CN118103493A - 增加固定二氧化碳的嗜热细菌的生长 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于增加穆尔氏菌属菌种细菌的生长的方法、来源于所述方法的基因修饰的细菌，以及使用所述细菌代谢含碳底物的用途,任选地在生化品的生产中的用途。

Description

增加固定二氧化碳的嗜热细菌的生长
技术领域
本发明涉及嗜热细菌固定CO2以及产生生化品的用途，并且涉及通过基因修饰增加所述细菌的生长从而增加CO2固定效率的方法。
背景技术
数百万吨规模的大量化学品是通过裂解化石燃料不可持续地生产的。同时，人类每年向大气排放超过400亿吨CO2，导致气候变化和气温上升的威胁效应。捕获工业CO2排放并将碳转化为价值的技术正在兴起。然而，效率和可行性限制其实施。捕获CO2的传统技术包括过滤器、植树或种植藻类。过滤器需要昂贵的催化剂，所述催化剂对CO2气体中的杂质敏感，而植树和种植藻类的土地面积效率极低。
为了开发满足这些限制的工艺，预见到细菌的应用(特别是在高温下操作细菌的应用)是非常重要的。高培养温度降低了被不需要的微生物污染的风险。发酵通常需要大量的冷却水。此要求不适用于使用嗜热细菌的发酵。总体而言，与其它基于生物的生产工艺相比，高温发酵工艺具有显著降低资本和运营支出的特征。
产乙酸菌是一组以CO2(或CO)为唯一碳源生长的细菌。产乙酸菌的生长与固定CO2直接相关。一种生物，热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)，具有从工业角度感兴趣的固定CO2的特性。虽然固定CO2在这种生物中非常有效，但其生长速率有限。生长速率较高的菌株高度有利于更有效的CO2固定。在工业生产中，气体供应会有波动，生物反应器中的梯度也会有波动。已知如果营养物质或底物受到限制，则热醋穆尔氏菌会死亡或形成孢子。这将导致次培养物失活，显著降低整体效率。开发能够存活更长时间或在更有应激性的条件下存活并且恢复更快(当营养或底物可用时)的细胞将有利于该工艺的效率。WO 2011/019717A1(Mascoma Corp.)涉及编码选择性标志物的载体及其应用，例如，在嗜热细菌宿主细胞中用所述标志物替换靶基因(例如spo0A)。WO2020/157487A2(诺丁汉大学)涉及用于控制孢子形成细胞中的基因(例如Spo0A)的表达的基因构建体。
0期孢子形成蛋白A同源物(Spo0A)是一种参与调控细菌孢子形成的蛋白质。Spo0A与DNA结合并控制许多基因的表达((Molle等人，Mol.Microbiol.；50:1683-1701 2003)。其激活不同属(包括芽孢杆菌属(Bacilli)和梭菌属(Clostridia))的孢子形成的级联反应。据报道，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中spo0A基因的缺失可防止孢子形成(Spigelman等人，J.Bacteriol.；172:5011-5019 1990)。
据报道，HTH型转录调控因子SinR(SinR)既可以作为营养生长结束时响应营养物质消耗而诱导的发育过程中的负调控因子和正调控因子。例如，其充当Spo0A的阻遏物。SinR四聚体在营养生长过程中充当基质基因的转录阻遏物，而在稳定期过程中，SinR单体与SinI或SlrR形成复合物。SinI是一种抗阻遏物，可以隔绝SinR，而SlrR-SinR复合物释放基质操纵子的阻遏，也抑制浮游生物生长所需的基因(Kearns等人，Mol.Microbiol.；55:739-749 2005,Chai等人，Mol.Microbiol.；74:876-887 2009,Chai等人，Genes Dev.；24:754-7652010)。
发明内容
本发明人发现，通过对编码SinR和Spo0A的基因进行基因修饰，可以增加穆尔氏菌属菌种的细菌的生长。因此，本发明通常涉及增强穆尔氏菌属菌种的细菌的生长的方法，从而增加固定CO2的效率和生化生产的效率。
因此，在第一方面，本发明涉及一种增加属于穆尔氏菌属菌种的细菌生长速率的方法，所述方法包括向细菌中引入一种或多种基因修饰以降低或消除细菌中0期孢子形成蛋白A同源物(Spo0A)的表达和/或活性。
在一些实施方案中，一种或多种基因修饰包含降低或消除细菌中Spo0A蛋白表达的基因修饰。
在一些实施方案中，spo0A基因缺失。
在一些实施方案中，该方法还包括向细菌中引入一种或多种基因修饰以在细菌中表达SinR的变体，其中SinR变体与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列同一性，并且在与SEQID NO:2中位置198对应的位置包含除V以外的氨基酸，优选地，其中所述氨基酸是F、I、Y或W，更优选地，其中所述氨基酸是F，其中与SEQ ID NO:2相比，SinR变体提供缩短的细菌迟缓期持续时间和/或增加的细菌生长速率。
在第二方面，本发明涉及一种缩短属于穆尔氏菌属菌种的细菌的迟缓期持续时间和/或增加其生长速率的方法，所述方法包括向细菌中引入一种或多种基因修饰以在细菌中表达HTH型转录调控因子SinR(SinR)的变体，其中SinR变体与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列同一性，并且在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置包含除缬氨酸(V)以外的氨基酸，其中与SEQ ID NO:2相比，SinR的变体提供缩短的迟缓期持续时间和/或增加的细菌生长速率。
在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是苯丙氨酸(F)、异亮氨酸(I)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)。
在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是F。在第一和第二方面的一些实施方案中，穆尔氏菌属菌种选自：(a)热醋穆尔氏菌；(b)热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica)；(c)基于MUMmer比对(ANIm)评分，与热醋穆尔氏菌菌株DSM 512T相比，具有至少约96.5％的平均核苷酸同一性的细菌菌株；(d)基于MUMmer比对(ANIm)评分，与热醋穆尔氏菌菌株DSM 2955T相比，具有至少约96.5％的平均核苷酸同一性的细菌菌株；以及(a)和(b)的组合；(a)和(c)的组合；(a)和(d)的组合；(a)、(b)和(c)的组合，或(a)至(d)全部的组合。
在第三方面，本发明涉及通过根据第一或第二方面的实施方案所述的方法获得的或可获得的基因修饰的细菌。
在第四方面，本发明涉及属于热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌菌种的细菌，其中该细菌已经基因修饰以降低或消除细菌中Spo0A的表达和/或活性，其中降低的表达和/或活性是相对于其在野生型热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌中的表达和/或活性而言。
在第五方面，本发明涉及属于热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌菌种的细菌，其中该细菌已经基因修饰以包含编码SinR的变体的转基因，其中SinR变体与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列同一性，并且在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置包含除V以外的氨基酸，并且其中与SEQ ID NO:2相比，SinR变体提供缩短的细菌迟缓期持续时间和/或增加的细菌生长速率。任选地，该细菌是热醋穆尔氏菌ATCC 39073菌株或其衍生的菌株，例如热醋穆尔氏菌39073-HH菌株。
在第六方面，本发明涉及属于热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌菌种的细菌，其中该细菌
(a)包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的SinR的变体，并且在与SEQ IDNO:2中位置198对应的位置包含除V以外的氨基酸，其中与SEQ ID NO:2相比，SinR变体提供缩短的细菌迟缓期持续时间和/或增加的细菌生长速率，并且
(b)具有降低的或消除的Spo0A的表达和/或活性，其中降低的表达和/或活性是相对于其在野生型热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌中的表达和/或活性而言。
在第四和第六方面的一些实施方案中，spo0A基因缺失。
在第五和第六方面的一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是F。
在第七方面中，本发明涉及根据第三至第六方面中任一项所述的细菌用于代谢含碳底物的用途，任选地在生化品的生产中的用途。
在一些实施方案中；
i)含碳底物是CO和/或CO2，
ii)生化品选自C1-C4醇、C1-C4酮、C1-C4醛、C1-C4羧酸及其任何混合物，或
iii)i)和ii)两者。
在第一至第七方面的一些实施方案中，所述细菌是热醋穆尔氏菌ATCC 39073菌株或衍生自其的菌株，例如热醋穆尔氏菌39073-HH菌株。
附图说明
图1：通过光密度(OD)测量确定的细菌培养物的生长曲线的示意图。细菌培养物的生长可分为四个阶段：迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。
图2：spo0A敲除质粒的质粒图谱。
图3：野生型(WT)和Δspo0A菌株的生长曲线作为时间(h)的函数。
A：显示了一式三份的培养物的单独测量值。
B：平均生长曲线，浅色图案显示标准差。
C：与B相同，但光学密度为对数量度。
图4：来自芽孢杆菌属的SinR-SinI复合物的结构分析。
A：来自芽孢杆菌属的SinR-SinI复合物(PDB ID:1b0n)。来自SinR的HTH结构域显示为没有任何图案，寡聚结构域由带圆圈的图案显示，SinI由带五聚体的图案显示。
B：图案方案如A所示，其中以棒表示的T60和L61的侧链具有小实心三角形的图案。
C：对L61的放大图，并可视化L至F突变。苯丙氨酸的拟定的结构以灰色棒表示。可见的圆盘和图案表明原子的范德华半径的成对重叠。当原子几乎接触或轻微重叠时，会显示短线或小圆盘。带有十字的大圆盘表明显著的范德华重叠。其它一切都处于这些极限之间。
D：对T60的放大图，并可视化T至F突变。左：SinR中的T60和SinI中的E14之间的氢键。中：T至F突变，在最常见的旋转异构体中含有苯丙氨酸。右：T至F突变，在最有利的旋转异构体中含有苯丙氨酸。圆盘和图案如C所示。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“穆尔氏菌属菌种”是指被分类为属于穆尔氏菌细菌属的菌种组中的任何成员，其属于厚壁菌门。穆尔氏菌属菌种通常是嗜热的、厌氧的和形成内生孢子的，例如可以将其从温泉中分离出来。穆尔氏菌属菌种的非限制性列表可以在美国国家生物技术信息中心(万维网(www)地址ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝44260；2021年7月1日访问，在此通过引用将其全部并入)和本文其它地方找到。
特别优选的是产乙酸(气体发酵)菌种热醋穆尔氏菌(一种以前称为热醋酸梭菌(Clostridium thermoaceticum)的菌种)和热自养穆尔氏菌以及衍生自它们的任何和所有菌株，包括在实验室环境中分离或从天然来源分离的菌株。虽然热醋穆尔氏菌和热自养穆尔氏菌通常被认为是两个不同的菌种，但基因组比较表明，热自养穆尔氏菌的菌株可能被重新分类为热醋穆尔氏菌的菌株(Redl等人，Front.Microbiol.；10:3070 2020)。因此，如本文所用，热醋穆尔氏菌可以是指通常分类为热醋穆尔氏菌的细菌菌株和通过基因分析可以分类为热醋穆尔氏菌菌株的细菌菌株，例如热自养穆尔氏菌的菌株。下面描述了用于确定细菌菌株是否属于热醋穆尔氏菌属菌种的方法。热醋穆尔氏菌菌株的非限制性实例包括热醋穆尔氏菌ATCC 39073、热醋穆尔氏菌ATCC 39073-HH(Genbank登录号CP031054，优选的版本CP031054.1)和热醋穆尔氏菌Y72。如本文所用，“野生型热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌”是指任何天然存在的热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌的菌株。例如，通常，野生型热醋穆尔氏菌的基因组包含spo0A基因(编码SinR蛋白的基因)、优选编码在与SEQ IDNO:22中位置198对应的氨基酸位置具有缬氨酸的SinR蛋白的基因、或两者。
如本文所用，术语“SinR”或“HTH型转录调控因子SinR”包括SinR的所有变体，但不限于由穆尔氏菌属菌种细菌编码的变体。由热醋穆尔氏菌编码的SinR变体的一个实例是具有UniProt ID:A0A5B7YPR1(SEQ ID NO:2)的蛋白质，参见表1。如本文所用，术语“SinR”是指与SEQ ID NO:2具有至少80％、例如85％、例如90％、例如91％、例如92％、例如93％、例如94％、例如95％、例如96％、例如97％、例如98％和例如99％的序列同一性的蛋白。优选地，在根据本文所述的方法进行任何基因修饰之前，待修饰的穆尔氏菌属菌种细胞包含天然SinR蛋白，该蛋白优选地在与SEQ ID NO:2中位置198对应的氨基酸位置包含缬氨酸。优选地，热醋穆尔氏菌的SinR由具有欧洲核苷酸档案(ENA)基因座标签MothHH_01753(SEQ IDNO:1)的基因编码，参见表1。
如本文所用，术语“Spo0A”或“0期孢子形成蛋白A同源物”是指相关的穆尔氏菌属菌种的内源蛋白。Spo0A的一个实例是UniProt ID:A0A5B7YPG0(SEQ ID NO:4)所示的热醋穆尔氏菌Spo0A，参见表1。Spo0A的另一个实例是UniProt ID:A0A1D7XBE2所示的热醋穆尔氏菌Spo0A。如本文所用，术语“Spo0A”是指与SEQ ID NO:4具有至少80％、例如85％、例如90％、例如91％、例如92％、例如93％、例如94％、例如95％、例如96％、例如97％、例如98％和例如99％的序列同一性的蛋白。优选地，热醋穆尔氏菌的Spo0A由具有ENA基因座标签MothHH_01617(SEQ ID NO:3)的基因编码，参见表1。
术语“基因”是指编码细胞功能(例如蛋白质)的核酸序列，任选地包括在编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调控序列。“转基因”是通过基因工程技术(例如通过转化)引入细胞的天然或异源基因。基因名称在本文中以斜体文字列出，并带有小写首字母(例如spo0A)，而蛋白质名称以正常文字并以大写首字母(例如spo0A)列出。
表1:热醋穆尔氏菌中的Spo0A和SinR
*bp＝碱基对，aa＝氨基酸
如本文所用，“基因修饰”是指在宿主细胞基因组中引入基因上遗传的变化。变化的实例包括基因和调控序列中的突变、编码和非编码DNA序列中的突变。“突变”包括基因组中核酸或核酸片段的缺失、置换和插入。
与亲本或参考蛋白相比，亲本或参考蛋白的“变体”包含一个或多个突变，例如氨基酸置换、插入和缺失。通常，该变体与亲本或参考蛋白的氨基酸序列具有高序列同一性，例如，至少在功能或催化活性部分上，任选地在全长上具有至少约70％、例如至少约80％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少87％、例如至少约90％、例如至少约93％、例如至少约95％、例如至少约96％、例如至少约97％、例如至少约98％、例如至少约99％的序列同一性。
除非另有说明，否则本文中用于氨基酸序列的“序列同一性”是通过根据下式(Nref–Ndif)·100/Nref比较两个长度相等的最佳比对序列来确定的，其中Nref是两个序列之一中的残基数，Ndif是这两个序列在整个长度和同一方向上比对时不同的残基的数量。因此，氨基酸序列GSTDYTQNWA(SEQ ID NO:19)与序列GSTGYTQAWA(SEQ ID NO:20；ndif＝2和nref＝10)具有80％的序列同一性。
序列同一性可以通过常规方法确定，例如Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.；2:482 1981)，通过Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA；85:2444 1988)的“搜索相似性”方法，使用Thompson等人(Nucleic Acids Res.；22:467380 1994)的CLUSTAL W算法，通过计算机实现这些算法(威斯康星大学遗传学计算机课题组Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.；48:443-453 1970)，如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite,Rice等人，Trends Genet.；16:276-277 2000)的Needle程序中实现的，例如欧洲生物信息学研究所网站(www.ebi.ac.uk)提供的Needle程序。也可以使用BLAST算法(Altschul等人，Mol.Biol.；215:403-410 1990)，其软件可以通过美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。当使用上述任何算法时，可以使用“窗口”长度、空位罚分等的默认参数。
氨基酸序列中“对应于”参考氨基酸序列中特定的参考残基的残基是与参考残基比对的残基，例如，通过使用前段所述的序列比对软件确定。
如本文所用，术语“表达”是指基因被转录成mRNA的过程，并且可以任选地包括随后将mRNA翻译成氨基酸序列，即蛋白质或多肽。
如本文所用，宿主细胞中基因的“降低的表达”意味着与对照相比，该基因编码的mRNA或蛋白质的水平在宿主细胞中显著减降低，通常至少降低25％、例如至少50％、例如至少75％、例如至少90％、例如至少95％。通常，当通过宿主细胞中的基因修饰获得降低的表达时，对照是未修饰的宿主细胞。
宿主细胞中基因的“消除的表达”意味着该基因编码的mRNA或蛋白质在宿主细胞中基本上不存在、不存在或检测不到。
如本文所用，术语“敲低”是指导致宿主细胞中基因表达降低的一系列技术中的任何一种，例如在启动子中引入突变。
如本文所用，术语“敲除”是指导致宿主细胞中消除的基因表达的一系列技术中的任何一种，例如在基因中引入突变或缺失。如本文所用，术语“缺失”是指部分或完全去除基因的编码序列，其导致该基因的表达被消除或无功能的基因产物的表达。
本文中使用的术语“活性”或“功能”在指代蛋白质的活性或功能时，在没有更多规定的情况下，可以表示该蛋白质的任何活性或功能，例如催化活性、结合活性、阻遏活性等。
如本文所用，宿主细胞中蛋白质的“降低的活性”意味着与对照相比，该蛋白质的一种或多种特定活性在宿主细胞中显著降低，通常至少降低25％，例如至少50％、例如至少75％、例如至少90％、例如至少95％。通常，当通过宿主细胞中的基因修饰获得降低的活性时，对照是未修饰的宿主细胞。宿主细胞中蛋白质的“消除的活性”意味着该蛋白质的一种或多种特定活性在宿主细胞中基本上不存在、不存在或不可检测。
导致靶蛋白活性降低或消除的基因修饰可能包括该蛋白编码序列中的突变或缺失，从而导致无功能或功能较低的蛋白质的表达。此外，如本文所用，导致靶基因表达和/或活性降低或消除的基因修饰可能是间接的，这意味着它们不是基因本身的基因修饰。这种基因修饰例如可以包括引入降低靶基因表达的核酸序列，例如抑制靶基因表达的阻遏物。
用于实施本发明实施方案的标准的重组DNA和分子克隆技术在本领域是众所周知的，并且由例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(2012).Molecular cloning:Alaboratory manual,第4版，Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NewYork,以及Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.(1984).Experiments with genefusions.Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,New York所述。用于靶向的基因组编辑的技术，例如敲除细菌基因组中的靶基因，包括基于成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)的系统，例如CRISPR-Cas9。
如本文所用，细菌的“生长速率”是反映每个时间单位的细胞分裂数的量度。它可以基于600nm处的细菌培养物的光密度(OD)测量值来计算，其中生长速率可以表示为每时间单位(例如每小时)的OD的变化。
如本文所用，当提及细菌的迟缓期时，术语“迟缓期”是指细菌生长的四个阶段(迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期)中的第一个阶段。迟缓期是细菌通常在开始复制(进入对数期)之前适应新的外部条件的阶段。新外部条件的非限制性实例包括接种到新培养基中以及向现有培养物中添加营养物质，例如碳源。在迟缓期期间，细胞分裂通常很低或不存在。
如本文所用，“代谢”是指在一个或多个代谢过程中消耗底物，任选地由一种或多种酶催化。
如本文所用，术语“底物”是指酶作用于其本身且形成产物的分子，在该过程中转化底物。当关于生物合成途径使用时，术语“底物”是指参考途径的第一酶作用的分子。“含碳底物”是指含有至少一个碳原子的底物，例如CO或CO2。
如本文所用，“生化品”是指可以通过生物过程产生的分子。在本发明的背景下，穆尔氏菌属菌种细菌可用于通过其天然内源酶的作用或在基因修饰后产生生化品；例如插入一种或多种编码适合产生感兴趣的生化品的特定酶的转基因。
本发明的具体实施方案
如实施例1所述，通过缺失编码Spo0A的基因(实施例1；图3和表3)增加热醋穆尔氏菌的生长速率。
控制细胞生长速率的基因表达的调控既复杂又是精细调节的，经常涉及多种基因/蛋白质。然而，在这里，单个基因(编码Spo0A的基因)的缺失增加了热醋穆尔氏菌的生长速率。此外，该基因通过由编码抗生素抗性蛋白的基因替换而缺失，编码抗生素抗性蛋白的基因受一个持家启动子的控制。这种修改通常会减缓修饰的生物的生长，但在这种情况下，观察到相反的效果。此外，与以前的报道(见“背景技术”)相反，在热醋穆尔氏菌中，spo0A的缺失并没有导致孢子形成减少。这一发现表明，在热醋穆尔氏菌中缺失spo0A后观察到的增加的生长速率不是由与孢子形成的级联相关的代谢负担的降低造成，因为级联仍然起作用。
如实施例2所述，在较长的孵育期后(实施例2)，将热醋穆尔氏菌接种到新鲜培养基中后，SinR中的V198F突变减少了热醋穆尔氏菌的迟缓期的持续时间(导致从休眠状态更快地恢复)。此外，发现热醋穆尔氏菌SinR中的V198突变如V198F可能会影响蛋白质的稳定性以及其对抗阻遏物SinI的亲和性和/或其寡聚能力(参见实施例2、图4和表4与表5)。
因此，本发明人已经识别了增强热醋穆尔氏菌细菌生长(通过增加生长速率和/或减少迟缓期的持续时间)的方法。在热醋穆尔氏菌中，生长和CO2固定之间存在直接联系。本发明为菌株提供了增强的生长，从而为菌株提供了增强的CO2固定。此外，可以修饰这些菌株以含有一种或多种用于产生感兴趣的生化品的酶，从而导致这种生化品生产的增加。
除了增加的CO2固定和生化品生产之外，根据本发明的方法用于这些目的的优点包括:
-正如背景技术部分所述，热醋穆尔氏菌的高培养温度具有一些优点，包括：与其它基于生物的生产工艺相比，污染风险降低，转化率更高，不需要冷却水，资本和运营支出显著更低。
-在生物反应器中使用在应激情况下能够更快恢复的细胞是非常有利的，因为这允许生物反应器中更大程度的波动和梯度(营养物、pH和底物)。
-在一些实施方案中，不需要过表达基因或操纵子，这将代表增加的代谢负担。这些改造的菌株将在整个发酵过程中保持高代谢活性。
方法
在一些方面，本发明涉及通过向穆尔氏菌属菌种细菌中引入基因修饰以影响Spo0A的表达和/或活性或表达SinR的突变变体来增强穆尔氏菌属菌种细菌生长的方法。
可以通过增加细菌的生长速率(每个时间单位的细胞分裂数)或通过缩短迟缓期的持续时间(在细菌本身适应新的外部条件之后，开始复制之前所需的时间)，或者通过两者的组合来增强穆尔氏菌属菌种细菌的生长。这两种增强生长的方法也增加了CO2固定，并且任选地增强了感兴趣的生化品的生产。
测量细菌生长
细菌的生长很容易通过标准技术进行测量，包括测量600nm处的光密度(OD)，如实施例中所用。连续测量可用于绘制图表，从中可以确定迟缓期的持续时间以及生长速率。为了确定迟缓期的持续时间，应从细胞暴露于新的外部条件(例如通过接种到新的培养基中)时开始，直到细胞进入指数生长期(对数期)，追踪细菌培养物的OD(作为细胞数量的量度)。为了计算生长速率，图以对数量度显示(见图1)。生长速率(μ)可以从图的线性部分(指数阶段或对数阶段)得出的两个数据点计算得出：时间点1的OD值(t1，OD1)和时间点2的OD值(t2，OD2)，其中t2>t1。然后可以根据式I计算生长速率:
基因修饰
Spo0A：
在一个方面，本发明涉及增加属于穆尔氏菌属菌种的细菌生长速率的方法，所述方法包括向细菌中引入一种或多种基因修饰以降低或消除细菌中0期孢子形成蛋白A同源物(Spo0A)的表达和/或活性。
Spo0A在这种细菌中的表达和活性可以由本领域技术人员使用标准技术确定。为了确定Spo0A mRNA或蛋白质的表达水平，可以使用定量聚合酶链式反应(qPCR)和蛋白质印迹等技术。为了量化细菌中Spo0A的活性，首先需要确定应该量化哪种活性。作为孢子形成的调控因子，Spo0A与DNA结合并控制许多基因的表达(Molle等人，Mol.Microbiol.；50:1683-1701 2003)。因此，可以通过评估一系列基因的表达来测试Spo0A的活性，这些基因包括abrB、spoIIA、spoIIG和spoIIE等，例如通过基因微阵列或使用包含已知的Spo0A结合基序的报告基因系统进行测试。
在一些实施方案中，与对照(例如，在引入基因修饰之前细菌中Spo0A的表达水平、参考细菌细胞中的表达水平或来自例如教科书或文献的对照值)相比，Spo0A在这种细菌中的表达降低。在进一步的实施方案中，细菌中Spo0A的表达降低了至少25％、例如至少50％、例如至少75％、例如至少90％、例如至少95％。例如，可以通过敲低Spo0A基因来降低Spo0A的表达，例如，通过在其启动子或翻译起始区(例如在核糖体结合位点)中引入突变(通过使用CRISPR干扰(CRISPRi)引入突变，CRISPR干扰是一种使用催化失活的Cas酶的CRISPR技术，通过将细菌细胞与干扰基因转录或翻译的反义序列接触，或者通过缺失编码激活Spo0A转录的转录因子的基因，或者引入编码抑制Spo0A转录的阻遏物的核酸序列而进行)。
在一些实施方案中，消除了Spo0A的表达。这意味着Spo0A mRNA、Spo0A蛋白或两者在细菌中基本上不存在、不存在或不可检测。例如，可以通过敲除Spo0A基因来消除Spo0A的表达，例如通过突变该基因，例如通过将提前终止密码子引入编码序列，或通过缺失该基因(如本文所用，其可以意味着部分或完全去除该基因的编码序列)。在一些实施方案中，可以通过使用诸如λRed介导的重组、P1噬菌体转导、单链寡核苷酸重组工程/MAGE技术(参见例如Datsenko和Wanner,2000；Thomason等人，2007；Wang等人，2009)和基于CRISPR的技术等技术来敲除spo0A。在一些实施方案中，如实施例1所述，可以通过用敲除载体转化细菌并使用同源重组替换染色体中的基因来敲除spo0A。在一些实施方案中，可以通过突变或缺失基因的启动子来消除Spo0A的表达。在一些实施方案中，可以使用CRISPR的催化失活的变体或例如通过表达抑制Spo0A的表达或翻译的反义RNA来消除Spo0A的表达。本文提供了在特定穆尔氏菌属菌种中的Spo0A蛋白和编码它们的基因的实例。可以使用本领域已知的方法(例如基于基因同源性)识别编码其它穆尔氏菌属菌种(包括本文特别公开的每种穆尔氏菌属菌种)中Spo0A蛋白的内源基因。
例如，将载体引入细菌宿主细胞可以通过原生质体转化(参见例如Chang和Cohen,Mol.Gen.Genet.；168:111-115 1979)实现，原生质体转化使用感受态细胞(参见例如Young和Spizizen,J.Bacteriol.；81:823-829 1961或Dubnau和Davidoff-Abelson,J.Mol.Biol.；56:209-221 1971)、电穿孔(参见例如Shigekawa和Dower,Biotechniques；6:742-751 1988)或接合(参见例如Koehler和Thome,J.Bacteriol.；169:5771-5278 1987)进行。
在一些实施方案中，Spo0A的活性降低。在进一步的实施方案中，细菌中Spo0A的活性降低至少25％，例如至少50％、例如至少75％、例如至少90％、例如至少95％。在一些实施方案中，消除了Spo0A的活性。这意味着Spo0A的一种或多种特定活性在细菌中基本上不存在、不存在或不可检测。例如，可以通过在Spo0A的编码序列中引入突变或缺失来降低或消除Spo0A的活性，这导致无功能或功能较低的蛋白质的表达。
SinR：
在一个方面，本发明涉及一种缩短属于穆尔氏菌属菌种的细菌的迟缓期持续时间和/或增加其生长速率的方法，所述方法包括向细菌中引入一种或多种基因修饰以在细菌中表达HTH型转录调控因子SinR(SinR)的变体，其中，SinR变体与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列同一性，并且在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置包含除缬氨酸(V)以外的氨基酸，其中与SEQ ID NO:2相比，SinR变体提供缩短的细菌迟缓期持续时间和/或增加的细菌生长速率。
在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是I。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是M。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是V。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是Y。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是C。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是W。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是T。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是A。在一些实施方案中，在与SEQID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是P。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是R。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是E。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是H。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是K。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是N。在一些实施方案中，在与SEQ IDNO:2中位置198对应的位置的氨基酸是Q。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是D。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是G。在一些实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是S。
在优选的实施方案中，在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是F。
在一些实施方案中，SinR变体与SEQ ID NO:2具有至少91％的序列同一性，例如92％、例如93％、例如94％、例如95％、例如96％、例如97％、例如98％以及例如99％的序列同一性。
在一些实施方案中，任选地使用本文别处描述的技术，通过转化将编码SinR变体的载体引入细菌细胞。一旦引入，编码SinR变体的基因可以作为染色体整合体或在自我复制的染色体外载体上以维持。
任选地，可以例如根据本领域已知的方法或通过本文别处描述的方法敲除内源sinR基因。
任选地，内源sinR基因可以不经修饰。优选地，内源sinR基因在与SEQ ID NO:2中位置198对应的氨基酸位置具有缬氨酸。
优选地，为了转化细菌宿主细胞，选择合适的启动子来控制SinR变体的表达。启动子对细菌宿主细胞而言可以是天然或异源的，即它可以来自与宿主细胞相同的物种，或者它可以分别源自与宿主细胞不同的物种。启动子可以是组成型或诱导型启动子。组成型启动子能够实现连续的蛋白质表达，而诱导型启动子能够实现条件性蛋白质表达。使用诱导型启动子，可以根据特定分子的存在与否、光的存在与否或特定温度来实现蛋白质的表达。可用于控制穆尔氏菌属菌种细菌中蛋白质表达的启动子包括组成型启动子PG3PD，其来源于热醋穆尔氏菌并且通常控制甘油醛-3-磷酸脱氢酶的表达。其它合适的启动子是已知的，或者可以由技术人员使用众所周知的技术来识别。
在一些实施方案中，可以通过定点诱变将一个或多个突变引入细菌染色体上编码SinR的基因中来生成SinR变体，所述SinR变体在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置包含除缬氨酸(V)以外的氨基酸。例如，这可以通过使用基于同源重组的技术实现。
可以使用本领域众所周知的方法来证实转化。所述方法包括例如全基因组测序、DNA或mRNA的Northern印迹杂交法或PCR扩增，用于表达基因产物的免疫印迹法或用于测试引入的核酸序列的存在或表达的其它合适的分析方法。可以使用本领域众所周知的方法进一步优化表达水平以获得足够的表达。
Spo0A+SinR：
在本发明的一些方面中，与Spo0A相关的基因修饰和与SinR相关的基因修饰(上文已经描述了这些修饰)在同一细胞内组合。因此，根据本发明的穆尔氏菌属菌种细菌可以例如包含如本文所述的SinR变体并且由于缺失而缺少spo0A基因。与本文所述的各种基因修饰有关的任何和所有方面和实施方案可以以任何和所有可能的组合进行组合。
在一个方面，本发明涉及属于热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌菌种的细菌，其中该细菌
(a)包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的SinR的变体，并且在与SEQ IDNO:2中位置198对应的位置包含除V以外的氨基酸，其中与SEQ ID NO:2相比，SinR变体提供缩短的细菌迟缓期持续时间和/或增加的细菌生长速率，并且
(b)具有降低或消除的Spo0A的表达和/或活性，其中降低的表达和/或活性相对于其在野生型热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌中的表达和/或活性而言。
在优选实施方案中，spo0A基因缺失，并且在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是F。
基因修饰的细菌
在一些方面，本发明涉及已经基因修饰以影响Spo0A的表达和/或活性和/或在细菌中表达SinR的突变变体的穆尔氏菌属菌种细菌。
细菌中的基因修饰可以通过本领域众所周知和如本文其它地方所述的技术生成。
在一个方面，基因修饰的细菌可以是属于穆尔氏菌属的任何细菌。该菌种可选自但不限于以下任何一种：热醋穆尔氏菌，Moorella glycerini，腐殖酸铁穆尔氏菌(Moorella humiferrea)，Moorella mulderi，Moorella perchloratireducens，Moorellastamsii，热自养穆尔氏菌，穆尔氏菌215559/E30-SF1&2种，穆尔氏菌60_41种，穆尔氏菌AIP246.00种，穆尔氏菌AIP 247.00种，穆尔氏菌AIP 248.00种，穆尔氏菌AIP 383.98种，穆尔氏菌AIP 384.98种，穆尔氏菌AIP 515.00种，穆尔氏菌auto11种，穆尔氏菌auto39种，穆尔氏菌auto54种，穆尔氏菌auto59种，穆尔氏菌CF4种，穆尔氏菌CF5种，穆尔氏菌E306M种，穆尔氏菌E308F种，穆尔氏菌F21种，穆尔氏菌Hama-1种，穆尔氏菌HUC22-1种，穆尔氏菌UBA4076种，穆尔氏菌富集克隆R19种，穆尔氏菌富集克隆R2种，穆尔氏菌富集克隆R65种，穆尔氏菌富集培养克隆B1-B-65种，穆尔氏菌富集培养克隆B11-B-11种，穆尔氏菌富集培养克隆B13-B-103种，穆尔氏菌富集培养克隆B13-B-72种，穆尔氏菌富集培养克隆DGGE-band1种，穆尔氏菌富集培养克隆TERIBC1种，穆尔氏菌富集培养克隆TERIBC2种，穆尔氏菌富集培养克隆TERIBC3种，穆尔氏菌富集培养克隆TERIBC4种，穆尔氏菌富集培养克隆TERIBC5种和未培养的穆尔氏菌种(例如，参见美国国家生物技术信息中心(万维网(www)地址ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝44260；2021年7月1日访问)。
在其它方面，基因修饰的细菌可以是分类为属于热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌菌种的任何细菌。热醋穆尔氏菌菌株可以选自但不限于热醋穆尔氏菌ATCC 39073和热醋穆尔氏菌Y72以及源自其中任何一种的菌株，例如热醋穆尔氏菌菌株39073-HH。热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌的分类可能基于NCBI的分类浏览器(见上文参考)等资源，和/或可能基于基因分析。
本领域已知用于评估两种细菌菌株是否属于相同或不同物种的方法，并且包括平均的核苷酸同一性(ANI)分析。一种特定类型的ANI分析是基于MUMmer比对(ANIm)的ANI分析。简而言之，将目标菌株的基因组与参考菌株的基因组比对，并识别匹配区。匹配区的核苷酸同一性百分比计算为所有匹配区的平均值。当两种细菌菌株的比较导致ANIm评分至少为96.5％时，它们可以被分类为属于同一物种(Richter等人，PNAS；106:19126-191312009，在此通过引用以其整体并入)。
基因修饰的细菌的用途
在一个方面，本发明涉及根据本发明多个方面的基因修饰的细菌用于代谢含碳底物的用途，任选地，在生化品生产中的用途。
在优选的实施方案中，含碳底物是CO和/或CO2。因此，本文所述的基因修饰的细菌可以有利地用于固定温室气体如CO2的方法中，这可能有益于环境。
含碳底物
穆尔氏菌属菌种细菌天然能够以H2/CO2或CO作为唯一的碳源生长。因此，使用根据本发明的基因修饰的细菌代谢CO和CO2不需要进一步的基因修饰。
穆尔氏菌属菌种细菌也在其它含碳底物上天然生长，包括木糖、果糖、甲醇、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖和丙酮酸。
生化品
在本发明的实施方案中，根据本发明的基因修饰的细菌用于生化品的生产。
例如，生化品可以选自C1-C4醇、C1-C4酮、C1-C4醛、C1-C4羧酸及其任何混合物。在一些实施方案中，生化品选自乙酸盐或酯、丙酮、丁酮和乙醇。
为了通过根据本发明的基因修饰的细菌产生选定的生化品，可以通过向细菌中引入一种或多种可用于生产选定的生化品的酶来进一步对细菌进行基因修饰。经常，生化品的产生需要不止一种酶的作用；它通常需要许多酶的连续作用，以构成特定的生物合成途径。该酶可以是文献中报道的来自任何物种的任何表征和测序的酶，只要它提供所需的活性即可。在一些实施方案中，酶是细菌天然的过表达的基因。在一些实施方案中，酶是对细菌来说是异源或天然的酶的功能活性片段或变体。此外，在一些实施方案中，重组生物合成途径包括敲低或敲除一个或多个基因，通常是为了避免竞争反应减少所需的生化品的产量。为了在嗜热宿主细胞中发挥功能，该酶应该具有相当的热稳定性。然而，它不一定必须来自嗜热生物。
可以通过用一种或多种载体转化细菌来将酶引入细菌中，每种载体在启动子的控制下编码一种或多种酶，如上文对SinR变体的表达所述，所述启动子确保基因以合适的水平的表达，以便基因的引入不会透支宿主细胞中的底物或能量。可以如本文其它地方所述进行转化。将用于产生选定的生化品的酶引入细胞的转化事件可以任选地与引入与本发明相关的任何其它载体相结合，例如Spo0A的敲除载体和/或编码SinR变体的载体，如果适用的话。一些基因可以组合在同一载体上。
下面给出了根据本发明可以产生的四种(优选的)生化品的实例以及适合于其生产的酶。生化品或生物合成途径不应被视为限制性的，而应仅作为实例。
乙酸盐或酯：
作为乙酸生成菌，穆尔氏菌属菌种细菌，包括热醋穆尔氏菌，天然产生乙酸盐或酯。
丙酮：
通过将以下酶引入细菌中，可以在穆尔氏菌属菌种细菌中产生丙酮，更具体地说，在热醋穆尔氏菌中产生丙酮：硫解酶(Thl)，乙酸乙酰乙酰辅酶A转移酶(CtfAB)和乙酰乙酸脱羧酶(Adc)。参见Genbank登录号MW436696，以了解可用于热醋穆尔氏菌中丙酮的产生的合成操纵子的实例(Zeldes等人，Biotechnol.Bioeng.；115:2951-2961 2018,Kato等人，AMB Expr.；11:59 2021)。特定的操纵子包含编码来自地下热厌氧杆菌(Caldanaerobactersubterraneus)的Thl、来自极端嗜热菌(Thermosipho melanesiensis)的CtfAB以及来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的Adc的基因。
丁酮：
通过引入催化2,3-丁二醇产生的酶和将产生的2,3-丁二醇转化为丁酮的酶，可以在穆尔氏菌属菌种细菌中产生丁酮，特别是在热醋穆尔氏菌中产生丁酮。2,3-丁二醇可以通过下述产生：将丙酮酸盐或酯转化为乙酰乳酸，然后通过乙偶姻(acetoin)将乙酰乳酸转化为2,3-丁二醇，这是由乙酰乳酸合酶(Als)、乙酰乳酸脱羧酶(Aldc)和2,3-丁二醇脱氢酶(Bdh)催化的反应。然后，2,3-丁二醇向丁酮的转化可以通过在罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)等菌株中天然发现的二醇水合酶(diolhydratase)(pduC、pduD和pduE)的作用发生(Ghiaci等人，Plos One；9(7):e102774 2014)。产生丁酮的第二种方法是通过混杂的β-酮硫醇酶将丙酰辅酶A与乙酰辅酶A融合形成3-酮戊酰辅酶A，然后通过乙酰乙酰辅酶A：乙酸盐或酯/丁酸盐或酯：辅酶A转移酶(CftAB)和乙酰乙酸脱羧酶(Adc)(通常在产生ABE的梭菌中表达(Srirangan等人，Biotechnology；82:2574-2584 2016))的作用将3-酮戊酰辅酶A转化为丁酮。
乙醇：
在穆尔氏菌属菌种中，更具体地说，在热醋穆尔氏菌中，乙醇的产生能够通过使用双功能醛/醇脱氢酶(AdhE)将乙酰辅酶A转化为乙醇或通过乙醛：铁氧化还原蛋白氧化还原酶(AOR)和乙醇脱氢酶(Liew等人，Metab.Eng.；40:104-114 2017)将乙酸盐或酯还原成乙醛并进一步还原成乙醇。
以下实施例说明了本发明，所述实施例不应被解释为限制性的。
实施例
实施例1
Spo0A的缺失增加了热醋穆尔氏菌的生长速率
构建环状敲除质粒以通过同源重组使热醋穆尔氏菌中的基因spo0A缺失。
质粒骨架是pK18，其包含在热醋穆尔氏菌中不起作用的大肠杆菌(E.coli)pMB1复制子和嗜温卡那霉素抗性标志物。热醋穆尔氏菌spo0A上游和下游各1kb的两个同源区在处于天然组成型热醋穆尔氏菌PG3PD启动子的控制下的嗜热kanR抗性标志物的两侧(质粒图谱如图2所示)。通过使用PCR(用高保真聚合酶)和表2中列出的引物扩增片段来构建质粒。使用Gibson方法(New England Biolabs)组装片段。一旦质粒构建好并通过测序验证，则将质粒转移到繁殖菌株中，也确保合适的DNA甲基化。
表2:本实验中使用的引物的列表
根据先前公布的方法(Daniel等人，J.Bacteriol.；172:4464-4471 1990,Redl等人，Front.Microbiol.；10[3070]2020)，将热醋穆尔氏菌ATCC 39073在用丁基橡胶塞(瓶子和塞：Ochs，德国)封闭的100ml血清瓶(50％填充)中培养。但是，通过用2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)代替缓冲系统并利用果糖作为碳源(终浓度为60mM)来改良培养基。培养基具有以下组成(单位为g/l)：KH2PO4(0.5)；NH4Cl(0.4)；NaCl(0.4)；MES(20)；酵母提取物(0.5)；向培养基中加入1％的微量元素溶液。微量元素溶液用2g/l氨三乙酸制备；用KOH将pH调节至6.0，并添加以下化合物(单位为mg/l)：MnSO4·H2O(1000)；Fe(SO4)2(NH4)2·6H2O(800)；CoCl2·6H2O(200)；ZnSO4·7H2O(200)；CuCl2·2H2O(20)；NiCl2·6H2O(20)；Na2MoO4·2H2O(20)；Na2SeO4(20)；Na2WO4(20)。将培养基的pH调节至6.5，用N2:CO2(80:20)冲洗，并在140℃下高压灭菌40分钟。高压灭菌后加入以下储备溶液：CaCl2(最终50mg/l)，MgCl2(最终330mg/l)，维生素溶液(1％)，半胱氨酸-HCl(最终1mM)。维生素溶液含有(mg/l)：生物素(2)；叶酸(2)；盐酸吡哆醇(10)；盐酸硫胺素(5)；核黄素(5)；烟酸(5)；D-(+)-泛酸钙(5)；维生素B12(0.5)；对氨基苯甲酸(5)；硫辛酸(5)。接种前将培养基预热。将菌株在60℃下培养并搅拌。固体培养基含有1％ GelzanTM、CaCl2(100mg/l)、MgCl2(660mg/l)，并将培养基在120℃下灭菌20分钟。
电穿孔之前，将细胞生长至指数期，并通过离心收获，并在缓冲液(5mM NaH2PO4/270mM蔗糖)中洗涤两次。通过电穿孔将大约1μg质粒DNA转化到细胞中。通过使用Bio-RadGene PulserTM和间隙为0.2cm的比色杯(Bio-Rad Laboratories，Inc.的产品)，电穿孔条件为1.5kV，500Ω。有关更多详细信息，参见Kita等人(J.Biosci.Bioeng.；115:347-3522013)。在上文所述的培养基(但具有增加的酵母提取物浓度(10g/L))中进行电穿孔后复苏。过夜完成复苏，然后将100μl培养物(不同稀释度)铺在含有400μg/ml卡那霉素的固体培养基上。在60℃中厌氧培养4-7天，直到平板上出现菌落。使用4个引物组(spo0A_up_ext_250bp-spo0A_dn_ext_250bp，spo0A_up_ext_250bp-Kan_Seq re，Kan_Seq fo-spo0A_dn_ext_250bp和Kan_Seq re-Spo0A_UP_fo(分别为ext-ext、ext-int、int-ext和int-int)，通过PCR测试菌落的整合。阳性菌落在含有100μg/ml卡那霉素的液体培养基中培养。
为了进一步验证转化，从培养物中提取gDNA并对整个基因组进行测序。以这种方式证实了spo0A基因被kanR盒取代。
如前所述，在培养基中培养野生型(WT)和Δspo0A菌株。进入稳定生长期后，采集样品并通过显微镜(Leica DM5000)进行目视检查。很明显，两种培养物都令人惊讶地形成了孢子。孔雀绿孢子染色进一步证实了这一点。将水溶液中的孔雀绿0.5％(wt/vol)加入到具有固定的细菌细胞的显微镜载玻片中。将载玻片置于沸水上，迫使孔雀绿进入孢子。冷却(至室温)后，用水冲洗掉多余的着色剂。通过显微镜(Leica DM5000)识别染色的孢子。在两种培养物中均观察到明显的绿色染色的孢子。
为了进一步研究缺失的影响，将两种菌株培养(一式三份)，并在线监测600nm处培养物的光密度。生长曲线如图3所示。令人惊讶的是，热醋穆尔氏菌Δspo0A的表型的特征在于显著更高的生长速率(更短的倍增时间)，如该图和表3所示的生长速率所示。
表3:菌株的生长速率
菌株 生长速率
Δspo0A 0.157±0.016h-1
WT 0.104±0.006h-1
通过t检验(置信区间为0.05)评估显著性，其表明Δspo0A的生长显著快于野生型。
实施例2
热醋穆尔氏菌的SinR的氨基酸序列的变化
用热醋穆尔氏菌39073-HH进行进化研究，以开发不易于孢子形成的菌株。将培养物在含有2.5g/l酵母提取物的培养基(与实施例1中所述的相同)中培养，并在60℃下孵育。为了施加选择性压力，一旦培养物达到稳定期(通常在4天后)，使用2％接种物将其重新接种到新鲜的培养基中。这种方法一直持续到培养物进化了大约2500代(14次转移)。
通过显微镜、孢子的孔雀绿染色(参见实施例1中的描述)和生物量的世代(通过光密度测量)，对在培养基中和在进化过程中使用的条件下生长的培养物进行表征。进化的培养物没有破坏的孢子形成，以及生物量的产生与未进化的菌株相似。通过将培养物在培养箱中保存较长时间并重新培养菌株，观察到该菌株在休眠状态超过25天后立即具有代谢活性，这与具有相当大的迟缓期的野生型不同；通常在休眠状态后1-3天才具有代谢活性。
为了评估进化过程中发生的基因变化，将培养物以不同稀释度铺在固体培养基上(以允许单个菌落的生长)，并在60℃下厌氧培养7天。挑取六个单菌落并在液体培养基中培养。孵育2天后，将细胞离心，并使用基因组DNA纯化试剂盒(Promega，Madison，WI，美国)从单个培养物中提取基因组DNA，并将提取的DNA溶解在pH 8.5的10mM Tris-Cl中。使用Qubit dsDNA HS测定试剂盒和Qubit 2.0荧光计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国)对DNA进行定量。DNA用于生成Illumina鸟枪法测序文库。按照制造商(Illumina，San Diego，CA，美国)的建议，使用MiSeq试剂盒v3使用MiSeq系统进行测序(600个循环)，得到2×300bp的配对的末端读数。通过与参考基因组序列比对来识别显性突变。与细胞状态相关的唯一突变是编码SinR的基因中的V198F突变。
进化的菌株没有破坏的孢子形成，但是野生型(携带SinR_198V)最易于产生孢子，其细胞形态更圆而不是明显的棒状。具有198F的进化的菌株具有更明显的杆状形态并且易于聚集。当作为接种物用于新鲜培养基的时，有SinR_198F的培养物的迟缓期显著缩短。
对热醋穆尔氏菌SinR的蛋白质结构的分析表明，其类似于芽孢杆菌的SinR，尽管这两种蛋白质不相同。使用两种不同的比对算法，对来自热醋穆尔氏菌中的SinR和来自枯草芽孢杆菌的SinR的第三个HTH结构域进行序列比对。不限于理论，这表明热醋穆尔氏菌中的V198可能等同于枯草芽孢杆菌中的T60或L61。枯草芽孢杆菌中的SinR具有限定的晶体结构，其允许进一步分析与其它蛋白质结合或寡聚化的变化。检查来自枯草芽孢杆菌的SinR-SinI复合物的结构，SinR寡聚化和SinI结合(SinI的结合模拟寡聚化相互作用(Bai等人，Genes Dev.；7:139–148 1993,Lewis等人，J.Mol.Biol.；283:907–912 1998))两者都表明T60和L61处于HTH结构域和寡聚结构域之间的相间(图4)。L61的侧链面向螺旋-转角-螺旋基序内部，将其突变为Phe(F)会导致空间冲突，并可能导致蛋白质的不稳定(图4C)。T60的侧链面向寡聚结构域，并与来自SinI的E14形成两个氢键(图4D，左)。T60突变为F会去除氢键键合能力，并导致SinR和SinI之间的空间冲突，很可能会降低亲和性(图4D，中和左)。
结构分析发现，L61面向SinR的蛋白核心，因此，L61的突变有望破坏SinR的稳定性。T60面向SinI相互作用的相间，因此，预计该残基的突变会影响SinR-SinI相互作用的亲和性。为了证实这些假设并识别预计对SinR蛋白稳定性和/或SinI相互作用亲和性具有相似影响的其它突变，应用了两种不同的生物信息学工具：(i)PremPS服务器(Chen等人，PLOSComp.Biol.；16:e1008543 2020)用于计算对SinR蛋白稳定性的预测的影响，以及(ii)mCSM-PPI2服务器(Rodrigues等人，Nucleic Acids Res.；47:W338–W344 2019)用于计算对SinI相互作用亲和性的预测的影响。在这两种情况下，都预测了T60和L61处所有可能的突变的影响。
L61突变的生物信息学预测(表4)表明，该位置的突变对蛋白质稳定性有很大影响，而对SinI相互作用亲和性的影响不太明显。这与结构分析一致，表明L61面向蛋白核心，不构成SinI相互作用位点的一部分。基于这些观察，在L61突变后观察到的任何表型效应的主要贡献因素预计是蛋白质的稳定性。对L61处单个突变的分析表明，预计所有突变都会失稳(即，失去稳定性)，其中L61F的失稳程度最小(预测的ΔΔ稳定性(kcal/mol)＝0.15)，而L61S的失稳程度最大(预测的ΔΔ稳定性(kcal/mol)＝2.77)。如果如先前的序列比对所示，热醋穆尔氏菌中的SinR V198与芽孢杆菌中的L61同源，则V198突变为任何氨基酸都会破坏热醋穆尔氏菌SinR的稳定性，因此具有的表型效应与关于V198F观察到的表型效应相似。
与对L61的预测相反，预计T60处的突变会对SinR和SinI之间的相互作用亲和性产生很大影响，而对蛋白质稳定性的影响则不太明显(表5)。这是结构分析所预期的，因为T60处于SinR-SinI相互作用的相间，并且面向SinR表面。考虑到这些结果，预计T60突变的主要表型效应是由于对SinI亲和性的变化。对单个突变的评估表明，预计两个突变T60D和T60E会增加对SinI的亲和性。通过检查模拟的突变结构很容易解释这一点，其中天冬氨酸和谷氨酸都形成了几个针对SinI的新的极性和氢键接触。突变的其余部分(天冬氨酸和谷氨酸以外的所有其它氨基酸)预计会降低对SinI的亲和性。这与结构分析非常吻合，其中发现T60的侧链与来自SinI的E14形成两个氢键。T60的突变去除了氢键键合能力，降低了SinR和SinI之间的亲和性。如果如先前的序列比对所示，热醋穆尔氏菌中的SinR V198与芽孢杆菌中的T60同源，则V198突变为天冬氨酸和谷氨酸以外的任何氨基酸都会降低SinR-SinI相互作用的亲和性，因此具有的表型效应与关于V198F观察到的表型效应相似。
表4:芽孢杆菌的SinR中L61位点饱和诱变对蛋白质特性的预测的影响
表5:芽孢杆菌的SinR中T60位点饱和诱变对蛋白质特性的预测的影响
参考文献列表
下面列出的或本文其它地方描述的每篇参考文献均以引用的方式全部并入本文。
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Claims (17)

1.一种增加属于穆尔氏菌属(Moorella)菌种的细菌生长速率的方法，所述方法包括向细菌中引入一种或多种基因修饰以降低或消除细菌中0期孢子形成蛋白A同源物(Spo0A)的表达和/或活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种基因修饰包含降低或消除细菌中Spo0A蛋白表达的基因修饰。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中spo0A基因缺失。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述方法还包括向细菌中引入一种或多种基因修饰以在所述细菌中表达SinR的变体，其中SinR变体与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列同一性，并且在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置包含除V以外的氨基酸，优选地，其中所述氨基酸是F、I、Y或W，更优选地，其中所述氨基酸是F，并且其中与SEQ ID NO:2相比，所述SinR变体提供缩短的细菌迟缓期持续时间和/或增加的细菌生长速率。
5.一种缩短属于穆尔氏菌属菌种的细菌的迟缓期持续时间和/或增加其生长速率的方法，所述方法包括向细菌中引入一种或多种基因修饰以在细菌中表达HTH型转录调控因子SinR(SinR)的变体，其中SinR变体与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列同一性，并且在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置包含除缬氨酸(V)以外的氨基酸，其中与SEQ ID NO:2相比，所述SinR变体提供缩短的细菌迟缓期持续时间和/或增加的细菌生长速率。
6.根据权利要求4和5中任一项所述的方法，其中在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是苯丙氨酸(F)、异亮氨酸(I)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是F。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述穆尔氏菌属菌种选自：
(a)热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)；
(b)热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica)；
(c)基于MUMmer比对(ANIm)评分，与热醋穆尔氏菌菌株DSM 512T相比，具有至少约96.5％的平均核苷酸同一性的细菌菌株；
(d)基于MUMmer比对(ANIm)评分，与热醋穆尔氏菌菌株DSM 2955T相比，具有至少约96.5％的平均核苷酸同一性的细菌菌株；
(e)(a)和(b)的组合；(a)和(c)的组合；(a)和(d)的组合；(a)、(b)和(c)的组合，或(a)至(d)全部的组合。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法获得的或可获得的基因修饰的细菌。
10.一种属于热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌菌种的细菌，其中所述细菌已经基因修饰以降低或消除细菌中Spo0A的表达和/或活性，其中降低的表达和/或活性是相对于其在野生型热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌中的表达和/或活性而言。
11.一种属于热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌菌种的细菌，其中所述细菌已经基因修饰以包含编码SinR的变体的转基因，其中SinR变体与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列同一性，并且在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置包含除V以外的氨基酸，并且其中与SEQ ID NO:2相比，所述SinR变体提供缩短的细菌迟缓期持续时间和/或增加的细菌生长速率。
12.一种属于热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌菌种的细菌，其中所述细菌
(a)包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的SinR的变体，并且在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置包含除V以外的氨基酸，其中与SEQ ID NO:2相比，SinR变体提供缩短的细菌迟缓期持续时间和/或增加的细菌生长速率，并且
(b)具有降低的或消除的Spo0A的表达和/或活性，其中降低的表达和/或活性是相对于其在野生型热醋穆尔氏菌和/或热自养穆尔氏菌中的表达和/或活性而言。
13.根据权利要求10和12中任一项所述的细菌，其中spo0A基因缺失。
14.根据权利要求11和12中任一项所述的细菌，其中在与SEQ ID NO:2中位置198对应的位置的氨基酸是F。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的细菌用于代谢含碳底物的用途，任选地在生化品的生产中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其中
i)含碳底物是CO和/或CO2，
ii)所述生化品选自C1-C4醇、C1-C4酮、C1-C4醛、C1-C4羧酸及其任何混合物，或
iii)i)和ii)两者。
17.根据权利要求1-8中任一项所述的方法、根据权利要求9至14中任一项所述的细菌或根据权利要求15和16中任一项所述的用途，其中所述细菌是热醋穆尔氏菌ATCC 39073菌株或衍生自其的菌株，例如热醋穆尔氏菌39073-HH菌株。
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