圧を少なくとも１５ｐｓｉ、又は少なくとも２０ｐｓｉ、又は少なくとも２５ｐｓｉ、又は少なくとも３０ｐｓｉ、又は少なくとも３５ｐｓｉ、又は少なくとも４０ｐｓｉ下げることができる。このプロセスは、アセテートの蓄積を防止し、アルコール濃度を増大するために繰り返すことができる。

代替の態様において、微生物培養物は、撹乱後、１時間まで、又は２時間まで、又は３時間まで、又は５時間まで酸をアルコールに変換できる。その後、培養物が高いＣＯ分圧に順応し及び／又はＣＯを消費してＣＯ濃度が低下すると、培養物は酸生成に戻ることになる。

数サイクルの間、酸の濃度は低濃度、例えば２０ｇ／Ｌ未満、又は３０ｇ／Ｌ未満、又は４０ｇ／Ｌ未満、又は５０ｇ／Ｌ未満のままで、アルコールの濃度は増大すると考えられる。

二つ（以上）のバイオリアクターシステム
本発明の一部の態様において、発酵反応は、微生物が培養され、場合により酸が製造される増殖（又は生成）リアクターと、増殖リアクターからのブロスが供給され、製造された又は添加された酸がアルコールに変換されるように撹乱を適用される変換リアクターとを含みうるシステムで、二つ以上の段階で実施することができる。前述のように、圧力定格発酵バイオリアクターが採用されうる。

図５を参照すると、発酵システム１００は増殖バイオリアクター１を含む。ここでは、発酵条件は、微生物バイオマス蓄積又は増殖及び／又は酸生成を促進するように適合させることができる。例えば、液体栄養培地の成分、栄養供給速度、運転圧力、運転ｐＨ、基質の内容及び濃度、基質供給速度、発酵槽撹拌速度（該当する場合）及び細胞密度などの条件を微生物増殖及び／又は酸生成を促進するために適合できる。定常状態の微生物バイオマス及び酸生成を提供するための条件の例は、以下の“実施例”の項に提供する。

増殖バイオリアクター１に供給される基質は前述のものから選ぶことができるが、特定の態様において、基質は炭水化物又はＣＯであるか又は炭水化物とＣＯの組合せである。
液体栄養培地は、微生物バイオマス及び／又は酸が所望のレベル及び／又は所望の生成速度に達するような時間、増殖バイオリアクター１内で実質的に維持されうる。増殖バイオリアクター内の微生物バイオマス及び／又は酸生成は、当該技術分野で公知の手段によって定期的又は連続的にモニターできる。さらに、増殖バイオリアクター内の条件は、増殖及び／又は酸生成にとって実質的に最適な条件を維持するように調整されうる。

当業者であれば、増殖バイオリアクター内の一定の条件下でアルコールも製造されうることは分かるであろう。しかしながら、特定の態様においては酸が増殖バイオリアクターにおける主要生成物となる。

所望のバイオマス及び／又は酸のレベル又は速度に到達したら、酸の少なくとも一部及び場合により微生物バイオマスの少なくとも一部は、適切な管路手段によって、増殖リアクター１から変換リアクター２に、連続的に又は所望の時点で送られうる。例えば、増殖バイオリアクター１内の所望の酸濃度、例えば少なくとも５ｇ／Ｌ、又は少なくとも１０ｇ／Ｌ、又は少なくとも２０ｇ／Ｌ、又は少なくとも３０ｇ／Ｌ、又は少なくとも４０ｇ／Ｌ、又は少なくとも５０ｇ／Ｌ、又は少なくとも６０ｇ／Ｌ、又は少なくとも７０ｇ／Ｌ、又は少なくとも８０ｇ／Ｌ、又は少なくとも９０ｇ／Ｌ、又は少なくとも１００ｇ／Ｌで、前記酸及び場合により微生物バイオマスを含む液体栄養培地の一部を変換バイオリアクター２に送ることができる。ここで、微生物培養物を撹乱して、酸がアルコールに変換されるようにすることができる。

増殖バイオリアクター１を出る液体栄養培地は、定常状態のバイオマス及び／又は酸生成のための適切な条件を提供するために典型的には新鮮な液体栄養培地と取り替えられる。増殖バイオリアクター１内の酸濃度は、特定の微生物の阻害が起こるレベル未満に維持されるべきである。

本発明の特定の態様において、ＣＯを含む基質は、液体栄養培地中のＣＯ濃度が少なくとも約２．５ｍｍｏｌ／Ｌ又は少なくとも約２．７５ｍｍｏｌ／Ｌ、又は少なくとも約３ｍｍｏｌ／Ｌ又は少なくとも約３．５ｍｍｏｌ／Ｌになるように変換バイオリアクター２に供給される。特定の態様において、ＣＯを含む基質はガス状で、ＣＯ分圧が少なくとも約２７ｐｓｉ、又は少なくとも約３７ｐｓｉ又は少なくとも約４７ｐｓｉになるように供給されうる。

変換バイオリアクター２内の酸消費及び／又はアルコール生成は、当該技術分野で公知の手段によって定期的又は連続的にモニターできる。液体栄養培地が所望のアルコール濃度、例えば少なくとも５ｇ／Ｌ、又は少なくとも１０ｇ／Ｌ、又は少なくとも２０ｇ／Ｌ、又は少なくとも３０ｇ／Ｌ、又は少なくとも４０ｇ／Ｌ、又は少なくとも５０ｇ／Ｌ、又は少なくとも６０ｇ／Ｌ、又は少なくとも７０ｇ／Ｌ、又は少なくとも８０ｇ／Ｌ、又は少なくとも９０ｇ／Ｌ、又は少なくとも１００ｇ／Ｌに達したら、前記アルコールを含む液体栄養培地の一部は生成物回収装置３に送ることができる。変換バイオリアクター内のアルコール濃度は、アルコール生成に使用された微生物培養物の阻害が起こるレベル未満に維持されるべきである。

本発明の一態様において、増殖バイオリアクター１内で培養及び増殖される微生物は、前述したようなカルボキシド栄養性微生物であり、条件は微生物増殖及び／又は酸生成のために最適化される。第二の微生物（同じくカルボキシド栄養性微生物）は変換バイオリアクター２に供給でき、条件はアルコール生成のために最適化される。増殖及び変換バイオリアクターに供給される微生物培養物は同じでも異なっていてもよい。しかしながら、特定の態様において、両バイオリアクターに供給される微生物はクロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)である。

本発明の一定の態様において、増殖バイオリアクター１は、増殖バイオリアクターを出る液体栄養培地から微生物バイオマスの少なくとも一部を除去し、増殖バイオリアクター１に戻すことができる細胞リサイクルシステムを含む。あるいは、微生物バイオマスは増殖リアクターを出る液体栄養培地から除去されず、変換バイオリアクター２に直接送られてもよい。

特定の態様において、微生物培養物は増殖リアクター１で増殖し、酸を生成する。同じ微生物培養物の少なくとも一部は、液体栄養培地中の酸と共に変換バイオリアクター２に連続的に又は断続的に送られる。その場合、前記変換バイオリアクター２内の条件は（例えば高めたＣＯ濃度）、同じ微生物培養物によるアルコールの生成を促進する。

増殖バイオリアクター１における液体栄養培地のリテンションタイムは、バイオマス蓄積及び／又は酸生成を最適化するために調節できる。例えば、開始時はバイオマス蓄積が望ましいので、増殖バイオリアクター１に流入及び流出する液体栄養培地の流速を低減して、増殖バイオリアクター１中の培地のリテンションタイムを増大させる。こうしてバイオマス及び／又は酸を所望レベル又は速度に到達させることが可能になる。

バイオマス及び／又は酸生成が所望レベル又は速度に近づいたら又は到達したら、増殖バイオリアクター１から変換バイオリアクター２への液体栄養培地の流速を増大させることによって液体リテンションタイムを短くすることができる。一定の態様において、微生物バイオマス及び／又は酸のレベルはモニターされ、リテンションタイムは、実質的に定常状態の酸濃度を達成するように調整することができる。さらに、条件は、増殖バイオリアクター１中少なくとも５ｇ／Ｌ、又は少なくとも１０ｇ／Ｌ、又は少なくとも２０ｇ／Ｌ、又は少なくとも３０ｇ／Ｌ、又は少なくとも４０ｇ／Ｌ、又は少なくとも５０ｇ／Ｌ、又は少なくとも６０ｇ／Ｌ、又は少なくとも７０ｇ／Ｌ、又は少なくとも８０ｇ／Ｌ、又は少なくとも９０ｇ／Ｌ又は少なくとも１００ｇ／Ｌの所望の定常状態の酸濃度を達成するために調節することもできる。

液体栄養培地の液体リテンションタイムは、効率的なアルコール生成を達成するために変換バイオリアクター２でも調節することができる。例えば、液体栄養培地は一定の速度で連続的に供給でき、変換バイオリアクター２内の液体栄養培地の容量は、所望のアルコール変換を達成するのに適切なリテンションタイムを提供するように調整することができる。本発明の特定の態様において、アルコール変換相における高めたＣＯ濃度でのアルコール生成速度は、増殖及び／又は酸生成速度よりも速い。従って、変換バイオリアクター２は増殖バイオリアクター１よりも実質的に小さくてよく、ひいては変換バイオリアクター２における液体リテンションタイムは実質的に短くなる。

本開示を考慮すれば、当業者には各バイオリアクターの適切な又は望ましい構成が分かるであろうが、特定の態様において、微生物培養物、酸及び場合によりアルコールを含む液体栄養培地の一部は、栓流バイオリアクターとして構成された第二の容器に送られる。ＣＯ分圧は栓流容器中で高めることができるので、液体栄養培地の一部が通過すると、酸がアルコールに変換される。当業者であれば、バイオリアクターを通る流れを維持するための静的ミキサーのような手段は分かるであろう。さらに、バイオリアクターは、バイオリアクター全体にわたって所要及び／又は所望のＣＯ濃度を維持するために、全体に追加の基質送達手段を含みうる。

別の態様において、生成バイオリアクターは少なくとも一つの微生物培養物を含み、変換バイオリアクターも少なくとも一つの微生物培養物を含む。酸及び／又はアルコールを含有する発酵ブロスは、生成バイオリアクターから変換リアクターに、及び変換バイオリアクターから生成物回収装置に送ることができるが、それぞれの微生物培養物は細胞リサイクルシステムによって各バイオリアクターに実質的に保持される。そのような態様において、微生物は、生成バイオリアクター中の培養物が酸を生成し、変換バイオリアクター中の培養物が酸をアルコールに変換する限り、異なっていてもよい。特定の態様において、変換バイオリアクター中の微生物培養物は、高めたＣＯ分圧で酸をアルコールに変換する。

一定の態様において、他の発酵及び／又は産業プロセスから生成した酸を、場合により変換バイオリアクターに添加してアルコールに変換することができる。
本発明の別の態様において、複数の増殖バイオリアクターを含み、酸及び場合により微生物バイオマスを含む液体栄養培地を単一の変換バイオリアクターに供給するように構成された発酵システムを提供する。例えば図６を参照すると、発酵システム１０１は、第一及び第二の増殖バイオリアクター１ａ及び１ｂを含み、それぞれ酸を生成するように構成されうる。増殖バイオリアクター１ａ及びｂからの酸と場合によりバイオマスとを含有する液体栄養培地は、アルコール生成のために変換バイオリアクター２に供給できる。あるいは、第一の増殖バイオリアクター１ａを迅速なバイオマス蓄積用に構成し（例えば長い液体リテンションタイム）、第二の増殖バイオリアクター１ｂを最適な酸生成用に構成してもよい（例えば短い液体リテンションタイム）。各増殖バイオリアクター１ａ及びｂの液体リテンションタイムは、システム全体にわたって最適なアルコール生成条件を維持するためにしかるべく調整することができる。

複数の増殖バイオリアクターを含む態様では、アルコール生成に実質的な悪影響なしに、一つ又は複数の増殖バイオリアクターをある期間（例えばメンテナンスのため）完全にシャットダウンすることができる。

培地の調製：

培地をｐＨ５．５で以下のように調製した。システインＨＣｌを除く全成分を４００ｍｌの蒸留水中に混合した。この溶液を、９５％ＣＯ、５％ＣＯ_２ガスの一定流量下で沸騰するまで加熱し、室温に放冷することによって嫌気性にした。冷却したら、システインＨＣｌを加え、溶液のｐＨを５．５に調整した後、容量を１０００ｍｌにした。嫌気性は実験を通して維持された。

細菌：
クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)をＧｅｒｍａｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＤＳＭＺ）から得た。該細菌に付与された受入番号はＤＳＭＺ１００６１である。あるいは、使用されたクロストリジウム・オートエタノゲナムは、Ｇｅｒｍａｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＤＳＭＺ）に寄託され、受入番号１９６３０を割り当てられたものである。

連続撹拌槽リアクター（ＣＳＴＲ）での連続発酵（典型的なセットアップ）：
５リットル入りのバイオリアクターに、前述のように調製されたＬＭ２３又はＬＭ３３培地４．９Ｌを入れた。ガスを大気圧の９５％ＣＯ、５％ＣＯ_２に切り替えた後、１００ｍｌのクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を植菌した。バイオリアクターを３７℃に維持し、培養開始時２００ｒｐｍで撹拌した。増殖相の間、撹拌を４００ｒｐｍに上げた。ｐＨは５．５に調整され、５ＭのＮａＯＨの自動添加によって維持された。新鮮な嫌気性培地をバイオリアクターに連続的に添加し、バイオリアクター内における規定のバイオマス及びアセテートレベルを維持した。

血清ボトル内、加圧下でのバッチ発酵：
無菌の血清ボトルをＣＯ含有ガス（組成については実施例参照）で３回パージした後、排気して−５ｐｓｉの真空にした。バイオマス、アセテート及び微量のエタノールを含有する大気圧下の活性培養物５０ｍｌを連続バイオリアクターから２３４ｍｌ入り血清ボトルに直接移した。次に２０４ｍｌの上部空間を必要な過剰圧になるまでＣＯ含有ガスで満たした。振盪培養器を使用し、反応温度は３７℃に維持した。

細胞密度：
これらの実験における細胞密度を測定するためにサンプルの吸光度を６００ｎｍで測定し（分光光度計）、乾燥質量を公表手順に従って計算することによって決定した。代謝産物のレベルは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び場合によってはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて特徴付けした。

ＨＰＬＣ：
ＨＰＬＣシステム Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ。移動相：０．００２５Ｎ 硫酸。流速及び圧力：０．８００ｍＬ／分。カラム：Ａｌｌｔｅｃｈ ＩＯＡ；カタログ番号９６４８、１５０×６．５ｍｍ、粒径５μｍ。カラム温度：６０℃。検出器：屈折率。検出器の温度：４５℃。

サンプル調製法：
４００μＬのサンプル及び５０μＬの０．１５Ｍ ＺｎＳＯ_４及び５０μＬの０．１５Ｍ Ｂａ（ＯＨ）_２をエッペンドルフ管に入れる。該管を１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離する。２００μＬの上清をＨＰＬＣバイアルに移し、５μＬをＨＰＬＣ機器に注入する。

ガスクロマトグラフィー：
炎イオン化検出器を利用するガスクロマトグラフＨＰ ５８９０シリーズII。キャピラリーＧＣカラム：ＥＣ１０００−Ａｌｌｔｅｃｈ ＥＣ１０００ ３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５ｕｍ。ガスクロマトグラフは、水素の総流速５０ｍＬ／分及び５ｍＬのパージフロー（１：１０スプリット）のスプリットモードで運転され、カラムヘッド圧１０ＰＩＳの結果、４５ｃｍ／秒の線速度が得られた。温度プログラムは６０℃で開始し、１分間保持した後、３０℃／分で２１５℃に上昇させ、２分間保持した。注入器（インジェクター）温度は２１０℃、検出器温度は２２５℃であった。

サンプル調製法：
５００μＬのサンプルを１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離する。１００μＬの上清を、２００μＬの水と１００μＬの内部標準スパイク溶液（１０ｇ／Ｌのプロパン−１−オール、５ｇ／Ｌのイソ酪酸、１３５ｍＭの塩酸）入りのＧＣバイアルに移す。該溶液１μＬをＧＣ機器に注入する。

実施例１：有機酸から対応アルコールへの変換
実施例１Ａ：ＣＳＴＲでの酪酸からブタノールへの変換
８リットルのリアクターに７２００ｍｌの培地ＬＭ２３を入れ、１２１℃で３０分間オートクレーブした。冷却中、培地にＮ_２を散布した。ガスを９５％ＣＯ、５％ＣＯ_２に切り替えた後、１６０ｍｌのクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を植菌した。バイオリアクターを３７℃に維持し、培養開始時２００ｒｐｍで撹拌した。増殖相の間、撹拌を５００ｒｐｍに上げた。ｐＨは５．５に設定し、５ＭのＮａＯＨの自動添加によって維持した。２０ｇの酪酸を含有し、ｐＨ５．５に緩衝されたｎ−ブチレート溶液を活発に増殖中の培養物に直接添加した。発酵ブロスのサンプルを酪酸添加後０、２４及び４８時間の時点で採取した（表１参照）。

実施例１Ｂ：アセテート及びブチレートから対応アルコールへの変換：
血清バイアルを上記に従って準備した。微生物増殖が確立されたら（生成したアセテート及び少量のエタノールを伴う）、下記化合物を血清ボトル中の５０ｍｌの活性培養物に加えた。すなわち、１ｍｌの亜ジチオン酸ナトリウム１０ｇ／ｌ溶液、２ｍｌのｎ−酪酸溶液１００ｇ／ｌ（ｐＨは５Ｍの水酸化ナトリウムで５．５に調整）である。気相を２５ｐｓｉｇ過剰圧の９５％ＣＯ、５％ＣＯ_２ガス混合物と交換した。酸の添加後、代謝産物定量のために１ｍｌのサンプルを様々な時点で採取した（表２参照）。

メディエーターのメチルビオロゲンの存在はｎ−ブチレートからｎ−ブタノールへの変換を著しく阻害している（表２）。さらに、酪酸はブタノールに化学量論的に変換された（図１）。

結果は、酸をそれらの対応アルコールに微生物変換する既報の方法に優るいくつかの重要な利点を示している。例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃ．オート）を用いて標準的な発酵条件下で製造できないことがわかっているアルコールが製造できることを初めて示している。

細菌細胞は、所望アルコールを製造するための酸の添加前に取り出す必要はない。酸からアルコールへの変換は培地中でそのまま実施される。このことは、細胞の取扱い、遠心分離及び再懸濁によって発生しうる細胞損傷のリスク、及び酸素汚染のリスクを著しく軽減する。

変換は、メチルビオロゲンのようなメディエーターの使用を必要としない。実際、メチルビオロゲンの添加は、酸からアルコールへの変換速度を阻害又は少なくとも低減することが示された。そのようなメディエーターは有毒であることが多い。メディエーターの必要性を排除することは、有毒化学物質の取扱いを軽減し、アルコール製造に伴うコストも低減する。

少なくともＣ．オートエタノゲナムの場合、細菌細胞は、増殖相及び酸からアルコールへの変換相中同じｐＨ及び温度に維持することが可能である（３７℃及びｐＨ５．５）。このことは、プロセスを単純化し、細胞への衝撃のリスクを低減する。

さらに、細菌が変換相にあるときの酸の添加と、細胞が添加された酸を対応アルコールに変換している間も一酸化炭素を消費し、アセテート及びエタノール（例えば）を製造し続ける細胞の能力は、いくつかの価値ある生成物を同時に製造できる方法を提供する。

実施例１Ｃ：様々な酸から対応アルコールへの変換：
血清バイアルを上記に従って準備した。ただし、５ｍＬの酸水溶液を空のバイアルに加え、ＮａＯＨでｐＨを５．５に調整した。亜ジチオン酸ナトリウム（１０ｇ／Ｌ水溶液０．５ｍＬ）又はシステイン（６．２５ｇ／Ｌ水溶液１ｍＬ）を植菌の前に加えた。各血清バイアルを９５％ＣＯガスで３０ｐｓｉｇに加圧し、常に振盪しながら３７℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを７２時間時点で採取した（表３参照）。

上から分かるように、クロストリジウム・オートエタノゲナムは、還元剤の存在下で、様々な酸をそれらの対応するアルコールに変換するのに使用できる。重ねて言うが、上記酸及びアルコールはＣ．オートエタノゲナムの天然産生代謝産物でないことがわかっているので、このことは特に重要である。

実施例２：アルコール生成に及ぼす還元剤濃度の効果
実施例２Ａ：アルコール生成に及ぼす亜ジチオン酸ナトリウム濃度の効果
血清バイアルを上記に従って準備した。ただし、亜ジチオン酸ナトリウム（１０ｇ／Ｌ水溶液）を植菌の前に加えた。各血清バイアルを７０％ＣＯ、１５％ＣＯ_２、１４％Ｎ_２、１％Ｈ_２ガスで３０ｐｓｉｇに加圧し、常に振盪しながら３７℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを４８時間時点で採取した（表４参照）。

結果は、酸からアルコールへの変換は広い還元剤濃度範囲で起こっているが、約２ｇ／Ｌという最適濃度があることを示している。
実施例２Ｂ：アルコール生成に及ぼす硫化ナトリウム濃度の効果
無菌の２３４ｍｌ入り血清ボトルを１００％Ｎ_２ガスでパージした後、上記処方による５０ｍｌの培地（ＬＭ３３）を加え、１２１℃で２０分間オートクレーブした。培地をＣｒ（II）溶液（約０．４ｍＭ）で還元し、硫化ナトリウム水溶液を加えた。血清ボトルに、活発に増殖中のクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物２．５ｍｌを連続バイオリアクターから植菌した。Ｎ_２のバックグラウンドを除去するために、１８４ｍｌの上部空間を７０％ＣＯ、１％Ｈ_２、１５％ＣＯ_２、及び１４％Ｎ_２ガスで３回パージし、排気して−１４ｐｓｉｇの真空にし、その後７０％ＣＯ、１％Ｈ_２、１５％ＣＯ_２、及び１４％Ｎ_２ガスを満たして３０ｐｓｉｇにした。反応温度は３７℃に維持した。サンプルを時々採取した。上部空間はサンプル採取後パージし、リフレッシュして３０ｐｓｉｇにした（表５参照）。

結果は、アセテート濃度のわずかな上昇を伴う短い遅滞期はあるが、硫化ナトリウムを含有する各バイアル中のアセテートは、実験の時間的経過を通してアルコールに変換されることを示している。

実施例３：ＣＯ分圧の効果
実施例３Ａ：アルコール生成に及ぼすＣＯ分圧の効果
血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルをＣＯ_２中９５％ＣＯのガス混合物を用いて３０又は４０又は５０ｐｓｉａに加圧し、常に振盪しながら３７℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを１８時間時点で採取した（表６参照）。

３０ｐｓｉ〜４０ｐｓｉのバイオリアクターボトル中で、約２ｇ／ｌのアセテートと０．６ｇのエタノールが生成し、上部空間の圧力降下は約１７ｐｓｉであった。このことは、相当量のＣＯがアセテート生成に使用されたことを示している。

驚くべきことに、５０ｐｓｉでは、約３ｇ／ｌのアセテートが消費され、２．６ｇ／ｌのエタノールが生成した。この結果は、アセテートからエタノールへの変換が長時間起こる最適の閾値ＣＯ分圧があることを示している。ＣＯ濃度はＣＯ分圧に比例するので、結果は、Ｃ．オートエタノゲナムが酸をアルコールに変換する十分なＣＯ濃度閾値があることを示している。しかしながら、低い圧力系でも酸をアルコールに変換できることに注意すべきである。ただし、ＣＯが枯渇すると、アセテート生成が主流になる。さらに、特定のＣＯ（又はＨ_２）枯渇条件下では、培養物はアルコールを生成するのにアルコールを再消費しうる（実施例４参照）。

実施例３Ｂ：アルコール生成に及ぼすＣＯ分圧の効果
これらの結果に基づいて、類似の発酵を、同じガス状基質を用い、異なる炭素源を補給した培地で実施した。血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルをＣＯ_２中９５％ＣＯのガス混合物を用いて４０又は５０ｐｓｉａに加圧し、常に振盪しながら３７℃でインキュベートした。対照バイオリアクターボトル（Ａ）は未補給であったが、他のボトルにはいくらかのフルクトース（Ｂ）、キシロース（Ｃ）又はピルベート（Ｄ）を補給した。これらのボトルを常に撹拌しながら３７℃でインキュベートした。代謝産物及びバイオマス濃度のほか、上部空間の過剰圧及びｐＨを発酵開始時及び４０時間後に測定した。４０ｐｓｉａでの結果を表７に、５０ｐｓｉａでの結果を表８に示す。

４０ｐｓｉａの全バイオリアクターボトルにおいて、ここで試験した全条件に対し、約３．５ｇ／ｌのアセテートと少量のエタノールが生成した。上部空間の圧力降下は約１７ｐｓｉｇであった。このことは、相当部分のＣＯがアセテート生成のために消費されたことを示す。ｐＨは約０．９単位減少して４．６になった。全例において最小の微生物増殖が見られた。

５０ｐｓｉａの全バイオリアクターボトルにおいて、ここで試験した全条件に対し、相当量のアセテートが消費され、３ｇ／ｌを超えるエタノールが生成した。アセテート消費とエタノール生成との間には強い相関関係がある。アセテート消費／エタノール生成は、消費されたアセテート各モルに対し、約１モルのエタノールが生成するという方式で起こる（表９）。しかしながら、補給された炭水化物（又はピルベート）は実質的に消費され、光学密度で推定したバイオマスレベルは減少した。どの場合も、上部空間の圧力降下は１０ｐｓｉ未満であった。すべての場合において、ｐＨは約０．９単位上昇して６．４になった。

消費されたアセテート／開始時のアセテート（列１）について見てみると、発酵ブロス中に存在する少なくとも５０％、場合によっては７５％を超えるアセテートが高めた圧力で消費されている。生成したエタノール／開始時のアセテート（列２）について見てみると、消費された酸の少なくとも６０％、場合によっては少なくとも８０％がアルコールに置き換わっている。生成したエタノール／消費されたアセテート（列３）について見てみると、発酵プロセスで消費されたアセテートの量と生成したアルコールとの間には強い相関がある。４０及び５０ｐｓｉａの上部空間過剰圧で培地中に溶解されているＣＯの理論的レベルは、ヘンリーの法則に基づいて表１０に計算した。

ここに提示した結果は、それを超えるとＣ．オートエタノゲナムの代謝がＣＯ基質からのアセテート及びバイオマス生成から、アセテートの少なくとも一部のエタノールへの変換に実質的に変化するＣＯ分圧があることを示している。従って、ＣＯ分圧が３７ｐｓｉ未満の場合、アセテート及びバイオマスがＣＯガス代謝の主要生成物であり、ｐＨは酸性になって更なる増殖が阻害される。ＣＯ分圧が３７ｐｓｉを超えると、バイオマス増殖及びアセテート生成は阻害されると見られ、アセテートの消費が起こる。さらに、エタノール生成がわずかなＣＯ消費で起こる。同時に、ｐＨは６．５に達するまで増加する。そのｐＨで細菌は実質的に阻害され、アセテートからエタノールへの変換が停止するようである。試験した濃度で、フルクトース、キシロース又はピルベートの目立った効果はない。

実施例３Ｃ：アルコール生成に及ぼすＣＯ分圧の効果
血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルを指定のガスで２５ｐｓｉｇ（４０ｐｓｉａ）に加圧し、常に振盪しながら３７℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを１時間、３時間及び５時間の間隔で採取した（表１１参照）。

結果は、酸がアルコールに変換される十分な閾値ＣＯ分圧は２０ｐｓｉａ未満であることを示している。短い反応時間スケールにわたって（実施例３Ａ〜Ｃ参照）、試験したすべてのＣＯ分圧でアセテートはアルコールに実質的に化学量論的に変換されている。従って、２０ｐｓｉａを超えるＣＯ分圧は、Ｃ．オートエタノゲナムが酸をアルコールに変換するのに十分である。

実施例４：ガス組成の効果
実施例４Ａ：アセテートからエタノールへの変換に及ぼす純ガスの効果
血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルを指定のガスで２５ｐｓｉｇ（４０ｐｓｉａ）に加圧し、常に振盪しながら３７℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを１時間、３時間及び５時間の間隔で採取した（表１２参照）。

結果は、Ｃ．オートエタノゲナムが酸をアルコールに変換するためにはＣＯ又はＨ_２のような還元ガスが必要であることを明らかに示している。酸からアルコールへの代謝経路はヒドロゲナーゼ酵素を含むので、水素はＣＯの代わりに使用できると考えられる。さらに、Ｈ_２は酸をアルコールに変換するための適切なエネルギー源であるが、エネルギー源の他に炭素源も必要とする生合成及び／又はアセテート生成には不向きであろうということも考えられる。

実施例４Ｂ：エタノール生成に及ぼすガス組成の効果
血清バイアルを上記に従って準備した。ただし、植菌前に、ＮａＯＨ（水溶液）でｐＨ５．５に緩衝された酪酸溶液をバイアルに添加（スパイク）した。ｔ＝０における初期濃度は、アセテート６．７ｇ／ｌ及びブチレート０．８ｇ／Ｌであった（エタノールもブタノールも存在せず）。発酵ブロスのサンプルを２４時間時点で採取した（表１３参照）。

酪酸及び酢酸のような酸は、混合ＣＯ／Ｈ_２基質の存在下でエタノール及びブタノールを含むアルコールに変換できる。明らかに、Ｈ_２の不在下では増大されたＣＯ分圧が総体的変換を改良する。しかしながら、特に高めた分圧でのＨ_２の存在も、総体的変換を改良する。

実施例４Ｃ：エタノール生成に及ぼすガス組成の効果
血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルを指定のガスで３５ｐｓｉｇ（５０ｐｓｉａ）に加圧し、常に振盪しながら３７℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを１８時間時点で採取した（表１４参照）。

ＣＯ及びＨ_２を含む混合基質は、Ｃ．オートエタノゲナムの存在下で酸をアルコールに変換するのに使用することができる。興味深いことに、実験の時間スケール全体を通して、アセテートが消費されるよりも著しく多いアルコールが生成している。このことは、アセテートはエタノールに化学量論的に変換されるが、ＣＯが完全に消費されるまでは追加のアセテートが蓄積し、それがアルコールに変換されうることを示している。

実施例４Ｅ：アルコール生成に及ぼすＣＯ及びＨ_２分圧の効果
血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルを指定のガスで３５ｐｓｉｇ（５０ｐｓｉａ）に加圧し、常に振盪しながら３７℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを１．５時間、３時間、５時間及び２４時間の間隔で採取した（表１５参照）。

結果は、Ｈ_２濃度が高いと、酸からアルコールへの総体的変換に改良が見られることを示している。しかしながら、実験の経過に伴ってＨ_２濃度が枯渇すると、特にＨ_２濃度が低い場合（例えば２０％）、エタノールはアセテートに再変換されると考えられる。

実施例４Ｆ：製鋼所廃ガス中のＣＯ分圧の効果
血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルを製鋼所の廃ガス（約５３％ＣＯ；１８％ＣＯ_２；２６％Ｎ_２；３％Ｈ_２）で２５ｐｓｉｇ（４０ｐｓｉａ）に加圧し、常に振盪しながら３７℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを１時間、３時間及び５時間の間隔で採取した（表１６参照）。

製鋼所の廃ガスは酸をアルコールに変換するのに使用することができる。廃ガス中のＣＯ分圧の増大は酸変換に有益な効果を有する。
実施例４Ｇ：エタノール生成に及ぼすＣＯ_２分圧の効果
血清バイアルを上記に従って準備した。各血清バイアルを指定のガスで３５ｐｓｉｇ（５０ｐｓｉａ）に加圧し、常に振盪しながら３７℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを１時間、３時間及び５時間の間隔で採取した（表１７参照）。

様々な成分を含有するＣＯを含む基質は、酸をアルコールに変換するのに使用することができる。しかしながら、増大したＣＯ_２濃度はアルコール生成にわずかな阻害作用を有することに注意する。

実施例５：ホルメート添加の効果
実施例５Ａ：バッチ容器中のホルメート濃度：
血清バイアルを上記に従って準備した。ただし、ホルメート水溶液を空のバイアルに加え、ＮａＯＨでｐＨを５．５に調整した後、植菌した。各血清バイアルを５０％ＣＯ；１２．５％ＣＯ_２；３７．５％Ｎ_２ガスで２５ｐｓｉｇに加圧し、常に振盪しながら３７℃でインキュベートした。発酵ブロスのサンプルを７２時間時点で採取した（表１８参照）。

ホルメートの不在下ではＣ．オートエタノゲナムはアセテートと少量のアルコールを製造し続ける。しかしながら、発酵反応にホルメートを添加すると、アセテートはアルコールに実質的に化学量論的な量で変換される。変換速度は、低いホルメート濃度（２ｇ／Ｌ）で最高となり、高いホルメート濃度では阻害及び／又は有毒作用がありうることを示している。

実施例５Ｂ：ＣＳＴＲでのホルメート添加：
５リットル入りＣＳＴＲ中の５Ｌの嫌気性発酵培地（上記のようにして調製）に、活発に増殖中のクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物（ＤＳＭＺ１９６３０）を５％（ｖ／ｖ）のレベルで植菌した。７０％ＣＯと１５％ＣＯ_２ １％Ｈ_２ １４％Ｎ_２ガスの連続流を拡散スパージャーによって６０ｍｌ／分の体積流速で発酵容器の底部に導入した。発酵槽の初期ｐＨは５．５に維持した。数日間の微生物増殖後、Ｎ_２を散布した新鮮な発酵培地を２ｍＬ／分の流速でＣＳＴＲに導入するポンプのスイッチを入れることによって連続培養を確立した。高さ制御装置(level controller)を使用して発酵容器内の培養物の正確な高さを維持する。これは、発酵容器内の高さが高くなりすぎたら自動的にスイッチが入り、高さが設定の高さに下がるまで容器から培養物を汲み出すレベルプローブとポンプを使用することによって行われる。こうすることによって、新鮮培地を培養物に安定供給し、活発に増殖する高生存性培養物を維持することが可能になる。

数日間の連続運転後、新鮮培地の供給を停止し、発酵槽をバッチ構成に戻した。時間＝０（図２）でギ酸（１５ｍＬ）を添加し、ｐＨをＮａＯＨの添加によって５．５に調整した。約３０分間の間に発酵培地のｐＨは６に上昇した。培養物によってアセテートが消費され、エタノールが生成したためである。そこで、追加のギ酸（３ｍＬ）を添加してｐＨを５．５に下げ戻した。約ｔ＝６０分の時点で、ギ酸の導入を、ｐＨが設定点の５．５より高くなると反応容器に自動的に投与するように構成された投与ポンプを使って行うようにした。ホルメート投与ポンプは約５時間運転され、この間、培養物によってアセテートが消費され、エタノールが生成した。

結果は、連続的にアセテートを生成している発酵反応を、系の撹乱、例えばホルメートの添加によって、アセテート生成から、アセテートからアルコールへの変換に切り替えられることを示している。変換は、実験の間を通して、実質的に化学量論的である。

実施例６：追加のアセテート添加の効果
１Ｌ入りＣＳＴＲ中の１Ｌの嫌気性発酵培地（上記のように調製、ただし下記の変更あり：低濃度ビタミン溶液［０．４ｍｌ／Ｌのパントテン酸非含有ＬＳ０３及び５００ｕｌ／Ｌのパントテン酸溶液（４０ｍｇ／Ｌ）］をストック溶液に添加した）に、活発に増殖中のクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物（ＤＳＭＺ１９６３０）を５％（ｖ／ｖ）のレベルで植菌した。３５％ＣＯと６０％Ｈ_２ ５％ＣＨ_４ガスの連続流を拡散スパージャーによって１０ｍｌ／分の体積流速で発酵容器の底部に導入した。発酵槽の初期ｐＨは５．５に維持した。数日間の微生物増殖後、ガス流速を２０ｍｌ／分に上げ、撹拌を２００ｒｐｍから５００ｒｐｍに増大した。新鮮培地（上記のように調製、ただし下記の変更あり：低濃度ビタミン溶液［０．４ｍｌ／Ｌのパントテン酸非含有ＬＳ０３及び１ｍｌ／Ｌのパントテン酸溶液（４０ｍｇ／Ｌ）］をストック溶液に添加した）を、発酵槽内の培地体積を一定に維持しながら導入することによって連続培養を確立した。新鮮培地の流速を数週間かけて６ｍｌ／時間から５４ｍｌ／時間に上げた。数週間の連続運転後、ガス供給を３５％ＣＯ ４５％Ｈ_２ １５％ＣＨ_４ ５％ＣＯ_２に変え、数週間運転した。エタノールの生産性は約６ｇ／Ｌ／日に維持された。５２日目、連続培養に供給されている新鮮培地に、ｐＨ５．５に緩衝された１５ｇ／Ｌの酢酸を２日間補給した。この間、アルコールの生産性は約１５ｇ／Ｌに増大し（５３日目−図３）、その後１２ｇ／Ｌ（５４日目）になった。発酵槽に導入されたアセテートの多くの部分がアルコールに変換されたと考えられる。

結果は、連続的にアルコールを生成している発酵反応において、追加の酸を添加することによってアルコール生産性を改良できることを示している。追加の酸（例えばアセテート）の添加は、発酵反応を撹乱し、添加された酸の相当部分がアルコール、例えばエタノールに変換されるようになる。

実施例７：ＣＯ含有ガスを用いるエタノール生成に及ぼすｐＨの効果
１リットル入りＣＳＴＲ中の１Ｌの嫌気性ＬＭ３３発酵培地に、活発に増殖中のクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物（ＤＳＭＺ１９６３０）を５％（ｖ／ｖ）のレベルで植菌した。７０％ＣＯと１５％ＣＯ_２ １％Ｈ_２ １４％Ｎ_２ガスの連続流を拡散スパージャーによって１９ｍｌ／分の体積流速で発酵容器の底部に導入した。発酵槽の初期ｐＨは５．５に設定した。大部分の実験で、培養物の酢酸濃度は、細胞リサイクル及び培地交換システムによって４ｇ／Ｌ未満に維持された。細胞をクロスフロー膜Ｖｉｖａ ２００に通してろ液を回収し、細胞を発酵容器に戻した。ろ液は新鮮培地と交換して、反応器内の培地体積が一定に保たれるよう確保した。３日目、細胞リサイクルシステムのスイッチを切り、３日間約５．６に維持されていたｐＨ（ＯＲＰは−４００〜−４３０ｍＶの間で変動）を上げた。ｐＨは約５．９に調整され、ＯＲＰは約−４７０ｍＶに低下した。

結果は、ｐＨ５．６でアセテートとエタノールは同時に生成し、アセテートの方が過剰であることを示している。図４を参照すると、この発酵段階は微生物増殖期間とも関連している。ｐＨを上げるとＯＲＰは約−４７０ｍＶに低下し、アルコール生成速度は約１．２ｇ／Ｌ／日に増大した。この間、多少のアセテートが約０．２ｇ／Ｌ／日の速度で消費された。従って、液体栄養培地のｐＨを調整することによって、微生物培養物を、アセテートを生成する生成相から、アセテートをエタノールに変換する変換相に切り替えることができる。

本発明をある好適な態様に関して本明細書中で説明してきたが、それは過度の実験をせずとも読者が本発明を実施できるようにするためである。当業者であれば、本発明は、具体的に記載されたもの以外にも、変形及び変更が可能であることは分かるであろう。本発明はすべてのそのような変形及び変更も含むことは理解されるはずである。さらに、表題、見出しなどは、本文献に対する読者の理解を増進するために提供されるものであって、本発明の範囲を制限するものとして読まれるべきでない。

以上及び以下で引用されたすべての出願、特許及び出版物（もしあるとすれば）の全開示内容は引用によって本明細書に援用する。
本明細書におけるいずれの先行技術への言及も、その先行技術が世界中のあらゆる国において共通の一般的知識の一部を形成していることの承認又は何らかの形態の示唆ではなく、そのように受け取られるべきでもない。

本明細書及び以下の請求項の全体を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、“含む(comprise, comprising)”などの用語は、排他的意味とは反対に、包括的意味、すなわち“含むが、限定されない”の意味と解釈されるものとする。

１ 増殖バイオリアクター
１ａ 増殖バイオリアクター
１ｂ 増殖バイオリアクター
２ 変換バイオリアクター
３ 生成物回収装置
１００ 発酵システム
１０１ 発酵システム

Claims (22)

1. ＣＯ及び／又はＨ_２を含む基質の存在下、微生物培養物を使用して酸を対応するアルコールに変換するための方法。
2. 前記方法が、
   ａ．バイオリアクター内でＣＯを含む基質の存在下、一つ又は複数のカルボキシド栄養性細菌株を培養し、一つ又は複数の酸及び場合により一つ又は複数のアルコールを製造し；そして
   ｂ．少なくとも一つの酸が少なくとも一つのアルコールに変換されるように微生物培養物を撹乱する
   ことを含む、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ａ）で製造された酸の少なくとも一部がステップ（ｂ）でアルコールに変換される、請求項２に記載の方法。
4. 前記酸がアセテートであり、前記アルコールがエタノールである、請求項２又は３に記載の方法。
5. 少なくとも一つの追加の酸をステップ（ａ）及び／又はステップ（ｂ）の最中にバイオリアクターに添加でき、少なくとも一つのアルコールに変換することができる、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記酸がモノ又はジ−カルボン酸である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 微生物培養物の撹乱が、
   ・微生物培養物を含有する液体栄養培地のｐＨを変えること；
   ・微生物培養物を含有する液体栄養培地のＯＲＰを変えること；
   ・一つ又は複数の酸をバイオリアクターに添加すること；
   ・一つ又は複数の還元剤をバイオリアクターに添加すること；
   ・微生物培養物を含有する液体栄養培地中のＣＯ濃度を変えること；
   ・バイオリアクター内のＣＯ分圧を変えること、この場合、ＣＯを含む基質はガス状である；
   の一つ又は複数を含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 添加される酸がホルメート及び／又はアセテートである、請求項７に記載の方法。
9. 添加される還元剤が、亜ジチオン酸ナトリウム、システイン及び／又は硫化ナトリウムである、請求項７又は８に記載の方法。
10. ＣＯ濃度を変えるステップが、液体栄養培地中のＣＯ濃度を少なくとも１ｍｍｏｌ増加させることを含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. ＣＯ分圧を増大させるステップが、分圧を少なくとも１５ｐｓｉ増大させることを含む、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. ＣＯ分圧を増大させるステップが、分圧を少なくとも３７ｐｓｉの十分な閾値より上に増大させることを含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. ステップ（ａ）が実質的に第一の増殖バイオリアクターで実施され、ステップ（ｂ）が実質的に第二の変換バイオリアクターで実施される、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 一つ又は複数のアルコールの製造法であって、前記方法は、少なくとも、
    ・第一のバイオリアクターにおいて、基質を発酵させて一つ又は複数の酸を製造させ；
    ・第二のバイオリアクターにおいて、一酸化炭素を含む基質の存在下、一つ又は複数の細菌株を培養し；
    ・第一のバイオリアクターからの一つ又は複数の酸を、前記一つ又は複数の細菌株が変換相にあるときに第二のバイオリアクターに導入して、前記一つ又は複数の酸に対応するアルコールを製造させる；ここで、製造されるアルコールは、前記一つ又は複数の細菌株が前記酸の不在下で前記基質上で増殖した場合に製造することができるアルコールではない；
    ステップを含む方法。
15. 前記方法がメディエーターの不在下で実施される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. ＣＯを含む基質がガス状基質である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. ＣＯを含む基質が、少なくとも約１５％〜約１００体積％のＣＯを含む、請求項１６に記載の方法。
18. ＣＯを含む基質が、少なくとも約４０％〜約７０体積％のＣＯを含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
19. 基質が製鋼所から得られたガスを含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 細菌が、クロストリジウム(Clostridium)、ムーレラ(Moorella)、ピロコッカス(Pyrococcus)、真正細菌(Eubacterium)、デスルホバクテリウム(Desulfobacterium)、カルボキシドサーマス(Carboxydothermus)、アセトゲニウム(Acetogenium)、アセトバクテリウム(Acetobacterium)、アセトアナエロビウム(Acetoanaerobium)、ブチリバクテリウム(Butyribacterium)及びペプトストレプトコッカス(Peptostreptococcus)からなる群から選ばれる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 細菌がクロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)である、請求項２０に記載の方法。
22. 発酵システムであって、
    ・ＣＯを含む基質の微生物発酵によって酸及び場合によりアルコールを製造するように適合された少なくとも一つのバイオリアクター；及び
    ・酸がアルコールに変換されるように微生物発酵を撹乱するための手段
    を含む発酵システム。

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