CN106190846A - 维持培养物的存活力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在底物限制供应期间维持微生物培养物的方法。按照本发明的所述方法，通过将包含一氧化碳营养菌的微生物培养物的温度保持在最佳操作温度以下可以在底物限制供应期间维持所述微生物培养物。

Description

维持培养物的存活力的方法
本申请是2010年2月23日提交的申请号为PCT/NZ2010/000029、发明名称为“维持培养物的存活力的方法”的国际申请的分案申请，所述国际申请于2011年9月28日进入中国国家阶段，其申请号为201080014015.3。
发明领域
一般地，本发明涉及通过气态底物上的微生物发酵提高微生物生长和产品生产的效率的方法。更具体地，本发明涉及在包含CO的底物流变得有限之前、期间和/或之后通过微生物发酵生产产品(如醇)的方法。在特定的实施方式中，本发明涉及在包含CO的有限底物期间维持微生物培养物的存活力的方法。
发明背景
乙醇正迅速成为世界各地主要的富氢液体运送用燃料。2005年乙醇的全球消费量估计为122亿加仑。由于欧洲、日本、美国和一些发展中国家对乙醇的兴趣增加，燃料乙醇产业的全球市场也预计将在未来继续大幅增长。
例如，在美国，乙醇用于生产E10(在汽油中加入10％乙醇的调和物)。在E10调和物中，乙醇成分作为充氧剂，提高燃烧效率并减少空气污染物的产生。在巴西，乙醇既作为混入汽油的充氧剂又作为独自的纯燃料，满足约30％的运送用燃料的需求。此外，在欧洲，围绕温室气体(GHG)排放后果的环境问题一直刺激欧洲联盟(EU)为成员国设定可持续的运送用燃料(如生物质乙醇)的强制消费目标。
绝大多数的燃料乙醇通过传统的利用从农作物中取得的碳水化合物(如从甘蔗中提取的蔗糖或从谷类作物中提取的淀粉)作为主要碳源的基于酵母发酵的过程进行生产。然而，这些碳水化合物原料的成本受其作为人类食品或动物饲料的价值的影响，而且用于乙醇生产的淀粉或蔗糖生产作物的栽培不是在所有地区都是经济上可持续发展的。因此，开发将更低成本和/或更丰富的碳资源转化成燃料乙醇的技术是非常有意义的。
CO是有机材料(如煤或石油及石油衍生产品)不完全燃烧的主要游离高能副产品。例如，据报道，澳大利亚的钢铁行业每年生产并释放超过50万公吨CO到大气中。
可以利用催化过程将主要由CO和/或CO和氢气(H2)组成的气体转化成各种燃料和化学品。也可以利用微生物将这类气体转化为燃料和化学品。虽然这些生物过程通常比化学反应慢，相比催化过程，它们却有几个优势，包括更高的特异性、更高的产量、更低的能源成本和更大的抗毒性。
微生物将CO作为唯一的碳源在其上生长的能力于1903年首次被发现。这后来被确定为利用自养生长的乙酰辅酶A(乙酰CoA)生化途径(也称Woods-Ljungdahl途径和一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶(CODH/ACS)途径)的生物体的特性。大量的厌氧生物体(包括一氧化碳营养生物体、光合生物体、产甲烷生物体和产乙酸生物体)已被证明将CO代谢为各种最终产品，即CO2、H2、甲烷、正丁醇、乙酸盐和乙醇。当利用CO作为碳源时，所有这些生物体产生这些最终产品中的至少两个。
厌氧细菌(如那些来自梭状芽孢杆菌属的细菌)已被证实通过乙酰CoA生化途径从CO、CO2和H2生产乙醇。例如，WO 00/68407、EP 117309、专利号为5,173,429、5,593,886和6,368,819的美国专利、WO 98/00558和WO 02/08438中描述了从气体生产乙醇的不同的扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株。细菌Clostridium autoethanogenum sp也已知从气体生产乙醇(Abrini等人，Archives of Microbiology 161，pp 345-351(1994))。
然而，由微生物通过气体发酵生产乙醇总是伴随着副产物乙酸盐和/或乙酸的产生。由于一些现有的碳转化成乙酸盐和/或乙酸而非乙醇，利用这种发酵过程生产乙醇的效率或许不甚理想。此外，除非所述乙酸盐/乙酸副产品可用于某种其他目的，否则，这可以构成垃圾处理问题。乙酸盐/乙酸由微生物转化为甲烷，因此有可能加剧GHG排放。
一些已知与微生物利用一氧化碳作为其唯一碳源和能源的能力相关的酶据知其活性需要金属辅助因子。其活性需要金属辅助因子结合的主要的酶的例子包含一氧化碳脱氢酶(CODH)和乙酰辅酶A合酶(ACS)。
WO2007/117157和WO2008/115080，其披露内容以引用的方式并入本文，描述了通过包含一氧化碳的气体的厌氧发酵生产醇，特别是乙醇的方法。WO2007/117157描述的作为发酵过程的副产品生产的乙酸盐被转化成氢气和二氧化碳气体，其一或两者都可用于厌氧发酵过程。
将包含CO的气态底物发酵以生产酸和醇等产品通常有利于产酸。通过本领域已知的方法，如WO2007/117157、WO2008/115080、WO2009/022925和WO2009/064200(其以引用的方式完全并入本文)中所述的方法能够提高醇的生产率。
为了维持一个或多个一氧化碳营养菌(如产乙酸菌)的存活力，微生物培养物必须得到包含足够CO量的基本上连续的底物流。相应地，如果微生物培养物没有得到足够的CO(或CO2/H2)量，所述培养物可能恶化并最终死亡。例如，不足的CO供应期间，如存储、底物限制供应或培养物/接种物转移期间，微生物培养物会迅速耗尽可用的CO，存活力会恶化。
WO2009/114127提供了一种在底物限制供应期间维持微生物存活力的方法。不过，所述方法包括向生物反应器中加入CO2，其中大量的乙醇被转化成乙酸盐，导致pH值降低。这种影响需要抵消，以防止多余的分子乙酸产生抑制。
本发明的目的是提供一种至少有助于克服上述缺点的方法，或者至少为公众提供一个有用的选择。
发明概述
在本发明的一特定方面，提供了一种维持一氧化碳营养菌的微生物培养物的存活力的方法，其中包含CO的底物有限或不可用，所述方法包括保持所述培养物在低于所述微生物培养物的生长和/或产品生产的最佳操作温度的温度下或者在低于所述微生物培养物的生长和/或产品生产的最佳操作温度的温度范围内的步骤。在特定的实施方式中，所述微生物培养物悬浮在液体营养培养基中。
当可用来维持所述微生物培养物的生长和/或代谢物的生产的CO不足时，认为底物是限制性的。例如，在连续培养中，当稳态生长不能维持时，认为底物是限制性的。
通常情况下，微生物培养物消耗所述包含CO的底物的速率为至少0.1mmol/g微生物细胞/min、至少0.2mmol/g/min、至少0.3mmol/g/min、至少0.4mmol/g/min或者至少0.5mmol/g/min。就这点而论，在特定的实施方式中，如果少于至少0.1mmol/g微生物细胞/min、至少0.2mmol/g/min、至少0.3mmol/g/min、至少0.4mmol/g/min或至少0.5mmol/g/min可用于所述微生物培养物，所述包含CO的底物便是限制性的。底物的限制性通常与微生物的生长停止或放缓有关。
在本发明的某些实施方式中，所述微生物培养物的温度降低到低于所述微生物培养物的最佳操作温度至少5°、至少10°、至少15°、至少20°、至少25°或至少30°。本领域的技术人员一旦考虑到本文的披露内容便会理解一氧化碳营养菌的最佳操作温度。不过，举例来说，Clostridium autoethanogenum的最佳操作温度为37℃。就这点而论，在本发明的特定实施方式中，所述微生物培养物的温度降至低于32℃、低于30℃、低于25℃、低于20℃、低于15℃、低于10℃或低于5℃。
在本发明的特定实施方式中，所述微生物培养物的温度可以通过直接或间接冷却所述液体营养培养基来降低。在特定的实施方式中，可将所述液体营养培养基的至少一部分通过热交换装置来冷却液体。附加地或者替代地，所述微生物培养物放在容器(如生物反应器或运送容器)内，而所述容器可以通过任何已知的冷却装置(如冷却夹套)冷却。
在特定的实施方式中，所述微生物培养物的存活力可以在降低的温度下基本保持至少3h、至少5h、至少7h、至少15h、至少30h或至少48h。
在本发明的另一方面，提供了一种存储一氧化碳营养菌的微生物培养物的方法，其中底物流有限或不可用，所述方法包括将所述微生物培养物的温度降低至所述最佳操作温度以下的步骤。
在特定的实施方式中，存储后，例如当包含足够CO的底物流恢复时，所述微生物培养物的温度上升至所述最佳操作温度。在这类实施方式中，所述微生物培养物的存活力通过冷却、存储和升温基本上得到维持。
在另一个方面，提供了一种维持存储期间微生物培养物的存活力的方法，所述方法包括步骤：
冷却所述微生物培养物至最佳操作温度以下或至最佳操作温度以
下的温度范围，
存储所述微生物培养物一段时间，
在特定的实施方式中，所述方法包括存储后，升温所述培养物至最佳操作温度。
在特定的实施方式中，延长时间为至少3h、至少5h、至少7h、至少15h、至少30h或至少48h。
在特定的实施方式中，所述方法用来在CO限制供应期间维持培养物的存活力。在另一实施方式中，所述方法可用于在运送到远程位置过程中维持微生物培养物的存活力。在这类实施方式中，认为维持存活力的CO供应可能不足和/或搅动可能不充分。就这点而言，冷却所述微生物培养物使得存活力维持的时间延长。
在前方面的特定实施方式中，所述培养物的存储包括其中在底物限制条件下将所述培养物保持在生物反应器中的实施方式。附加地或者替代地，所述培养物可以从生物反应器转移到存储容器和/或运送容器。在这类实施方式中，期望可以在稍后的时间将所述培养物放回生物反应器。
在特定的实施方式中，存储后，所述微生物培养物可用于接种生物反应器。在这类实施方式中，接种前、接种期间或者接种之后，所述微生物培养物可以升温至最佳操作温度。
在本发明的另一方面，提供了一种运送包含一氧化碳营养菌的微生物培养物的接种物的方法，所述方法包括：
冷却所述微生物培养物至最佳操作温度以下，
运送所述微生物培养物至远程位置，
用所述微生物培养物接种生物反应器。
在特定的实施方式中，所述微生物培养物在运送容器中被运送到远程位置。在特定的实施方式中，所述微生物培养物可在所述运送容器中被冷却和/或升温。
在特定的实施方式中，所述方法包括了用包含CO的底物加压所述运送容器。在特定的实施方式中，所述运送容器包括混合装置。
本发明的实施方式在通过包含CO的气态底物的发酵生产酸和醇(如乙醇)中有特定的应用。所述底物可包含作为工业过程的副产品而获得的气体。在某些实施方式中，所述工业过程选自黑色金属产品制造、有色金属产品制造、石油炼制工艺、生物质气化、煤炭气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产。在本发明的一个实施方式中，所述气态底物为合成气。在一个实施方式中，所述气态底物包括从钢厂获得的气体。
所述包含CO的底物通常会包含大比例的CO，如至少约20％至约100％体积的CO、从40％到95％体积的CO、从40％到60％体积的CO以及从45％至55％体积的CO。在特定的实施方式中，所述底物包含约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％体积的CO。具有较低CO浓度(如6％)的底物也可以是合适的，特别是当H2和CO2也存在时。
在不同的实施方式中，使用一个或多个一氧化碳营养菌菌株进行发酵。在不同的实施方式中，所述一氧化碳营养菌选自梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、穆尔氏菌属(Moorella)、醋菌属(Oxobacter)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)或丁酸杆菌属(Butyribacterium)。在一个实施方式中，所述一氧化碳营养菌为Clostridium autoethanogenum。
本发明的所述方法可以用来在底物，特别是包含一氧化碳的气态底物的存在下，通过酸的厌氧发酵生产任何种类的醇，包括但不限于乙醇和/或丁醇。本发明的所述方法还可以应用于好氧发酵、其他产品(包括但不限于异丙醇)的厌氧或好氧发酵以及非含碳气体底物的发酵。
在另一个方面，提供了一种用于包含CO的底物的发酵的系统，包括至少一个生物反应器；测定装置，其适于测定提供至微生物培养物的所述包含CO的底物有限与否；以及温度控制装置，其被配置为在使用中，根据供应给所述微生物培养物的所述包含CO的底物有限与否的测定结果，能够调整所述生物反应器的温度。
在特定的实施方式中，所述控制装置被配置为如果所述测定装置测得所述包含CO的底物的供应有限，则降低所述生物反应器的温度。在特定的实施方式中，所述系统包括处理装置，所述处理装置被配置为根据所述包含CO的底物有限与否的变化，能够自动调整所述生物反应器的温度。
在另一实施方式中，所述温度控制装置被配置为如果所述底物不受限，则保持所述生物反应器的温度为或约为所述最佳操作温度。
本发明也可包括本申请的说明书中单独地或共同地提及或指出的部分、元素和特征，以及两个或两个以上所述部分、元素或特征的任何或所有组合，其中本文提到特定的整数，其在本发明涉及的领域具有已知的等同物，这类已知的等同物被认为并入本文中如同其单独地阐述一样。
发明详述
按照本发明的所述方法，令人惊讶地认识到一氧化碳营养微生物培养物可以在很少或没有额外的底物供应和/或搅动的条件下，在低于其最佳温度的温度下储存。相应地，在特定的实施方式中，所述微生物培养物可以在基本上低于其生长和/或代谢物生产的最佳温度的温度下从一个位置运送到一个远程位置，并可随后用于接种生物反应器。通常情况下，当在不提供额外的底物和/或搅动的条件下储存一氧化碳营养微生物培养物时，所述微生物培养物将迅速消耗任何溶解在液体营养培养基中的CO，而所述培养物的存活力会随着时间的推移恶化。因此，当没有搅动的存储后，这类培养物被用来接种生物反应器时，观察到微生物的生长和/或预期的生产力可能存在一个时间滞后的问题和/或所述接种可能会失败。
附加地或者替代地，在特定的实施方式中，当没有连续可用的包含CO的底物(例如气态底物流)时，所述微生物培养物可以冷却至低于所述最佳操作温度的温度并存储起来，直至有更多可用的底物。在其他其中所述底物有限(即其中CO可用但不足以促进最佳生长和/或代谢物的生产)的实施方式中，所述微生物培养物可冷却以减少对CO的需求。
按照本发明的特定实施方式，所述方法可以用来在底物限制供应期间维持微生物培养物的存活力。例如，包含CO的底物的连续稳态发酵通常要求所述底物以非受限的方式提供，以便维持基本上不断的生长和代谢物的产率。然而，本发明的所述方法可以用来在底物限制供应期间维持所述培养物的存活力，否则，便会导致培养物的恶化。
不希望受束于理论，为了维持一氧化碳营养菌(如Clostridiumautoethanogenum)的存活力，CO需要以大于或等于所述微生物培养物的CO摄取速率的速率供应至所述培养物。例如，促进生长和/或代谢物生产所需的最佳条件下，所述微生物培养物的所述CO摄取速率为至少0.1mmol/g微生物细胞/min、至少0.2mmol/g/min、至少0.3mmol/g/min、至少0.4mmol/g/min或至少0.5mmol/g/min。相应地，在其中微生物培养物悬浮在液体营养培养基中的特定实施方式中，所述培养物会迅速消耗溶解在所述培养基中的CO，除非所述溶解的CO能够以等于或快于所述CO摄取速率的速率被补充。由于CO难溶于水性营养培养基，除了稳定供应包含CO的底物之外，通常需要外力(如搅动和/或加压)以保持理想的CO到溶液的传送速率。在生物反应器中，这通常通过喷射CO到所述液体营养培养基以及可选地进一步搅动所述液体以提高CO到所述液体的传送速率来实现。这种方法一般不可用于适合在液体营养培养基中存储微生物培养物的容器(如运送容器)中。
已知在特定的实施方式中，其中所述微生物培养物正被从一个位置运送到远程位置，可以存在由所述容器的运动引起的小程度的搅动。然而，认为与容器运送(即通过公路运送)相关的轻微搅动远小于维持CO到所述液体营养培养基以防止培养物恶化的传送速率所需的搅动。
按照本发明的所述方法，冷却所述微生物培养物基本上使得所述培养物的存活力维持的时间延长。在特定的实施方式中，存储容器中CO的消耗能够通过冷却所述容器而减至最少。附加地或者替代地，可允许所述微生物培养物冷却至较低的环境温度。因此，当这种培养物可选地返回最佳温度(或最佳温度范围内)并于存储后用于接种生物反应器时，更快速地观察到微生物生长和/或所需的生产力。这种方法改善或至少减少对额外的CO、喷射和/或搅动的需求。
定义
除另有限定，本说明书通篇所用的以下术语定义如下：
术语“包含一氧化碳的底物”和类似术语应被理解为包括任何例如可用于一个或多个菌种的生长和/或发酵的一氧化碳的底物。
“包含一氧化碳的气态底物”包括任何包含一氧化碳的气体。所述气态底物通常会包含相当大的比例的CO，优选地至少约5％至约100％体积的CO。
在发酵产品的背景下，本文使用的术语“酸”包括羧酸和相关的羧酸阴离子，如本文所述的发酵液中存在的游离乙酸和乙酸盐的混合物。所述发酵液中分子酸和羧酸的比例取决于所述系统的pH值。术语“乙酸盐”包括单独的乙酸盐以及分子或游离乙酸和乙酸盐的混合物，如本文所描述的发酵液中存在的乙酸盐和游离乙酸的混合物。所述发酵液中分子乙酸和乙酸盐比例取决于所述系统的pH值。
术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道配置组成的发酵设备，其包括连续搅拌釜式反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气举发酵罐、膜反应器(如中空纤维膜生物反应器(HFMBR))、静态混合器或适用于气液接触的其他容器或其他设备。
除非文意另有所指，本文所用的短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等类似短语意在既包括过程的生长阶段，又包括过程的产品生物合成阶段。如本文将进一步描述的，在一些实施方式中，所述生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。就这点而言，向发酵反应添加金属或组分应理解为向这两种反应器中之一或两者添加。
除非文意另有所指，短语“存储”和“储存”用于指微生物培养物的底物供应有限或底物不可用的时段。就这点而言，该术语包括稳态生长条件下的微生物培养物的底物供应暂时有限而不可用的时段并包括微生物培养物从生物反应器转移到存储容器(如接种转移容器)的时段。
本文所用的术语“整体净转化”等意在描述通过微生物培养物，在特定的时间点底物(如CO)到包括酸和/或醇的产品的转化。微生物培养物的部分在特定的时间点可以用于不同的功能并可生产大量的产品，这是公认的。此外，所述发酵液中存在的一个或多个所述产品可被转化成其它产品。因此，所述整体净转化包括所述微生物培养物在任何特定时间点生产的所有产品。
虽然下面的说明重点在本发明的特定实施方式，即利用CO作为主要底物生产乙醇和/或乙酸盐，应当理解，本发明可适用于替代醇和/或酸的生产以及替代底物的使用，如本发明涉及领域的普通技术人员所知。例如，也可使用含有二氧化碳和氢气的气态底物。此外，本发明可适用于发酵以生产丁酸盐、丙酸盐、己酸盐、乙醇、丙醇和丁醇。所述方法也可用于生产氢。举例来说，这些产品可通过利用来自穆尔氏菌属、梭状芽胞杆菌属、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、醋酸杆菌属、真杆菌属、丁酸杆菌属、醋菌属、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、以及脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)的微生物进行的发酵来生产。
本发明的某些实施方式适于利用一个或多个工业过程产生的气流。这类过程包括炼钢过程，尤其是产生具有高CO含量或高于预定水平(即5％)的CO含量的气流的过程。根据这类实施方式，产乙酸菌优选地用于在一个或多个生物反应器中生产酸和/或醇，特别是乙醇或丁醇。本领域的技术人员一旦考虑到本文的披露内容便会意识到本发明可应用于各种行业或废气流，包括那些具有内燃机的车辆的废气流。此外，本领域的技术人员一旦考虑到本文的披露内容便会意识到本发明可应用于其他发酵反应，包括那些使用相同或不同的微生物的发酵反应。因此，本发明的范围意在不局限于所述的特定实施方式和/或应用，而应当在更广泛的意义上予以理解；例如，所述气流的来源是没有限制的，只要至少其一个组分可用于为发酵反应提供原料。本发明特别适用于改善整体的碳捕获和/或从气态底物(如汽车废气和含大量CO的工业烟气)生产乙醇和其他醇。
发酵
已知从气态底物生产乙醇和其他醇的工艺。示例性的工艺包括例如WO2007/117157、WO2008/115080、US 6,340,581、US 6,136,577、US 5,593,886、US 5,807,722和US5,821,111(其中每个以引用的方式并入本文)中描述的那些工艺。
已知许多厌氧细菌能够进行CO到醇(包括正丁醇和乙醇)和乙酸的发酵，而且其适用于本发明的工艺。适用于本发明的这类细菌的例子包括梭状芽孢杆菌属的细菌(例如扬氏梭菌菌株)，包括WO 00/68407、EP 117309、专利号为5,173,429、5,593,886和6,368,819的美国专利、WO 98/00558和WO 02/08438中所述的那些细菌，Clostridiumcarboxydivorans(Liou等人，International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology 33：pp2085-2091)、Clostridium ragsdalei(WO/2008/028055)和Clostridium autoethanogenum(Abrini等人，Archives of Microbiology 161：pp 345-351)。其他合适的细菌包括穆尔氏菌属的那些细菌，包括Moorella spHUC22-1，(Sakai等人，Biotechnology Letters 29：pp 1607-1612)以及氧化碳嗜热菌属的那些细菌(Svetlichny，V.A.，Sokolova，T.G.等人(1991)，Systematic and Applied Microbiology14：254-260)。进一步的例子包括热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica)、产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、普氏醋菌属(Oxobacter pfennigii)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)(Simpa等人.CriticalReviews in Biotechnology，2006 Vol.26.Pp41-65)。此外，应当理解，其他产乙酸厌氧菌可适用于本发明，本领域的技术人员会作此理解。也会理解本发明可应用于两个或两个以上细菌的混合培养物。
适用于本发明的一个示例性微生物是Clostridium autoethanogenum。在一个实施方式中，所述Clostridium autoethanogenum是具有存储在德国生物材料资源中心(DSMZ)且识别存储号为19630的菌株的识别特征的Clostridium autoethanogenum。在另一实施方式中，所述Clostridium autoethanogenum是具有DSMZ存储号DSMZ 10061的识别特征的Clostridium autoethanogenum。
用于本发明所述方法的细菌培养可用本领域已知的任意数量的利用厌氧菌的培养和发酵底物的工艺来进行。示例性技术在下文的“实施例”部分提供。进一步举例来说，可利用下文中一般描述的那些将气态底物用于发酵的工艺：(i)K.T.Klasson，等人.(1991).Bioreactors for synthesis gas fermentations resources.Conservation andRecycling，5；145-165；(ii)K.T.Klasson，等人.(1991).Bioreactor design forsynthesis gas fermentations.Fuel.70.605-614；(iii)K.T.Klasson，等人.(1992).Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels.Enzyme andMicrobial Technology.14；602-608；(iv)J.L.Vega，等人.(1989).Study of GaseousSubstrate Fermentation:Carbon Monoxide Conversion to Acetate.2.ContinuousCulture.Biotech.Bioeng.34.6.785-793；(v)J.L.Vega，等人.(1989).Study of gaseoussubstrate fermentations；Carbon monoxide conversion to acetate.1.Batchculture.Biotechnology and Bioengineering.34.6.774-784；(vi)J.L.Vega，等人.(1990).Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations.Resources，Conservation and Recycling.3.149-160；以上全部以引用的方式并入本文。
所述发酵可在任何合适的生物反应器中进行，如连续搅拌釜式反应器(CSTR)、固定化细胞反应器、气举反应器、鼓泡塔反应器(BCR)、膜反应器(如中空纤维膜生物反应器(HFMBR))或滴流床反应器(TBR)。此外，在本发明的一些实施方式中，所述生物反应器可包括第一生长反应器(在其中培养微生物)和第二发酵反应器(向其提供来自所述生长反应器的发酵液且在其中生产大部分的发酵产品(如乙醇和乙酸盐))。
根据本发明的各种实施方式，所述发酵反应的碳源是包含CO的气态底物。所述底物可以是作为工业过程的副产品获得的或者来自某另一来源(如来自汽车排气)的包含CO的废气。在某些实施方式中，所述工业过程选自黑色金属产品制造(如钢厂)、有色金属产品制造、石油炼制工艺、煤炭气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产。在这些实施方式中，通过使用任何方便的方法，在所述包含CO的底物排放到大气中前将其从所述工业过程中捕获。根据所述包含CO的底物的成分，在将其引入发酵之前进行处理以去除任何不希望有的杂质(如尘粒)，这也许是可取的。例如，利用已知的方法可过滤或擦洗所述气态底物。
替代地，所述包含CO的底物可来源于所述生物质气化。气化过程涉及空气或氧气的受限供应中生物质的部分燃烧。由此产生的气体通常主要包括CO和H2，以及小体积的CO2、甲烷、乙烯和乙烷。例如，食品提取和加工过程中获得的生物质副产品(如来自甘蔗的糖或来自玉米或谷物的淀粉)或林产业所产生的非食品生物质废物可以被气化，以产生适用于本发明的包含CO的气体。
所述包含CO的底物通常会包含大比例的CO，如至少约20％至约100％体积的CO、从40％至95％体积的CO、从60％至90％体积的CO以及从70％至90％体积的CO。在特定的实施方式中，所述底物包含25％、30％、35％、40％、45％或50％体积的CO。具有较低CO浓度(如6％)的底物也可以是合适的，特别是当H2和CO2也存在时。
虽然所述底物并不必要包含任何氢，H2的存在不应该不利于按照本发明方法的产品形成。在特定的实施方式中，氢的存在使得醇生产的整体效率得到改善。例如，在特定的实施方式中，所述底物可包括约2∶1、1∶1或1∶2比例的H2∶CO。在其他的实施方式中，所述底物流包含低浓度的H2，例如低于5％、低于4％、低于3％、低于2％、低于1％或基本上不含氢。所述底物还可包含例如一些CO2，如约1％至约80％体积的CO2或1％至约30％体积的CO2。
通常情况下，一氧化碳以气态形式被添加到所述发酵反应。然而，本发明的所述方法不仅限于这种状态的底物的添加。例如，一氧化碳能够以液体形式提供。例如，液体可饱含包含一氧化碳的气体而所述液体被添加到所述生物反应器中。这可以使用标准的方法来实现。举例来说，微泡分布发生器(microbubble dispersion generator)(Hensirisak等人.Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation；Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101，Number 3/October，2002)可用于此目的。
应当理解，为使细菌生长和CO到醇的发酵发生，除了所述包含CO的底物气体，需要提供合适的液体营养培养基至所述生物反应器。营养培养基含有足以允许所用的微生物生长的维生素和矿物质。适于利用CO作为唯一碳源的乙醇发酵的厌氧培养基为本领域所知。例如，上面提到的专利号为5,173,429和5,593,886的美国专利以及WO 02/08438、WO2007/115157和WO2008/115080中描述了合适的培养基。本发明提供了一种新颖培养基，其提高了支持发酵过程中微生物生长和/或醇生产的效率。所述培养基将在以下更详细的描述。
为使所需的发酵(如CO到乙醇)发生，所述发酵应当在适当的条件下适宜进行。应该考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH值、培养基氧化还原电位、搅动速度(如果使用连续搅拌釜式反应器)、接种水平、确保液相的CO不会变得限制性的最大的气体底物浓度以及避免产物抑制的最大的产物浓度。适当的条件在WO02/08438、WO07/117157和WO08/115080中有描述。
最佳反应条件将部分取决于所用的特定微生物。然而，在一般情况下，优选地在高于环境压力的压力下进行发酵。在增大压力下的操作允许CO从气相到液相的转移速率得到显著提高，其中CO被微生物作为碳源吸收，以用于乙醇生产。这反过来意味着，当生物反应器保持在加压而非大气压力下时，保留时间(定义为所述生物反应器中的液体体积除以输入气体流量)可减少。
此外，由于给定的CO到乙醇的转化率在某种程度上是底物保留时间的函数，而且实现所需的保留时间反过来又要求生物反应器的所需体积，加压系统的使用能够大大减少所需的生物反应器的体积，从而减少发酵设备的基本费用。据专利号为5,593,886的美国专利中所给的例子，反应器体积的减小与反应器操作压力的增加呈线性比例，即10个大气压的压力下操作的生物反应器只需为1个大气压的压力下操作的生物反应器体积的十分之一。
在加压下进行气体到乙醇的发酵的好处也已经在别处得到描述。例如，WO 02/08438描述了在30psig和75psig压力下进行的气体到乙醇的发酵，分别提供150克/升/天和369克/升/天的乙醇生产率。然而，发现在大气压力下使用类似的培养基和输入气体成分操作的实例性发酵每天每升产生的乙醇少10至20倍。
还希望所述包含CO的气态底物的引入率能确保液相的CO浓度不会变得有限。这是因为CO限制性的情况其后果可能是乙醇产品被所述培养物消耗。
产品回收
所述发酵反应的产品可以利用已知的方法回收。示例性方法包括WO07/117157、WO08/115080、US 6,340,581、US 6,136,577、US 5,593,886、US 5,807,722和US 5,821,111中描述的那些方法。然而，简要地举例来说，只有乙醇可通过诸如分馏或脱水法和萃取发酵等的方法从发酵液中回收。
从发酵液中蒸馏乙醇获得乙醇和水的共沸混合物(即95％的乙醇和5％的水)。随后通过使用亦为本领域所熟知的分子筛乙醇脱水技术可以获得无水乙醇。
萃取发酵过程涉及利用对发酵生物体呈现低毒性风险的水溶性溶剂，以从稀释的发酵液中回收乙醇。例如，油醇便是一种可用于这种类型的萃取过程的溶剂。不断地将油醇引入所述发酵罐，随后该溶剂在所述发酵罐的顶部上升形成一个层，不断地萃取该层并提供通过离心机。然后从所述油醇中容易地分离水和细胞并将水和细胞放回所述发酵罐，而将充满乙醇的溶剂注入闪蒸装置。蒸发并冷凝大部分的乙醇，而所述油醇是不挥发的，其被回收再用于发酵中。
利用本领域已知的方法也可以从所述发酵液中回收作为所述发酵反应的副产品生产的乙酸盐。
例如，可以使用涉及活性炭过滤器的吸附系统。在这种情况下，优选地，首先利用合适的分离装置将微生物细胞从所述发酵液中去除。本领域已知许多基于过滤的用于生成产品回收用的无细胞发酵液的方法。然后将无细胞的含乙醇和乙酸盐的渗透物通过含活性炭的柱，以吸附所述乙酸盐。以酸的形式(乙酸)而不是盐(乙酸盐)的形式存在的乙酸盐更容易被活性炭吸附。因此，优选地，在所述发酵液通过活性炭柱之前，所述发酵液的pH值降低到小于约3，以将大部分乙酸盐转化为乙酸形式。
利用本领域已知的方法，通过洗脱可以回收吸附至活性炭的乙酸。例如，可用乙醇洗脱结合的乙酸盐。在某些实施方式中，可用所述发酵过程本身产生的乙醇洗脱乙酸盐。由于乙醇的沸点是78.8℃而乙酸的沸点是107℃，乙醇和乙酸盐能够通过基于挥发性的方法(如蒸馏)很容易地彼此分离。
其他从发酵液回收乙酸盐的方法也为本领域所知并可在本发明的工艺中使用。例如，专利号为6,368,819和6,753,170的美国专利描述了可用于从发酵液中萃取乙酸的溶剂和潜溶剂的系统。如同所述用于乙醇萃取发酵的基于油醇的系统的实例，专利号为6,368,819和6,753,170的美国专利中所述的系统描述了能够在存在或不存在发酵的微生物的情况下与发酵液混合以萃取乙酸产品的水溶性溶剂/潜溶剂。然后通过蒸馏从所述液中分离含有乙酸产品的溶剂/潜溶剂。然后可用第二蒸馏步骤以从所述溶剂/潜溶剂系统中纯化所述乙酸。
通过连续地从所述发酵生物反应器中去除部分发酵液，(方便地通过过滤)从所述液中分离微生物细胞并且同时或相继地从所述液中回收一个或多个产品的步骤可以从所述液中回收所述发酵反应的产品(例如乙醇和乙酸盐)。在乙醇的情况下，其可方便地通过蒸馏回收，使用上述方法通过活性炭吸附可回收乙酸盐。分离出的微生物细胞优选地返回所述发酵生物反应器。乙醇和乙酸盐回收后剩余的无细胞的渗透物也优选地返回所述发酵生物反应器。所述无细胞的渗透物返回所述生物反应器前，可以向其中添加额外的营养物质(如B族维生素)，以补充营养培养基。此外，在返回所述发酵生物反应器之前，如果所述液的pH值如上所述进行调整，以提高乙酸的活性炭吸附，所述pH值应重新调整至与所述生物反应器的所述液的pH值类似。
维持培养物的存活力
根据本发明，提供了一种基本上维持一氧化碳营养菌的微生物培养物的存活力的方法，其中包含CO的底物有限或不可用，所述方法包括将所述微生物培养物的温度降到生长和/或产品生产的最佳温度以下。
根据本发明的所述方法，如果升温至最佳温度(或范围)后，培养物能够恢复新陈代谢以产生产品和/或细胞生长，所述培养物的存活力便得到维持。在特定的实施方式中，所述微生物培养物可用于接种生物反应器，维持培养物的存活力确保所述培养物可以在转移后恢复新陈代谢。按照本发明的所述方法储存的微生物培养物可以继续代谢和/或生长，尽管速度较慢。然而，一旦所述微生物培养物的温度恢复至最佳温度，新陈代谢和/或生长率预计将增加至储存前的水平。
当CO至水性营养培养基的转移速率比微生物培养物可以吸收(或消耗)所述CO的速率稍慢时，所述微生物培养物的CO会变得有限。通常情况下，一氧化碳营养菌，如Clostridium autoethanogenum，从液体营养培养基中吸收CO的速率大于0.1mmol/g微生物细胞/min、至少0.2mmol/g/min、至少0.3mmol/g/min、至少0.4mmol/g/min或者至少0.5mmol/g/min。因此，通常需要向所述微生物培养物提供恒定的包含CO的底物流。此外，由于CO在水性体系中的溶解度低，通常需要，例如，通过提高所述底物流中CO的分压和/或所述液体营养培养基的搅动，以进一步提高CO的转移速率(质量转移)。一旦考虑到本文的披露内容，本领域的技术人员便会理解根据本发明的特定实施方式提高CO的质量转移的替代方法。
在特定的实施方式中，本发明的所述方法可以用来维持微生物培养物的存活力，其中所述微生物培养物的CO有限，使得CO到溶液的转移速率小于所述培养物的吸收速率。当包含CO的底物不连续地提供至所述微生物培养物、质量转移速率低或者底物流中用以维持最佳温度下培养物的存活力的CO不足时，这种情况便会出现。在这类实施方式中，所述微生物培养物会迅速消耗溶解在所述液体营养培养基中的CO，并随着进一步的底物不能足够快地提供而变得底物受限。除非所述微生物培养物按照本发明的所述方法冷却，否则，所述微生物培养物的存活力会随着时间的推移减弱，导致培养物完全死亡或者所述培养物恶化到不再受条件限制的这样一个程度。
例如，在特定的实施方式中，当包含CO的底物不受限时，能够在基本上稳态的条件下进行包含一个或多个一氧化碳营养微生物的微生物培养物。在这种情况下，预计所述微生物培养物将有基本上恒定的生长速率和基本上恒定的代谢物生产速度。但是，当不能以非限制方式提供底物时，微生物的生长会放缓或停止，而且所述微生物培养物将迅速恶化并将从不断清洗的生物反应器中洗出。在这种情况下，即使所述底物恢复非限制供应，所述培养物可能不会复苏，或者至少复苏需要的时间被延长。然而，根据本发明，降低所述培养物的温度，以至在限制或没有底物供应的存储期间维持所述微生物培养物的存活力。
据公认，当温度降低时，微生物培养物的新陈代谢可放缓，所以或许需要调整操作条件，如细胞的保留时间。
在本发明的特定实施方式中，将储存的微生物培养物用于生物反应器的接种。在这类实施方式中，希望所述培养物具有适当的密度(即每单位体积内有大量的微生物)且所述培养物的存活力在储存期间(即运送到远程位置)基本上得到维持。通常情况下，所述培养物中所述微生物细胞的密度越高，他们耗尽液体营养培养基中的任何可用的CO的速度更快。不希望受束于理论，认为当CO不可用，或者被完全耗尽时，所述微生物培养物的存活力下降。例如，所述培养物的至少一部分开始相继死亡和/或所述培养转而放缓新陈代谢，以至于当生物反应器接种有所述微生物培养物时，高生长率和/或生产率的实现有滞后。然而，当冷却所述培养物时，所述液体营养培养基中CO的消耗放缓，以便所述培养物的存活力保存的时间基本上延长。
按照本发明的所述方法，可以将所述培养物冷却到最佳生长和/或代谢物的生产温度以下，从而使得所述培养物的存活力维持的时间延长。通常情况下，一氧化碳营养微生物具有一氧化碳营养菌的30-70℃范围的最佳操作温度。最佳的操作温度的例子在“Microbiology of synthesis gas fermentation for biofuels production”(A.M.Henstra等人.Current Opinion in Biotechnology，2007，18，200-206)中详述。例如，嗜温菌(如Clostridium autoethanogenum、Clostridium ljungdahli和Clostridiumcarboxydivorans)的最佳生长和代谢物的生产温度约为37℃。然而，嗜热菌的最佳温度显著较高，为55-70℃，例如，菌株热醋穆尔氏菌(55-60℃)、生氢氧化碳嗜热菌(70-72℃)、Desulfotomaculum carboxydivorans(60℃)。就这点而言，按照本发明的所述方法，有必要将所述微生物培养物冷却到低于所述最佳温度至少2°、至少5°、至少10°、至少15°、至少20°、至少25°或至少30°，以维持培养物的存活力。例如，Clostridium autoethanogenum可以冷却到小于30℃、小于25℃、小于20℃、小于15℃、小于10℃或小于5℃。
按照本发明的所述方法，一旦冷却，甚至在没有额外的包含CO的底物和/或搅动的情况下，所述培养物的存活力维持的时间会延长。在特定的实施方式中，所述培养物的存活力维持至少3h、至少5h、至少7h、至少15h、至少30h或至少48h。例如，当在降低的温度下存储时，Clostridium autoethanogenum的存活力维持至少30小时。
本领域的技术人员会理解，冷却微生物培养物需要的手段将取决于几个因素，包括盛放所述培养物的容器的大小和形状、所述培养物的冷却速度以及所述培养物是放热的还是吸热的。例如，许多大规模的发酵过程需要外部冷却，以消除发酵反应过程中产生的多余的热量。已经提供的已知的冷却方式可适于进一步冷却所述微生物培养物，以维持存活力。在替代的实施方式中，当所述微生物培养物需要外部加热以保持最佳的操作温度时，可以通过去除热源并允许所述发酵罐随着时间的推移冷却到室温的方式冷却所述培养物。附加地或者替代地，利用任何已知的制冷或冷却方式可以进一步冷却这类培养物。
在本发明特定的实施方式中，通过去除恒温热量控制，允许所述液体营养培养基冷却到最佳操作温度以下。在这种条件下，所述液体营养培养基和所述微生物培养物的温度将随着时间的推移下降至环境温度。根据本发明，随着所述微生物培养物的温度下降至低于最佳操作温度，乙醇的生产率得以提高。
认为工业发酵过程中将普遍遇到可以使用本发明的所述方法维持微生物培养物的存活力的情况，因为包含CO的底物流的连续性无法得到保证。例如，当包含CO的底物来自工业过程(如废气来自钢厂)时，可能有工业过程(即钢铁制造)减缓或长时间关闭的情况。在这种情况下，包含CO的底物的生产将放缓或完全停止。因此，当包含一氧化碳营养的微生物培养物的生物反应器的CO的供应有限或CO不可用时，所述培养物的存活力将随着时间的推移而减弱。然而，根据本发明的所述方法，如果冷却所述培养物，可以维持CO限制的操作期间的存活力。
同样，当产自原料(如生物质或市政固体废物)气化的合成气用作底物流时，会出现所述流的CO含量降低或者气化器因为(例如)保养而不得不脱机的情况。同样，在这种情况下，除非按照本发明的所述方法冷却需要CO用于新陈代谢的微生物培养物，否则所述培养物的存活力将会恶化。
在一替代的实施方式中，本发明的所述方法可以用来充分地维持用于接种远程生物反应器的微生物培养物的存活力。例如，微生物培养物可放置在适合运送和运送到远程位置的容器中。通常情况下，所述运送容器将要求供应CO和搅动装置，以确保所述培养物的存活力得到维持，这两者在移动环境下都难以提供。然而，按照本发明的所述方法，可在所述运送容器中冷却所述微生物培养物，以便在运送过程中，甚至在没有供应充足的CO和/或搅动的情况下，维持接种物的存活力。
按照本发明的另一实施方式，提供了一种用于包含CO的底物的发酵的系统，包括至少一个生物反应器；测定装置，其适于测定提供至微生物培养物的所述包含CO的底物是否有限；以及温度控制装置，其被配置为在使用中，根据供应给所述微生物培养物的所述包含CO的底物有限与否的测定结果，能够调整所述生物反应器的温度。
在特定的实施方式中，当所述测定装置测定所述底物的供应已经变得有限时，可以降低所述微生物培养物的温度，以维持培养物的存活力。附加地或者替代地，当所述测定装置测定所述底物不受限时，温度可基本上保持在最佳操作温度。在特定的实施方式中，所述系统包括处理装置，以便在使用中，所述控制装置能够按照本发明的所述方法自动调节所述微生物培养物的温度。
图1是根据本发明的实施方式之一的系统100的示意图。输入底物流1通过合适的导管进入生物反应器2。输入底物流1包括CO，而根据本发明的所述方法，所述底物流1的供应率和/或成分可以有所不同。所述系统100包括测定装置3，所述测定装置3在使用中测定供应给所述生物反应器中的微生物培养物的所述底物有限与否。所述系统100包括温度控制装置4，所述温度控制装置4能够调节所述生物反应器1的温度，以便能够将微生物培养物保持在最佳操作温度或者保持在降至和/或保持在所述最佳操作温度以下的温度。
在特定的实施方式中，所述温度控制装置4配置为使用时，如果所述测定装置测得所述底物供应不受限，能够将发酵的温度保持在最佳操作温度或者最佳操作温度左右。附加地或者替代地，如果所述测定装置3测得所述底物供应有限，所述控制装置4能够按照本发明的所述方法降低所述生物反应器1的温度。因此，温度能够控制在基本上低于所述最佳操作温度的温度，直到所述底物供应不再有限。
在特定的实施方式中，所述系统100包括可选的处理装置5，所述处理装置5被配置为根据所述测定装置3做出的测定结果自动调节所述控制装置4。
实施例
材料和方法
培养基LM33的制备：
培养基成分 每1.0L培养基的浓度
MgCl2.6H2O 0.5g
NaCl 0.2g
CaCl2.6H2O 0.26g
NaH2PO4 2.04g
KCl 0.15g
NH4Cl 2.5g
复合痕量金属溶液(LS06) 10mL
复合维生素B溶液(LS03) 10mL
刃天青(2g/L储液) 1mL
FeCl3(5g/L储液) 2mL
半胱氨酸盐酸 0.5g
蒸馏水 高达1L
复合痕量金属溶液(LS06) 每升储液
次氮基三乙酸 1.5g
MgSO4.7H2O 3.0g
MnSO4.H2O 0.5g
NaCl 1.0g
FeSO4.7H2O 0.1g
Fe(SO4)2(NH4)2.6H2O 0.8g
CoCl2.6H2O 0.2g
ZnSO4.7H2O 0.2g
CuCl2.2H2O 0.02g
AlK(SO4)2.12H2O 0.02g
H3BO3 0.30g
NaMoO4.2H2O 0.03g
Na2SeO3 0.02g
NiCl2.6H2O 0.02g
Na2WO4.6H2O 0.02g
pH值为5.5的培养基制备如下。将除了半胱氨酸盐酸以外的所有成分在400ml蒸馏水中混合。通过加热溶液至沸腾并允许其在定量的N2气流下冷却至室温使得所述溶液厌氧。一旦冷却，加入所述半胱氨酸盐酸，将所述溶液的pH值调整到5.5，然后将体积增大到1000ml；整个实验中保持无氧。
细菌：Clostridium autoethanogenum从德国生物材料资源中心(DSMZ)获得。提供给所述细菌的登录号为DSMZ 19630。
大气压力下生物反应器中用于接种的典型的连续培养物
用不含复合维生素B溶液(LS03)或半胱氨酸盐酸的4900ml的培养基LM33填充5升的生物反应器并在121℃下高压灭菌所述生物反应器30分钟。当冷却下来时，对所述培养基喷射N2以确保无氧。然后加入半胱氨酸盐酸和复合维生素B溶液(LS03)。整个发酵过程中保持无氧。在接种100ml Clostridium autoethanogenum培养物之前，在大气压下气体转化为95％的CO、5％的CO2。培养的开始，所述生物反应器保持在37℃，并在200rpm下搅拌。在生长阶段，搅动增加至400rpm。pH值设置至5.5，并通过自动添加5M NaOH得以保持。新鲜的厌氧培养基不断地加入到所述生物反应器，以保持所述生物反应器的生物量和乙酸盐在限定的水平。
实施例1：
用含有CO的气体(20％CO2；30％N2和3％H2；其余为CO)清洗无菌血清瓶三次，然后排空至-5psi真空。将大气压下的含有生物质、乙酸盐和痕量乙醇的50ml活性培养物从连续的生物反应器直接转移至234ml的血清瓶。然后用所述含有CO的气体填充184ml的顶空至40psia，并在指定的温度下不加摇晃进行孵育。
孵育3、6、24和31小时后，将来自每个血清小瓶的2ml样品转移到新的包含50ml按照上述制备的培养基(LM33)的血清小瓶。用所述包含CO的气体填充所述小瓶至40psia，并在37℃下不断搅拌数天进行孵育。
按时间间隔对接种小瓶的生长进行直观地评估，且分别用-/+/++描述无生长、略有生长以及密集生长(见表1)。
表1：不同温度下3、6、24和31h的存储后接种Clostridium autoethanogenum培养物的生长。
Clostridium autoethanogenum的产品生产和微生物生长的最佳温度是37℃。37℃时，当3、6、24和31小时后未经摇晃的小瓶用于接种时，所述小瓶是没有存活力的或者存活力基本上降低了。认为，没有搅动的情况下，活性微生物培养物迅速耗尽所述液体营养培养基中溶解的有限的CO。所述顶空中多余的一氧化碳到所述液体营养培养基中的转移可能有限。然而，不存在搅动的情况下，预计会有CO梯度，其中所述液体营养培养基的最高表面可具有相对较高的CO浓度，但是穿过所述培养基，这会降低。在不存在搅动的情况下，微生物细胞将落到所述小瓶的底部，在那里他们的底物基本上会匮乏而且存活力会迅速下降。随后，恶化或死亡的培养物不再适合接种。
储存的培养物的温度一旦降至24℃，超过3h后所述微生物培养物仍然基本上具有生物反应器接种所需的存活力。14℃时，存储3h、6h和24h后，所述微生物培养物仍然基本上具有存活力。31h存储后，所述微生物培养物仍然具有存活力，但是接种后的生长需要较长的时间。4℃时，存储超过所有研究过的时间后，所述微生物培养物仍然具有存活力。
本文根据特定的优选的实施方式对本发明进行了描述，以便使读者能够实践本发明而无需过度的实验。本领域的技术人员将理解，本发明易有所专门描述的那些以外的变化和修改。会理解本发明包括所有这类变化和修改。此外，提供题目、标题等等以提高读者对本文件的理解，而不应将其阐释为对本发明范围的限制。上文和下文列举的所有申请、专利和出版物的全部披露内容(若有)以引用方式并入本文。
本说明书中对任何在先技术的引用不能且不应该被视作对以下的承认或者任何形式的建议：所述在先技术形成世界上任何国家的发明领域的一般公识的一部分。
纵观本发明书和随后的任何权利要求，除非文意另有所指，“包括”、“包含”等词应以相对于排斥意义而言的包容性意义进行解释，也就是说，是“包括但不限于”的意思。

Claims (20)

1.一种维持一氧化碳营养菌的微生物培养物的存活力的方法，所述方法包括：
a.提供包含CO作为碳源的气态底物至包含在液体营养培养基中的微生物培养物的生物反应器；
b.当CO浓度有限时将微生物培养物的温度降低至低于操作温度；
c.将微生物培养物的温度增加至其最佳操作温度以响应CO浓度不再有限；
其中当CO至液体营养培养基的转移速率比微生物培养物可以吸收所述CO的速率稍慢时确定CO有限。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤b中的温度保持低于所述最佳操作温度至少5℃。
3.根据权利要求1的方法，其中所述温度降低至低于30℃。
4.根据权利要求1的方法，其中所述培养物保持在低于所述最佳操作温度的温度持续至少3小时的时间。
5.根据权利要求1的方法，其中所述培养物保持在低于所述最佳操作温度的温度持续至少30小时的时间。
6.根据权利要求1的方法，其中所述一氧化碳营养菌选自梭状芽孢杆菌属、穆尔氏菌属、热球菌属、真杆菌属、脱硫杆菌属、氧化碳嗜热菌属、产醋菌属、醋酸杆菌属、厌氧醋菌属、丁酸杆菌属和消化链球菌属。
7.根据权利要求6的方法，其中所述一氧化碳营养菌选自Clostridiumautoethanogenum、Clostridium ljungdahli、Clostridium carboxydivorans和Clostridium ragsdalei。
8.根据权利要求1的方法，其中当确定CO有限时所述培养物转移到存储容器。
9.根据权利要求8的方法，其中所述培养物的温度保持在低于5℃。
10.根据权利要求8或9的方法，其中所述微生物培养物存储至少5小时。
11.根据权利要求8或9的方法，其中存储后，所述微生物培养物用于接种生物反应器。
12.根据权利要求1的方法，其中所述包含CO的底物包括至少15％至100％体积的CO。
13.根据权利要求1的方法，其中所述最佳操作温度为37℃并且当CO浓度有限时温度降低至低于30℃。
14.一种运送存活的一氧化碳营养菌的微生物培养物的方法，所述方法包括：
将包含所述细菌——悬浮在液体营养培养基中——的微生物培养物在细菌最佳操作温度下转移到运送容器；
用包含CO的气态底物加压所述容器；
将所述容器温度降低至低于细菌最佳操作温度；
运送所述容器至远程位置；
所述细菌的特征在于将包含CO的气态底物发酵以生产酸和醇。
15.根据权利要求14的方法，其中所述温度降低至低于所述最佳操作温度至少5℃。
16.根据权利要求14的方法，其中所述温度降低至低于5℃。
17.根据权利要求14的方法，其中所述微生物培养物在运送过程中搅拌。
18.根据权利要求14的方法，还包括将在远程位置处的运送容器的温度增加至细菌的最佳操作温度并用所述微生物培养物接种生物反应器。
19.根据权利要求14的方法，还包括用在远程位置处的所述微生物培养物接种生物反应器并且将所述生物反应器的温度增加至细菌的最佳操作温度。
20.一种维持选自Clostridium autoethanogenum、Clostridium ljungdahli、Clostridiumcarboxydivorans和Clostridium ragsdalei的一氧化碳营养菌的微生物培养物的存活力的方法，所述方法包括：
a.提供包含CO作为碳源的气态底物至包含在液体营养培养基中的微生物培养物的生物反应器，其中所述培养物维持在最佳操作温度；
b.当CO浓度有限时将微生物培养物的温度降低至低于30℃；
c.将微生物培养物的温度增加至其最佳操作温度以响应CO浓度不再有限；
其中当CO至液体营养培养基的转移速率比微生物培养物可以吸收所述CO的速率稍慢时确定CO有限。
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