NO326775B1

NO326775B1 - Fremgangsmater for fremstilling av utvalgte organiske produkter ved hjelp av mikroorganismer med crabtree-negativ fenotype, anvendelse av mikroorgansimene for fremstilling av melkesyre og K. thermotolerans gjaerstamme.

Info

Publication number: NO326775B1
Application number: NO20015688A
Authority: NO
Inventors: Jeffrey John Kolstad; Aharon Meir Eyal; Ting Liu Carlson; John N Starr; Vineet Rajgarhia; Vassily Hatzimanikatis; Stacey Olson
Original assignee: Cargill Dow Llc
Priority date: 1999-05-21
Filing date: 2001-11-21
Publication date: 2009-02-16
Also published as: EP1183385B1; KR20020048910A; HK1045174A1; US20040029238A1; NO20015688L; US7700332B1; CA2374482A1; AU5034400A; CZ20014090A3; JP4637372B2; PL352434A1; BR0010806A; US6485947B1; CA2374482C; DE60029440D1; CZ299320B6; UA77386C2; US7229805B2; NO20015688D0; HUP0201204A3

Description

Oppfinnelsen angår fremgangsmåter for utvalgte organiske produkter, anvendelse av en genetisk modifisert organisme og K. thermotolerans gjærstamme.

Organiske produkter slik som melkesyre har mange viktige industrielle anvendelser. For eksempel kan organiske syrer anvendes for å syntetisere plastmaterialer samt andre produkter. For å imøtekomme det økende behovet for organiske produkter, er mer effektive og kostnadseffektive produksjonsmetoder under utvikling. En slik metode omfatter anvendelsen av bakterier. Spesielt kan visse bakterier produsere store mengder av spesielle organiske produkter under visse fermenteringsforhold. Anvendelsen av levende bakterier som produksjons-anlegg er imidlertid begrenset av bakterienes evne til å vokse når det organiske produktet akkumuleres i vekstløsningen. For å omgå slike begrensninger er det blitt anvendt forskjellige produktrenseteknikker under produktsyntese. I tillegg er det blitt forsøkt å anvende mikroorganismer som er forskjellige fra bakterier. Saccharomyces cerevisiae, som faktisk er kjent å være syretolerant, har blitt genetisk modifisert i et forsøk på å produsere melkesyre. Spesielt ble S. cerevisiae-celler modifisert ved å gi cellene et bovinlaktatdehydrogenase cDNA og oppsplitte endogene pyruvatdekarboksylasegener (PDC1, PDC5 og PDC6). Mens disse modifiserte S. cerevisiae- ceWene produserte noe melkesyre, ble cellevekst undertrykket, noe som førte til den konklusjon at både cellevekst og melkesyreproduksjon må forbedres.

Den kjente teknikken på området er blant annet beskrevet i WO-A1-9914335, EP-A2-370160 og i Biotechnology Progress, vol. 11, nr. 3, 1995, s 294-298, D. Porro et al.

Den foreliggende oppfinnelsen angår generelt fremgangsmåter for å fremstille organiske produkter. Spesielt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for å produsere forskjellige organiske produkter. Oppfinnelsen er basert på oppdagelsen av at spesielle mikroorganismer (for eksempel bakterie- og soppmikroorganismer) genetisk kan manipuleres slik at de har evnen, under spesifikke dyrkningsforhold, å vokse, benytte forskjellige karbonkilder for vekst samt produktproduksjon, og å produsere et ønsket organisk produkt for kommersielle formål. For eksempel kan gjærcellene fremskaffet her vokse og produsere et organisk produkt når de dyrkes ved lav pH og temperatur. Det å ha evnen til å vokse raskt og produsere et organisk produkt effektivt under for eksempel lav pH og høye temperaturforhold, er spesielt fordelaktig. En mikroorganismes evne til å tolerere lav pH unngår behovet for å opprettholde nøytralt pH-miljø, som kan være vanskelig og dyrt under masseproduksjonsprosesser. I tillegg kan fremgangsmåtene og materialene som er nødvendige for å utvinne det ønskede organiske produktet fra en næringsløsning med lav pH være mer praktisk og mer effektiv enn de som er nødvendige for å utvinne det samme organiske produktet fra en næringsløsning som har en mer nøytral pH. For eksempel kan visse organiske syreprodukter felles ut av løsningen når pH-verdien faller under produktets pKa-verdi, noe som gjør utvinning ganske enkel. En mikroorganismes evne til å tolerere høye temperaturer unngår behovet for å opprettholde kjøletemperaturer under vekst- og produksjonsfasene. Reduksjon av behovet for å senke temperaturen i en stor volumtank av næringsløsning under masseproduksjonsprosesser gjør den totale prosessen mer effektiv og billigere. Videre tilveiebringer en mikroorganismes evne til å tolerere både lav pH og høy temperatur en egnet metode for å forhindre forurensning av andre mindre tolerante mikroorganismer under masseproduksjonsprosessene.

Det er viktig å legge merket til at et kritisk aspekt som angår evnen til å produsere et ønsket organisk produkt for kommersielle formål kan være den spesifikke produktiviteten hvorved det ønskede organiske produktet produseres. For eksempel tilveiebringelse av en høy spesifikk produktivitet ved anvendelse av fremgangsmåtene og materialene som er beskrevet her, kan gjøre det mulig for en mikroorganisme å generere energien som er nødvendig for celleopprettholdelse når de eksponeres for dyrkningsforhold som lav pH og høy temperatur. Den påkrevde energien kan genereres via en fermenteringsvei under i alt vesentlig anaerobe forhold, i stedet for å stole på genereringen av energi via respirasjonsveien.

Oppnåelse av energi via en fermenteringsvei er spesielt fordelaktig under produksjon av et produkt som ikke krever respirasjonsveien, siden i alt vesentlig alt av den tilveiebrakte karbonkilden kan anvendes for å produsere det ønskede organiske produktet.

Oppfinnelsen er også basert på oppdagelsen av at benyttelsen av en karbonkilde av visse genetisk manipulerte mikroorganismer kan kontrolleres og ledes hovedsakelig mot produksjonen av enten biomasse eller et ønsket organisk produkt. I generelle termer omfatter oppfinnelsen to typer av dyrkningsprosesser. En dyrkningsprosess omfatter dyrking av mikroorganismer under spesifikke dyrkningsforhold, avhengig av mikroorganismen og ønsket utfall, som fremmer biomasseproduksjon, mens den andre omfatter et annet sett av dyrkningsforhold, også avhengig av mikroorganismen og ønsket utfall, som fremmer produksjonen av et ønsket organisk produkt. Det å ha evnen til å manipulere benyttelsen av en karbonkilde under masseproduksjonsprosesser, gir produsenter større fleksibilitet og mer kontroll enn det som ellers er mulig.

I tillegg er oppfinnelsen basert på oppdagelsen av at visse mikroorganismer kan være genetisk manipulerte slik at mesteparten, om ikke alt, av en karbonkilde benyttes for produksjonen av enten biomasse eller et ønsket organisk produkt. Spesielt tilveiebringer oppfinnelsen gjærceller som er modifisert slik at biosynteseveier, som leder benyttelsen av en karbonkilde bort fra produksjonen av biomasse eller det ønskede organiske produktet, inaktiveres. Inaktivering av slike biosynteseveier tilveiebringer mikroorganismer som effektivt kan vokse og produsere det ønskede produktet.

Generelt beskrives en gjærcelle som inneholder et eksogent nukleinsyremolekyl, hvor det eksogene nukleinsyremolekylet koder for et polypeptid som har enzymatisk aktivitet inne i cellen. Nukleinsyren kan være innarbeidet inn i cellens genom. Den enzymatiske aktiviteten fører til dannelsen av et organisk produkt som, i noen utførelsesformer, utsondres fra cellen. Cellen har ytterligere en crabtree-negativ fenotype og produserer det organiske produktet. Cellen kan for eksempel være fra slekten Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon eller Yamadazyma. Det organiske produktet kan for eksempel være et fermenteringsprodukt, et pyruvat-avledet produkt, en organisk syre eller et karboksylat så som laktat. Polypeptidet kan for eksempel ha laktatdehydrogenaseaktivitet. For eksempel kan den eksogene nukleinsyren kode for et bakterielaktatdehydrogenase eller sopplaktatdehydrogenase slik som et K. lactis sopplaktatdehydrogenase.

En slik celle, for eksempel en gjærcelle, kan inneholde et eksogent nukleinsyremolekyl, hvor det eksogene nukleinsyremolekylet koder for et polypeptid som fremmer nedbrytning av et pentosekarbon av cellen. Polypeptidet kan for eksempel være xylosereduktase, xylitoldehydrogenase eller xylulokinase, og pentosekarbonet kan for eksempel være ribose, arabinose, xylose og lyksose. Cellen kan videre nedbryte et heksosekarbon og kan, om ønskelig, samtidig nedbryte heksosekarbonet og pentosekarbonet. Heksosekarbonet kan for eksempel være allose, altrose, glukose, mannose, gulose, jodose, fruktose, galaktose og talose.

I ett aspekt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et organisk produkt. Fremgangsmåten omfatter tilveiebringelse en mikroorganisme, hvor mikroorganismen kan omfatte et eksogent nukleinsyremolekyl som koder et polypeptid som har enzymatisk aktivitet inne i mikroorganismen, hvor den enzymatiske aktiviteten fører til dannelsen av det organiske produktet, og hvor mikroorganismen har en crabtree-negativ fenotype, og dyrking av mikroorganismen med kulturløsning slik at det organiske produktet produseres. Mikroorganismen kan være gjærceller som kan være valgt fra artene Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon eller Yamadazyma. Det organiske produktet kan være et fermenteringsprodukt, pyruvat-avledet produkt, organisk produkt inneholdende mer enn tre karbonatomer, karboksylat, karbohydrat, aminosyre, vitamin eller lipidprodukt. Det organiske produktet kan ytterligere være laktat, glyserol, akrylat, xylose, askorbat, citrat, isocitrat, a-ketoglutarat, succinyl-CoA, succinat, fumarat, malat eller oksaloacetat. Det organiske produktet kan utskilles fra cellene. Fremgangsmåten kan resultere i celler som har redusert pyruvatdekarboksylaseaktivitet eller redusert alkoholdehydrogenaseaktivitet. Den enzymatiske aktiviteten kan føre til dannelsen av det organiske produktet på en NADH-forbrukende måte.

Dyrkningsløsningen, som kan være væske, kan omfatte en inhibitor av cellulær respirasjon, slik som antimycin A, cyanid eller azid. Dyrkningstrinnet kan omfatte dyrking av cellene under aerobe vekstforhold, og cellene blir så brakt i kontakt med en inhibitor av cellulær respirasjon.

I en alternativ utførelsesform omfatter dyrkningstrinnet inkubering av cellene under anaerobe dyrkningsforhold. I en ytterligere alternativ utførelsesform omfatter dyrkningstrinnet vekst av cellene under aerobe vekstforhold, og deretter blir cellene inkubert under anaerobe dyrkningsforhold. Dyrkningstrinnet kan også omfatte dyrking av cellene ved en temperatur høyere enn ca. 35°C.

Dyrkningsløsningen kan ha en organisk pH-verdi på mindre enn ca. 3,0 og/eller en uorganisk pH-verdi på mindre enn ca. 3,0. Løsningen kan inneholde et pentosekarbon slik som ribose, arabinose, xylose eller lyksose. Løsningen kan også omfatte et maisfiberhydrolysat som for eksempel har en pH-verdi på mellom ca. 2,0 og ca. 6,5.

Spesielt angår dermed foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et utvalgt organisk produkt, som er kjennetegnet ved at den innbefatter: a) tilveiebringelse av en mikroorganisme som fremviser en crabtree-negativ fenotype; b) dyrking av den crabtree-negative mikroorganismen i en første dyrkningsløsning som omfatter en karbonkilde under et første sett av

dyrkningsforhold som fremmer cellulær respirasjon; og

c) dyrking av den crabtree-negative mikroorganismen i en dyrkningsløsning som omfatter en karbonkilde under et andre sett av dyrkningsforhold som

fremmer produksjon av det utvalgte organiske produktet, der ikke mer enn 0,3 gram biomasse blir produsert per gram karbonkilde som blir konsumert under det andre settet av dyrkningsforhold.

I ett aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er den crabtree-negative mikroorganismen genetisk modifisert.

I et annet aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter det utvalgte, organiske produktet et pyruvat-avledet produkt.

I et annet aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er den crabtree-negative mikroorganismen genetisk modifisert til å inkludere et eksogent laktatdehydrogenasegen, og der det pyruvat-avledede produktet er laktat.

I et annet aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er laktatdehydrogenasegenet valgt fra gruppen bestående av

bovinlaktatdehydrogenase, bakterielaktatdehydrogenase og sopplaktatdehydrogenase.

I et annet aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter karbonkilden i den første dyrkningsløsningen glukose.

I et annet aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter karbonkilden i den andre dyrkningsløsningen glukose.

I et annet aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter det første settet med dyrkningsforhold aerobe forhold.

I et annet aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter det andre settet med dyrkningsforhold anaerobe forhold.

I et annet aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen benyttes den til produksjon av et utvalgt pyruvat-avledet produkt som ytterligere omfatter: d) dyrkning av mikroorganismen under et tredje sett med dyrkningsforhold som omfatter en dyrkningsløsning som inkluderer et middel som øker metabolsk energi

for mikroorganismen.

I et annet aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter det første settet med dyrkningsforhold aerobe forhold og det andre settet med dyrkningsforhold omfatter anaerobe forhold.

I et annet aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen inkluderer det første, andre og tredje settet med dyrkningsforhold en dyrkningsløsning som inkluderer glukose.

I et annet aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter middelet som øker metabolsk energi for mikroorganismen oksygen.

I et annet aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er mikroorganismen en gjærtype som er utvalgt fra gruppen som består av Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon og Yamadazyma.

I et annet aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er den crabtree-negative mikroorganismen genetisk modifisert slik at den inneholder et eksogent laktatdehydrogenasegen, det pyruvat-avledede produktet er laktat, karbonkilden i den første og andre dyrkningsløsningen inkluderer glukose, det første settet med dyrkningsforhold omfatter aerobe forhold og det andre settet med dyrkningsforhold omfatter anaerobe forhold.

I et annet aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen mikroorganismen er en gjærtype av slekten Kluyveromyces.

Oppfinnelsen gjelder også anvendelse av en genetisk modifisert organisme som oppviser en crabtree-negativ fenotype i en fremgangsmåte for produksjonen av melkesyre, der nevnte fremgangsmåte omfatter en aerob fase og en anaerob fase.

I tillegg vedrører oppfinnelsen spesielt en K. thermotolerans gjærstamme som er kjennetegnet ved at den mangler etanolproduksjonsevne eller har redusert etanolproduksjonsevne med hensyn på villtypegjær av samme stamme, og som har et endogent laktatdehydrogenasegen.

Med mindre noe annet er definert, har alle tekniske og vitenskapelige uttrykk anvendt her den samme betydningen som vanligvis forstås av fagfolk. Skjønt fremgangsmåter og materialer som er like eller ekvivalent med de beskrevet her kan anvendes i utøvelsen eller testingen av den foreliggende oppfinnelsen, er egnede fremgangsmåter og materialer som beskrevet under. I tilfelle av konflikt, vil den foreliggende fremstilling, omfattende definisjoner, gjelde. I tillegg er materialene, fremgangsmåtene og eksemplene bare illustrerende og er ikke ment å være begrensende.

Andre trekk og fordeler med oppfinnelsen vil fremgå av den følgende detaljerte beskrivelsen, og fra kravene.

Figur 1 er et diagram som viser pHES-plasmidet.

Figur 2 er et diagram som viser pSEH-plasmidet.

Figur 3 er et diagram som viser genereringen av pCRII-plasmider inneholdende enten Lh-ldh eller Pa-ldh.

Figur 4 er et diagram som viser ldh/pCRII-plasmider.

Figur 5 er et diagram som viser genereringen av pHES-plasmider inneholdende Lh-ldh eller Pa-ldh. Figur 6a er et diagram som viser genereringen av pyruvatdekarboksylase (PDC) utstøterfragment. Figur 6b er et diagram som viser 575 kbp-fragmentet som omgir K. marxianus 1,7 kbp PDC1. Figur 6c er et diagram som viser utelatelsen av 400 bp av 5,5 kbp PDC homologt område og innsettelsen av et gen for kanamycinresistens. Figur 6d er et diagram som viser 4 kb-området som inneholder kanamycinresistensgenet og det omgivende 2,3 kbp av PDC1. Figur 6e er et diagram som viser 7,5 kbp K. thermotolerans PDC1 og omgivende område. Figur 6f er et diagram som viser utelatelsen av 750 bp fra 1,7 kbp PDC 1-genet og innsettelsen av kanamycinresistensgenet. Figur 7 er en kurve som plotter vekst (optisk tetthet; OD) mot tid (timer) for Kluyveromyces marxianus dyrket under forhold med lav pH (pH 2,5) og høy temperatur (40°C). Figur 8 er en kurve som plotter vekst (OD) mot tid (timer) for K. marxianus dyrket med glukose, xylose eller arabinose ved 30°C. Figur 9 er en kurve som plotter vekst (OD) mot tid (timer) for K. marxianus dyrket med et maisfiberhydrolysat ved 30°C. Figur 10 er en kurve som plotter vekst (OD) mot tid (timer) for K. marxianus dyrket ved 30°C og den indikerte pH. Figur 11 er en kurve som plotter vekst (OD) mot tid (timer) for K. marxianus dyrket ved 30°C og den indikerte pH i nærværet av 40 g melkesyre. Figur 12 viser tre kurver som plotter (A) biomasseproduksjon; (B) glukoseforbruk; og (C) etanolproduksjon av S. uvarum og K. marxianus når de er dyrket på mineralløsning med 2 % glukose under aerobe forhold. Figur 13 viser tre kurver som plotter (A) biomasseproduksjon; (B) glukoseforbruk; og (C) etanolproduksjon av S. uvarum og K. marxianus når de er dyrket på mineral-løsning med 2 % glukose under anaerobe forhold.

Figur 14 er et plasmidkart av PDCl-promotervektor.

Oppfinnelsen angår fremgangsmåter relatert til produksjonen av organiske produkter. Spesielt tilveiebringer oppfinnelsen gjærceller og fremgangsmåter for fremstilling av forskjellige organiske produkter. Mikroorganismene kan anvendes for å produsere organiske produkter. Slike organiske produkter kan anvendes i en rekke forskjellige applikasjoner. For eksempel kan organiske produkter produsert av mikroorganismene beskrevet her anvendes som konserveringsmidler eller additiver i mat, farmasøytiske produkter eller kosmetiske produkter, og kan anvendes for å lage plast samt andre produkter.

For formålet med denne oppfinnelse er et organisk produkt en hvilken som helst forbindelse som inneholder et karbonatom. For eksempel karboksylater (for eksempel laktat, akrylat, citrat, isocitrat, cc-ketoglutarat, succinat, fumarat, malat, oksaloacetat), karbohydrater (for eksempel D-xylose), alditoler (for eksempel xylitol, arabitol, ribitol), aminosyrer (for eksempel glysin, tryptofan, glutamat), lipider, estere, vitaminer (for eksempel L- askorbat), polyoler (for eksempel glyserol, 1,3-propandiol, erytritol), aldehyder, alkener, alkyner og ketoner er organiske produkter. Således kan et organisk produkt inneholde ett, to, tre, fire, fem, seks, syv, åtte, ni, ti eller flere karbonatomer. I tillegg kan organiske produkter ha en molekylvekt som er mindre enn ca. 1000 (for eksempel mindre enn ca. 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 eller 100). For eksempel er D-xylose (C5H10O5) et organisk produkt som har en molekylvekt på 150. Videre kan organiske produkter være fermenteringsprodukter. Uttrykket "fermenteringsprodukt" som anvendt her, refererer til enhver organisk forbindelse som er produsert ved en fermenteringsprosess. I generelle termer omfatter en fermenteringsprosess den anaerobe enzymatiske omdannelsen av organiske forbindelser slik som karbohydrater til forbindelser slik som etylalkohol, som resulterer i energi i form av adenosintrifosfat (ATP). Således skiller fermentering seg fra cellulær respirasjon ved at organiske produkter i stedet for molekylært oksygen anvendes som elektronakseptorer. Eksempler på fermenteringsprodukter omfatter, uten begrensning, acetat, etanol, butyrat og laktat.

Organiske produkter kan også være pyruvat-avledede produkter. Uttrykket "pyruvat-avledet produkt" som anvendt her refererer til enhver forbindelse som er syntetisert fra pyruvat innenfor ikke mer enn 15 enzymatiske trinn. Et enzymatisk trinn er enhver kjemisk reaksjon eller serie av reaksjoner katalysert av et polypeptid som har enzymatisk aktivitet. Uttrykket "polypeptid som har enzymatisk aktivitet" som anvendt her refererer til ethvert polypeptid som katalyserer en kjemisk reaksjon av andre substanser uten selv å ødelegges eller endres ved fullendelse av reaksjonen eller reaksjonene. Typisk katalyserer et enzymatisk polypeptid dannelsen av ett eller flere produkter fra ett eller flere substrater. Slike polypeptider kan ha enhver type av enzymatisk aktivitet omfattende, uten begrensning, den enzymatiske aktiviteten forbundet med et enzym slik som aconitase, isocitratdehydrogenase, ketoglutaratdehydrogenase, succinattiokinase, succinatdehydrogenase, fumarase, malatdehydrogenase, citratsyntase, 2,5-dioksovaleratdehydrogenase, 5-dehydro-4-deoksy-D-glukaratdehydrogenase, glukaratdehydratase, aldehyddehydrogenase, glukuronolaktonreduktase, L-gulonolakton-oksidase, 2-dehydro-3-deoksy-D-pentanoataldolase, xylonatdehydratase, xylonolaktonase, D-xylosedehydrogenase, laktatdehydrogenase, CoA-transferase, laktyl-CoA-dehydratase eller akrylyl-CoA-hydratase.

Det er viktig å legge merke til at et polypeptid som har en spesiell enzymatisk aktivitet kan være et polypeptid som er enten naturlig forekommende eller ikke-naturlig forekommende. Et naturlig forekommende polypeptid er ethvert polypeptid som har en aminosyresekvens som finnes i naturen, omfattende vill-type og polymorfe polypeptider. Slike naturlig forekommende polypeptider kan oppnås fra enhver art, omfattende uten begrensning, pattedyr-, sopp- og bakteriearter. Et ikke-naturlig forekommende polypeptid er ethvert polypeptid som har en aminosyresekvens som ikke finnes i naturen. Således kan et ikke-naturlig forekommende polypeptid være en mutert versjon av et naturlig forekommende polypeptid eller et konstruert polypeptid. For eksempel kan et ikke-naturlig forekommende polypeptid som har citratsyntaseaktivitet være en mutert versjon av et naturlig forekommende polypeptid som har citratsyntaseakti vitet som beholder minst noe citratsyntaseaktivitet. Et polypeptid kan være mutert ved for eksempel sekvensaddisjoner, delesjoner og/eller substitusjoner.

Et organisk produkt er ikke et pyruvat-avledet produkt hvis det produktet er syntetisert fra pyruvat som krever mer enn 15 enzymatiske trinn. Eksempler på pyruvat-avledede produkter omfatter, uten begrensning, citrat, a-ketoglutarat, succinat, fumarat, malat, oksaloacetat, 2-dehydro-3-deoksy-D-xylonat, D-xylonat, D-xylonolakton, D-xylose, akrylat, acetat, etanol, butyrat og laktat.

For formål med denne oppfinnelsen vil karboksylatprodukter som kan være i en "fri syre" eller i "salt"-form refereres til ved anvendelse av saltformnomenklaturen. For eksempel vil melkesyre refereres til som laktat. I dette tilfellet vil således uttrykket "laktat" forstås til å omfatte melkesyre så vel som laktat.

Uttrykket "nukleinsyre" som anvendt her omfatter både RNA og DNA, omfattende cDNA, genomisk DNA og syntetisk (for eksempel kjemisk syntetisert) DNA. Nukleinsyren kan være dobbelttrådet eller enkelttrådet. Hvis enkelttrådet, kan nukleinsyren være sansetråden eller antisansetråden. I tillegg kan nukleinsyre være sirkulær eller lineær.

Uttrykket "eksogen" som anvendt her med referanse til et nukleinsyremolekyl og en spesiell celle refererer til ethvert nukleinsyremolekyl som ikke stammer fra den spesielle cellen som blir funnet i naturen. Således er alle ikke-naturlig forekommende nukleinsyremolekyler ansett å være eksogene til en celle straks den er innført i cellen. Det er viktig å legge merke til at ikke-naturlig forekommende nukleinsyremolekyler kan inneholde nukleinsyresekvenser eller fragmenter av nukleinsyresekvenser som er funnet i naturen, forutsatt at nukleinsyremolekylet som en helhet ikke eksisterer i naturen. For eksempel er et nukleinsyremolekyl inneholdende en genomisk DNA-sekvens innenfor en ekspresjonsvektor ansett å være et ikke-naturlig forekommende nukleinsyremolekyl, og er således ansett å være eksogen til en celle straks den er innført inn i cellen, ettersom nukleinsyremolekylet som en helhet (genomisk DNA pluss vektor DNA) ikke eksisterer i naturen. Således er enhver vektor, autonomt repliserende plasmid, eller virus (for eksempel retrovirus, adenovirus eller herpesvirus) som, som en helhet, ikke eksisterer i naturen, ansett å være et ikke-naturlig forekommende nukleinsyremolekyl. Det følger at genomiske DNA-fragmenter produsert ved PCR eller restriksjonsendonukleasebehandling samt cDNA'er er ansett å være ikke-naturlig forekommende nukleinsyremolekyler ettersom de eksisterer som separate molekyler som ikke finnes i naturen. Det følger også at ethvert nukleinsyremolekyl inneholdende en promotorsekvens og polypeptidkodende sekvens (for eksempel cDNA eller genomisk DNA) i et arrangement som ikke finnes i naturen er ansett å være et ikke-naturlig forekommende nukleinsyremolekyl.

Uttrykket "endogen" refererer til genomisk materiale som ikke er eksogent. Generelt utvikler endogent genomisk materiale seg inne i en organisme, vev eller celle, og er ikke innsatt eller modifisert ved rekombinant teknologi. Endogent genomisk materiale omfatter innenfor dets ramme naturlig forekommende variasjoner.

Det er også viktig å legge merke til at et nukleinsyremolekyl som er naturlig forekommende kan være eksogent for en spesiell celle. For eksempel ville et fullstendig kromosom isolert fra en celle fra person X anses å være et eksogent nukleinsyremolekyl med hensyn til en celle fra person Y straks det kromosomet er innført i Y's celle.

Som anvendt her refererer uttrykket "genetisk modifisert" til en organisme hvis genom er blitt modifisert for eksempel ved tilsetning, substitusjon eller utelatelse av genetisk materiale. Metoder for tilsetning eller utelatelse av genetisk materiale er kjent og omfatter, men er ikke begrenset til, vilkårlig mutagenese, punkt-mutasjoner omfattende innsettelser, utelatelser og substitusjoner, utstøterteknologi og transformasjon av en organisme med en nukleinsyresekvens ved anvendelse av rekombinant teknologi, omfattende både stabile og transiente transformanter. Gjærcellene kan også nedbryte stivelse, enten naturlig eller på grunn av en genetisk modifikasjon, og kan til og med være genetisk modifisert for å nedbryte celluloseholdig materiale ved tilsetningen av for eksempel soppbaserte cellulaser.

1. Gjærceller som har en crabtree- negativ fenotype

Oppfinnelsen angår en rekke genetisk manipulerte mikroorganismer som har en crabtree-negativ fenotype. Slike rekombinante mikroorganismer kan anvendes for å produsere organiske produkter. For eksempel vedrører oppfinnelsen en gjærcelle som har en crabtree-negativ fenotype, og inneholder et eksogent nukleinsyremolekyl som koder et polypeptid som har enzymatisk aktivitet som fører til dannelsen av et organisk produkt. Slike gjærceller er innenfor rammen av oppfinnelsen forutsatt at de produserer det organiske produktet. Det skal bemerkes at det produserte organiske produktet kan utsondres fra gjærcellen, noe som eliminerer behovet for å rive opp cellemembranen for å gjenvinne det organiske produktet. Ved bestemmelse av utbyttet av organisk produktproduksjon for en spesiell gjærcelle, kan en hvilken som helst metode anvendes. Det vises for eksempel til Kiers et al., Yeast, 14(5): 459-469 (1998). Det skal også bemerkes at den enzymatiske aktiviteten til det kodede polypeptidet kan føre til dannelsen av det organiske produktet på en NADH-forbrukende måte. Med andre ord kan produksjonen av den organiske forbindelsen kreve NADH som en energikilde. Uttrykket "NAD" refererer til ko-faktorene som virker som elektron- og hydrogenbærere i spesielle oksidasjons-reduksjonsreaksjoner, mens uttrykket "NADH" refererer til den reduserte formen av NAD. Eksempler på organiske produkter hvis syntese krever NADH omfatter, uten begrensning, laktat, etanol, acetat og akrylat. Gjærcellene bryter typisk ned et heksosekarbon så som glukose. Imidlertid kan også slike gjærceller nedbryte et pentosekarbon (for eksempel ribose, arabinose, xylose og lyksose). Med andre ord kan en gjærcelle enten naturlig benytte et pentosekarbon, eller kan være konstruert for å benytte et pentosekarbon. For eksempel kan en gjærcelle være gitt et eksogent nukleinsyremolekyl som koder xylosereduktase, xylitoldehydrogenase og/eller xylulokinase slik at xylose kan nedbrytes. Gjærcellene kan også bryte ned stivelse, enten naturlig eller på grunn av en genetisk modifikasjon, og kan til og med være genetisk modifisert for å nedbryte celluloseholdige materialer ved tilsetning av for eksempel soppbaserte cellulaser.

En gjærcelle som har en crabtree-negativ fenotype er enhver gjærcelle som ikke fremviser crabtree-effekten. Uttrykket "crabtree-negativ" refererer til både naturlig forekommende og genetisk modifiserte organismer. I korte trekk er crabtree-effekten definert som inhiberingen av en mikroorganismes oksygenforbruk når den er dyrket under aerobe forhold på grunn av nærværet av en høy glukosekonsentrasjon (for eksempel 50 g glukose/l). Med andre ord fortsetter en gjærcelle som har en crabtree-positiv fenotype å fermentere uten hensyn til oksygentilgjengelighet på grunn av nærværet av glukose, mens en gjærcelle som har crabtree-negativ fenotype ikke fremviser glukose-mediert (glucose-mediated) inhibering av oksygenforbruk. Eksempler på gjærceller som typisk har en crabtree-negativ fenotype omfatter, uten begrensning, gjærceller fra de følgene slektene: Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon og Yamadazyma.

Det beskrives her mange forskjellige typer av rekombinante gjærceller som er i stand til å produsere en rekke forskjellige organiske produkter. For eksempel kan en gjærcelle inneholde et eksogent nukleinsyremolekyl som koder et polypeptid som har laktatdehydrogenaseaktivitet slik at laktat produseres. Eksempler på et slikt polypeptid omfatter, uten begrensning, bovinlaktatdehydrogenase, bakterielaktatdehydrogenase og sopplaktatdehydrogenase (for eksempel K. lactis eller K. thermotolerans sopplaktatdehydrogenase). Igjen kan polypeptider som har enzymatisk aktivitet, slik som en laktatdehydrogenaseaktivitet, være naturlig forekommende eller ikke-naturlig forekommende.

Det er viktig å legge merke til at gjærcellene kan inneholde en enkelt gjenpart (kopi) eller flere gjenparter (for eksempel ca. 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 eller 150 gjenparter) av et spesielt eksogent nukleinsyremolekyl. For eksempel kan en gjærcelle inneholde ca. 50 gjenparter av eksogent nukleinsyremolekyl X. Det er også viktig å legge merke til at gjærcellene kan inneholde mer enn ett spesielt eksogent nukleinsyremolekyl. For eksempel kan en gjærcelle inneholde ca. 50 gjenparter av eksogent nukleinsyremolekyl X samt ca. 75 gjenparter av eksogent nukleinsyremolekyl Y. I disse tilfeller kan hvert forskjellige nukleinsyremolekyl kode et forskjellig polypeptid som har sin egen unike enzymatiske aktivitet. For eksempel kan en gjærcelle inneholde fire forskjellige eksogene nukleinsyremolekyler slik at akrylat produseres. En slik gjærcelle kan inneholde et første eksogent nukleinsyremolekyl som koder et polypeptid som har laktatdehydrogenaseaktivitet, et andre som koder et polypeptid som har CoA-transferaseaktivitet, et tredje som koder et polypeptid som har laktyl-CoA-dehydrataseaktivitet og et fjerde som koder et polypeptid som har akrylyl-CoA-hydrataseaktivitet. En gjærcelle kan også inneholde fire forskjellige eksogene nukleinsyremolekyler slik at D-xylose produseres. Spesielt kan en slik gjærcelle inneholde et første eksogent nukleinsyremolekyl som koder et polypeptid som har 2-dehydro-3-deoksy-D-pentanoataldolaseaktivitet, et andre som koder et polypeptid som har xylonatdehydrataseaktivitet, et tredje som koder et polypeptid som har xylonolaktonaseaktivitet og et fjerde som koder et polypeptid som har D-xylosedehydrogenaseaktivitet. I et annet eksempel kan en gjærcelle inneholde seks forskjellige eksogene nukleinsyremolekyler slik at vitaminet, L-askorbat, produseres. Spesielt kan en slik gjærcelle inneholde et første eksogent nukleinsyremolekyl som koder et polypeptid som har 2,5-dioksovalerathehydrogenaseaktivitet, et andre som koder et polypeptid som har 5-dehydro-4-deoksy-D-glukarat-dehydrogenaseaktivitet, et tredje som koder et polypeptid som har glukarat-dehydrataseaktivitet, et fjerde som koder et polypeptid som har aldehyddehydrogenaseaktivitet, et femte som koder et polypeptid som har glukurono-laktonreduktaseaktivitet og et sjette som koder et polypeptid som har L-gulono-laktonoksidaseaktivitet.

Det er viktig å legge merket til at enzymatiske polypeptider kan anvendes slik at det ønskede organiske produktet er optisk rent (for eksempel ca. 90, 95, 99 % rent). For eksempel kan et polypeptid som har en (L)-laktatdehydrogenaseaktivitet anvendes for å produsere (L)-laktat.

Gjærceller kan også ha redusert enzymatisk aktivitet slik som redusert pyruvatdekarboksylase- og/eller alkoholdehydrogenaseaktivitet. Uttrykket "redusert" som anvendt her med hensyn til en celle og en spesiell enzymatisk aktivitet refererer til et lavere nivå av enzymatisk aktivitet enn det målt i en sammenlignbar gjærcelle av de samme artene. Således er en gjærcelle som mangler pyruvatdekarboksylaseaktivitet ansett å ha redusert pyruvatdekarboksylaseaktivitet ettersom mesteparten, om ikke alle, av sammenlignbare gjærceller har minst noe pyruvatdekarboksylaseaktivitet. Slike reduserte enzymatiske aktiviteter kan være resultatet av lavere enzymkonsentrasjon, lavere spesifikk aktivitet av et enzym, eller kombinasjoner derav. Mange forskjellige metoder kan anvendes for å lage en gjærcelle som har redusert enzymatisk aktivitet. For eksempel kan en gjærcelle konstrueres til å ha en oppsplittet enzym-kodende lokalitet ved anvendelse av vanlig mutagenese eller utstøterteknologi. Det vises for eksempel til Methods in Yeast Genetics (1997 edition), Adams, Gottschling, Kaiser and Sterns, Cold Spring Harbor Press (1998). Alternativt kan antisanseteknologi anvendes for å redusere enzymatisk aktivitet. For eksempel kan en gjærcelle konstrueres til å inneholde et cDNA som koder et antisensmolekyl som forhindrer et enzym i å bli laget. Uttrykket "antisensmolekyl" som anvendt her omfatter ethvert nukleinsyremolekyl som inneholder sekvenser som korresponderer med den kodende tråden til et endogent polypeptid. Et antisansemolekyl kan også ha flankerende sekvenser (for eksempel regulerende sekvenser). Således kan antisansemolekyler være ribozymer eller antisensoligonukleotider. Et ribozym kan ha enhver generell struktur omfattende, uten begrensning, hårnål-, hammerhode- eller øksehodestrukturer, forutsatt at molekylet kløyver RNA.

Gjærceller som har en redusert enzymatisk aktivitet identifiseres ved anvendelse av en hvilken som helst metode. For eksempel kan en gjærcelle som har redusert pyruvatdekarboksylaseaktivitet være lett å identifisere ved anvendelse av vanlige metoder. Det vises for eksempel til Ulbrich, Methods in Enzymology 18: 109-115

(1970).

3. Egnede organismer

En rekke organismer er egnet til bruk i henhold til oppfinnelsen, slik som Saccharomyces sp., omfattende S. cerevisiae og S. uvarum, Kluyveromyces, omfattende K. thermot oler ans, K. lactis og K. marxianus, Pichia, Hansenula, omfattende H. polymorpha, Candidia, Trichosporon, Yamadazyma, omfattende Y. stipitis, eller Torulaspora pretoriensis. For eksempel kunne en organisme så som Rhizopus oryzae, en naturlig produsent av melkesyre, være genetisk modifisert for syretoleranse, utbytteforbedring og optisk ren melkesyre. Aspergillus spp. er også kjent for å produsere en rekke organiske syrer, så som sitronsyre, og tolererer lav pH. Metoder for genetisk modifisering av Aspergillus spp. for å produsere melkesyre er tilgjengelige. Dessuten produserer sopp så som Rhizopus og Aspergillus spp. enzymer som er i stand til å nedbryte stivelse og andre karbohydratpolymerer til monomerkarbohydrater for anvendelse som en karbonkilde.

Prokaryoter slik som Eschericia coli, Zymomonas mobilis og Bacillus spp. har vært eller kan være genetisk modifisert for melkesyreproduksjon. Mikroorganismer som er blitt identifisert som Bacillus coagulans er også naturlige produsenter av melkesyre som kunne være ytterligere genetisk modifisert for å forbedre lav pH-melkesyreproduksjon.

I tillegg kan ekstremeofile organismer fra familien Archea tolerere ekstremt lav pH og høye temperaturer. Genetisk modifisering av utvalgte arter fra denne familien kunne tilveiebringe en melkesyreproduserende stamme.

4. Genetiske aspekter

Et nukleinsyremolekyl som koder et polypeptid som har enzymatisk aktivitet kan identifiseres og oppnås ved anvendelse av en hvilken som helst metode. For eksempel kan standard nukleinsyresekvensteknikker og programvare som oversetter nukleinsyresekvensene til aminosyresekvenser basert på den genetiske koden anvendes for å bestemme om en spesiell nukleinsyre har noen sekvens-homologi med kjente enzymatiske polypeptider. Sekvensinnretningsprogramvare slik som MEGALIGN<®> (DNASTAR, Madison, WI, 1997) kan anvendes for å sammenligne forskjellige sekvenser. I tillegg kan nukleinsyremolekyler som koder kjente enzymatiske polypeptider muteres ved anvendelse av vanlige molekylære kloningsteknikker (for eksempel seteutledede mutageneser). Mulige mutasjoner omfatter, uten begrensning, utelatelser, innsettinger og basesubstitusjoner, samt kombinasjoner av utelatelser, innsettinger og basesubstitusjoner. Videre kan nukleinsyre- og aminosyredatabaser (for eksempel GenBank<®>) anvendes for å identifisere en nukleinsyresekvens som koder et polypeptid som har enzymatisk aktivitet. I korte trekk kan en hvilken som helst aminosyresekvens som har noe homologi med et polypeptid som har enzymatisk aktivitet eller enhver nukleinsyresekvens som har noe homologi med en sekvens som koder et polypeptid som har enzymatisk aktivitet, anvendes som en forespørsel for søk i GenBank<®>. De identifiserte polypeptidene kan deretter analyseres for å bestemme om de utviser enzymatisk aktivitet eller ikke.

Nukleinsyremolekyler som koder et polypeptid som har enzymatisk aktivitet kan identifiseres og oppnås ved anvendelse av vanlige molekylære klonings- eller kjemiske nukleinsyresynteseprosedyrer og -teknikker, omfattende PCR. PCR refererer til en prosedyre eller teknikk hvor sluttnukleinsyre er amplifisert på en måte lik den beskrevet i U.S. patent nr. 4 683 195, og påfølgende modifiseringer av prosedyren beskrevet deri. Generelt er sekvensinformasjon fra endene av det aktuelle området eller utenfor anvendt for å utforme oligonukleotidprimere som er identiske eller lik i sekvens med motstående tråder av et potensielt templat som skal amplifiseres. Ved anvendelse av PCR kan en nukleinsyresekvens amplifiseres fra RNA eller DNA. For eksempel kan en nukleinsyresekvens isoleres ved PCR-amplifisering fra totalt cellulært RNA, totalt genomisk DNA og cDNA så vel som fra bakteriofagsekvenser, plasmidsekvenser, viralsekvenser og lignende. Ved anvendelse av RNA som en templatkilde, kan revers transkriptase anvendes for å syntetisere komplementære DNA-tråder.

Videre kan nukleinsyrehybridiseringsteknikker anvendes for å identifisere og oppnå et nukleinsyremolekyl som koder et polypeptid som har enzymatisk aktivitet. I korte trekk kan ethvert nukleinsyremolekyl som koder et kjent enzymatisk polypeptid eller fragment derav anvendes som en prøve for å identifisere et lignende nukleinsyremolekyl ved hybridisering under forhold av moderat til høy stringens. Slike lignende nukleinsyremolekyler kan deretter isoleres, sekvenseres og analyseres for å bestemme om det kodede polypeptidet har enzymatisk aktivitet.

Hybridisering kan utføres ved Southern eller Northern analyse for å identifisere henholdsvis en DNA- eller RNA-sekvens som hybridiserer en prøve. Prøven kan være merket med et radioisotop slik som <32>P, et enzym, digoksygenin eller ved biotinylering. DNA eller RNA som skal analyseres kan være elektroforetisk separert på en agarose- eller polyakrylamidgel, overført til nitrocellulose, nylon eller et annet egnet membran, og hybridisert med prøven ved anvendelse av standardteknikker som er vel kjent innen fagområdet slik som de beskrevet i avsnitt 7.39-7.52 i Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY. En prøve er typisk minst ca. 20 nukleotider i lengde. For eksempel kan en prøve tilsvarende en 20 nukleotidsekvens som koder en pattedyrcitratlyase anvendes for å identifisere et nukleinsyremolekyl som koder et soppolypeptid som har sitronlyaseaktivitet. I tillegg kan det anvendes prøver lengre eller kortere enn 20 nukleotider.

Enhver metode kan anvendes for å innføre et eksogent nukleinsyremolekyl i en celle. Mange metoder for innføring av nukleinsyre i gjærceller er vel kjent for fagfolk. For eksempel er transformasjon, elektroporering, konjugasjon og fusjon av protoplaster vanlige metoder for innføring av nukleinsyre inn i gjærceller. Det vises for eksempel til Ito et al., J. Bacterol. 153: 163-168 (1983); Durrens et al., Curr. Genet. 18: 7-12 (1990); og Becker and Guarente, Methods in Enzymology 194: 182-187 (1991).

Det er viktig å legge merke til at det eksogene nukleinsyremolekylet inneholdt inne i en gjærcelle ifølge oppfinnelsen kan opprettholdes inne i cellen i en hvilken som helst form. For eksempel kan eksogene nukleinsyremolekyler være integrert inn i genomet til cellen eller opprettholdt i en episomal tilstand. Med andre ord kan en celle ifølge oppfinnelsen være en stabil eller transient transformant. I tillegg kan gjærcellene beskrevet her inneholde en enkel gjenpart eller flere gjenparter (for eksempel ca. 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 eller 150 gjenparter) av et spesielt eksogent nukleinsyremolekyl som beskrevet ovenfor.

Metoder for å uttrykke en aminosyresekvens fra et eksogent nukleinsyremolekyl er vel kjent for fagfolk på området. Slike metoder omfatter, uten begrensning, konstrukt av en nukleinsyre slik at et regulerende element fremmer ekspresjonen av en nukleinsyresekvens som koder et polypeptid. Typisk er regulerende elementer DNA-sekvenser som regulerer ekspresjonen av andre DNA-sekvenser ved transkripsjonsnivået. Således omfatter regulerende elementer, uten begrensning, promotorer, forsterkere og lignende. Dessuten er metoder for å uttrykke et polypeptid fra et eksogent nukleinsyremolekyl i gjær velkjent for fagfolk. For eksempel er nukleinsyrekonstrukter som er i stand til å uttrykke eksogene polypeptider innen Kluyveromyces vel kjente. Det vises for eksempel til U.S. patent nr. 4 859 596 og 4 943 529.

Som beskrevet her kan gjærceller inneholde et eksogent nukleinsyremolekyl som for eksempel koder for et polypeptid som har enzymatisk aktivitet som fører til dannelsen av et organisk produkt. Metoder for å identifisere celler som inneholder eksogene nukleinsyrer er vel kjente for fagfolk. Slike metoder omfatter, uten begrensning, PCR og nukleinsyrehybridiseringsteknikker slik som Northern og Southern analyse. I noen tilfeller kan immunhistokjemi og biokjemiske teknikker anvendes for å bestemme om en celle inneholder en spesiell nukleinsyre ved å detektere ekspresjonen av det kodede enzymatiske polypeptidet kodet av det spesielle nukleinsyremolekylet. For eksempel kan et antistoff som har spesifisitet for et kodet enzym anvendes for å bestemme om én spesiell inneholder det kodede enzymet eller ikke. Videre kan biokjemiske teknikker anvendes for å bestemme om en celle inneholder et spesielt nukleinsyremolekyl som koder et enzymatisk polypeptid ved å detektere et organisk produkt produsert som et resultat av ekspresjonen av det enzymatiske polypeptidet. For eksempel kan deteksjon av laktat etter innføring av et eksogent nukleinsyremolekyl som koder et polypeptid som har laktatdehydrogenaseaktivitet inn i en gjærcelle som ikke normalt uttrykker et slik polypeptid, indikere at gjærcellen ikke bare inneholder det innførte eksogene nukleinsyremolekylet men også uttrykker det kodede enzymatiske polypeptidet fra det innførte eksogene nukleinsyremolekylet. Metoder for å detektere spesifikke enzymatiske aktiviteter eller nærværet av spesielle organiske produkter er vel kjente for fagfolk. For eksempel kan nærværet av laktat bestemmes som beskrevet andre steder. Det vises til Witte et al., J. Basic Microbiol. 29: 707-716 (1989).

Uttrykket "rekombinasjonssekvens" som anvendt her refererer til enhver nukleinsyresekvens som korresponderer med en genomisk sekvens funnet inne i en celle. Rekombinasjonssekvensene beskrevet her kan anvendes for å lede rekombinasjonsutfall under genereringen av utstøterorganismer. Med andre ord kan en rekombinasjonssekvens anvendes for spesifikt å oppsplitte en lokalitet inneholdende en nukleinsyresekvens som koder et spesielt enzym. Uttrykket "utvalgt sekvens" som anvendt her omfatter enhver nukleinsyresekvens. Typisk koder en utvalgt sekvens et polypeptid som har enzymatisk aktivitet som fører til dannelsen av et organisk produkt inne i en celle. Således kan nukleinsyrekonstruktene ifølge oppfinnelsen anvendes for å utstøte en endogen enzymaktivitet og tilføre en eksogen enzymaktivitet i et enkelt trinn. I de fleste tilfeller er den valgte sekvensen innenfor rekombinasjonssekvensen slik at den valgte sekvensen er flankert på hver ende av rekombinasjonssekvensen.

5. Organisk produktproduksjon og dvrkningsmetoder

Oppfinnelsen angår metoder for å produsere organiske produkter ved anvendelse av mikroorganismer. Slike metoder omfatter tilveiebringelse av mikroorganismer og

dyrking av tilveiebrakte mikroorganismer med dyrkningsløsning slik at et organisk produkt (for eksempel glyserol, akrylat, xylose, askorbat, laktat, citrat, isocitrat, a-ketoglutarat, succinyl-CoA, succinat, fumarat, malat og oksaloacetat) produseres. I generelle termer kan dyrkningsløsningen og/eller dyrkningsforhold klassifiseres i en av to kategorier: de som fremmer cellulær respirasjon og/eller produksjonen av biomasse og de som reduserer cellulær respirasjon. Typisk er dyrkningsløsningen og/eller dyrkningsforholdene som fremmer cellulær respirasjon anvendt i situasjoner hvor rask vekst er nødvendig, eller hvor det organiske produktet som skal produseres ikke kan produseres uten cellulær respirasjon. Slike organiske produkter kan omfatte, uten begrensning, Krebs-syklusprodukter. På den annen side er dyrkningsløsning og/eller dyrkningsforhold som reduserer cellulær

respirasjon anvendt i situasjoner hvor rask vekst ikke er nødvendig eller ikke er ønskelig, eller hvor det organiske produktet som skal produseres kan produseres uten cellulær respirasjon. Slike organiske produkter omfatter, uten begrensning, laktat, akrylat og xylose. Som anvendt her betyr uttrykket "fremme cellulær respirasjon" eller "fremme biomasseproduksjon" under henvisning til et dyrkningsforhold, at celledyrkningsforholdene er opprettholdt slik at karbonkilden inne i dyrkningsløsningen hovedsakelig er metabolisert ved oksiderende respirasjon eller for å produsere biomasse. Som anvendt her refererer uttrykket "biomasse" til organismens tørrvekt. Som anvendt her betyr uttrykket "hovedsakelig metabolisert for å produsere biomasse" at minst ca. 0,3 g biomasse produseres pr. gram karbonkilde (i formen av karbohydrat) forbrukt (for eksempel minst 0,4, 0,45, 0,5 eller 0,6 g biomasse). Generelt produseres mellom ca. 0,3 til ca. 0,6 g biomasse pr. gram karbonkilde. Metoder for å bestemme mengden av biomasse (celletørrvekt) i en kultur er kjent og omfatter for eksempel metodene beskrevet av Postma et al., "Enzymic analysis of the Crabtree effect in glucose-limited chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae," Appl. Environ. Microbiol, 53, 468-477 (1989); og Kiers et al., "Regulation of alcoholic fermentation in batch and chemostat cultures of Kluyveromyces laclis CBS 2359", Yeast, 14, 459-469 (1998). Metoder for å bestemme mengden av karbonkilde forbrukt er kjent og omfatter for eksempel HPLC-metodikker.

Det skal bemerkes at effektivitet av karbonkildebenyttelse kan avhenge av karbonkilden og organismen. Mens en kompleks vekstløsning som omfatter karbonkilder forskjellig fra karbohydratet kan anvendes, refererer mengden av biomasse produsert pr. gram karbonkilde bare til mengden av biomasse produsert pr. gram karbohydratkarbonkilde forbrukt.

Generelt kan dyrkningsløsning inneholdende en inhibitor av cellulær respirasjon (for eksempel antimycin A, cyanid og azid) redusere cellulær respirasjon, mens fraværet av slike inhibitorer kan fremme cellulær respirasjon. På lignende måte kan anaerobe dyrkningsforhold redusere cellulær respirasjon, mens aerobe dyrkningsforhold kan fremme cellulær respirasjon. Et aerobt forhold er ethvert forhold hvor oksygen innføres eller forekommer naturlig og fungerer som et substrat for den respiratoriske veien. Generelt refererer uttrykket "aerob" til dyrkningsforhold hvor dyrkningsløsningen er opprettholdt under en luftstrøm på minst 0,1 VVM (volum luft/volum væske/minutt) (for eksempel større enn 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 1,5 eller 2,0 VVM). Hvis en gass forskjellig fra luft anvendes, så reguleres det nominelle VVM til en luftekvivalent basert på gassens oksygeninnhold. Alternativt kan "aerob" være definert som en dyrkningsløsning som har et oppløst oksygeninnhold på minst 2 % (for eksempel minst 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75 eller 80 %) i forhold til mengden tilstede ved mettede forhold med luft ved atmosfærisk trykk.

Et anaerobt forhold er ethvert forhold hvor oksygen er formålstjenlig eller naturlig gjort i alt vesentlig utilgjengelig for den respiratoriske veien, som for eksempel fører til produksjonen av et redusert produkt slik som etanol. Forhold hvor dyrkningsløsning generelt har et oppløst oksygen(DO)-innhold på mindre enn ca. 2,0 % (for eksempel mindre enn ca. 1,5, 1,0 eller 0,5 %, eller lik ca. 0 %), er ansett å være et anaerobt forhold. På lignende måte er et forhold som har en VVM (volum luft/volum væske/minutt) mindre enn ca. 0,1 (for eksempel mindre enn ca. 0,05 eller lik ca. 0) ansett å være et anaerobt forhold. Typisk refererer uttrykket "luft" som anvendt her med hensyn til VVM til luft slik som den som eksisterer i atmosfæren. Andre dyrkningsforhold som kan påvirke cellulær respirasjon omfatter, uten begrensning, pH, temperatur og nærværet av spesielle karbonkilder (for eksempel glukose). Det er viktig å legge merke til at noen dyrkningsløsninger og/eller dyrkningsforhold som fremmer cellulær respirasjon innenfor en gjærart kan redusere cellulær respirasjon innenfor andre arter. For eksempel reduserer nærværet av glukose i dyrkningsløsning cellulær respirasjon i gjærceller som har en crabtree-positiv fenotype mens det samtidig har liten eller ingen effekt på cellulær respirasjon i gjærceller som har en crabtree-negativ fenotype.

Styrt manipulasjon av dyrkningsforhold under en kommersiell produksjon kan være et viktig trinn for å oppnå optimale nivåer av et ønsket organisk produkt som beskrevet her. Typisk er en gjærcelle innenfor rammen av oppfinnelsen dyrket under dyrkningsforhold som fremmer cellulær respirasjon for å produsere en signifikant celletetthet. For eksempel kan gjærceller plasseres i et dyrkningskar og gi en overflod av glukose og oksygen. Typisk under forhold som fremmer cellulær respirasjon er doblingstiden for mikroorganismene tilveiebrakt her mindre enn ca. 10 timer (for eksempel mindre enn ca. 8, 5 eller 3 timer). Straks cellene når en signifikant tetthet, kan dyrkningsforholdene endres til forhold som reduserer cellulær respirasjon slik at et organisk produkt som ikke krever cellulær respirasjon produseres. For eksempel kan gjærcellene overføres til et dyrkningskar og gis en overflod av glukose, men ikke oksygen. I dette tilfellet kan styrt manipulering av dyrkningsforholdene slik at de endres fra aerobe til anaerobe produsere optimale nivåer av et ønsket organisk produkt. Alternativt kan i noen tilfeller cellene dyrkes bare under forhold som fremmer cellulær respirasjon, slik at et organisk produkt som krever cellulær respirasjon produseres. Det skal bemerkes at cellemassen i produksjonskaret typisk er større enn ca. 2 g/l (for eksempel større enn ca. 4, 6 eller 8 g/l).

Under dyrkning kan temperaturen være høyere enn ca. 35°C (for eksempel høyere enn ca. 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 eller 45°C). I tillegg kan dyrknings-løsningen være væske. Dyrkningsløsningen inneholder typisk en karbonkilde. Generelt omfatter karbonkilden karbohydrat inneholdende råmaterialer. Typisk inneholder også næringsløsningene en nitrogenkilde. Fortrinnsvis omfatter nitrogenkilden en kombinasjon av organiske og uorganiske nitrogenholdige forbindelser.

I en driftsmetode kan det være ønskelig å fylle et stort fermenteringskar med en dyrkningsløsning omfattende alle de næringsstoffer som er nødvendige og alt karbohydratet, tilstrekkelig både for biomasseproduksjon og for produksjonen av det ønskede produktet. Karet kan drives under forhold slik at biomasseproduksjon fremmes innledningsvis, for eksempel ved å tilveiebringe aerobe forhold og deretter endre til anaerobe forhold for produksjonen av det ønskede produktet.

I en alternativ driftsmetode anvendes et mindre kar for biomasseproduksjon med et høyt nivå av næringsstoffer og tilstrekkelig karbohydrat til å produsere for eksempel ca. 100 g/l biomasse. Innholdene i dette karet kan så overføres til et større kar inneholdende en andre dyrkningsløsning som inneholder mindre næringsstoffer, for eksempel bare glukose som en karbonkilde eller en annen karbohydratkarbonkilde i vann. Dette karet kan drives under anaerobe forhold for produksjonen av det ønskede organiske produktet. Biomassevekst reduseres på grunn av det reduserte nivået av næringsstoffer og de anaerobe forholdene.

I en foretrukket utførelsesform er næringsløsningene holdt til bare de påkrevde materialene for å forenkle utvinning av det ønskede produktet. Anvendelse av aerob vekst kan muliggjøre anvendelse av en forenklet løsning i forhold til det som er nødvendig dersom vekst under anaerobe forhold var nødvendig. Mange av gjærene beskrevet her kan dyrkes under aerobe forhold på en løsning som bare består av sukker, en uorganisk nitrogenkilde, spormineraler og noen vitaminer.

Før tilsetning av organisk produkt til dyrkningsløsningen som et resultat av fermentering eller andre prosesser, har dyrkningsløsningen generelt en pH på mellom ca. 5,0 og 7,0. Etter hvert som organiske produkter slik som organiske syrer utsondres i mikroorganismens dyrkningsløsning, har imidlertid dyrknings-løsningens pH en tendens til å synke. Uttrykket "organisk pH" som anvendt her, refererer til dyrkningsløsningens pH som tilskrives organiske forbindelser til stede i løsningen slik som karboksylater, for eksempel melkesyre. Uttrykket "uorganisk pH" som anvendt her, refererer til pH tilskrevet uorganiske forbindelser slik som HC1 og H2SO4. Dyrkningsløsningen kan ha en organisk pH-verdi på mindre enn ca. 3,0 (for eksempel mindre enn ca. 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 eller 1,5) eller en uorganisk pH-verdi mindre enn ca. 3,0 (for eksempel mindre enn ca. 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 eller 1,5). Enhver karbonkilde kan anvendes under dyrkningsprosedyren. For eksempel kan det anvendes løsning inneholdende et pentosekarbon (for eksempel ribose, arabinose, xylose og lyksose). I tillegg kan det anvendes løsning inneholdende et maisfiberhydrolysat. Et maisfiberhydrolysat kan ha en pH-verdi på mellom 2,0 og 6,5. Typisk inneholder et maisfiberhydrolysat glukose, xylose og arabinose. For eksempel kan et maisfiberhydrolysat inneholde ca. 40 g/l glukose, ca. 40 g/l xylose og ca. 20 g/l arabinose.

For masseproduksjonsprosesser kan følgende metoder anvendes. Først en stor tank (for eksempel en ca. 200-, 400,- 800,- eller større tank (i liter) (tilsvarende hhv. 50-, 100-, 200- eller større tank (i gallon)) inneholdende passende dyrkningsløsning med for eksempel heksose- og/eller pentosekarboner inokuleres med en spesiell mikroorganisme. Etter inokulering kan dyrkningsforholdene manipuleres slik at karbonkilden anvendes hovedsakelig for å produsere biomasse. For eksempel kan dyrkningsløsningen manipuleres til å ha en pH-verdi på ca. 7,0, en temperatur på ca. 35°C og et oppløst oksygeninnhold som danner et aerobt miljø over hele tanken. Det skal bemerkes at det ønskede organiske produktet kan produseres under denne biomasseproduksjonsfasen. Straks en tilstrekkelig biomasse oppnås, kan løsningen inneholdende mikroorganismene overføres til den andre tanken. Denne andre tanken kan være av en hvilken som helst størrelse. For eksempel kan den andre tanken være større, mindre eller være av samme størrelse som den første tanken. Typisk er den andre tanken større enn den første slik at ytterligere dyrkningsløsning kan tilsettes til løsningen fra den første tanken. I tillegg kan dyrkningsløsningen i den andre tanken være det samme som, eller forskjellig fra, det anvendt i den første tanken. For eksempel kan den første tanken inneholde løsning med xylose og arabinose, mens den andre tanken inneholder løsning med glukose.

Straks overføring er utført kan dyrkningsforholdene i den andre tanken manipuleres slik at karbonkilden anvendes hovedsakelig for å produsere organisk produkt, idet "organisk produkt" blant annet omfatter pyruvat-avledede produkter og karbon-dioksid (CO2) men omfatter ikke biomasse (dvs. celletørrvekt). Som anvendt her betyr uttrykket "hovedsakelig produserer et utvalgt organisk produkt" eller et "utvalgt pyruvat-avledet produkt" under henvisning til dyrkningsforhold, at karbonkilden i dyrkningsløsningen metaboliseres, typisk ved en fermenteringsprosess (skjønt ikke nødvendig) for å danne minst 0,5 g organisk produkt pr. gram karbonkilde forbrukt (for eksempel minst 0,6, 0,75 eller 0,8 g organisk produkt). Metoder for å bestemme mengden av organisk produkt produsert og/eller karbonkilde forbrukt er kjent og omfatter for eksempel HPLC.

Som beskrevet tidligere kan effektivitet av karbonkildebenyttelse variere avhengig av substratet og organismen. Mens en kompleks vekstløsning som omfatter karbonkilder forskjellige fra karbohydrat (for eksempel aminosyrer) kan anvendes, refererer mengden av organisk produkt eller pyruvat-avledet produkt produsert pr. gram karbonkilde bare til mengden av organisk produkt eller pyruvat-avledet produkt produsert pr. gram karbohydratkarbonkilde forbrukt. Ved dette trinnet produseres fortrinnsvis ikke mer enn 0,3 g biomasse pr. gram karbonkilde (for eksempel ikke mer enn 0,2, 0,1 eller 0,05 g biomasse).

For eksempel kan dyrkningsløsningen manipuleres til å ha et oppløst oksygeninnhold som skaper et anaerobt miljø i hele tanken, eller til å inneholde en inhibitor av cellulær respirasjon. I tillegg kan dyrkningsløsningen manipuleres slik at en spesiell pH-verdi (for eksempel en sur, nøytral eller basisk pH-verdi) opprettholdes. Alternativt kan kulturens pH justeres periodisk uten å opprettholde noen spesiell pH-verdi. Når man produserer en organisk syre, opprettholdes dyrknings-løsningens pH-verdi typisk over minst ca. 1,5 (for eksempel minst ca. 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 eller 7,0). Etter hvert som mikroorganismen nedbryter de tilveiebrakte karbonkildene, vil temperaturen i tanken øke. Således kan dyrkningsløsningen manipuleres slik at en spesiell temperatur opprettholdes. Alternativt kan dyrkningsløsningens temperatur justeres periodisk uten å opprettholde noen spesiell temperatur. Typisk opprettholdes en temperatur som er lavere enn ca. 35°C (for eksempel lavere enn ca. 34, 33, 32, 31 eller 30°C) når det anvendes varmefølsomme mikroorganismer, mens en temperatur som er lavere enn 45°C (for eksempel lavere enn ca. 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36 eller 35°C) opprettholdes ved anvendelse av varmeufølsomme mikroorganismer. Det skal bemerkes at biomasse kan produseres under denne organiske produktproduksjons-fasen. I tillegg kan dyrkningsforholdene i den andre tanken endres fra de som fremmer produktproduksjon til de som fremmer biomasseproduksjon og omvendt, en eller flere ganger. For eksempel kan dyrkningsforholdene i den andre tanken være anaerobe mesteparten av tiden med korte pulser av oppløst oksygen slik at aerobe forhold eksisterer periodisk.

I en annen metode kan de anaerobe dyrkningsforholdene modifiseres for å øke den metabolske energien til de dyrkede mikroorganismene, for eksempel ved tilsetningen av en terminal elektronakseptor. Som anvendt her refererer uttrykket "metabolsk energi" til energien (uttrykt ved ATP) utledet av organismen fra en energikilde (slik som en karbonkilde). Under noen forhold er mengden av metabolsk energi oppnådd av organismen fra metabolismen av en karbonkilde større enn mengden av energi oppnådd fra den samme karbonkilden under forskjellige forhold.

Levende celler er i høy grad ordnet og må skape orden seg imellom for å overleve og vokse. For å opprettholde orden inne i organismen, skjer det hele tiden tusenvis av forskjellige kjemiske reaksjoner inne i organismen. For eksempel trenger celler energi for biosyntetiske reaksjoner slik som DNA-, RNA- og proteinpolymerisa-sjonsreaksjoner og dannelse av metaboliske produkter. Celler trenger også energi for å bringe substrater inn i cellen, holde metabolitter inne i cellen, opprettholde en passende saftspenning og intern pH, og for motilitet eller bevegelighet.

Fordi energi ikke kan skapes eller ødelegges, krever cellen en innførsel av energi fra omgivelsene for å opprettholde orden. Energi tilføres generelt fra omgivelsene i form av elektromagnetisk stråling eller kjemisk energi. Energien oppnådd fra omgivelsene utnyttes av cellen anvendt ved en eller to generelle biokjemiske mekanismer: substratnivåfosforylering og elektrontransport.

Generelt produseres under anaerobe forhold ATP (den "cellulære sirkulasjonen" for energi) ved substratnivåfosforylering. I substratnivåfosforylering frigjøres energi fra kjemiske bindinger og lagres hovedsakelig i form av ATP.

Et eksempel på substratnivådannelse er omdannelsen av glukose til pyruvat via glykolyse:

Pyruvat kan deretter omdannes til melkesyre:

Nettoenergien produsert ved den ovennevnte transformasjonen er ekvivalent med 2

ATP.

Pyruvat kan ytterligere bearbeides til trikarboksylsyre(TCA)-syklus og generere ytterligere energi og hydrogenatomer:

Nettoreaksjonen for glukoserespirasjon:

Ved substratnivåfosforylering vil således den fullstendige respirasjonen av glukose til CO2 tilveiebringe en nettoenergi ekvivalent med 4 ATP og 24 hydrogenatomer.

I "elektrontransport" utnyttes oksidasjon-reduksjons-potensialene til forbindelsene som utgjør elementer av en "elektrontransportkjede" slik at hvert element kan reduseres ved den reduserte formen av det foregående elementet. Således kan reduksjon av energi, som elektroner, strømme gjennom kjeden av bærermolekyler til en terminal elektronakseptor slik som oksygen (O2), nitrat (NO3') og fumarat. Tilsetning av en terminal elektronakseptor slik som oksygen, nitrat eller fumarat til en dyrkningsløsning kan utstyre mikroorganismen med økt metabolsk energi (for eksempel økt ATP-produksjon for den samme mengden av karbonkilde forbrukt). Oksygen er den mest foretrukne terminale elektronakseptoren.

Hvis for eksempel oksygen anvendes som en terminal elektronakseptor, kan hydrogen bearbeides gjennom elektrontransportkjeden og utstyre cellen med et ytterligere 1,5 ATP pr. hydrogenatom og 3 ATP pr. oksygenatom. Generelt kan mengden av metabolsk energi bestemmes ved å måle forholdet mellom mengden av oksygen forbrukt og mengden av glukose forbrukt. Tabell 1 viser forventede maksimale og minimale forbedringer av energiutbytte (mol ATP pr. mol glukose) når oksygen tilsettes under produksjon som en funksjon av produktutbyttet som synker som en følge av tap av pyruvat til TCA-syklus (og følgelig til respirasjon). Maksimal % forbedring ble beregnet ved å anta et P/O-forhold på 3 mens minimal % forbedring ble antatt som et P/O-forhold på 0,5. Tabell 2 viser den estimerte maksimale mengde oksygen forbrukt pr. mol glukose forbrukt. Tilsetning av oksygen kan fremme minimal vekst som vil avsondre karbon til biosyntese og som etterlater en liten mengde av karbon tilgjengelig for respirasjon (og derfor oksygenbenyttelse). For å forbedre den metabolske energien til mikroorganismene i cellekulturen, kan oksygen således tilsettes til cellekulturen som en terminal elektronakseptor. Mens det maksimale molutbyttet av melkesyre fra glukose er 2 mol laktat pr mol glukose og molutbyttet av ATP fra glukose er 2 mol ATP pr. mol glukose, muliggjør tilsetning av oksygen som en terminal elektronakseptor noe av pyruvatet til å bli kanalisert til sitronsyre (TCA)-syklusen hvor den omdannes til CO2 og energi. Ved at en terminal elektronakseptor således tilføres, "økes den metabolske energien" til mikroorganismen.

Divertering av pyruvat til TCA-syklusen vil ha en tendens til å redusere mengden av andre pyruvat-avledede produkter (så som melkesyre) produsert. For eksempel kan en 10 % reduksjon i utbytte resultere i genereringen av 2,6 ganger mer metabolsk energi for mikroorganismen, en 20 % reduksjon i utbytte kan resultere i genereringen av 4,2 ganger mer metabolsk energi for mikroorganismen, og en 50 % reduksjon i utbytte kan resultere i genereringen av 9 ganger mer metabolsk energi for mikroorganismen.

Det er antatt at i de senere trinnene i en prosess, når høye nivåer av metabolske produkter slik som melkesyre er til stede, kan cellen kreve mer metabolsk energi for å opprettholde funksjon.

Således kan det være ønskelig å eksponere mikroorganismene i en anaerob dyrkningsløsning for korte pulser av oppløst oksygen. Fortrinnsvis resulterer den "korte pulsen av oppløst oksygen" i at dyrkningsløsningen har en oppløst oksygenkonsentrasjon på ikke mer enn 0,5 %, fortrinnsvis mellom ca. 0,1 og 0,5 %. Alternativt kan veksthastigheten eller den cellulære opprettholdelsen av mikroorganismene under anaerob fermentering økes ved tilsetningen av andre terminale elektronakseptorer slik som nitrat eller fumarat. Oksygenet tilsettes ved et nivå som er akkurat tilstrekkelig til å øke den metabolske energien til mikroorganismen mens den opprettholder produktivitet ved et ønsket nivå. Det må utvises forsiktighet for å unngå ytterligere utbyttetap. Denne teknikken kan også anvendes for å bidra til å forbruke restsukkere for derved å ytterligere forenkle utvinningsprosesser.

6. Organiske produktrensemetoder

Straks det er produsert, kan enhver metode anvendes for å isolere det ønskede produktet. For eksempel kan vanlige separasjonsteknikker anvendes for å fjerne biomassen fra næringsløsningen, og vanlige isolasjonsprosedyrer (for eksempel ekstraksjon, destillasjon og ioneutbytteprosedyrer) kan anvendes for å oppnå det organiske produktet fra den mikroorganismefrie næringsløsningen. Det vises for eksempel til U.S. patent nr. 4 275 234; U.S. patent nr. 5 510 526; U.S. patent nr. 5 831 122; U.S. patent nr. 5 641 406; og internasjonal patentsøknad nr. WO 93/00440.1 tillegg kan det ønskede organiske produktet isoleres mens det blir produsert, eller det kan isoleres fra næringsløsningen etter at produktproduksjons-fasen har blitt terminert. Det er viktig å legge merke til at dyrkningsforholdene i den andre tanken kan manipuleres slik at isolasjonsprosessen bedres. For eksempel kan pH og temperaturen i den andre tanken manipuleres slik at det ønskede organiske produktet felles ut av løsningen, eller er i en form som er mer mottakelig for isolasjon. Spesielt kan pH-verdien av organiske syrer felles ut av løsningen når næringsløsningens pH er mindre enn pKa-verdien for den organiske syren. For eksempel kan dyrkningsforholdene ved produksjon av glutaminsyre være slik at pH er mindre enn 2,19, som er pKa-verdien for glutaminsyre. Manipulering av næringsløsningens pH, temperatur og innhold kan således lette organisk produktisolasjon. I tillegg kan spesielt genetisk manipulert gjær velges og/eller spesifikke dyrkningsforhold kan manipuleres slik at et hvilket som helst biprodukt i næringsløsningen er slik at det ikke interfererer med utvinningen av det ønskede organiske produktet.

Det vil forstås at metodene og materialene beskrevet her kan tilpasses og anvendes i en hvilken som helst type dyrkningsprosess omfattende, uten begrensning, prosessene vanligvis referert til som "kontinuerlig fermenterings-" og "sats-fermenterings-" prosesser. I tillegg kan mikroorganismene anvendt under en produksjonsprosess utvinnes og anvendes på nytt i påfølgende produksjons-prosesser. For eksempel kan mikroorganismene på nytt anvendes flere ganger for å produsere et ønsket organisk produkt. Videre kan enhver karbonkilde anvendes. For eksempel kan allose, altrose, glukose, mannose, gulose, jodose, galaktose, talose, melibiose, sukrose, fruktose, raffinose, stachyose, ribose, arabinose, xylose, lyksose, stivelser slik som maisstivelse og hvetestivelse og hydrolysater slik som maisfiberhydrolysater og andre celluloseholdige hydrolysater anvendes som en karbonkilde for produksjonen av enten biomasse eller det ønskede organiske produktet. Dessuten kan enhver løsning anvendes. For eksempel kan standard-dyrkningsløsninger (for eksempel gjær-minimalløsning og YP-løsning (gjærekstrakt 10 g/l, peptonnæringsløsning 20 g/l)) samt løsninger slik som maisvann (corn steep water) og maisvæske (corn steep liquor) kan anvendes.

En stor fordel med den foreliggende oppfinnelsen er at de foretrukne mikroorganismene, spesielt når de dyrkes under aerobe forhold, kan benytte minimale løsninger. Den anaerobe produksjonen vil typisk ikke kreve ytterligere næringsstoffer, slik at sluttproduktet kan isoleres fra en relativt ren fermenterings-næringsløsning ved anvendelse av en hvilket som helst av en rekke separasjonsteknikker. Væske-væske-ekstraksjon er en vel kjent teknikk for separasjonen av organiske syrer fra fermenteringsnæringsløsninger, og fører til betydelig rensing. Med den foreliggende oppfinnelsen er det antatt at enklere, mindre kostbare, mindre energikrevende systemer også kan være nyttige.

I en utførelsesform anvender den foreliggende oppfinnelsen genetisk modifisert gjær som har en crabtree-negativ fenotype i en prosess av kjedetypen (train-type) som induserer et "skifte" i den metabolske veien etter at en kritisk celletetthet er blitt nådd og hvorved det er ønskelig å dramatisk øke den spesifikke produktiviteten av det ønskede organiske produktet. En typisk metode for å indusere det metabolske veiskiftet er å føre biomassen fra et svært utluftet kar til et stort sett anaerobt kar, noe som fører til at lite oksygen er tilstede. Det skal bemerkes at et vanlig karbohydrat (for eksempel glukose eller xylose) kan anvendes som karbonkilden under både vekstfasen og produksjonsfasen. Anvendelsen av en genetisk modifisert gjærcelle som har en crabtree-negativ fenotype kan være kritisk for denne utførelsesformens vellykkethet. I tillegg kan den spesifikke produktiviteten av det ønskede organiske produktet være kritisk for vellykkethet. Uttrykket "spesifikk produktivitet" som anvendt her reflekterer mengden av produkt produsert og er representert som antall gram av organisk produkt produsert pr gram biomasse (tørrvekt) pr time, dvs. g/(g<*>time). Typisk er den spesifikke produktiviteten for organiske produkter slik som laktat og akrylat større enn ca. 0,1 g/(g<*>time), for eksempel større enn ca. 0,2 g/(g<*>time), eller større enn ca. 0,5 g/(g<*>time). Ved å tilveiebringe en høy spesifikk produktivitet som beskrevet her kan energien som er påkrevet for celleopprettholdelse oppnås via den fermenter-ende produktveien og stort sett anaerobe forhold, i stedet for å være avhengig av utlufting for å generere høye mengder av energi via den respiratoriske veien. Det skal bemerkes at anaerobe kar stort sett er utluftet med en hastighet på ca. 0,1 VVM. Under visse produksjonssituasjoner vil det ikke anvendes noe utlufting. I tillegg er utbyttet (dvs. g organisk produkt/g karbonkilde forbrukt) i denne utførelsesformen typisk større enn ca. 70 vekt%, og produseres uten tilsetningen av karbonkilder slik som etanol og acetat. For å oppnå den spesifikke produktiviteten som er nødvendig for å generere den påkrevde energien for celleopprettholdelse, kan det i noen tilfeller være nødvendig å øke veien fra glukose til pyruvat i tillegg til å tilveiebringe de nødvendige enzymene for å produsere det ønskede produktet.

I en annen utførelsesform kan kjede-typeprosessene (train-type process) være utformet slik at bare det svært utluftede vekstkaret er utstyrt med steriliserings-mulighet. Det anaerobe produksjonskaret er typisk drevet ved temperaturer høyere enn ca. 35°C (for eksempel høyere enn 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 eller 45° C). Få vill-type-gjær vil være i stand til å overleve og konkurrere med den genetisk modifiserte gjæren ved slike temperaturer etterhvert som pH faller under produkt-produksjonen, spesielt ettersom de ikke vil ha en økt fermenteringsvei som kan generere energi for celleopprettholdelse. I tillegg kan gjæren konstrueres til å inneholde "drepeplasmider" som beskrevet her som kan forhindre gjær fra andre arter i å overleve.

Ved dyrking av gjærceller kan for eksempel en gjærcelle som har en crabtree-negativ fenotype dyrkes med dyrkningsløsning ved enten å ha en organisk pH-verdi på mindre enn ca. 3,0, eller som inneholder et maisfiberhydrolysat. Andre metoder for dyrking av gjærceller omfatter, uten begrensning, dyrking av gjærceller som har en crabtree-negativ fenotype ved en temperatur som er høyere enn ca. 35°C med dyrkningsløsning som enten har en uorganisk pH-verdi på mindre enn ca. 3,0, eller som inneholder et pentosekarbon eller maisfiberhydrolysat.

Videre tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille et organisk produkt. Denne prosessen omfatter dyrking av en mikroorganisme under dyrkningsforhold og endring av dyrkningsforholdene for å fremme produksjon av det organiske produktet. I denne prosessen kan mikroorganismen ha redusert pyruvatdekarboksylase-, alkoholdehydrogenase-, aldehyddehydrogenase- og/eller acetyl-CoA-syntaseaktivitet, og utviser en veksthastighet i fraværet av etanol og acetat som er minst ca. 30% (for eksempel ca. 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200% eller mer) av det observert i en korresponderende mikroorganisme som ikke har redusert pyruvatdekarboksylase-, alkoholdehydrogenase, aldehyddehydrogenase- og/eller acetyl-CoA-syntaseaktivitet. Typisk anvendes dyrkningsforhold som fremmer cellulær respirasjon i situasjoner hvor rask vekst er nødvendig, eller hvor det organiske produktet som skal produseres ikke kan produseres uten cellulær respirasjon, mens dyrkningsforhold som reduserer cellulær respirasjon anvendes i situasjoner hvor rask vekst ikke er nødvendig, eller hvor det organiske produktet som skal produseres kan produseres uten cellulær respirasjon.

EKSEMPLER

Eksempel 1 - Rekombinant plasmid pHES/ pSEH

0,5 (lg av plasmid pGAD424 beskrevet av Chien et al. { Proe. Nat' 1 Acad. Sei., 88(21): 9578-9582 (1991)) ble digerert (digested) med restriksjonsenzymet Hindlll. Den digererte blandingen ble separert ved gelelektroforese på en 0,8% agarosegel ved anvendelse av TBE-buffer. Et 5,9 kbp fragment ble så renset fra gelen som beskrevet i Sambrook et al., ( Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Et komplementært par av 92 bp syntetiske oligomerer med multiple restriksjonsenzym-gjenkjennelsesseter ble konstruert. Den første ble angitt som fwd hes oligo og har den følgende sekvensen:5'-CCCAAGCTTGAATTCCCCGGGGGATCCCTGCAGGGTACCACGCGTAGATC TACTAGTGCGGCCGCCTCGAGTCTAGAGGGCCCAAGCTTGGG-3' (SEQ ID

NO:l). Den andre ble angitt som comp hes oligo og har den følgende sekvensen: 5'-CCAAGCTTGGGCCCTCTAGACTCGAGGCGGCCGCACTAGTAGATCTACGC GTGGTACCCTGCAGGGATCCCCCGGGGAATTCAAGCTTGGG-3' (SEQ ID NO:2). 500 nmol av de to komplementære oligomerene ble avherdet (annealed) til hverandre ved koking i 10 minutter og gradvis avkjøling til romtemperatur. Den dobbelttrådede 92 bp DNA ble digerert med Hindlll og ombundet (ligated) til Hindlll-digerert 5,9 kbp pGAD424. Ombindingsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli DH10B (electromax celler, Life Technologies, Rockville, MD) ved elektroporese som beskrevet i Sambrook et al., { Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Rekombinant E. coli ble plettert (plated) på Luria-Bertani næringsløsningsplater, og celler inneholdende plasmid ble valgt ved anvendelse av 100 ug/ml av det antibiotiske ampicillinet. Plasmid DNA fra ampicillinresistent E. co//-kloner ble screenet for å oppnå de to plasmidene pHES og pSEH (figurer 1 og 2). De to plasmidene skiller seg fra hverandre i orienteringen av den syntetiske oligomeren med hensyn til alkoholdehydrogenase - ADH1-promotoren på vektoren.

Eksempel 2 - PCR- amplifisering av nukleinsyre som koder laktatdehydrogenase fra Lactobacillus helveticus og Pediococcus acidilactici

Genomisk DNA ble isolert fra overnatten-kulturer av Lactobacillus helveticus (ATCC 10797) og Pediococcus acidilactici (ATCC 25741) ved anvendelse av PUREGENE<®> genomisk DNA isolasjonskit (isolation kit)(Gentra systems, Minneapolis, MN). PCR-primere ble konstruert for å isolere laktatdehydrogenase-kodende nukleinsyre fra L. helveticus (lh-ldh-oligoer) og P. acidilactici (pa-ldh-oligoer) genomisk DNA. Disse primerne ble konstruert basert på de tilgjengelige gensekvensene for laktatdehydrogenase i Genbank-databasene, og har de følgende sekvensene: 5' lh-ldh, 5'-CCGGGATCCATGGCAAGAGAGGAAAAACCTC-3'

(SEQ ID NO:3); 3' lh-ldh, 5'-CCAAGATCTTTATTGACGAACCTTAACGCCAG-3' (SEQ ID NO:4); 5' pa-ldh, 5-CCGGGATCCATGTCTAATATTCAAAATCATCAAAAAG-3' (SEQ ID NO:5);

og 3' pa-ldh, 5'-CCAAGATCTTTATTTGTCTTGTTTTTCAGCAAG-3' (SEQ ID NO:6). Primerne ble optimalisert ved anvendelse av Primer Designer programvare oppnådd fra Sci-ed software (Durham, NC). 1 |imol av det genomiske DNA ble anvendt sammen med 100 nmol av primere. Pfu DNA polymerase (New England Biolabs) ble anvendt for å PCR-amplifiserte laktatdehydrogenase (LDH) nukleinsyre som beskrevet i Sambrook et al., { Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)).

En lignende strategi er anvendt for å isolere L-laktatdehydrogenase-kodende nukleinsyre fra genomisk DNA fra mikroorganismer så som Bacillus sp., for eksempel Bacillus megaterium (ATCC 6458) eller Rhizopus oryzae (ATCC 76275) eller en hvilken som helst annen laktatproduserende organisme (omfattende mikroorganismer så som sopp og bakterier og multicellulære organismer så som pattedyr) eller fra vev fra en laktatproduserende organisme. Genomisk DNA isoleres fra en voksende kultur av organismen ved anvendelse av PUREGENE<® >genomisk DNA isolasjonskit (Gentra systems, Minneapolis, MN). Egnede PCR-primere er konstruert for å isolere den laktatdehydrogenase-kodende nukleinsyren basert på LDH-gensekvensene for disse artene tilgjengelige fra Genbank. Generelt anvendes 1 fimol av det genomiske DNA sammen med 100 nmol av de passende primerne. Pfu DNA-polymerase (New England Biolabs) eller en hvilken som helst annen egnet DNA-polymerase anvendes for å amplifisere laktatdehydrogenase (LDH) nukleinsyre fra det respektive genomiske DNA ved anvendelse av PCR-teknologi, for eksempel som beskrevet i Sambrook et al., { Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Alternativt isoleres laktatdehydrogenase-kodende nukleinsyre fra Kluyveromyces theromotolerans ATCC 52709, Trichoderma reesei ATCC 13631, Torulaspora pretoriensis ATCC 36245, eller en hvilken som helst annen laktatdehydrogenase-produserende organisme som anvender en hvilken som helst av de følgende metodologiene.

1) Et genomisk cDNA-bibliotek fra en av disse organismene er klonet inn i en standard E. co//-ekspresjonsvektor slik som pUC19 ved anvendelse av standardteknikker (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). En E. coli (ldh pfi) mutantstamme NZN111 (Bunch et al., (1997) "The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli," Microbiology, 143: 187-95) transformeres med dette biblioteket og cellene dyrkes under anaerobe forhold i M9-medium supplert med casaminosyre. Enhver E. coli som vokser under disse forholdene koder enten en laktatdehydrogenase eller er en revertant i ldh eller pfi. Positiver (kolonier som dannes under de anaerobe vekstforholdene) screenes

for LDH-aktivitet ved anvendelse av en kolorimetrisk assay av melkesyrespesifikt myk-agar overlag (LASSO) som er i stand til å skille mellom (L)-LDH og (D)-LDH (Witte et al. (/. Basic Microbiol. 29: 707-716 (1989)). Plasmid DNA fra kloner som man antar uttrykker L-laktatdehydrogenase blir deretter isolert og sekvensert.

2) K. thermotolerans ATCC 52709, T. reesei ATCC 13631 og Torulaspora pretoriensis ATCC 36245 er alle eukaryoter som produserer L-melkesyre når de blir dyrket under anaerobe forhold (Witte et al. ( J. Basic Microbiol. 29: 707-716

(1989)). Ifølge denne metoden dyrkes således minst en av disse stammene under anaerobe forhold for å indusere laktatdehydrogenaseenzymaktivitet. En cellefri ekstrakt blir så oppnådd ved anvendelse av standardmetoder og utsettes for kjente proteinrensestrategier for å isolere laktatdehydrogenaseenzymet. Metoder for å rense laktatdehydrogenase er kjent (Kelly et al., (1978) "Affinity chromatography of bacterial lactat dehydrogenases," Biochem J, 171(3): 543-7). Etter at proteinet er renset blir det delvis spaltet og sekvensert for å bestemme aminosyresekvensen. Denne aminosyresekvensen blir så anvendt for å konstruere degenererende primere for å isolere genet som koder laktatdehydrogenase fra det genomiske DNA.

Et eukaryotisk LDH, slik som det isolert fra K. thermotolerans eller Trichoderma reseei eller Torulaspora pretoriensis, kan fungere bedre (uttrykt ved transkripsjonseffektivitet, translasjonseffektivitet og/eller proteinaktivitet) i gjæren K. marxianus sammenlignet med LDH fra bakteriekilder så som Bacillus eller Lactobacillus. 3) Ved å anvende kjente eukaryotiske laktatdehydrogenasegensekvenser tilgjengelige fra Genbank, blir degenererte primere konstruert for å isolere genet for laktatdehydrogenase fra genomisk DNA av K. thermotolerans ATCC 52709, T. reesei ATCC 13631 eller Torulaspora pretoriensis ATCC 36245. Det konserverte NAD+-bindingssetet og pyruvatbindingssetet blant LDH-gensekvenser blir anvendt for å konstruere degenererte primere. 1 ^imol av genomisk DNA blir anvendt sammen med 100 nmol av primere. Pfu DNA-polymerase (New England Biolabs) eller en hvilken som helst annen egnet DNA-polymerase, blir anvendt for å amplifisere fragmenter av L+-laktatdehydrogenase (LDH) nukleinsyre ifølge kjente PCR-metoder, for eksempel de beskrevet i Sambrook et al., ( Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)).

Eksempel 3 - Kloning av L . helveticus og P . acidilactici inn i pCRII- vektor

PCR-amplifiserte LDH DNA-produkter ble ombundet med pCRII-vektorer (figurer 3 og 4) ved anvendelse av TA-kloningskit skaffet til veie fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Ombindingsblandingen ble deretter anvendt for å transformere E. coli DH10B ved anvendelse av fremgangsmåter beskrevet i Sambrook et al., ( Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). pCRII-vektorene tilført med kit sørget for rask kloning av PCR-produktene ifølge produsentens instruksjoner. pCRII-vektorene med LDH-genene fra L. helveticus og P. acidilactici er vist i figur 4.

Eksempel 4 - Rekombinant plasmid pLh ldh- HES/ pPa ldh- HES som har L . helveticus og P . acidilactici LDH- gener i pHES- vektor

pCRII-vektorene inneholdende LDH-gen fra L. helveticus og P. acidilactici ble digerert med de passende restriksjonsendonukleasene. pHES-vektoren ble på lignende måte digerert med de samme restriksjonsendonukleasene. En 1 kbp innsetning inneholdende LDH fra pCRII-vektorer ble så ombundet til 6,0 kbp pHES-vektoren ved å anvende T4 DNA-ligase som beskrevet i Sambrook et al., ( Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview,

NY (1989)). Ombindingsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli DH10B (electromax-celler, Life Technologies, Rockville, MD), og rekombinante kloner ble valgt for ampicillinresistens. DNA isolert fra rekombinante kloner ble analysert for å bekrefte pLh ldh-HES og pPa ldh-HES-vektorene (figur 5). Disse vektorene inneholder genene som koder LDH fra L. helveticus og P. acidilactici i pHES-vektoren under kontrollen av gjæralkoholdehydrogenasepromotoren (ADH1).

Eksempel 5 - Kloning av Bacillus sp .. Rhizopus oryzae . K . thermotolerans . Trichoderma reseei eller Torulaspora pretoriensis LDH- gen for ekspresjon ved anvendelse av Saccharomyces PDCl- genpromotor

Skjønt det er mulig å anvende laktatdehydrogenasepromotoren funnet i Rhizopus oryzae, K. thermotolerans, Trichoderma reseei eller Torulaspora pretoriensis for å kontrollere ekspresjon av et laktatdehydrogenasegen klonet i K. marxianus, kan PDC 1 -promotoren fra Saccharomyces cerevisiae anvendes for å kontrollere ekspresjon av det isolerte laktatdehydrogenasegenet. Saccharomyces cerevisiae glykolytiske promotorer har på vellykket måte blitt anvendt for å uttrykke gener i Kluyveromyces- stammer. (Gellissen og Hollenberg, (1997) "Application of yeasts in gene expression studies: a comparison of Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha and Kluyveromyces lactis — a review," Gene, 190(1): 87-97).

Tilsvarende blir PDC 1-promotoren fra Saccharomyces cerevisiae oppnådd ved å konstruere egnede oligomeriske primere ved anvendelse av Saccharomyces cerevisiae genomsekvensen, tilgjengelig i Genbank. PDCl-gensekvensen og 1 Kb-områdene som omgir PDC 1-genet er amplifisert ved PCR-teknologier. Det resulterende 4 Kb DNA-fragmentet inneholder både promotoren og terminatorene som kontrollerer PDCl-genekspresjon. Multiple restriksjonsenzymseter er inkludert mellom promotoren og terminatoren som kontrollerer PDCl-gen-ekspresjonen slik at en rekke LDH-gener kan innsettes under kontroll av PDC1-promotoren og terminatorene. 4 Kb DNA-fragmentet innsettes i en egnet vektor, slik som en pUC19-basert Saccharomyces cerevisiae eller E. coli shuttlevektor. LDH-genet innføres så i vektoren ved ett av de multiple kloningssetene under kontroll av promotoren og terminatorene slik at laktatdehydrogenasegenekspresjon kontrolleres av PDC 1-promotoren og terminatoren (figur 14). Alternativt kan andre Saccharomyces glykolytiske promotorer slik som de som kontrollerer ekspresjonen av Saccharomyces cerevisiae glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase eller fosfo-glyseratkinasegener anvendes på lignende måte for å uttrykke det klonede LDH-genet i K. marxianus.

Eksempel 6 - Amplifisering av lineære fragmenter av homolo<g>t DNA for genoppsplitting av pvruvatdekarboksylase

En 82 bp oligomerisk primer (5'kmPDClKo) ble konstruert slik at den inneholdt 51 bp identisk med 5'-enden til pyruvatdekarboksylasen (PDC) fra K. marxianus og 30 bp identisk til 5'-enden av ADH1-promotoren fra pHES-vektorer. Sekvensen av 5'KmPDClKo er som følger: 5'-TAAACAGTACAATCGCAAAGAAAAGCTCCACACCCAAACCAAATAATTG CAATGCAACTTCTTTTCTTTTTTTTTCTTTTCT-3* (SEQ ID NO:7). Sekvensen til PDC-genene fra gjær ( K. marxianus eller Y. stipitis eller H. polymorpha) ble oppnådd fra den innleverte Genbanksekvensen. På lignende måte ble en revers 79 bp oligomer (3'KmPDClKo) konstruert slik at 54 bp var identisk med 3'-enden til PDC-genet og 22 bp var identisk med 3'-enden til ADH1-terminatoren. Sekvensen til 3'KmPDClKo er som følger: 5<*->

TTATAAAATCATTAAAATCCAAAATCGTAATTTATCTCTTTATCCTCTCCC

TCTCTACATGCCGGTAGAGGTGTGGTCA-3' (SEQ ID NO:8). Primerne ble konstruert for å amplifisere et lineært DNA-fragment fra pLhldh-HES og pPaldh-HES-plasmider slik at fragmentet inneholder hele laktatdehydrogenasegenet sammen med ADH1 -promotoren og terminatoren (figur 6). Det PCR-amplifiserte produktet inneholder også ender som var homologe med sekvenser fra enten K. marxianus PDC1, Yamadazyma stipitis PDC1 og PDC2, og Hansenula polymorpha PDC1 og PDC2. Amplifiseringsreaksjonen ble utført ved anvendelse av Pfu DNA-polymerase (New England Biolabs; Beverly, MA). 100 ng av pLhldh-HES eller pPaldh-HES ble anvendt i reaksjonen sammen med 5 enheter av polymerase og 100 nmol av oligomerene. Reaksjonen ble utført ifølge protokoller beskrevet i Sambrook et al., ( Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Figur 6 viser det endelige lineære produktet med de beskrevne homologiene.

Alternative konstrukter ble fremstilt for å forbedre sannsynligheten for å oppnå en pdc-negativ samme av K. marxianus. For å fremstille konstruktene ble et 5,5 kbp-fragment som omgir K. marxianus 1,7 kbp PDC 1-genet isolert (figur 6b) ved å benytte PCR og genomvandrende teknikker (Clonetech). 5,5 kbp-fragmentet ble så klonet inn i pCRII TA-kloningsvektoren (Invitrogen) ved anvendelse av standard fremgangsmåter. En andel av omtrent 370 bp nær midten av det 1,7 kbp-kodende området av PDC1 ble fjernet fra K. marxianus 5,5 kbp-fragmentet ved restriksjons-oppløsninger (Sambrook). Det fjernede fragmentet har den følgende sekvensen:

Et kanamycinresistensgen og dets promotor ble så isolert fra en pPIC9K-vektor (Invitrogen) ved å benytte standard restriksjonsteknologi (det vises til Sambrook et al.), og klonet inn i setet i det 5,5 kbp fra hvilket fragmentet identifisert ovenfor ble fjernet. pPIC9K (Invitrogen) kanamycinresistensgenet og dets promotor ble innsatt slik at sekvensen til det innsatte området var som følger:

Den resulterende konstrukten inneholder G418 resistensgenet omgitt av om lag 5 kbp av pdc-området som vist i figur 6c. En lignende DNA-konstrukt ble laget som inneholdt det interne G418-genet omgitt av 2,3 kbp av K. marxianus PDC1 i pCRII-vektoren som vist i figur 6d.

Eksempel 7 - Anvendelse av lineært DNA- fragment for å oppsplitte den endogene PDC- kodende sekvensen og innsetning av en LDH- kodende sekvens samtidig Det lineære DNA-fragmentet generert av PCR som beskrevet i eksempel 5 er anvendt for å transformere K. marxianus, Yamadazyma stipitis eller Hansenula polymorpha. Protokollen anvendt for transformasjon er som beskrevet av Wesolowski-Louvel et al. (Nonconventional yeasts in Biotechnology: Kluyveromyces lactis, ed. Klaus Wolf, Springer verlag, Berlin, sider 138-201

(1996)). I korte trekk ble 5 ml av en overnatten-kultur spunnet ned og vasket med elektroporeringsbuffer (10 nM Tris-HCl, 270 nM sukrose, 1 nM MgCb, pH 7,5). De vaskede cellene blir så inkubert i 30 minutter ved 30°C i inkubasjonsbuffer (gjærekstrakt 5 g/l, peptonnæringsløsning 10 g/l, glukose 10 g/l, 25 nM DTT, 20 nM HEPES, pH 8,0). Ved slutten av denne perioden blir cellene igjen vasket og suspenderes på nytt i 400 \ x\ inkubasjonsbuffer. 200 ng av DNA tilsettes disse cellene, og cellene blir deretter pulset ved anvendelse av Bio-Rad Gene Pulser ved 1800 volt, 1000 Q, og 25 i en 0,4 cm kuvette.

Cellene blir plettert på regulære YPD (gjærekstrakt 10 g/l, peptonnæringsløsning 20 g/l, glukose 20 g/l, agar 15%) plater, og kolonier blir tillatt å regenerere i 72 timer. Hver av platene med kolonier blir igjen plettert på nye YPD-plater og inkuberes i 48 timer. Koloniene blir så belagt med 6,5% myk agar (0,5% agar i 300 mM Tris-HCl, 187 mM glutamat, pH 8,3). En fargeblanding (3,2 ml av 1% agar, 1,6 ml av 120 mM Tris, 75 mM glutamat, pH 8,3, 0,4 ml av 2 mg/ml fenazinmetosulfat, 7 enheter av glutamatpyruvattransaminase og 7 enheter av L(+)-grisemuskel-laktatdehydrogenase) tilsettes de belagte platene. Gjærstammer med høy L(+) danner blå ringer i løpet av 10-120 minutter. Denne fremgangsmåten er lik den foreslått av Subden et al. ( Canadian J. Microbiol.^ 28: 883-886 (1982)), og modifisert av Witte et al. ( J. Basic Microbiol. 29: 707-716 (1989)). Koloniene velges, og DNA som er isolert fra koloniene blir testet ved PCR-analyse og sekvensert for å detektere det oppsplittede pyruvatdekarboksylasegenet.

I en annen utførelsesform oppløses klonene beskrevet i eksempel 6 og vist på figurene 6c og 6d med to restriksjonsenzymer (jf. Sambrook et al.) for å gi omtrent 3 mg av fragment DNA inneholdende det homologe PDC-området som inkluderer det midtsekvensinnsatte kanamyacinresistensgenet. K. marxianus transformeres med fragmentet ved anvendelse av kjente teknikker, så som elektroporese, for å oppsplitte pdc av K. marxianus.

Generelt utføres elektroporese som følger: a) dyrke en kultur av en mikroorganisme i YPAD over natten (~15 timer) i et volum på 20 ml; b) overføre 500 |il fra kulturen til et mikrofugerør, spinne ved 4 K, 4 minutter, kaste supernatanten; c)

vaske pelleten med 1 ml kald EB (EB = elektroporesebuffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 270 mM sukrose; 1 mM MgCb); d) resuspendere i 1 ml IB (IB = inkuberings-buffer: YPD; 25 mM DTT; 20 mM Hepes, pH 8,0); e) riste ved 800 opm. ved 30°C i 30 minutter i en Eppendorf termomikser; f) spinne ned, vaske en gang med EB, resuspendere i 400 \ i\ EB; g) tilsette 3 mg fragment DNA (i vann 10 mM Tris-Cl, pH 8,5), inkubere på is i 30 minutter; h) overføre til 0,4 cm elektroporeseskål. Bio-Rad Gene Pulser-innstillinger: 1000 V, 1000 Q, 50 uP. Tidskonstant etter puls: ~20 msek.; i) overføre til 3 ml Morton Closure-rør, inkubere uten risting v ed 30°C i 1 time. Tilsette 400 ^1 flytende YPAD-løsning (YPAD: 10 g gjærekstrakt; 20 g pepton; 20 g glukose, 100 mg adeninhemisulfat. Volum =11. Ingen pH-justering), riste ved 800 opm. ved 30°C i 1 time i Eppendorf termomikser. Tilsette 400 |il flytende YPAD og utvinne i 4-6 timer; j) spinne ned i mikrofugerør ved 4 K, 4 minutter, kaste supernatanten, resuspendere i 400 |il 1 M sorbitol; k) plettere oppå 200 ug/ml G418 selektive plater; og 1) inkubere ved 30°C i 3-5 dager.

Koloniene screenes først ved en andre sammenskraping oppå 300 [J.g/ml G418. Det genomiske DNA isoleres fra den andre gjærflekken ved standard genomiske prepareringer (Sambrook). Disse screenes så via PCR for 1) nærværet av kanamyacinfragmentet ved anvendelse av egnede primere og forhold (Sambrook) og 2) fraværet av det avbrutte pdc-området ved anvendelse av passende primere og PCR-forhold. Kolonier positive for seleksjonsmarkøren og negative for pdc-oppsplittet området blir så dyrket og analysert ved HPLC for fysiologi. Genomisk DNA fra disse stammene ble ytterligere analysert ved Southern hybridiseringsanalyse.

Eksempel 8 - Cellers vekstkarakteristikker

1. Lav pH/høy temperatur

Overnatten-kulturer av K. marxianus ble inokulert i 50 ml gjær-minimalløsning ifølge Kiers et al. ( Yeast, 14(5): 459-469 (1998)). 100 g/l glukose ble anvendt som karbonkilden. Overnatten-kulturene ble opprettholdt ved 40°C og inokulert i løsning som også ble opprettholdt ved 40°C. Tilsetning av inokulanten endret løsningens pH fra 5,5 til 2,5. Under dette eksperimentet forble pH 2,5. Glukosekonsentrasjon ble målt ved hjelp av YSI-membran, og optisk tetthet (OD) ble målt ved anvendelse av et spektrofotometer.

Glukose ble benyttet i 72 timer, noe som indikerte at metabolsk aktivitet skjer under lav pH og dyrkningsforhold med høy temperatur under den tidsperioden (figur 7). I tillegg sank biomasse noe i løpet av perioden på 48-72 timer, noe som indikerte at cellenedbrytningen går fortere enn anabolismen (figur 7).

2. Pentosekarbonkilder

Overnatten-kulturer av K. marxianus ble inokulert i tre 50 ml kolber inneholdende gjær-minimalløsning ifølge Kiers et al. ( Yeast, 14(5): 459-469 (1998)). Hver av de tre kolbene inneholdt ulike karbonkilder. Den første inneholdt 10% glukose, den andre inneholdt 10% D-xylose og den tredje inneholdt 10% L-arabinose. Kolbene ble inkubert ved 30°C, og OD-målingene ble gjort periodisk.

Etter 40 timer var biomasseutbyttet for gjær dyrket med glukose eller xylose lik, mens biomasseutbyttet for gjær dyrket med arabinose var lavere (figur 8). Sammenligning av veksten av gjær dyrket med glukose med dyrket med xylose eller arabinose viste en innledende latenstid i vekst. Gjæren dyrket med arabinose viste en latenstid på noen få timer, mens latenstiden for gjær dyrket med xylose var mye mer utpreget (figur 8). Nærværet av denne latenstiden indikerer at gjærcellene trenger tid for å tilpasse xylose og arabinose til karbonkilder. Det antas at denne tiden er nødvendig for å indusere syntesen av polypeptider som ikke normalt uttrykkes.

3. Maisfiberhydrolysat ved lav pH

Overnatten-kulturer av K. marxianus ble inokulert i kolber inneholdende gjær-minimalløsning ifølge Kiers et al. ( Yeast, 14(5): 459-469 (1998)). Hver kolbe inneholdt 30% maisfiberhydrolysat som karbonkilde. I korte trekk ble maisfiber-hydrolysatet laget ved å reagere maisfiber med 1,2% svovelsyre ved 145°C i 25 minutter. Under reaksjonen ble hemicellulosen brutt ned til de monomere produktene arabinose, xylose og glukose. På grunn av den høye temperaturen under reaksjonen, ble noe arabinose og xylose nedbrutt til furfural, mens noe glukose ble nedbrutt til hydroksymetylfurfural. HPLC-analyse av hydrolysatet viste nærværet av 38,7 g/l glukose, 39,1 g/l xylose, 20,7 g/l arabinose og 1,6 g/l furfural. I tillegg hadde hydrolysatet en pH på 1,51. Før dyrking av gjæren ble maisfiber-hydrolysatets pH-verdi justert til 3,0. Under dyrkningsforsøket ble OD-målinger utført periodisk.

Gjærcellene var i stand til å generere biomasse når de ble dyrket med maisfiberhydrolysat (figur 9).

4. Forskjellige pH-forhold

Overnatten-kulturer av K. marxianus ble inokulert i fire kolber inneholdende 50 ml gjær-YPD-løsning (gjærekstrakt 10 g/l, peptonnæringsløsning 20 g/l, glukose 20 g/l). Hver kolbe hadde ulik pH, som ble justert ved anvendelse av HC1. Under dyrkningsforsøket ble temperaturen opprettholdt ved 30°C, og OD-målinger ble gjort periodisk. Vekst ble observert i hver kolbe (figur 10).

5. Forskjellige pH-forhold/melkesyre

Overnatten-kulturer av K. marxianus ble inokulert i fire kolber inneholdende 50 ml gjær-YPD-løsning (gjærekstrakt 10 g/l, peptonnæringsløsning 20 g/l, 20 g/l glukose) så vel som 40 g/l melkesyre. Tilsetningen av melkesyren resulterte i en pH på 2,8. Således ble pH i tre kolber justert til den indikerte pH-verdien ved anvendelse av NaOH. Under dyrkningsforsøket ble temperaturen opprettholdt ved 30°C, og OD-målinger ble gjort periodisk. Vekst ble observert i hver kolbe (figur 11).

Eksempel 9 - Rekombinante celler som er i stand til å produsere akrvlvl- CoA

En organisme som ikke er i stand til å benytte akrylat som en karbonkilde (for eksempel E. coli) transformeres med et Clostridium propionicum genomisk DNA-bibliotek. Det C. propionicum genomiske biblioteket genereres ved anvendelse av pHES-plasmidet slik at det uttrykker 10 kbp-fragmenter av C. propionicum-genomet. Det transformerte E. coli pletteres på seleksjonsløsninger med bare akrylsyre som en karbonkilde. Bare de celler som har evnen til å oppta akrylat vil vokse. Akrylat opptas normalt av dets enzym-medierte (enzyme-mediated) omdannelse til laktat. Laktat kan så omdannes til pyruvat og benyttes av cellene via Krebs-syklusen.

Straks en transformert E. coli er valgt, isoleres DNA-plasmidet fra det genomiske biblioteket, og det innsatte fragmentet sekvenseres. Straks det er sekvensert, skannes fragmentet for åpen leseramme (open reading frames) for å bestemme kodesekvensen for enzymer involvert i omdannelsen mellom laktat og akrylat (for eksempel laktoyl-CoA-dehydrogenase og CoA-transferaser).

De isolerte klonene inneholdende den kodende sekvensen for disse enzymene innføres i gjærcellene beskrevet i eksempel 6, som inneholder laktatdehydrogenase og mangler pyruvatdekarboksylaseaktivitet. Seleksjon av rekombinante gjærceller som inneholder den introduserte nukleinsyren utføres ved anvendelse av G418 (300 g/l). Straks det er isolert dyrkes de rekombinante gjærcellene aerobt på glukose, og endres så til anaerobe forhold. Næringsløsningen samles så opp og testet mot akrylat ved anvendelse av standard HPLC-metoder som beskrevet av Danner et al.

(Biotechnological production of acrylic acid from biomass, In: Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 70-72 (1998)).

Eksempel 10 - Rekombinante celler som er i stand til å produsere askorbat Ekspresjonsvektorer konstrueres slik at de følgende polypeptidene uttrykkes: 2,5-dioksovaleratdehydrogenase, 5-dehydro-4-deoksy-D-glutaratdehydratase, glukaratdehydratase, aldehyddehydratase, glukuronolaktonreduktase og L-gluonolaktonoksidase. Nukleinsyresekvensen som koder disse polypeptidene isoleres fra forskjellige mikroorganismer. Straks de er konstruert transformeres ekspresjonsvektorene inn i en gjærcelle ved elektroporese. Straks de er transformert analyseres gjærcellene for å bestemme om de produserer L-askorbat eller ikke.

Eksempel 11 - Rekombinante celler som er i stand til å produsere D- xylose

Ekspresjonsvektorer konstrueres slik at de følgende polypeptidene uttrykkes: 2-dehydro-3-deoksy-D-pentanoataldolase, xylonatdehydratase, xylonolaktonase og D-xylosedehydrogenase. Nukleinsyresekvensene som koder disse polypeptidene isoleres fra Pseudomonas sp. Straks de er konstruert transformeres ekspresjonsvektorene inn i gjærceller ved elektroporese. Straks de er transformert analyseres gjærcellene for å bestemme om de produserer D-xylose eller andre pentose-karbonforbindelser eller ikke.

Eksempel 12 - Rekombinante celler som er i stand til å produsere citrat PCR-primere blir konstruert basert på S. cerevisiae aconitase (ACOl, Genbank aksesjonsnummer M33131) nukleinsyresekvensen. Disse primerne anvendes for å klone aconitasen som koder nukleinsyre fra en Kluyveromyces, Yamadazyma eller Hansenula- arter. Straks de er sekvensert blir lineære konstrukter laget som beskrevet i eksempel 5 og anvendt for å oppsplitte aconitasen som koder nukleinsyren i gjærceller. Seleksjonsmarkøren som er benyttet er det antibiotiske G418 i stedet for laktatproduksjon som beskrevet i eksempel 5. Nukleinsyre som gir resistens til det antibiotiske G418 er neomycin/kanamycingenet. Dette genet oppnås fra pPIC9K-vektoren (InVitrogen) og innsettes i pHES-vektoren. Gjærceller transformeres med PCR-genererte lineære fragmenter som er konstruert til å ha ender som er homologe med ACOl som beskrevet ovenfor. Det lineære fragmentet er utformet for å kode G418-resistensgenet. Bare celler som har integrert det lineære fragmentet i lokaliteten av aconitasen som koder nukleinsyren er resistente mot antibiotikumet. Disse cellene er analysert for den passende integrasjonen ved anvendelse av PCR. Gjærcellene oppnådd ved denne metoden har en delvis funksjonell TCA-syklus, og kan således overprodusere citrat. Citratet transporteres over mitokondriemembranen og inn i løsningen. I tillegg er disse gjærcellene gitt et eksogent nukleinsyremolekyl som koder et enzym så som ATP-citratlyase slik at de kan katalysere omdannelsen av akkumulert citrat inn i oksaloacetat (jf. eksempel 13).

Eksempel 13 - Rekombinante celler som er i stand til å uttrykke citratlvase i cytosol

En crabtree-positiv gjærcelle transformeres med pHES-plasmidet inneholdende en nukleinsyresekvens som koder et polypeptid som har ATP-citratlyaseaktivitet. Denne nukleinsyren isoleres fra E. coli, Klebsiella pneumoniae (Genbank aksesjonsnummer X79817) eller andre publiserte kilder. Straks de er transformert analyseres gjærcellene for å bestemme om de kan benytte sukker for å produsere store mengder av lipidakkumulasjon. I tillegg analyseres gjærcellene for å bestemme om de utviser ATP-citratlyaseaktivitet som beskrevet av Holdsworth et al. (J. Gen. Microbiol., 134: 2907-2915 (1998)). Gjærcellene som har ATP-citratlyaseaktivitet er i stand til å tilveiebringe cytosolisk acetat under aerobe forhold ved en rute som er ulik nedbrytningen av aldehyd til acetat via aldehyddehydrogenase. I tillegg, når en slik gjær mangler pyruvatdekarboksylase- eller aldehyddehydrogenaseaktivitet, bør de være i stand til å tilveiebringe acetat for biosyntese via Krebs-syklusen.

Eksempel 14 - Rekombinante celler som ikke er i stand til å benytte laktat som karbonkilde

Gjærceller konstrueres slik at aktiviteten til en karboksylsyretransportør lik S. cerevisiae JEN 1-polypeptidet reduseres. Slike gjærceller vil ha en redusert evne til å transportere laktat, og således benytter de laktat mindre effektivt. Aktiviteten til karboksylsyretransportøren inne i gjærceller reduseres ved å oppsplitte lokaliteten inneholdende den kodende sekvensen for dette polypeptidet. Først isoleres homologen til JEN 1-polypeptidet fra en vertscelle som anvender degenererte primere som er konstruert basert på den tilgjengelige sekvensen for JEN1 (Genbank aksesjonsnummer U24155). Straks nukleinsyren er isolert fra vertscellen sekvenseres den. Oppsplittelse av den kodende sekvensen for dette polypeptidet gjøres ved anvendelse av prosedyrene beskrevet i eksempel 11. Lineære fragmenter som koder homologe områder genereres til JEN 1-sekvensen samt til hele G418-resistensgenet. Dette lineære fragmentet integreres i den JEN1 genomisk sekvensen som fører til slutt på aktiviteten. Celler som mangler karboksylsyretransportør-aktivitet identifiseres ved deres manglende evne til å transportere karboksylsyre, og følgelig deres manglende evne til å vokse når de dyrkes på laktat.

I tillegg modifiseres celler slik at aktiviteten til en funksjonell ekvivalent av 5. cerevisiae cytokrom b2-polypeptidet reduseres. Cytokrom b2-polypeptidet gjør det mulig for S. cerevisiae- cellene å metabolisere laktat inne i mitokondrien. Først blir degenererte primere konstruert fra Saccharomyces cytokrom b2-sekvensen (Genbank aksesjonsnummer S46729). Straks de er isolert sekvenseres klonen. Oppsplittelsen av gjærvertshomologen av cytokrom b2 utføres ved anvendelse av fremgangsmåter beskrevet i Methods in Yeast Genetics (Eds. Alison et al., Cold Spring Harbor Press (1997)). Denne rekombinante gjærcellen vil ikke være i stand til å benytte laktat som en karbonkilde.

Eksempel 15 - Masseproduksjon av laktat

Multiple varianter av K. marxianus- ceWer som har redusert PDC-aktivitet blir produsert og isolert. Hver variant konstrueres til å inneholde et ulikt kopitall av et eksogent nukleinsyremolekyl som koder et polypeptid som har LDH-aktivitet. LDH-polypeptidet er fra flere forskjellige kilder. Slike varianter av celler kan ha ulik spesifikk produktivitet for melkesyre ved 40°C.

Hver variant dyrkes i et kar under aerobe forhold med en luftstrøm på 1,5 VVM og oppløst oksygeninnhold på 30% for å oppnå en celletetthet på omkring 60 g/l, tørr basis. Straks tettheten er tilstrekkelig slås luftstrømmen av, og forholdene i karet endres til anaerobe forhold. Ingen base tilsettes. Variantene med den høyeste spesifikke produktiviteten under den anaerobe fasen kan finnes ikke bare for å produsere melkesyre raskere, men også for å oppnå en høyere konsentrasjon ved en lavere pH, enn variantene med lavere spesifikk produktivitet. Produktutbytte på glukose under produksjonsfasen kan overstige 90%.

Visse varianter blir valgt og utsettes for de samme dyrkningsmetodene, med unntak av at luftstrømmen reduseres til 0,1 VVM i stedet for å bli fullstendig avstengt. Under slike forhold kan slutt-pH i karet være lavere, og laktatkonsentrasjonen kan være høyere enn under forholdene uten noe luftstrøm. Produktutbytte på glukose kan reduseres, men kan fortsatt være på ca. 90%. Når testen gjentas, men med en luftstrøm på 0,5 VVM, kan produktutbyttet på glukose reduseres til mindre enn 80%.

Eksempel 16 - Masseproduksjon av laktat ved anvendelse av en rekke satsfermenterineer

En kultur av K. marxianus som mangler PDC-aktivitet og som har LDH-aktivitet anvendes som inokulumet i en rekke satsfermenteringer. Hver fermentering utføres i progressivt større kar, hvor hver er sterilisert umiddelbart før anvendelse. I tillegg er hvert kar tilført en luftstrøm på 1,5 VVM og tilstrekkelig røring til å opprettholde et oppløst oksygeninnhold på over 10%. Sluttkaret har et volum på 6000 1. Karene opprettholdes også ved en temperatur på 45°C for å øke overlevelsesevnen til de genetisk modifiserte K. marxianus- cellene i forhol til vill-type-gjær og andre organismer. Hvert kar fylles med standard dyrkningsløsning for optimal vekst.

Innholdene i sluttkaret, med en celletetthet på 100 g celler/l, tørr basis, overføres til et produksjonskar som nettopp er dampet og som har et volum på 300000 1. Eventuelt tilsettes ytterligere celler oppnådd fra filtreringen av en foregående produksjonsprosess. Celletettheten i produksjonskaret er 6 g av celler/l, tørr basis. Glukose tilsettes til et nivå på 80 g/l. Forholdene i karet er anaerobe, og temperaturen er 42°C i et tidsrom på 25 timer. Den spesifikke produktiviteten er større enn 0,5 g laktat/(g biomasse <*> time) inntil nær slutten av prosessen, hvorved produktiviteten begynner å falle. Med en gang produktiviteten begynner å falle, fjernes cellene og lagres for ny anvendelse. Den endelige laktatkonsentrasjonen kan være 75 g/l, idet pH er 2,8. Etter biomassefjerning konsentreres løsningen ved fordampning til en konsentrasjon på 50% laktat. Den frie syren (ca. 86% av totalt laktat) ekstraheres ved væskeekstraksjon inn i en organisk løsning og tilbakeekstraheres ved en høyere temperatur inn i vann. Raffinatet inneholdende laktatsaltet blir enten renset og resirkulert som en buffer i vekstkaret, eller surgjort med for eksempel svovelsyre og renset.

Eksempel 17 - Sammenligning av aerob produksjon av crabtree- negative ( K .

marxianus ) og crabtree- positive ( S . uvarum ) organismer

En crabtree-negativ ( K. marxianus) og en crabtree-positiv ( S. uvarum) organisme ble dyrket hver seg i aerobe og anaerobe satsfermentorer. Satsdyrking ble utført ved 30°C i laboratoriefermentere med et arbeidsvolum på 1,5 1. pH ble opprettholdt ved 5,0 ±0,1 ved automatisert tilsetning av 2 mol-1"<1> kaliumhydroksid (KOH). Fermentoren ble spylt med luft (aerobe kulturer) eller nitrogengass (anaerobe kulturer) ved en strømningshastighet på 0,8 1-min'<1> og rørt ved 800 omdreininger pr minutt (opm.). Den oppløste oksygenkonsentrasjonen ble kontinuerlig overvåket med en oksygenelektrode (Ingold, type 34 100 3002). I de aerobe kulturene ble den oppløste oksygenkonsentrasjonen opprettholdt over 60%. 10 ml prøver ble tatt ut ved passende intervaller for bestemmelse av tørrvekt og metabolittkonsentrasjoner. Tween-80 og ergosterol ble tilsatt til anaerobe kulturer for å levere forbindelsene som er nødvendige for fettsyresyntese.

Under eksponensiell vekst ble både tørrvekten og OD660 av gjærkulturer, og glukose- og etanolkonsentrasjonen i supernatanten bestemt ved passende intervaller. Den spesifikke etanolproduksjonshastigheten (qetanoi, mol-g^-h"<1>) ble beregnet ved den følgende ligningen ved anvendelse av lineær regresjonsanalyse:

dE/dt (hastigheten av økning av etanolkonsentrasjonen i kulturen; mmol-l^-h"<1>) og dCx/dt (hastigheten av økning av biomassekonsentrasjonen; g-l^-h'<1>) ble beregnet ved anvendelse av differensiering av plott av etanolkonsentrasjon og biomasse-konsentrasjon kontra tid. (J.maks (h"<1>). Den maksimale spesifikke veksthastigheten på glukose ble estimert fra den eksponensielle delen av et plott av Cx kontra tid. For å beregne den spesifikke glukoseforbrukshastigheten (qgiUkose> mmol-g^-h"<1>), ble dE erstattet med dG (mengde av glukose forbrukt pr time).

I de aerobe satskulturene utviste Kluyveromyces- og Saccharomyces- stammene en maksimal spesifikk veksthastighet på glukose på henholdsvis 0,4 h"<1> og 0,28 h"<1>. Den høye glukosekonsentrasjonen og den resulterende høye spesifikke veksthastigheten til Saccharomyces- kultuTen resulterte i høye hastigheter av aerob alkoholfermentering (tabell 3, figur 1). Den spesifikke hastigheten av glukoseforbruk var ca. 2 ganger høyere i Saccharomyces- stammen sammenlignet med Kluyveromyces- stammen på grunn av den kraftige alkoholfermenteringen. Fra et energetisk ståsted er alkoholfermentering en mindre effektiv måte for cellen å generere ATP. Biomasseutbyttet på glukose var 0,38 g/g for Kluyveromyces og 0,14 g/g for Saccharomyces uvarum. Etanolutbyttet på glukose var null for crabtree-negativ fenotype Kluyveromyces- stammen og 1,83 mmol/mmol for Saccharomyces-, crabtree-positiv fenotypen, kulturen.

Tabell 3: Maksimal spesifikk veksthastighet, spesifikke hastigheter (q, mmol[g biomasse]"<1> h"<1>) av etanolproduksjon og glukoseforbruk, biomasseutbyttet (g/g), produktutbyttet (mmol/mmol) og karbonutvinning (i %; bare kalkulert for anaerobe kulturer) under eksponensiell vekst i satskulturer av Saccharomyces uvarum og Kluyveromyces marxianus på mineralløsning inneholdende 2% (vekt/volum) glukose.

I anaerobe satskulturer var den spesifikke veksthastigheten og biomasseutbyttet for begge stammene svært lav sammenlignet med de funnet under aerobe forhold (tabell 3, figurene 1 og 2). For Kluyveromyces- og Saccharomyces- stammene var biomasseutbyttet henholdsvis 0,07 og 0,09 g/g. Begge stammene har god ytelse med hensyn til den spesifikke hastigheten av alkoholfermentering under anaerobe forhold. Dette ble bekreftet ved anvendelse av C02-produksjonsdata.

Generelt demonstrerer dette eksempelet at aerob produksjon av biomasse er mye raskere enn anaerob, og at utbyttet av biomasse under aerobe forhold er høyere for crabtree-negative organismer (fordi i crabtree-positive organismer finner noe alkoholfermentering sted, som bruker opp glukose). Dette eksempelet demonstrerer også at fermenteringsproduktet (i dette tilfellet etanol) produseres ved den samme hastigheten for både crabtree-positive og -negative organismer under anaerobe forhold. Således tilveiebringer et aerobt veksttrinn et høyt biomasseutbytte, og et påfølgende anaerobt fermenteringstrinn kanaliserer metabolsk energi inn i produktdannelse (i stedet for mer vekst). Totalt sett tilveiebringer en prosess hvor produksjon er separert fra vekst større prosessfleksibilitet og bedre kontroll med det totale prosessutbyttet.

Eksempel 18 - Forbedret laktatproduksjon i en vertsstamme som naturlig lager L-melkesvre: amplifisering av lineære fra<g>menter av homologt DNA for genoppsplittelser av p<y>ruvatdekarboksylase

Gjæren Kluyveromyces thermotolerans { K. thermotolerans) er en naturlig produsent av L-melkesyre (Kurtzman and Fell, (1998) " The Yeasts, A Taxonomic Study" sider 240-241; Elsevier Science B.V.; Amsterdam, Nederland). K. thermotolerans har et naturlig forekommende laktatdehydrogenase (ldh) gen som tillater produksjonen av L-melkesyre. Mengden av melkesyre produsert under anaerobe forhold er omtrent 4% g/g av benyttet glukose, mens det gjenværende av glukosen i alt vesentlig omdannes til etanol (42,5% g/g glukose forbrukt), glyserol (3% g/g av glukose forbrukt) og acetat (0,3 g/g av glukose forbrukt).

En 600bp-område av PDC1 ble isolert fra K. thermotolerans ved anvendelse av konsensusprimere konstruert fra en sekvens avledet ved å sammenligne PDC1-gensekvensen fra K. marxianus og K. lactis. PDC 1-fragmentet ble deretter sekvensert (Sanger) og anvendt for å isolere et 7,5 kbp-fragment som omgir K. thermotolerans pdcl (figur 6e) ved anvendelse av PCR og genomvandrende teknikker (Clonetech). 7,5 kbp-fragmentet ble så klonet inn i pCRII TA-kloningsvektoren (Invitrogen). En andel på om lag 730 bp nær midten av det kodende området til PDC1 ble fjernet fra K. thermotolerans 7,5 kbp-fragmentet. Andelen av K. thermotolerans pdcl fjernet ved restriksjonsdigestere (Sambrook) inneholdt den følgende sekvensen:

Et gen som koder kanamycinresistens, omfattende dens promotor, ble så isolert fra pPIC9K-vektor (Invitrogen) ved restriksjonsdigerere (Sambrook), og klonet inn i setet til 7,5 kbp hvorfra 730 bp-fragmentet ble fjernet. Sekvensen til kanamycinresistensgenet og dets promotor fra pPIC9K (Invitrogen) var som følger:

Den resulterende konstrukten inkluderer kanamycinresistensgenet (G418) omgitt av omtrent 6,8 kbp av PDC-området som vist i figur 6f.

Konstrukten vist i figur 6f oppløses med to restriksjonsenzymer (Sambrook) for å gi omtrent 3 mg av fragment DNA inneholdende det homologe PDC-området og det midtsekvensinnsatte kanamycinresistensgenet. K. thermotolerans transformeres med fragmentet ved anvendelse av kjente transformasjonsteknikker, slik som elektroporese for å oppsplitte PDC av K. thermotolerans. Fremgangsmåten for elektroporese er som følger: a) dyrke kultur i YPAD over natten (~15 timer) i et volum på 20 ml; b) overføre 500 (il av kultur til et mikrofugerør, spinne ved 4 K i 4 minutter, kaste supernatant; c) vaske med 1 ml kald EB (EB = elektroporesebuffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 270 mM sukrose; 1 mM MgCh); d) resuspendere i 1 ml IB (IB = inkubasjonsbuffer: YPD; 25 mM DTT; 20 mM Hepes, pH 8,0); e) riste ved 800 opm. ved 30°C i 30 minutter i en Eppendorf termomikser; f) spinne ned, vaske en gang med EB, resuspendere i 400 |il EB; g) tilsette 3 mg fragment DNA (i vann 10 mM Tris-Cl, pH 8,5), inkubere på is i 30 minutter; h) overføre til

0,4 cm elektroporeseskål. Bio-Rad genpulser-innstillinger: 1000 V, 1000 Q, 50 fiF. Tidskontant etter puls: ~20 msek; i) overføre til 3 ml Morton Closure-rør, inkubere uten risting ved 30°C i 1 time; j) tilsette 400 fil væske YPAD-medium (YPAD: 10 g gjærekstrakt; 20 g pepton; 20 g glukose; 100 mg adeninhemisulfat. Volum =11. Ingen pH-justering), riste ved 800 opm. ved 30°C i 1 time i en Eppendorf termomikser; k) tilsette 400 (il flytende YPAD og utvinne i 4-6 timer; 1) spinne ned i mikrofugerør ved 4 K i 4 minutter, kaste supernatant, resuspendere i 400 (il 1 M sorbitol og plettere oppå 100 fig/ml G418-selektive plater; og m) inkubere ved 30° C i 3-5 dager.

Kolonier screenes først ved en andre flekk (patching) oppå en kulturskål inneholdende 200 (ig/ml G418. Det genomiske DNA isoleres fra den andre gjærflekken ved anvendelse av standard genomiske prepareringer (Sambrook). Det isolerte genomet screenes så via PCR for 1) nærværet av kanamycinfragmentet ved anvendelse av egnede primere og forhold (Sambrook); og 2) fraværet av det oppsplittede PDC-området ved anvendelse av egnede primere og PCR-forhold. Kolonier positive for seleksjonsmarkøren og negative for PDC-oppsplittelses-området dyrkes så for videre studier, for eksempel analyseres genomisk DNA fra disse stammer videre ved Southern hybridiseringsanalyse.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et utvalgt organisk produkt, karakterisert ved at den innbefatter: a) tilveiebringelse av en mikroorganisme som fremviser en crabtree-negativ fenotype; b) dyrking av den crabtree-negative mikroorganismen i en første dyrkningsløsning som omfatter en karbonkilde under et første sett av dyrkningsforhold som fremmer cellulær respirasjon; og c) dyrking av den crabtree-negative mikroorganismen i en dyrkningsløsning som omfatter en karbonkilde under et andre sett av dyrkningsforhold som fremmer produksjon av det utvalgte organiske produktet, der ikke mer enn 0,3 gram biomasse blir produsert per gram karbonkilde som blir konsumert under det andre settet av dyrkningsforhold.

2. Fremgangsmåte som angitt krav 1, karakterisert ved at den crabtree-negative mikroorganismen er genetisk modifisert.

3. Fremgangsmåte som angitt krav 1 eller 2, karakterisert ved at det utvalgte organiske produktet omfatter et pyruvat-avledet produktet.

4. Fremgangsmåte som angitt krav 3, karakterisert ved at den crabtree-negative mikroorganismen er genetisk modifisert til å inkludere et eksogent laktatdehydrogenasegen, og der det pyruvat-avledede produktet er laktat.

5. Fremgangsmåte som angitt krav 4, karakterisert ved at laktatdehydrogenasegenet valgt fra gruppen bestående av bovinlaktatdehydrogenase, bakterielaktatdehydrogenase og sopplaktatdehydrogenase.

6. Fremgangsmåte som angitt krav 1, karakterisert ved at karbonkilden i den første dyrkningsløsningen omfatter glukose.

7. Fremgangsmåte som angitt krav 1, karakterisert ved at karbonkilden i den andre dyrkningsløsningen omfatter glukose.

8. Fremgangsmåte som angitt krav 1, karakterisert ved at det første settet med dyrkningsforhold omfatter aerobe forhold.

9. Fremgangsmåte som angitt krav 1, karakterisert ved at det andre settet med dyrkningsforhold omfatter anaerobe forhold.

10. Fremgangsmåte som angitt krav 3, karakterisert ved at den benyttes til produksjon av et utvalgt pyruvat-avledet produkt som ytterligere omfatter: d) dyrkning av mikroorganismen under et tredje sett med dyrkningsforhold som omfatter en dyrkningsløsning som inkluderer et middel som øker metabolsk energi for mikroorganismen.

11. Fremgangsmåte som angitt krav 10, karakterisert ved at det første settet med dyrkningsforhold omfatter aerobe forhold og det andre settet med dyrkningsforhold omfatter anaerobe forhold.

12. Fremgangsmåte som angitt krav 10, karakterisert ved at det første, andre og tredje settet med dyrkningsforhold inkluderer en dyrkningsløsning som inkluderer glukose.

13. Fremgangsmåte som angitt krav 10, karakterisert ved at middelet som øker metabolsk energi for mikroorganismen omfatter oksygen.

14. Fremgangsmåte som angitt krav 1, karakterisert ved at mikroorganismen er en gjærtype som er utvalgt fra gruppen som består av Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon og Yamadazyma.

15. Fremgangsmåte som angitt krav 1, karakterisert ved at den crabtree-negative mikroorganismen er genetisk modifisert slik at den inneholder et eksogent laktatdehydrogenasegen, det pyruvat-avledede produktet er laktat, karbonkilden i den første og andre dyrkningsløsningen inkluderer glukose, det første settet med dyrkningsforhold omfatter aerobe forhold og det andre settet med dyrkningsforhold omfatter anaerobe forhold.

16. Fremgangsmåte som angitt krav 14, karakterisert ved at mikroorganismen er en gjærtype av slekten Kluyveromyces.

17. Anvendelse av en genetisk modifisert organisme som oppviser en crabtree-negativ fenotype i en fremgangsmåte for produksjonen av melkesyre, der nevnte fremgangsmåte omfatter en aerob fase og en anaerob fase.

18. K. thermotolerans gjærstamme, karakterisert ved at den mangler etanolproduksjonsevne eller har redusert etanolproduksjonsevne med hensyn på villtypegjær av samme stamme, og som har et endogent laktatdehydrogenasegen.