UA77386C2 - Method for producing lactic acid - Google Patents

Description

Опис винаходу

Винахід стосується способів і матеріалів, які застосовуються у виробництві органічних продуктів. 2 У промисловості широке застосування знаходять такі органічні продукти, як молочна кислота. Органічні кислоти можуть використовуватися, наприклад, у синтезі пластмас та інших продуктів. Для задоволення зростаючих з кожним днем потреб в органічних продуктах ведеться безперервний пошук все більш ефективних і економічних способів їх вироблення. В одному з таких способів для одержання органічних продуктів використовуються бактерії. Відомо, що певні бактерії за певних умов ферментації можуть виробляти великі 70 кількості органічних продуктів. Проте використання живих бактерій у якості фабрик обмежується здатністю цих бактерій рости в умовах нагромадження органічного продукту в живильному середовищі. Для подолання цього обмеження застосовувалися найрізноманітніші способи очищення продукту в процесі його синтезу. Крім того, робилися спроби застосовувати інші мікроорганізми, що не є бактеріями. Дійсно, Засспаготусез сегемізіае, відома своєю кислотостійкістю, була піддана генетичній модифікації у спробі застосування її для вироблення 75 молочної кислоти. Зокрема, клітини З. сегемівіае модифікувалися шляхом піддавання їх дії бичачої лактатдегідрогеназної ДНК і дезінтегрування ендогенних піруватдекарбоксилазних генів (РОС1, РОС5 і РОС).

Хоча модифіковані клітини 5. сегемівіае і виробляли молочну кислоту, ріст цих клітин був пригнічений, вказуючи на те, що як ріст клітин, так і вироблення молочної кислоти потребує поліпшення.

В цілому даний винахід стосується способів і матеріалів для вироблення органічних продуктів. Зокрема, винаходом пропонуються дріжджові клітини, способи культивування дріжджових клітин, способи одержання дріжджових клітин, конструкцій нуклеїнових кислот, а також способи і матеріали для виготовлення різноманітних органічних продуктів. Винахід грунтується на тому виявленому авторами факті, що деякими мікроорганізмами (наприклад, бактеріальними або грибковими) можна керувати за допомогою генетичних засобів і надавати їм таким шляхом спроможності за певних умов культивування рости із найрізноманітніших вуглецевих джерел і с давати найрізноманітнішу продукцію, у тому числі органічні продукти у промислових масштабах. Наприклад, (3 запропоновані дріжджові клітини можуть рости і давати органічну продукцію при культивуванні їх в умовах низького рН і високої температури. Здатність до швидкого росту і високоефективного вироблення органічної продукції в умовах, наприклад, низького рН і високої температури є особливо корисною. Зокрема, здатність мікроорганізму переносити низький рН дозволяє уникнути необхідності підтримувати середовище з нейтральним о рН, що може бути важким і дорогим при здійсненні промислових процесів. Крім того, способи і матеріали, що со дозволяють одержувати потрібний органічний продукт із живильного середовища з низьким рН, можуть стати більш практичними й ефективними, ніж ті, що застосовуються для одержання того ж органічного продукту, але із о живильного середовища, що має більш нейтральний рН. Наприклад, деякі органічні кислоти можуть ча преципітувати із розчину з рН, що падає нижче рівня рКа продукту, значно спрощуючи тим самим виробничий

Зо процес. Що ж до спроможності мікроорганізму витримувати високі температури, то вона, ця спроможність, - дозволяє уникнути необхідності підтримувати низькотемпературні умови на стадіях росту мікроорганізму і вироблення продукту. Зрозуміло, що зменшення потреби у підтриманні низьких температур у резервуарах із живильним середовищем великої ємності дозволяє весь процес зробити більш ефективним і менш дорогим. Крім « того, здатність мікроорганізму переносити як низькі рН, так і високі температури дає у розпорядження зручний З 70 спосіб запобігання забрудненню робочого середовища іншими, менш стійкими мікроорганізмами в промислових с процесах. з» Слід зауважити, що суттєвою ознакою, що стосується здатності до промислового вироблення бажаного органічного продукту може бути питома продуктивність, за якої цей органічний продукт виробляється.

Наприклад, забезпечення високої питомої продуктивності за допомогою описаних тут способів і матеріалів може дозволити мікроорганізму генерувати енергію, потрібну для культивування клітин у даних умовах культурного і середовища - низького рН і високої температури. Генерування такої енергії може здійснюватися шляхом -І ферментації у практично анаеробних умовах, відмовляючись, таким чином, від генерування енергії респіраторним шляхом. Отримання потрібної енергії ферментаційним шляхом є особливо вигідним, коли процес о вироблення органічного продукту не потребує респіраторного шляху, оскільки це дозволяє для одержання о 20 бажаного органічного продукту використовувати практично будь-яке відповідне джерело вуглецю, що є у розпорядженні. с Іншим підгрунтям для даного винаходу є те, що використання джерела вуглецю певними генетично регульованими мікроорганізмами може регулюватися і спрямовуватися переважним чином на вироблення чи то біомаси, чи то цільового органічного продукту. Взагалі кажучи, даним винаходом охоплюються два типи процесів 25 культивування: в одному залучається культивування мікроорганізмів у специфічних умовах, де залежно від

ГФ) застосовуваного мікроорганізму і бажаного виходу стимулюється продукування біомаси, а в іншому, за інших умов культивування, залежно також від застосовуваного мікроорганізму і бажаного виходу стимулюється о продукування цільового органічного продукту. Ясно, що можливість керувати використанням джерела вуглецю у великомасштабному промисловому виробничому процесі робить останній більш гнучким і більш керованим, ніж бо до сих пір.

Крім того, винахід базується на тому спостереженні, що певними мікроорганізмами можна керувати генетичними засобами так, що майже все, якщо не цілком все, джерело вуглецю використовується для вироблення біомаси або бажаного органічного продукту. Зокрема винаходом пропонуються дріжджові клітини, модифіковані таким чином, щоб інактивувати шляхи біосинтезу, які відхиляють використання джерела вуглецю бо від вироблення біомаси або бажаного органічного продукту. Інактивація таких шляхів біосинтезу дає мікроорганізми, які можуть ефективно рости і виробляти бажаний продукт.

Взагалі предметом даного винаходу є дріжджові клітини, які містять екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид з ферментативною активністю в клітині. Ця нуклеїнова кислота може бути Включеною в геном клітини. Ферментативна активність приводить до створення органічного продукту, який в деяких варіантах здійснення винаходу секретується з клітини. Ця клітина має негативний фенотип дикої яблуні і виробляє органічний продукт. Така клітина може походити, наприклад, з роду Кісумеготусез, Ріспіа, Напзепиціа,

Сапаїда, Тгіспозрогоп або Матадагута. Органічним продуктом може бути, наприклад, продукт ферментації, продукт переробки пірувату, органічна кислота або карбоксилат, наприклад, лактат. В одному з варіантів 70 здійснення винаходу поліпептид може мати лактатдегідрогеназну активність. Наприклад, екзогенна нуклеїнова кислота може кодувати бактеріальну або грибкову лактатдегідрогеназу, наприклад, грибкову лактатдегідрогеназу К. Іасіів.

В іншому варіанті здійснення згадана клітина містить чотири екзогенні молекули нуклеїнової кислоти, які кодують різні поліпептиди. Наприклад, перша з цих чотирьох екзогенних молекул нуклеїнової кислоти може /5 Кодувати перший поліпептид, що має лактатдегідрогеназну активність, друга молекула може кодувати другий поліпептид, що має СоА-трансферазну активність, третя може кодувати третій поліпептид, що має лактил-СоА-дегідратазну активність, і нарешті четверта може кодувати четвертий поліпептид, що має акриліл-СоА-гідратазну активність. Карбоксилатним продуктом діяльності такої клітини може бути акрилат. В альтернативному варіанті перша з чотирьох екзогенних молекул нуклеїнової кислоти може кодувати перший поліпептид з 2-дегідро-З-деокси-О-пентаноатальдолазною активністю, друга молекула може кодувати другий поліпептид з ксилонатдегідратазною активністю, третя молекула може кодувати третій поліпептид з ксилонолактоназною активністю і четверта молекула може кодувати четвертий поліпептид з

О-ксилозодегідрогеназною активністю. Така клітина може виробляти вуглевод, наприклад, О-ксилозу як органічний продукт. с

Ще в одному варіанті здійснення винаходу клітина містить шість екзогенних молекул нуклеїнової кислоти, кожна з яких кодує свій поліпептид, що відрізняється від інших. Наприклад, перша з шести екзогенних молекул (8) нуклеїнової кислоти може кодувати перший поліпептид, що має 2,5-діоксовалератдегідрогеназну активність, друга молекула може кодувати другий поліпептид, що має б5-дегідро-4-деокси-О-глюкаратдегідрогеназну активність, третя молекула може кодувати третій поліпептид, що має глюкаратдегідратазну активність, четверта («о зо Молекула може кодувати четвертий поліпептид, що має альдегіддегідрогеназну активність, п'ята молекула може кодувати п'ятий поліпептид, що має глюкуронолактонредуктазну активність, і нарешті шоста молекула може со кодувати шостий поліпептид, що має І-гулонолактоноксидазну активність. Продуктом діяльності такої клітини с може бути вітамін, наприклад, І -аскорбат як органічний продукт.

Органічний продукт може містити більше трьох атомів вуглецю і може бути, наприклад, амінокислотою. ї-

В іншому варіанті здійснення винаходу клітина здатна на катаболічне перетворення пентозного джерела ї- вуглецю, такого як рібоза, арабіноза, ксилоза і ліксоза.

Можливий також варіант, в якому клітина має знижену піруватдекарбоксилазну активність або знижену алкогольдегідрогеназну активність. Клітина може навіть зовсім не мати піруватдекарбоксилазної активності.

Знижена піруватдекарбоксилазна активність може бути наслідком дезінтегрування генетичного локусу, який у « Нормальному стані має послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує піруватдекарбоксилазу. В альтернативному пев) с випадку клітина може містити молекулу "проти сенсу", наприклад, рібозиму, яка відповідає послідовності ендогенної нуклеїнової кислоти, де ця молекула знижує піруватдекарбоксилазну активність. Клітина може також з містити додаткову молекулу екзогенної нуклеїнової кислоти, яка діє як плазміда-кілер.

В іншому варіанті здійснення ферментативна активність поліпептиду, кодованого екзогенною нуклеїновою Кислотою, приводить до створення органічного продукту шляхом споживання МАОН. -І Можливий також варіант, в якому клітина виробляє принаймні бог органічного продукту на кожні 100г споживаної глюкози за умов культивування, які є оптимальними для вироблення органічного продукту. ш- Згідно з іншою ознакою даного винаходу пропонується клітина, наприклад, дріжджова, яка містить екзогенну оо молекулу нуклеїнової кислоти, котра кодує поліпептид, що стимулює катаболічне перетворення пентозного джерела вуглецю цією клітиною. Таким поліпептидом може бути, наприклад, ксилозоредуктаза, со ксилітолдегідрогеназа або ксилулокіназа, а пентозним джерелом вуглецю може бути, наприклад, рібоза,

Ф арабіноза, ксилоза і ліксоза. Клітина може також піддавати катаболічному перетворенню гексозу і, якщо потрібно, водночас катаболічно перетворювати гексозу і пентозу. Гексозним джерелом вуглецю може бути, наприклад, алоза, альтроза, глюкоза, маноза, гулоза, йодоза, фруктоза, галактоза і талоза.

Згідно з ще однією ознакою даний винахід пропонує дріжджову клітину, що містить екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, що стимулює акумулювання ацетил-СоА в цитоплазмі клітини. Таким (Ф) поліпептидом може бути поліпептид з цитратліазною активністю або мітохондріальний мембранний поліпептид, ка що стимулює проникність ацетил-СоА через мітохондріальну мембрану. Клітина може мати знижену піруватдекарбоксилазну активність або знижену алкогольдегідрогеназну активність. В альтернативному випадку бо дріжджова клітина може не виробляти етанол і мати швидкість росту в етанол- і ацетат-дефіцитних умовах культивування, яка є більшою ніж швидкість росту, що спостерігається у порівняному етанол-дефіцитному продукуванню дріжджовими клітинами.

Згідно з ще однією ознакою даного винаходу пропонується дріжджова клітина зі зниженою активністю мітохондірального поліпептиду і негативним фенотипом дикої яблуні. Така клітина може бути, наприклад, із роду 65 Кінсумеготусевз, Ріспіа, Напзепша, Сапаїда, Тгіспозрогоп або Матадалута. У цієї клітини активність цілком відсутня. Вона може містити дезінтегрований локус, який звичайно включає у себе нуклеїнокислотну послідовність, що кодує мітохондріальний поліпептид. Таким мітохондріальним поліпептидом може бути фермент циклу Кребса. Крім того, ця клітина може акумулювати продукт циклу Кребса. Клітина може включати у себе молекулу екзогенної нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з ферментативною активністю усередині

Клітини, причому ця ферментативна активність приводить до створення органічного продукту таким чином, що ця клітина виробляє цей органічний продукт. Органічним продуктом може бути, наприклад, цитрат, о-кетоглутарат, сукцинат, фумарат, малат і оксалоацетат. Зазначеним поліпептидом може бути поліпептид, що бере участь у катаболізмі лактату або ацетату.

Ще однією ознакою даного винаходу є спосіб вироблення органічного продукту. Цей спосіб включає у себе 7/о надання дріжджових клітин, які містять молекулу екзогенної нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з ферментативною активністю усередині клітин, причому ця ферментативна активність приводить до створення органічного продукту, а клітини мають негативний фенотип дикої яблуні, і культивування клітин у культурному середовищі так, що виробляється бажаний органічний продукт. Згадані дріжджові клітини можуть бути із роду

Кінулеготусевз, Ріспіа, Напзепціа, Сапаїда, Тгіспозрогоп або Хатада;ута. Згаданим органічним продуктом може 7/5 бути продукт ферментації, продукт переробки пірувату, органічний продукт, що містить більше трьох атомів вуглецю, карбоксилат, вуглевод, амінокислота, вітамін або ліпідний продукт. Органічним продуктом може бути також лактат, гліцерол, акрилат, ксилоза, аскорбат, цитрат, ізоцитрат, о-кетоглютарат, сукциніл-СоА, сукцинат, фумарат, малат або оксалоацетат. У деяких варіантах здійснення винаходу органічний продукт секретується клітинами. Даний спосіб може давати клітини зі зниженою піруватдекарбоксилазною активністю або зниженою 2о алкогольдегідрогеназною активністю. Ця ферментативна активність може приводити до створення органічного продукту шляхом споживання МАОН.

Клітини, одержані у ці способи, можуть виробляти принаймні близько бог органічного продукту на кожні 100г споживаної глюкози, коли стадія культивування є оптимальною для вироблення цього органічного продукту.

Культурне середовище, яке може бути рідким, може включати у себе інгібітор клітинного дихання такий, як Га 2; антиміцин А, ціанід або азид. Стадія культивування може включати у себе вирощування клітин в аеробних умовах з наступним приведенням цих клітин у контакт з інгібітором клітинного дихання. о

В альтернативному варіанті здійснення винаходу стадія культивування включає у себе інкубування клітин в анаеробних умовах культивування. Ще в одному варіанті здійснення стадія культивування включає у себе вирощування клітин в аеробних умовах росту з наступним інкубуванням цих клітин в анаеробних умовах (Те)

Культивування. Стадія культивування може також включаючи у себе культивування клітин при температурі більше ніж приблизно 3520. со

В одному з варіантів здійснення винаходу культурне середовище має величину органічного рН менше ніж со приблизно 3,0 і/або величину неорганічного рН менше ніж приблизно 3,0. В іншому варіанті здійснення культурне середовище містить пентозне джерело вуглецю, наприклад, рібозу, арабінозу, ксилозу або ліксозу. Культурне - середовище може також включати у себе гідролізат маїсового волокна з величиною рН, наприклад, приблизно /-|Їч« від 2,0 до 6,5.

Предметом даного винаходу є також спосіб вироблення органічного продукту, який включає у себе: а) надання дріжджових клітин, що містять екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, котрий « стимулює катаболічне перетворення пентозного джерела вуглецю клітиною, причому згадана клітина має ферментативну активність, що приводить до створення згаданого органічного продукту; і Б) культивування - с згаданих клітин у культурному середовищі так, що виробляється органічний продукт. ц Згідно з ще одним предметом даного винаходу пропонується спосіб вироблення органічного продукту, який "» включає у себе: а) надання дріжджових клітин, що містять екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, котрий стимулює акумулювання ацетил-СоА в цитоплазмі клітини, причому згадана клітина має ферментативну активність, що приводить до створення згаданого органічного продукту; і Б) культивування клітин -і у культурному середовищі так, що виробляється органічний продукт. -1 Предметом даного винаходу є також спосіб вироблення органічного продукту, який включає у себе: а) надання дріжджових клітин зі зниженою активністю мітохондріального ферменту, причому зниження активності (95) приводить до акумулювання органічного продукту; і Б) культивування згаданих клітин у культурному середовищі со 50 так, що виробляється органічний продукт.

Згідно з ще одним предметом даного винаходу пропонується спосіб культивування дріжджових клітин 42) негативного фенотипу дикої яблуні, який включає у себе культивування клітин у культурному середовищі, яке має величину органічного рН менше, ніж приблизно 3,0, і/або величину неорганічного рН менше, ніж приблизно 3,0. Стадія культивування може включати у себе культивування клітин при температурі більше, ніж приблизно 359С. Культурне середовище може містити інгібітор клітинного дихання. Культурне середовище може також о містити пентозне джерело вуглецю. В іншому варіанті здійснення винаходу культурне середовище може містити гідролізат маїсового волокна. їмо) Згідно з ще однією особливістю даного винаходу пропонується спосіб культивування дріжджових клітин негативного фенотипу дикої яблуні, який включає у себе культивування клітин у культурному середовищі, яке 60 містить гідролізат маїсового волокна.

Згідно з ще однією особливістю даного винаходу пропонується спосіб культивування дріжджових клітин негативного фенотипу дикої яблуні, який включає у себе культивування клітин у культурному середовищі при температурі більше, ніж приблизно 3592С, причому це культурне середовище має величину неорганічного рн менше, ніж приблизно 3,0. 65 Згідно з ще однією особливістю даного винаходу пропонується спосіб культивування дріжджових клітин негативного фенотипу дикої яблуні, який включає у себе культивування клітин у культурному середовищі при температурі більше, ніж приблизно 352С, причому це культурне середовище містить пентозне джерело вуглецю.

Згідно з ще однією особливістю даного винаходу пропонується спосіб культивування дріжджових клітин негативного фенотипу дикої яблуні, який включає у себе культивування клітин у культурному середовищі при температурі більше, ніж приблизно 359С, причому це культурне середовище містить гідролізат маїсового волокна.

Згідно з подальшою особливістю даного винаходу пропонується конструкція нуклеїнової кислоти, яка містить рекомбінантну послідовність і вибрану послідовність, причому рекомбінантна послідовність відповідає геномній послідовності клітини негативного фенотипу дикої яблуні, де геномна послідовність кодує експресований 70 Кклітиною фермент, а вибрана послідовність кодує фермент, що приводить до створення органічного продукту усередині клітини. Вибрана послідовність може знаходитися усередині рекомбінантної послідовності так, що ця вибрана послідовність на кожному своєму кінці має рекомбінантну послідовність.

Ще однією особливістю даного винаходу є запропонований спосіб одержання рекомбінантної дріжджової клітини, який включає у себе: надання дріжджової клітини негативного фенотипу дикої яблуні; вибирання 75 Кінцевого продукту; визначення того, який екзогенний фермент чи ферменти потрібно добавляти в клітину для вироблення кінцевого продукту; визначення того, активність якого ендогенного ферменту чи ферментів потрібно зменшити в даній клітині для того, щоб надати можливість вироблення в ній кінцевого продукту; добавлення визначеного екзогенного ферменту чи ферментів в надану дріжджову клітину і зниження активності визначеного ендогенного ферменту чи ферментів у наданій дріжджовій клітині так, щоб клітина виробляла кінцевий продукт 2о за даних умов культивування.

Подальшим предметом даного винаходу є гідролізат маїсового волокна, який має величину рН у межах приблизно від 2,0 до 6,5. Цей гідролізат може містити глюкозу, ксилозу й арабінозу. Гідролізат може містити приблизно 40г/л глюкози, приблизно 4Ог/л ксилози і приблизно 20г/л арабінози. В альтернативному варіанті гідролізат може містити приблизно З8,7г/л глюкози, приблизно 39,1г/л ксилози, приблизно 20,7г/л арабінозмі с приблизно 1,бг/л фурфуралу.

Предметом даного винаходу є також спосіб одержання органічного продукту, який включає у себе: а) о культивування мікроорганізму в даних умовах культури, де мікроорганізм має знижену ферментативну активність; ферментативною активністю при цьому може бути піруватдекарбоксилазна, алкогольдегідрогеназна, альдегіддегідрогеназна або ацетил-СоА-синтазна активність. Мікроорганізм при цьому виказує швидкість росту «о зо за відсутності етанолу й ацетату принаймні приблизно 3095 від тієї що спостерігається у відповідного мікроорганізму, що не має такої зниженої ферментативної активності; і Б) зміну умов культивування для со стимулювання вироблення органічного продукту. со

Ще одним предметом даного винаходу є запропонований спосіб одержання органічного продукту, який включає у себе: а) культивування мікроорганізму в даних умовах культури, які стимулюють клітинне дихання, де т 3з5 мікроорганізм має знижену ферментативну активність; ферментативною активністю при цьому може бути |ч- піруватдекарбоксилазна, алкогольдегідрогеназна, альдегіддегідрогеназна або ацетил-СоА-синтазна активність, причому мікроорганізм виказує швидкість росту за відсутності етанолу й ацетату принаймні приблизно 3095 від тієї, що спостерігається у відповідного мікроорганізму, що не має такої зниженої ферментативної активності; і «

Б) зміну умов культивування для зниження клітинного дихання, стимулюючи тим самим вироблення органічного продукту. - с Якщо не зазначено іншого, то всі застосовані тут науково-технічні терміни мають звичайні значення, ц загальноприйняті у даній галузі і відомі фахівцям, яких стосується даний винахід. Хоча в практичному "» здійсненні або у випробуваннях даного винаходу можуть застосовуватися подібні або еквівалентні описаним тут способи і матеріали, відповідні способи і матеріали описані нижче. Всі публікації, патентні заявки, патенти та інші згадані тут літературні джерела включені у даний опис шляхом посилань в усій їхній повноті. У разі -І конфліктної ситуації даний опис призначений служити в якості базового документу для урегулювання справи.

Крім того, описані тут матеріали, способи і приклади мають" виключно ілюстративне, а не обмежувальне - призначення. о Інші ознаки і переваги даного винаходу будуть докладно з'ясовані у подальшому опису й окреслені у Формулі винаходу. со Фіг.1. Схема, що ілюструє плазміду РНЕ5. 4) Фіг.2. Схема, що ілюструє плазміду РЗЕН.

Фіг.3. Схема, що ілюструє генерацію плазмід рекІЇ, які містять І п-14й або Ра-14п.

Фіг.4. Схема, що ілюструє плазміди 1аП/рскІЇ!.

Фіг.5. Схема, що ілюструє генерацію плазмід рНЕ5, які містять І п-14й або Ра-14п.

Фіг.бА. Схема, що ілюструє генерацію нокаут-фрагмента піруватдекрбоксилази (РОС). о Фіг.68. Схема, що ілюструє 5,5 Кор фрагмент, який оточує 1,7 Кор РОС К. тагхіапив. ко ФігбС. Схема, що ілюструє делецію 400 рЬ гомологічної ділянки 5,5 Кор РОС і інсерцію гена стійкості до канаміцину. 60 Фіг.6Ю0. Схема, що ілюструє 4 КбЬ ділянку, яка містить ген стійкості до канаміцину і оточує 2,3 Кор РОСТІ.

Фіг.бЕ. Схема, що ілюструє 7,5 Кор РОСТІ К. Тпептойоіегапз і навколишню ділянку.

Фіг.6г. Схема, що ілюструє делецію 750 Ьр із 1,7 Кор гена РОСТІ і інсерцію гена стійкості до канаміцину.

Фіг.7. Графік росту (оптична густина, ОБ) в часі (години) Кісулхеготусевз тагхіапиз, вирощуваних в умовах низького рН (рнН 2,5) і високої температури (402). 6Е Фіг.8. Графік росту (оптична густина, ОБ) в часі (години) К. тагхіапиз, вирощуваних з глюкозою, ксилозою або арабінозою при температурі 3096.

Фіг.9. Графік росту (оптична густина, ОО) в часі (години) К. тагхіапиз, вирощуваних з гідролізатом маїсового волокна при температурі 3090.

Фіг.10. Графік росту (оптична густина, ОБ) в часі (години) К. тагхіапиз, вирощуваних при температурі З09С і зазначеному рН.

Фіг.11. Графік росту (оптична густина, ОБ) в часі (години) К. тагхіапиз, вирощуваних при температурі З09С і зазначеному рН за наявності 40 г молочної кислоти.

Фіг.12. Три графіки залежності вироблення біомаси (А), споживання глюкози (В) і вироблення етанолу (С) мікроорганізмами 5. имагит і К. тагхіапизх, культивованими на мінеральному середовищі з 295 глюкози в 70 аеробних умовах.

Фіг.13. Три графіки залежності вироблення біомаси (А), споживання глюкози (В) і вироблення етанолу (С) мікроорганізмами 5. имагит і К. тагхіапизх, культивованими на мінеральному середовищі з 295 глюкози в анаеробних умовах.

Фіг.14. Плазмідна карта промоторного вектора РОСТІ.

Даним винаходом пропонуються способи і матеріали, що стосуються вироблення органічних продуктів.

Зокрема, винаходом пропонуються дріжджові клітини, способи культивування дріжджових клітин, способи одержання дріжджових клітин, конструкції нуклеїнових кислот, способи і матеріали для вироблення різноманітних органічних продуктів.

Запропоновані дріжджові клітини можуть використовуватися для вироблення органічних продуктів. Такі органічні продукти можуть використовуватися в широких межах практичного застосування. Наприклад, органічні продукти, вироблені описаними тут дріжджовими клітинами, можуть використовуватися в якості консервантів або добавок в їжу, фармацевтичних і косметичних продуктів, а також для виготовлення пластмас та інших продуктів.

Для цілей даного винаходу органічним продуктом є будь-яка сполука, що містить атом вуглецю. Наприклад, органічними продуктами є карбоксилати (наприклад, лактат, акрилат, цитрат, ізоцитрат, о-кетоглютарат, Ге! сукцинат, фумарат, малат, оксалоацетат), вуглеводи (наприклад, О-ксилоза), альдітоли (наприклад, ксилітол, (5) арабітол, рібітол), амінокислоти (наприклад, гліцин, триптофан, глютамат), ліпіди, ефіри, вітаміни (наприклад, І-аскорбат), поліолі (наприклад, гліцерол, 1,3-пропанедіол, еритритол), альдегіди, алкени, алкіни і кетони. Таким чином, органічний продукт може містити один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять і більше атомів вуглецю. Крім того, органічні продукти можуть мати молекулярну масу (Се) менше, ніж приблизно 1000 (наприклад, менше ніж приблизно 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 або 100). со

Наприклад, Ю-ксилоза (С5НіоО5) є органічним продуктом, молекулярна маса якого складає 150. Органічні продукти можуть бути також продуктами ферментації. Використовуваний тут термін "продукт ферментації" «9 стосується будь-якої органічної сполуки, одержаної шляхом ферментації. У загальному випадку спосіб м ферментації передбачає анаеробне ферментаційне перетворення органічних сполук таких, наприклад, як вуглеводи, на такі сполуки, як етиловий спирт, з накопиченням звільненої енергії у формі аденозинтрифосфату - (АТФ). Таким чином, ферментація відрізняється від клітинного дихання тим, що в якості акцепторів електронів тут використовуються органічні продукти, а не молекулярний кисень. У якості прикладів продуктів ферментації можна назвати, не обмежуючись лише ними, ацетат, етанол, бутират і лактат. «

Органічними продуктами можуть бути також продукти переробки пірувату. Використовуваний тут термін "продукт переробки пірувату стосується будь-якої сполуки, синтезованої з пірувату не більш ніж за 15 - с ферментативних стадій. Ферментативною стадією є будь-яка хімічна реакція або серія реакцій, каталізованих и поліпептидом, що має ферментативну активність. Використовуваний тут термін "поліпептид, що має є» ферментативну активність" стосується будь-якого поліпептиду, що каталізує хімічні реакції між іншими речовинами, залишаючись по завершенні реакції або реакцій незруйнованим і незміненим. Ферментативний поліпептид, як правило, каталізує створення одного і більше продуктів із одної і більше речовин. Такі -і поліпептиди можуть мати будь-який тип ферментативної активності, включаючи, але не обмежуючись лише цим, -1 ферментативну активність, зв'язану з такими ферментами, як аконітаза, ізоцитратдегідрогеназа, кетоглутаратдегідрогеназа, сукцинаттіокіназа, сукцинатдегідрогеназа, фумараза, малатдегідрогеназа, (95) цитратсинтаза, 2,5-діоксовалератдегідрогеназа, 5-дегідро-4-деокси-О-глюкаратдегідрогеназа, со 50 глюкаратдегідратаза, альдегіддегідрогеназа, глюкурунолактонредуктаза, ІЇ-гулонолактоноксидаза, 2-дегідро-3-деокси-О-пентаноатальдолаза, ксилонатдегідратаза, ксилонолактоназа, Ю-ксилозодегідрогеназа, 4) лактатдегідрогеназа, СоА-трансфераза, лактил-СоА-дегідратаза або акриліл-СоА-гідратаза.

Слід зауважити, що поліпептид з даною ферментативною активністю може бути як природного, так і неприродного походження. Поліпептидом природного походження є будь-який поліпептид, що має амінокислотну послідовність, котра зустрічається в природі, включаючи поліпептиди дикого типу і поліморфні о поліпептиди. Поліпептиди природного походження можуть одержуватися від будь-яких видів і, у тому числі, ссавців, грибкових і бактеріальних видів. Поліпептидом неприродного походження може бути будь-який іме) поліпептид, амінокислотна послідовність якого в природі не зустрічається. Отже поліпептидом неприродного походження може бути мутована версія поліпептиду природного походження або поліпептид, одержаний за 60 методами генної інженерії. Наприклад, поліпептидом неприродного походження з цитратсинтазною активністю може бути мутована версія природного поліпептиду з цитратсинтазною активністю, в котрій залишилась принаймні деяка цитратсинтазна активність. Поліпептид може бути мутований, наприклад, добавленнями, делеціями і/або заміщеннями послідовностей.

Органічний продукт не є продуктом переробки пірувату, якщо він синтезований із пірувату за більш ніж 15 65 ферментативних стадій. В число продуктів переробки пірувату входять, не обмежуючись лише ними, цитрат, а-кетоглутарат, сукцинат, фумарат, малат, оксалоацетат, 2-дегідро-З-деокси-ЮО-ксилонат, Ю-ксилонат,

О-ксилонолактон, О-ксилоза, акрилат, ацетат, етанол, бутират і лактат.

Для цілей даного винаходу карбоксилатні продукти, які можуть бути у "вільнокислотній" або "сольовій" формі, одержують тут назви відповідно до номенклатури сольових форм. Наприклад, молочна кислота тут Зветься лактатом. Таким чином, у даному випадку терміном "лактат" охоплюються як молочна кислота, так і лактат.

Використовуваний тут термін "нуклеїнова кислота" охоплює як РНК, так і ДНК, включаючи кДНК, геномну ДНК, синтетичну (наприклад, хімічно синтезовану) ДНК. Нуклеїнова кислота може бути дволанцюговою або одноланцюговою. Одноланцюгова нуклеїнова кислота може являти собою ланцюг, що має сенс, або ланцюгом 7/0 "проти сенсу". Крім того, нуклеїнова кислота може бути кільцевою або лінійною.

Використовуваним тут терміном "екзогенний" стосовно молекули нуклеїнової кислоти і конкретної клітини визначається будь-яка молекула нуклеїнової кислоти, що не походить із даної клітини за природних умов. Отже всі молекули нуклеїнових кислот неприродного походження вважаються екзогенними до клітин, в які вони уведені. Слід зауважити, що молекули нуклеїнових кислот неприродного походження можуть містити /5 Нуклеїнокислотні послідовності або фрагменти нуклеїнокислотних послідовностей, які зустрічаються в природі за умов, що даної молекули нуклеїнової кислоти в цілому в природі не існує. Наприклад, молекула нуклеїнової кислоти, що містить послідовність геномної ДНК у векторі експресії, вважається молекулою нуклеїнової кислоти неприродного походження і отже є екзогенною до клітини, в яку вона уведена, оскільки цієї молекули нуклеїнової кислоти в цілому (геномна ДНК - вектор ДНК) в природі не існує. Таким чином, будь-який вектор, що го автономно реплікує плазміду або вірус (наприклад, ретровірус, аденовірус, або вірус герпеса), якого в цілому в природі не існує, вважається молекулою нуклеїнової кислоти неприродного походження. Звідси випливає, що фрагменти сгеномної ДНК, продуковані полімеразно-ланцюговою реакцією (РСК) або оброблянням ендонуклеазою рестрикції а також кКДНК, розглядаються як молекули нуклеїнової кислоти неприродного походження, оскільки вони існують у формі відокремлених молекул, які в природі не зустрічаються. Звідси також сч об випливає, що будь-яка молекула нуклеїнової кислоти, яка містить промоторну послідовність і послідовність, що кодує поліпептид, (наприклад, КкКДНК або геномну ДНК) в структурі яка в природі не зустрічається, і) розглядається як молекула нуклеїнової кислоти неприродного походження.

Термін "ендогенний" стосується геномного матеріалу, який не є екзогенним. У загальному випадку ендогенний геномний матеріал створюється в організмі, тканині або клітині і не уводиться, а також не Ге зо модифікується за рекомбінантними методами. Ендогенний геномний матеріал не включає у сферу свого визначення варіації природного походження. со

Слід також зауважити, що молекула нуклеїнової кислоти природного походження може бути для даної с клітини екзогенною. Наприклад, ціла хромосома, виділена із клітини людини Х, вважається екзогенною молекулою нуклеїнової кислоти по відношенню до клітини людини МУ, якщо ця хромосома уведена в клітину ї-

Зв ЛЮДИНИ У. ї-

Використовуваний тут термін "генетично модифікований" стосується організму, геном якого був модифікований, наприклад, добавленням, заміщенням або делецією генетичного матеріалу. Способи добавлення або делеції генетичного матеріалу добре відомі і включають до свого числа, але не обмежуючись лише ними, неспецифічний мутагенез, точкові мутації, включаючи інсерції, делеції і заміщення, нокаут-методи і « трансформування організму нуклеїнокислотною послідовністю за допомогою рекомбінантних методів, з с включаючи як стабільні, так і перехідні трансформанти. Дріжджові клітини можуть також піддавати катаболічним

Й перетворенням крохмаль, як природним шляхом, так і через генетичну модифікацію, і можуть навіть бути а генетично модифіковані для катаболічного перетворення целюлози шляхом добавлення, наприклад, целюлази на грибковій основі. 1. Дріжджові клітини негативного фенотипу дикої яблуні -І Винаходом пропонуються різноманітні генетично регульовані дріжджові клітини негативного фенотипу дикої яблуні. Такі рекомбінантні дріжджові клітини можуть застосовуватися у виробленні органічних продуктів. - Наприклад, винаходом пропонується дріжджова клітина негативного фенотипу дикої яблуні, яка містить оо екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид з ферментативною активністю, котра приводить 5р до створення органічного продукту. Такі дріжджові клітини входять в об'єм даного винаходу з умови, що вони со виробляють органічний продукт. Слід зауважити, що вироблений органічний продукт може секретуватися

Ф дріжджовою клітиною, уникаючи необхідності розривання клітинної мембрани для його видобування. Типові дріжджові клітини за даним винаходом виробляють органічний продукт з виходом принаймні приблизно 40г (наприклад, принаймні 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90 або 95г) органічного продукту на кожні 100г ов споживаної глюкози при культивуванні в оптимальних для вироблення продукту умовах. Для оцінки виходу процесу вироблення органічного продукту даною дріжджовою клітиною може бути застосований будь-який

Ф) спосіб, див., наприклад, ІКіеге еї аї., Меаві, 14(5):459-469 (1998)). Слід також зауважити, що ферментативна ка активність кодованого поліпептиду може приводити до створення органічного продукту шляхом споживання

МАБОН. Іншими словами, вироблення даної органічної сполуки може потребувати МАОН у якості джерела енергії. бо Термін "МАС" стосується кофакторів, що діють як носії електрону й водню в даних окисно-відновних реакціях, у той час як термін "МАОН" стосується відновленої форми МАО. У якості прикладів органічних продуктів, синтез яких потребує МАОСН, можна назвати, але не обмежуючись лише ними, лактат, етанол, ацетат і акрилат. Як правило, дріжджові клітини згідно з даним винаходом піддають катаболічному перетворенню пентозне джерело вуглецю, таке як пентоза. Однак, такі дріжджові клітини можуть також піддавати каталітичному перетворенню 65 пентозне джерело вуглецю (наприклад, рібозу, арабінозу, ксилозу й ліксозу). ІншИМИ словами, дріжджова клітина за даним винаходом може використовувати пентозне джерело вугледю як природним шляхом, так і бути пристосованою штучно для використання пентозного джерела вуглецю. Наприклад, дріжджова клітина може бути наділена екзогенною молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує ксилозоредуктазу, ксилитолдегідрогеназу і/або ксилулокіназу так, що ксилоза може піддаватися катаболічному перетворенню. Дріжджові клітини можуть також катаболічно перетворювати крохмаль як природним шляхом, так і через генетичну модифікацію, і можуть бути навіть генетично модифіковані для катаболічного перетворення целюлози шляхом добавлення, наприклад, целюлози на грибковій основі.

Дріжджовою клітиною негативного фенотипу дикої яблуні є будь-яка дріжджова клітина, що не виказує ефекту дикої яблуні. Термін "негативний фенотип дикої яблуні" стосується організмів як природного походження, так і /о Генетично модифікованих. Коротко, ефект дикої яблуні полягає в інгібуванні споживання кисню мікроорганізмом при культивуванні його в аеробних умовах через наявність високої концентрації глюкози (наприклад, 50г глюкози/літр). Іншими словами, дріжджова клітина позитивного фенотипу дикої яблуні продовжує давати бродіння незалежно від доступності кисню завдяки наявності глюкози, у той час як дріжджова клітина негативного фенотипу дикої яблуні не виказує глюкозо-опосередкованого інгібування споживання кисню. У якості прикладів дріжджових клітин, які звичайно відносяться до негативного фенотипу дикої яблуні, можна назвати, але не обмежуючись лише ними, дріжджові клітини таких родів: Кісухеготусез, Ріспіа, Напзепшіа, Сапаїйда,

Тгіспозрогоп і Уатадагута.

Як згадувалося вище, винаходом пропонується багато різних типів рекомбінантних дріжджових клітин, здатних виробляти велике різноманіття органічних продуктів. Наприклад, дріжджова клітина може містити 2о екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, з лактатдегідрогеназною активністю так, що виробляється лактат. У якості прикладів таких поліпептидів можна назвати, але не обмежуючись лише ними, бичачу лактатдегідрогеназу, бактеріальну лактатдегідрогеназу і грибкову лактатдегідрогеназу, наприклад, грибкову лактатдегідрогеназу К. Іасіз або К. (ПегтоіоІегап5. Тут також поліпептиди, що володіють ферментативною, наприклад, лактатдегідрогеназною активністю, можуть бути як природного, так і неприродного с г поХОДЖжеНння.

Слід зауважити, що описані тут дріжджові клітини можуть містити одну копію або багато копій (наприклад, і) приблизно 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 або 150 копій) даної екзогенної молекули нуклеїнової кислоти. Наприклад, дріжджова клітина може містити 50 копій екзогенної молекули Х нуклеїнової кислоти. Слід зауважити також, що описані тут дріжджові клітини можуть містити більш ніж одну екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти. Ге зо Наприклад, дріжджова клітина може містити приблизно 50 копій екзогенної молекули Х нуклеїнової кислоти, а також приблизно 75 копій екзогенної молекули У нуклеїнової кислоти. У даному випадку молекули нуклеїнових со кислот двох різних типів можуть кодувати різні поліпептиди зі своєю власною ферментативною активністю. /((е

Наприклад, дріжджова клітина може містити чотири різні екзогенні молекули нуклеїнової кислоти так, щоб вироблявся акрилат. У даному прикладі така дріжджова клітина може містити першу екзогенну молекулу - нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з лактатдегідрогеназною активністю, другу молекулу, що кодує ї- поліпептид з СоА-трансферазною активністю, третю молекулу, що кодує поліпептид з лактил-СоА-дегідратазною активністю, і нарешті четверту молекулу, що кодує поліпептид з акрил-СоА-гідратазною активністю. В іншому варіанті дріжджова клітина може містити чотири різні екзогенні молекули нуклеїнової кислоти так, щоб вироблялася ЮО-ксилоза. Зокрема, така дріжджова клітина може містити першу екзогенну молекулу нуклеїнової «

Кислоти, що кодує поліпептид з 2-дегідро-3-деокси-О-пентаноатальдолазною активністю, другу молекулу, що /7- с кодує поліпептид з ксилонатдегідратазною активністю, третю молекулу, що кодує поліпептид з ксилонолактоназною активністю і четверту молекулу, що кодує поліпептид з Ю-ксилозодегідрогеназною ;» активністю. Можливий також варіант, в якому дріжджова клітина містить шість різних екзогенних молекул нуклеїнової кислоти так, щоб вироблявся вітамін І-аскорбат. Зокрема, така дріжджова клітина може містити першу екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з 2,5-діоксовалератдегідрогеназною -І активністю, другу молекулу, що кодує поліпептид з 5-дегідро-4-деокси-О-глюкаратдегідрогеназною активністю, третю молекулу, що кодує поліпептид з глюкаратдегідратазною активністю, четверту молекулу, що кодує - поліпептид з альдегіддегідрогеназною активністю, п'яту молекулу, що кодує поліпептид з оо глюкуронолактонредуктазною активністю, і шосту молекулу, що кодує поліпептид з І-гулонолактоноксидазною активністю. со Слід зауважити, що ферментативні поліпептиди можуть використовуватися таким чином, щоб цільовий

Ф органічний продукт був оптично чистим (наприклад, приблизно 90, 95, 9995 чистоти). Наприклад, поліпептид з (І)-лактатдегідрогеназною активністю може застосовуватися для вироблення (І )-лактату.

Дріжджові клітини за даним винаходом можуть також мати знижену ферментативну, наприклад, піруватдекарбоксилазну і/або алкогольдегідрогеназну активність. Термін "знижений", застосовуваний тут по відношенню до клітини і даної ферментативної активності, означає більш низький рівень ферментативної (Ф) активності, ніж рівень, виміряний у порівняної дріжджової клітини того ж виду. Таким чином, дріжджова клітина ка з дефіцитом піруватдекарбоксилазної активності розглядається як така, що має знижену піруватдекарбоксилазну активність, оскільки більшість порівняних дріжджових клітин, якщо не всі вони, мають принаймні деяку во піруватдекарбоксилазну активність. Такі знижені рівні ферментативної активності можуть бути результатом знижених концентрацій ферменту, зниженої питомої активності ферменту або того й іншого разом. Для одержання дріжджових клітин зі зниженою ферментативною активністю можуть застосовуватися найрізноманітніші способи. Наприклад, за допомогою генної інженерії дріжджова клітина може бути наділена дезінтегрованим ферменто-кодувальним локусом із застосуванням загального мутагенезу або нокаут-методу, б5 див., наприклад, ІМеїййтодвз іп Меавзі Сепеїйісв (1997 еййоп), Адатв, Сойеспіїпо, Каївзег, апа б(іегпв, Соїй

Зргіпу Нагброг Ргезз (1998)). Для зниження ферментативної активності може застосовуватися також спосіб "проти сенсу". Наприклад, дріжджова клітина за методами генної інженерії може бути перетворена так, щоб містити

КДНК, що кодує молекулу "проти сенсу", яка запобігає утворенню ферменту. Термін "молекула проти сенсу" охоплює собою всі можливі молекули нуклеїнових кислот, які містять послідовності, що відповідають

Кодувальному ланцюгу ендогенного поліпептиду. Молекула "проти сенсу" може також мати флангові (наприклад, регуляторні) послідовності. Отже молекулами "проти сенсу" можуть бути рібозими або олігонуклеотиди "проти сенсу" Рібозима може мати будь-яку загальну структуру, у тому числі, шпилькоподібну, молотоподібну або сокироподібну структуру за умови, що ця молекула розщеплює РНК.

Ідентифікація дріжджових клітин зі зниженою ферментативною активністю може здійснюватися у будь-який 70 спосіб. Наприклад, дріжджова клітина зі зниженою піруватдекарбоксилазною активністю може бути легко ідентифікована за допомогою загальновідомих способів, описаних, наприклад, в (ШІбгісй, Меййоаз іп Епгутоіоду 18:109-115(1970)). 2. Дріжджові клітини позитивного і негативного фенотипів дикої яблуні

Винаходом також пропонуються різноманітні генетично регульовані дріжджові клітини, які не потребують /5 наявності у них негативного фенотипу дикої яблуні. Іншими словами такі клітини можуть бути як позитивного, так і негативного фенотипів дикої яблуні. Такі рекомбінантні дріжджові клітини можуть застосовуватися у виробленні органічних продуктів. Наприклад, винаходом пропонується дріжджова клітина, що містить екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, котра кодує поліпептид, що стимулює катаболічне перетворення цією клітиною пентозного джерела вуглецю (наприклад, рібози, арабінози, ксилози, ліксози). Зокрема, дріжджова клітина може го мати екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, котра кодує ксилозоредуктазу, ксилітолдегідрогеназу і/або ксилулокіназу так, що ксилоза може катаболічно перетворюватися більш ефективним шляхом. Крім того, дріжджові клітини, здатні катаболічно перетворювати пентозне джерело вуглецю, можуть також бути здатними катаболічно перетворювати гексозне джерело вуглецю (наприклад, алозу, альтрозу, глюкозу, манозу, гулозу, йодозу, галактозу й талозу) як послідовно, так і одночасно. Наприклад, дріжджова клітина може бути сч об Модифікована шляхом генної інженерії так, що катаболічне перетворювання ксилози і глюкози буде відбуватися одночасно. Слід зауважити, що дріжджові клітини з підвищеною здатністю катаболічно перетворювати пентозу (8) можуть застосовуватися для модифікації дріжджових клітин, здатних виробляти органічні продукти із пентозних джерел вуглецю. Ця властивість є особливо корисною, оскільки такі пентозні джерела вуглецю, як ксилоза, у загальному випадку є менш дорогими, ніж такі гексозні джерела вуглецю, як глюкоза. Серед інших вуглецевих (о зо джерел, які можуть піддаватися катаболічному перетворенню, можна назвати, не обмежуючись лише ними, мелібіозу, сахарозу, фруктозу, рафінозу, стахіозу, крохмаль (наприклад, маїсовий крохмаль і пшеничний со крохмаль) і гідролізат (наприклад, гідролізат маїсового волокна та інші целюлозні гідролізати). с

Крім того, винаходом пропонується дріжджова клітина, яка містить екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, котрий стимулює акумулювання ацетил-СоА в цитоплазмі клітини. Наприклад, дріжджова ї- клітина може мати екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з цитратліазною активністю. В ї- альтернативному варіанті дріжджова клітина може мати екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує мітохондріальний мембранний поліпептид, котрий стимулює ацетил-СоА-проникність крізь мітохондріальну мембрану. Слід зауважити, що багато дріжджових клітин, котрим бракує здатності виробляти етанол, не можуть рости за відсутності етанолу й ацетату. Як правило, дріжджова клітина не має здатності виробляти етанол, коли « їй тим чи іншим чином бракує піруватдекарбоксилазної або алкогольдегідрогеназної активності. Наприклад, пт») с дріжджі позитивного фенотипу дикої яблуні (наприклад, Засспаготусевз), у яких відсутня піруватдекарбоксилазна

Й активність, слабо ростуть за відсутності етанолу й ацетату. Таким чином, керування такими дріжджами а позитивного фенотипу дикої яблуні у напрямку зменшення продукування етанолу з метою переспрямування використання пірувату на інші органічні продукти (наприклад, лактат і акрилат) приводить до погіршення характеристик росту за відсутності етанолу й ацетату, і особливо тому що дріжджі позитивного фенотипу дикої -І яблуні обмежують клітинне дихання за наявності глюкози. Згідно з даним описом дріжджові клітини, здатні стимулювати акумулювання цитоплазмового ацетил-СоОА, який певним чином відрізняється від того, що

Ш- базується на концентрації цитоплазмового ацетату і ацетил-СоА-синтазної активності, можуть рости за оо відсутності етанолу й ацетату навіть, коли вони не є спроможними виробляти етанол. Слід зауважити, що дріжджові клітини, здатні рости за відсутності етанолу й ацетату, не маючи при цьому спроможності виробляти со етанол, можуть переспрямовувати використання пірувати на вироблення інших, ніж етанол, органічних

Ф продуктів.

Дріжджі будь-якого типу можуть містити екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, що стимулює акумулювання ацетил-СоА в цитоплазмі клітини. Наприклад, дріжджова клітина негативного або в позитивного фенотипу дикої яблуні може містити екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, що стимулює акумулювання ацетил-СоА в цитоплазмі клітини. Як правило, такі дріжджові клітини можуть бути

Ф) ідентифіковані (1) шляхом керування клітиною, що містить екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, таким чином, ка щоб вона не мала піруватдекарбоксилазної або алкогольдегідрогеназної активності, (2) шляхом визначення характеристик росту клітини, культивованої за наявності титраційних кількостей інгібітора дихання (наприклад, бо антиміцину А, ціаніду або азиду), і (3) порівняння цих характеристик росту з тими, що спостерігаються у порівняної дріжджової клітини, яка не містить екзогенної молекули нуклеїнової кислоти і яка також була регульована на відсутність піруватдекарбоксилазної або алкогольдегідрогеназної активності. Дріжджові клітини, визначені в результаті такого порівняння як такі, що мають більш сприятливі характеристики росту завдяки наявності екзогенної молекули нуклеїнової кислоти, вважаються такими, що містять екзогенну молекулу 65 нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, що стимулює акумулювання ацетил-СоОА в цитоплазмі клітини.

Дріжджові клітини, що містять екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, що стимулює акумулювання ацетил-СоА в цитоплазмі клітини, також можуть мати знижену ферментативну активність, наприклад, знижену піруватдекарбоксилазну і/або алкогольдегідрогеназну активність. Наприклад, дріжджова клітина може не мати здатності виробляти етанол. Звичайно, такі дріжджові клітини мають швидкість росту за умов культивування без етанолу й ацетату, яка є вищою (напрклад, приблизно 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100, 150, 20095 або більше), ніж швидкість росту, що спостерігається у порівняних дріжджових клітин (тобто дріжджових клітин, що не мають здатності виробляти етанол), які не містять екзогенної нуклеїнової кислоти і, до того ж, культивувалися за подібних умов (тобто без етанолу й ацетату).

Винаходом також пропонується дріжджова клітина зі зниженою активністю поліпептиду. Такі дріжджові 70 клітини можуть мати позитивний або негативний фенотип дикої яблуні. Наприклад, дріжджова клітина за даним винаходом може мати знижену активність поліпептиду плазмової мембрани (наприклад, переносника плазмової мембрани), цитоплазмового поліпептиду (наприклад, піруватдекарбоксилази) і/або мітохондріального поліпептиду (наприклад, піруватдегідрогенази). Термін "переносник плазмової мембрани" стосується поліпептидів, які полегшують рух органічних продуктів крізь плазмову мембрану. В якості прикладів таких поліпептидів можна назвати, без обмеження, переносники карбонової кислоти, такі як УЕМІ в 5. сегемізіде (номер доступу 024155 в генбанку (СепрапКк)). Термін "мітохондріальний поліпептид" стосується будь-якого поліпептиду, що функціонує в мітохондріях, включаючи без обмеження піруватдегідрогеназу, поліпептиди, що беруть участь в катаболізмі лактату або ацетил-СоА (наприклад, поліпептид цитохрому 62) і ферменти циклу

Кребса. До числа ферментів циклу Кребса належать аконітаза, ізоцитратдегідрогеназа, Кетоглутаратдегідрогеназа, сукцинаттіокіназа, сукцинатдегідрогеназа, фумараза, малатдегідрогеназа |і цитратсинтаза. Згідно з даним описом дріжджова клітина зі зниженою ферментативною активністю може повністю бути позбавленою даної ферментативної активності. Слід зауважити, що термін "знижена", використовуваний по відношенню до активності дріжджової клітини і поліпептиду, стосується більш низького рівня активності, ніж той, що спостерігається у порівняної дріжджової клітини того ж виду за подібних умов. сч

Таким чином, дріжджова клітина, позбавлена даної транспортної активності, вважається такою, що має знижену транспортну активність порівняно з клітиною, яка має принаймні деяку транспортну активність. Такі знижені і) поліпептидні активності можуть бути результатом зниженої концентрації поліпептидів, зниженої питомої активності поліпептиду або того й іншого разом. Для одержання дріжджової клітини зі зниженою поліпептидною активністю можуть застосовуватися будь-які способи. Наприклад, локус, який має нуклеїнокислотну «о зо послідовність, що кодує мітохондріальний поліпептид, може бути інактивований, наприклад, шляхом загального мутагенезу або за допомогою нокаут-методу. со

Слід зауважити, що дріжджові клітини зі зниженою активністю мітохондріального ферменту можуть «93 акумулювати продукти циклу Кребса (наприклад, цитрат, ізоцитрат, о-кетоглутарат, сукциніл-СоА, сукцинат, фумарат, малат і оксалоацетат). Наприклад, дріжджові клітини зі зниженою фумаразною активністю можуть - 3з5 акумулювати фумарат. Крім того, дріжджова клітина може містити екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що р кодує поліпептид з ферментативною активністю, яка приводить до створення органічного продукту так, що клітина виробляє органічний продукт.

Слід зауважити, що деякі продукти циклу Кребса не можуть проникати крізь мітохондріальну мембрану (наприклад, о-кетоглутарат і сукциніл-СоА). Отже зниження активності конкретних ферментів циклу Кребса буде « приводити до акумулювання певних продуктів циклу Кребса в порожнині мітохондрій. У цих випадках дріжджові й с клітини зі зниженою активністю ферменту циклу Кребса можуть бути за методами генної інженерії модифіковані ц так, щоб містити одну і більше екзогенних молекул нуклеїнової кислоти, кожна з яких буде кодувати поліпептид "» зі своєю особливою ферментативною активністю, а цільовий продукт циклу Кребса буде акумулюватися в цитоплазмі. Наприклад, зниження кетоглутаратдегідрогеназної активності буде мати результатом акумулювання о-кетоглутарату, що у свою чергу приведе до акумулювання ізоцитрату. Альфа-кетоглутарат не -і може проникати крізь мітохондріальну мембрану, у той час як ізоцитрат крізь неї проникати може. Таким чином, -1 ізоцитрат може акумулюватися в цитоплазмі клітини. Проте дріжджові клітини, які також містять екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з ізоцитратдегідрогеназною активністю, і експресують цей (95) функціональний поліпептид в цитоплазмі, можуть виробляти цитоплазмовий о-кетоглутарат. Таким чином, со 50 зниження активності конкретних ферментів циклу Кребса з наданням екзогенних молекул нуклеїнової кислоти, що кодують ті ж самі (або різні) ферменти циклу Кребса так, що вони можуть функціонувати в цитоплазмі, може 42) мати результатом вироблення різноманітних продуктів циклу Кребса (або продуктів, одержуваних переробкою продуктів циклу Кребса) в цитоплазмі.

Далі, винаходом пропонується дріжджова клітина зі зниженою активністю ферменту, який виводить використання вуглецевого джерела з процесу вироблення біомаси або бажаного органічного продукту. о Наприклад, ферменти гліцерольного або ацетоїнового шляхів можуть бути дезінтегровані так, що вуглецеве джерело в культурному середовищі буде використовуватися переважно для вироблення біомаси або бажаного ко органічного продукту. У якості прикладу ферменту гліцерольного шляху можна назвати без обмеження дигідроксіацетонфосфатредуктазу. У числі ферментів ацетоїнового шляху входять, не обмежуючись лише бо ними, о-ацетолактатсинтаза і 5х-ацетолактатдекарбоксилаза. Тут також для зниження активності ферменту може бути застосований будь-який спосіб.

Крім того, будь-які запропоновані тут дріжджові клітини можуть містити екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що діє як плазміда-кілер. Термін "плазміда-кілер' стосується молекули нуклеїнової кислоти, що дає один з видів дріжджів зі здатністю нейтралізувати інші види дріжджів. Наприклад, дріжджові клітини роду 65 Кіумеготусев, що містять плазміду-кілера, можуть запобігати росту дріжджів роду Засспаготусевз. Таким чином, дріжджові клітини, що мають плазміду-кілера, можуть використовуватися для запобігання виникненню проблем зі споживанням в промислових процесах. У додаток до цього дріжджовій клітині може бути наданий будь-який тип плазміди-кілера. Наприклад, плазміда-кілер, виділена із К. Іасіївх, може бути надана дріжджовій клітині К. тагхіапив. Дріжджові клітини, що містять плазміду-кілера, можуть бути легко ідентифіковані за допомогою загальновідомих способів, див., наприклад, |(Сипде еї аї., у). Васіегіої, 145(1):382-390 (1981); Сцупде апа

Кіада, Еиг. 9. Ерідетіо!.4:409-414 (1988) та МУезоіомузКі-і оимеІ еї аЇ, Мопсопмепіпа! уеавів (іп

Віосїесппоіоду: Кісумеготусез Іасіїз, ей. Кіаиз УМоїї, Зргіпдег мегіад, Вегіїп, р.138-201 (1996).

Подібним чином будь-яка із запропонованих тут дріжджових клітин може містити екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з АТФ-азною активністю, модифікований так, що ця дріжджова клітина /0 стає більш толерантною до навколишніх середовищ з низьким рН. Наприклад, дріжджова клітина може бути наділена АТФ-азою, яка ефективно підтримує низьку цитоплазмову концентрацію протонів, коли міжклітинна концентрація протонів є високою. Такі поліпептиди можуть бути модифіковані за допомогою генної інженерії так, як описано в роботі |Могзотте еї а!., (ЕМВО 3. 15:5513-5526 (1996)).

Слід зауважити, що будь-яка з описаних тут рекомбінантних дріжджових клітин може містити будь-яку комбінацію бажаних генетичних регулювань. Наприклад, дріжджова клітина позитивного фенотипу дикої яблуні може містити екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з цитратліазною активністю, а також екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид з ферментативною активністю, що приводить до створення органічного продукту.

З. Підходящі організми

Для використання згідно з даним винаходом підходящими є найрізноманітніші організми. Крім того, дріжджові мікроорганізми негативного і позитивного фенотипів дикої яблуні, такі, як Засспаготусез зр., включаючи 5. сегемівіде і 5. иймагит, Кісумеготусез, включаючи К. (ПпегтоіоІегапе, К. Іасів і К. тагхіапив, Рісніа,

Напзепша, включаючи Н. роїутогрпа, Сапаїйдіа, Тгіспозрогоп, Матадалута, включаючи У. звірів, або

Тогціазрога ргефгіепвіз, організми широкого ряду мікробних видів можуть також служити в якості хазяїнів для сч вироблення молочної кислоти. Наприклад, такий організм, як Кпігориз огугае, природний виробник молочної кислоти, може бути генетично модифікований на кислотну толерантність, підвищення виходу продукції і і) вироблення оптично чистої молочної кислоти. Організми АзрегаїІиз зрр. відомі також своєю здатністю виробляти різноманітні органічні кислоти, наприклад, лимонну кислоту, і переносити низьку рН. Способи генетичної модифікації Азрегоййиз зрр. для вироблення молочної кислоти добре відомі. Крім того, грибки такі, як Ге

Зо ЕПігориз і АвзрегоїПив зрр., виробляють ферменти, котрі дозволяють їм розкладати крохмаль та інші полімерні вуглеводи на мономерні вуглеводи для застосування їх у якості вуглецевого джерела. со

У розрахунку на вироблення молочної кислоти були та можуть генетично модифіковані такі прокаріоти, як с

Езспегіспіа соїї, 7утотопавз торбіїв і Васійиз зврр. Мікроорганізми, які були ідентифіковані як Васіїйив5 соадціапз, є також природними виробниками молочної кислоти і можуть далі генетично модифікуватися на ї- поліпшення вироблення молочної кислоти в умовах низького рн. ї-

Крім того, екстремофільні організми родини Агспеа можуть переносити дуже низькі рН і високі температури.

Генетичні модифікації деяких видів з цієї родини можуть давати штами для вироблення молочної кислоти. 4. Генетичні аспекти

Молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з ферментативною активністю, можна ідентифікувати й « одержувати у будь-який спосіб. Наприклад, для визначення того, чи має дана нуклеїнова кислота будь-яку в с гомологію послідовностей з відомими ферментативними поліпептидами, можуть застосовуватися стандартні методи секвенування нуклеїнових кислот і комп'ютерні програми, що транслюють нуклеїнокислотні послідовності ;» в амінокислотні послідовності на основі генетичного коду. Для порівняння різноманітних послідовностей можуть застосовуватися програми порівнювального аналізу послідовностей, наприклад, МЕСАГІОМ Ф (ОМАЗТАК,

Мадізоп, УМІ, 1997). Крім того, молекули нуклеїнових кислот, що кодують відомі ферментативні поліпептиди, -І можуть бути мутовані за допомогою загальновідомих способів молекулярного клонування (наприклад, сайт-спрямованого мутагенезу). До числа можливих при цьому мутацій входять, але не обмежуючись лише

Ш- ними, делеції, інсерції, заміни основ, а також різноманітні комбінації делецій, інсерцій і замін основ. Крім 2) того, для ідентифікації нуклеїнокислотної послідовності, що кодує поліпептид з ферментативною активністю, 5р Можуть використовуватися нуклеїнокислотні і амінокислотні бази даних (наприклад, СепВапкФ). При цьому в со якості запиту для пошуку у базі даних СепВапке може бути використана будь-яка амінокислотна послідовність,

Ф котра має деяку гомологію з поліпептидом, що має ферментативну активність, або будь-яка нуклеїнокислотна послідовність, що має певну гомологію з послідовністю, котра кодує поліпептид з ферментативною активністю.

Ідентифіковані таким чином поліпептиди можуть бути проаналізовані для визначення того, чи виказують вони дв ферментативну активність.

Молекули нуклеїнових кислот, що кодують даний поліпептид з ферментативною активністю, можуть бути

Ф) ідентифіковані й одержані за допомогою загальновідомих способів молекулярного клонування або хімічного ка синтезу нуклеїнових кислот, включаючи РСК (полімеразно-ланцюгову реакцію). Терміном "РСК" тут називають спосіб, за допомогою якого цільову нуклеїнову кислоту ампліфікують так, як описано в патенті США Мо4,683,195, бо а також описані тут подальші модифікації цього способу. У загальному випадку для конструювання олігонуклеотидних праймерів, що є ідентичними або подібними за послідовністю протилежним ланцюгам потенційного темплату, що піддається ампліфікуванню, використовуються дані про послідовності з кінців потрібної ділянки або за їх межами. За допомогою РСК нуклеїнокислотна послідовність може бути ампліфікована від РНК або ДНК. Наприклад, нуклеїнокислотна послідовність може бути виділена шляхом 65 РСкК-ампліфікації із всієї клітинної РНК, всієї геномної ДНК і кДНК, а також із послідовностей бактеріофагів, послідовностей плазмід, послідовностей вірусів і под. У разі використання РНК у якості джерела темплату для синтезу комплементарних ланцюгів ДНК може застосовуватися зворотна транскриптаза.

Далі, для ідентифікації й одержання молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з ферментативною активністю, можуть застосовуватися методи гібридизації нуклеїнових кислот. У якості зонда для ідентифікації подібної молекули нуклеїнової кислоти шляхом гібридизації за умов у діапазоні від помірних до жорстких можуть використовуватися будь-які молекули нуклеїнових кислот або їхні фрагменти, що кодують відомий ферментативний поліпептид. Такі подібні молекули нуклеїнових кислот можуть виділятися, піддаватися секвенуванню і аналізуватися для визначення того, чи має кодований поліпептид ферментативну активність.

Гібридизацію можна здійснювати шляхом Саузерн- або Нозерн-аналізу для ідентифікації послідовності ДНК 70 або РНК відповідно, що гібридизується з зондом. Зонд можна позначити радіоіїзотопом, наприклад, з2р, ферментом, дигоксигеніном або біотинілюванням. Аналіз ДНК або РНК можна проводити з електрофоретичним розділянням на агарозному або поліакриламідному гелі, перенесенням на нітроцелюлозну, нейлонову або іншу підходящу мембрану і гібридизацією зі зондом за допомогою стандартних методів, добре відомих фахівцям у даній галузі і описаним у розділах 7.39-7.52 |ЗатрьгоокК еї аї., (1989) МоіІесшаг Сіопіпу, зесопа еайіоп. Соїй 75 Зргіпд Нагрог І арогаїгу, Ріаіпміем, ММ). Зонд, як правило, має довжину принаймні близько 20 нуклеотидів.

Наприклад, зонд, що відповідає 20-нуклеотидній послідовності і кодує цитратліазу ссавця, може бути застосований для ідентифікації молекули нуклеїнової кислоти, що кодує грибковий поліпептид із цитроліазною активністю. Застосовуватися можуть також зонди довжиною як більше, так і менше, ніж 20 нуклеотидів.

Для введення екзогенної молекули нуклеїнової кислоти в клітини можуть застосовуватися будь-які підходящі способи. Фахівцям у даній галузі добре відомі численні способи уведення нуклеїнової кислоти в дріжджові клітини. Серед них можна назвати, наприклад, трансформацію, електропорацію, кон'югацію і злиття протопластів, див., наприклад, Мо еї аї., 9. ВасіегоЇї. 153:163-168 (1983); ЮОипепев еї аїЇ., Си. бепеї. 18:7-12 (1990); ВесКег апа Спцагепів, Меййодз іп Епгутоіоду 194:182-187(1991)).

Слід зауважити, що екзогенна молекула нуклеїнової кислоти в дріжджовій клітині за даним винаходом може Га знаходитися у будь-якій відповідній формі. Наприклад, вона може бути інтегрована в геном клітини або витримуватися у стані епісоми. Іншими словами, клітина за даним винаходом може бути стабільним або і) перехідним трансформантом. Крім того, як зазначалося вище, запропоновані дріжджові клітини можуть містити одну або численні копії (наприклад, приблизно 5, 10, 20, 35, 50, 75,100 або 150 копій) даної екзогенної молекули нуклеїнової кислоти. (Те)

Способи експресії амінокислотної послідовності із екзогенної молекули нуклеїнової кислоти добре відомі фахівцям у даній галузі. В число таких способів входить, наприклад, конструювання нуклеїнової кислоти таким со чином, щоб регуляторний елемент стимулював експресію послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує со поліпептид. Як правило, регуляторними елементами є послідовності ДНК, які регулюють експресію інших послідовностей ДНК на рівні транскрипції. Отже регуляторними елементами можуть бути, без обмеження, - промотори, енхансери, тощо. Що стосується способів експресії поліпептиду із екзогенної молекули нуклеїнової - кислоти в дріжджах, то вони також добре відомі фахівцям у даній галузі. Наприклад, добре відомі конструкції нуклеїнових кислот, здатні експресувати екзогенні поліпептиди в Кісумеготусевз, див., наприклад, (Патенти США

МоМо 4,859,596 і 4,943,529). «

Як зазначалося вище, дріжджові клітини за даним винаходом містять екзогенну молекули нуклеїнової 70 Кислоти, яка, наприклад, кодує поліпептид з ферментативною активністю, що має результатом створення - с органічного продукту. Добре відомі способи ідентифікації клітин, які містять екзогенну нуклеїнову кислоту. В ц число таких способів входять, не обмежуючись лише ними, способи РОК і гібридизації нуклеїнових кислот, і и"? серед них Нозерн- і Саузерн-методи аналізу. У Деяких випадках для визначення того, чи містить дана клітина конкретну нуклеїнову кислоту, можуть застосовуватися методи імуногістохімії і біохімічні методи з виявленням експресії ферментативного поліпептиду, кодованого даною молекулою нуклеїнової кислоти. Наприклад, для -І визначення того, чи містить дана дріжджова клітина цей кодований фермент, може використовуватися антитіло, специфічне до даного кодованого ферменту. Далі, для визначення того, чи містить дана клітина молекулу 7 нуклеїнової кислоти, що кодує ферментативний поліпептид, можуть застосовуватися біохімічні методи з оз виявленням органічного продукту, виробленого в результаті експресії даного ферментативного поліпептиду.

Наприклад, виявлення лактату після уведення екзогенної молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з со лактатдегідрогеназною активністю, в дріжджову клітину, яка звичайно не експресує такий поліпептид, може

ФО означати, що ця дріжджова клітина не тільки містить уведену екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, але також експресує кодований ферментативний поліпептид із цієї уведеної екзогенної молекули нуклеїнової кислоти.

Фахівцям у даній галузі добре відомі методи виявлення специфічної ферментативної активності або наявності даних органічних продуктів. Наприклад, наявність лактату може бути визначена так, як описано в роботі (М/Ще еї аї., 9. Вавіс Місгобіої!. 29:707-716 (1989)).

Ф, Винаходом пропонується також конструкція нуклеїнової кислоти, що містить послідовність рекомбінації і ко вибрану послідовність. Використовуваний тут термін "послідовність рекомбінації" стосується будь-якої нуклеїнокислотної послідовності, що відповідає геномній послідовності, яка знаходиться усередині клітини. бо Описані тут послідовності рекомбінації можуть використовуватися для спрямування рекомбінаційних подій в процесі генерування нокаут-організмів. ІНШИМИ словами, послідовність рекомбінації може використовуватися для специфічного дезінтегрування локусу, що містить нуклеїнокислотну послідовність, яка кодує даний фермент.

Термін "вибрана послідовність" включає у себе будь-яку нуклеїнокислотну послідовність. Як правило, вибрана послідовність кодує поліпептид з ферментативною активністю, що приводить до створення органічного продукту 65 В клітині. Таким чином, конструкції нуклеїнових кислот за даним винаходом можуть використовуватися для усунення активності ендогенного ферменту і добавлення активності екзогенного ферменту в одну стадію. У більшості випадків вибрана послідовність знаходиться в послідовності рекомбінації таким чином, що вибрана послідовність закривається на кожному кінці даною послідовністю рекомбінації. 5. Вироблення органічного продукту і способи культивування

Даним способом пропонуються способи вироблення органічних продуктів за допомогою запропонованих дріжджових та інших мікробних клітин. Ці способи передбачають надання дріжджових клітин і культивування наданих дріжджових клітин в культурному середовищі таким чином, щоб утворювався органічний продукт (наприклад, гліцерол, акрилат, ксилоза, аскорбат, лактат, цитрат, ізоцитрат, о-кетоглютарат, сукциніл-СоА, сукцинат, фумарат, малат і оксалоацетат. В цілому культурне середовище і/або умови культивування можуть 70 бути поділені на дві категорії: ті що стимулюють клітинне дихання і/або вироблення біомаси, і ті, що знижують клітинне дихання. Як правило, культурне середовище і/або умови культивування, що стимулюють клітинне дихання, використовуються в ситуаціях, коли потребується швидкий ріст або коли вироблюваний органічний продукт не може бути одержаний без клітинного дихання. В число таких продуктів входять без обмеження продукти циклу Кребса, тощо. З іншого боку, культурне середовище і/або умови культивування, що 7/5 Знижують клітинне дихання, використовуються в тих ситуаціях, коли швидкий ріст не потребується або не є бажаним, або ж коли вироблюваний органічний продукт може бути одержаний без клітинного дихання. В число таких продуктів входять лактат, акрилат, ксилоза та інші. Використовуваний тут термін "стимулювання клітинного дихання" або "стимулювання вироблення біомаси" стосовно умов культивування означає, що умови культивування клітин підтримуються такими, щоб джерело вуглецю в культурному середовищі метаболізувалося го переважно шляхом окисного дихання або для вироблення біомаси. Використовуваний тут термін "біомаса" означає суху масу організму. Використовуваний тут термін "переважно метаболізований для вироблення біомаси" означає, що на кожний грам витраченого (наприклад, принаймні 0,4, 0,45, 0,5 або 0,6 грами біомаси) джерела вуглецю (у формі карбогідрату) виробляється принаймні 0,Зг біомаси. У загальному випадку на кожний грам джерела вуглецю виробляється приблизно від 0,3 до 0,бг біомаси. Способи визначення кількості біомаси с (сухої маси клітин) в культурі добре відомі у даній галузі і включають у себе, наприклад, такі, що описані в (Розвіта еї а), "Еплутіс апаїузвів ої (Ше Стабігее оеПйесі іп діисове-йтней спетовіаї сийигев ої о

Засспаготусев сегемізіае", Аррі. Епумігоп. Місгобріоі., 53, 468-477 (1989); Кіеге еї аїЇ., "Кедшайоп о ої аІсопоїїс Теппепіайоп іп раїсп апа спетовіаї сийигез ої Кісумеготусев Іасів СВ5 2359", Меаві, 14,459-469 (1998)). Добре відомі також методи визначення кількості спожитого джерела вуглецю, серед яких можна назвати, «о наприклад, методи НРІ С (рідинної хроматографії високої розрізнювальної спроможності).

Слід зауважити, що ефективність використання джерела вуглецю може залежати від самого джерела со вуглецю і використовуваного організму. Отже у разі використання складного культурного середовища, яке со включає у себе окрім карбогідратних також інші джерела вуглецю, кількість біомаси, вироблюваної на грам джерела вуглецю, все одно визначається лише як кількість біомаси, вироблюваної на грам спожитого в

Зз5 Ккарбогідратного джерела вуглецю. че

У загальному випадку культурне середовище, що містить інгібітор клітинного дихання (наприклад, антиміцин

А, ціанід, азид), може зменшувати клітинне дихання, у той час як відсутність таких інгібіторів може клітинне дихання стимулювати. Подібним чином анаеробні умови культивування можуть зменшувати клітинне дихання, у той час як аеробні умови культивування можуть клітинне дихання стимулювати. Аеробними є такі умови, за яких « кисень уводиться або постачається природним шляхом і служить у якості основи для респіраторного шляху 8 с процесу перетворення. Взагалі, термін "аеробний" стосується умов культивування, за яких культурне й середовище витримується в потоці повітря величиною принаймні 0,1 МУМ (об'єм повітря/об'єм рідини/хвилина) и? (наприклад, більше ніж 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 МУМ). Якщо замість повітря використовується інший газ, то номінальна величина М/М встановлюється на рівень повітряного еквівалента, який визначається кількістю

КИСНЮ в газі. В альтернативному варіанті культурне середовище може визначатися як "аеробне", якщо вміст у -І ньому розчиненого кисню складає принаймні 295 (наприклад, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 8095) відносно його кількості за насичених умов культивування у повітрі під атмосферним тиском. і Анаеробними є такі умови культивування, за яких респіраторний процес перетворення умисне або г) природним шляхом практично позбавляється кисню, що приводить, наприклад, до вироблення такого Відновленого продукту, як етанол. Взагалі, умови, за яких культурне середовище містить розчинений кисень (00: со діззоїЇмей охудеп) у кількості менше, ніж приблизно 2,095 (наприклад, менше ніж приблизно 1,5, 1,0 або 0,595 або 4») дорівнює приблизно 095), вважаються анаеробними. Подібним чином умови, де МУМ (об'єм повітря/об'єм рідини/хвилина) є менше ніж приблизно 0,1 (наприклад, менше ніж приблизно 0,05 або дорівнює приблизно 0), розглядаються як анаеробні. Під використовуваним тут по відношенню до М/М терміном "повітря" мається на увазі атмосферне повітря. До інших умов культивування, які можуть впливати на клітинне дихання, належать, не обмежуючись лише ними, рН, температура і наявність певних джерел вуглецю (наприклад, глюкози). Слід іФ) зауважити, що деякі культурні середовища і/або умови культивування, які стимулюють клітинне дихання дріжджів ко одного виду, можуть зменшувати клітинне дихання дріжджів іншого виду. Наприклад, наявність глюкози в культурному середовищі зменшує клітинне дихання дріжджових клітин позитивного фенотипу дикої яблуні, але бо при цьому мало впливає або зовсім не впливає на клітинне дихання дріжджових клітин негативного фенотипу дикої яблуні.

Керована зміна умов культивування у промисловому виробничому процесі може, згідно з вищевикладеним, являти собою важливу стадію у досягненні оптимальних рівнів бажаного органічного продукту. Звичайно, дріжджова клітина згідно з даним винаходом вирощується за умов культивування, що стимулюють клітинне б5 дихання у розрахунку на вироблення суттєвої клітинної густини. Наприклад, дріжджові клітини можуть поміщуватися в посудину для культивування і в достатку забезпечуватися глюкозою і киснем. Звичайно, за умов,

що стимулюють клітинне дихання, час дуплікації для запропонованих тут мікроорганізмів складає менше ніж приблизно 10 годин (наприклад, менше ніж приблизно 8, 5 або З години). Як тільки клітини досягають значної густини, умови культивування можуть бути змінені на такі, що знижують клітинне дихання таким чином, щоб вироблявся органічний продукт, який не потребує клітинного дихання. Наприклад, дріжджові клітини можуть бути перенесені в посудину для культивування і забезпечені у достатку глюкозою, але без кисню. У цьому випадку керована зміна умов культивування з аеробних на анаеробні може привести до вироблення оптимальних кількостей бажаного органічного продукту. В альтернативному варіанті культивування клітин може проводитися лише за умов, що стимулюють клітинне дихання так, що виробляється органічний продукт, який клітинне дихання 70 потребує. Слід зауважити, що клітинна маса у посудині для культивування звичайно становить більше 2г/л (наприклад, більше ніж приблизно 4, 6 або 8Гг/л).

В процесі культивування температура може складати більше 352С (наприклад, більше ніж приблизно 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 або 45922). Крім того, культурним середовищем може бути рідина. Культурне середовище, звичайно, містить джерело вуглецю. У загальному випадку джерело вуглецю включає у себе 75 сировинні матеріали, що містять вуглеводи. Звичайно, живильне середовище містить також джерело азоту. У кращому варіанті джерело азоту включає у себе комбінацію органічних і неорганічних азотовмісних сполук.

Можливий робочий режим з наповненням великої ферментаційної посудини культурним середовищем, в яке входять всі потрібні живильні речовини і всі вуглеводні у кількості, достатній як для вироблення біомаси, так і для вироблення бажаного продукту. Посудина може працювати в умовах, де спочатку стимулюється вироблення біомаси, наприклад, шляхом створення аеробних умов з наступною зміною їх на анаеробні умови для вироблення бажаного продукту.

В іншому робочому режимі може використовуватися мала посудина для вироблення біомаси з високим рівнем живильних речовин і достатньою кількістю вуглеводу для продукування, наприклад, 100г/л біомаси. Вміст цієї посудини після цього можна перенести до більшої посудини з другим культурним середовищем, яке містить Га меншу кількість живильних речовин, наприклад, лише глюкозу в якості джерела вуглецю або інше вуглеводне джерело вуглецю у воді. Ця посудина може працювати в анаеробних умовах для вироблення бажаного о органічного продукту. Ріст біомаси при цьому зменшується завдяки зниженню рівня живильних речовин і анаеробним умовам.

У кращому варіанті здійснення винаходу живильне середовище містить лише потрібні матеріали з метою Ге) спрощення видобування цільового продукту. Використання аеробного росту дозволяє використовувати спрощене культурне середовище порівняно з тим, що потребується при рості в анаеробних умовах. Багато з со описаних тут дріжджів можуть культивуватися в аеробних умовах у середовищі, що складається лише із цукру, со неорганічного джерела азоту, слідів мінералів і деяких вітамінів.

Перед тим як в результаті ферментації чи інших процесів в культурному середовищі добавляється органічний - 3з5 продукт, це культурне середовище, зазвичай, має рН у межах приблизно від 5,0 до 7,0. Проте, як тільки в ч- культурне середовище мікроорганізмом секретуються органічні продукти, такі як органічні кислоти, рн культурного середовища отримує тенденцію до зменшення. Використовуваний тут термін "органічний рн" стосується рН культурного середовища, який визначається наявними у середовищі органічними сполуками, « якими є, наприклад, вуглеводи і, зокрема, молочна кислота. Термін "неорганічний рН" стосується рН, відповідальними за який є неорганічні сполуки, таких, наприклад, як НСІ і НьЗО). Культурне середовище може Ше с мати величину органічного рН менше ніж приблизно 3,0 (наприклад, менше ніж приблизно 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, ц 24,23, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 або 1,5) або величину неорганічного рН менше ніж приблизно 3,0 "» (наприклад, менше ніж приблизно 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 24, 2,3, 22, 2,1, 2,0, 1,95 1,8, 1,7, 1,6 або 1,5). В процесі культивування може використовуватися будь-яке джерело вуглецю. Наприклад, використовуватися може середовище, що містить пентозу (наприклад, рібозу, арабінозу, ксилозу і ліксозу). Крім -І того, можна використовувати середовище, що містить гідролізат маїсового волокна. Гідролізат маїсового волокна може мати величину рН у межах від 2,0 до 6,5. Зазвичай, гідролізат маїсового волокна містить глюкозу, ксилозу й арабінозу. Наприклад, вміст в ньому глюкози може складати приблизно 40г/л, ксилози - приблизно оз 40г/л і арабінози - приблизно 20Ог/л.

У великомасштабних промислових процесах використовуватися може ціла низка способів. Один з них со полягає в тому, що в бак великої ємності (наприклад, 50, 100, 200 і більше галонів) з відповідним культурним б середовищем, що містить, наприклад, гексозне і/або пентозне джерело вуглецю, інокулюють певний мікроорганізм. Після інокуляції умови культивування регулюють таким чином, щоб джерело вуглецю використовувалося переважно для вироблення біомаси. Наприклад, культурне середовище може бути Відрегульоване на величину рН приблизно 7,0, температуру приблизно 3592 і вміст розчиненого кисню, що створює анаеробне середовище в усьому баку. Слід зауважити, що бажаний органічний продукт може о вироблятися на цій фазі продукування біомаси. По досягненні достатньої кількості біомаси бульйон з іме) мікроорганізмами може бути перенесений до другого баку. Другий бак може мати будь-які розміри, за потребою, - більше, менше, або таких самих розмірів, що й перший бак. Зазвичай, другий бак є більшим ніж перший у тому бо розрахунку, щоб до бульйону з першого баку можна було добавляти додаткове культурне середовище. Окрім цього, культурне середовище в другому баку може бути таким самим, що й в першому баку, або відрізнятися від нього. Наприклад, перший бак може містити середовище з ксилозою й арабінозою, а другий - середовище з глюкозою.

Після перенесення культурного середовища у другий бак умови культивування можуть бути відрегульовані 65 так, щоб джерело вуглецю використовувалося, головним чином, на вироблення органічного продукту, який поряд з іншими речовинами може включати у себе продукти переробки пірувату і двоокис вуглецю (СО»), але не містити біомаси (тобто сухої маси клітин). Використовуване тут словосполучення "виробляти, головним чином, вибраний органічний продукт" або "вибраний продукт переробки пірувату" стосовно умов культивування означає, що джерело вуглецю в культурному середовищі піддається метаболічному перетворенню, як правило, шляхом ферментації (хоча і не обов'язково) для створення принаймні 0,5г органічного продукту на грам спожитого джерела вуглецю (наприклад, принаймні 0,6, 0,75 або 0 8г органічного продукту). Способи визначення кількостей виробленого органічного продукту і/або спожитого джерела вуглецю добре відомі і включають у себе, у тому числі, наприклад, НРІ С.

Як зазначалося вище, ефективність використання джерела вуглецю може варіювати залежно від 7/0 Використовуваних основи і організму. Отже, у разі використання комплексного середовища росту, яке включає у себе інші, ніж вуглеводи, джерела вуглецю (наприклад, амінокислоти), кількість вироблюваного органічного продукту або продукту переробки пірувату на грам спожитого джерела вуглецю буде визначатися лише кількістю органічного продукту або продукту переробки пірувату, виробленого на грам спожитого вуглеводного джерела вуглецю. Краще, якщо на цій стадії виробляється не більше ніж 0,Зг біомаси на грам джерела вуглецю (наприклад, не більше ніж 0,2, 0,1 або 0,05г біомаси).

Культурне середовище може бути відрегульоване, наприклад, на такий вміст розчиненого кисню, щоб створювати анаеробне середовище в усьому баку, або щоб містити інгібітор клітинного дихання. Крім того, культурне середовище може бути відрегульоване так, щоб підтримувати задану величину рН (наприклад, кислотну, нейтральну або основну). В альтернативному варіанті величина рН середовища для культивування

Може також регулюватися періодично, без підтримання будь-якого її конкретного рівня. Зазвичай, при виробленні органічної кислоти величина рН культурного середовища підтримується на рівні вище, ніж принаймні 1,5 (наприклад, принаймні 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,00, 6, або 7,0). Далі, в процесі катаболічного перетворення мікроорганізмами наданих вуглецевих джерел температура в баку підвищується.

Отже культурне середовище може бути відрегульоване так, щоб підтримувати задану температуру. с

Температура культурного середовища може також регулюватися періодично без підтримання заданого рівня.

Зазвичай, у разі використання теплочутливих мікроорганізмів температура культурного середовища і) підтримується на рівні менше ніж приблизно 352С (наприклад, менше ніж приблизно 34, 33, 32, 31 або 302), у той час як при використанні нечутливих до тепла мікроорганізмів температура середовища підтримується меншою ніж 4592С (наприклад, менше ніж 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36 або 3523). Слід зауважити, що біомаса «о може вироблятися на цій фазі вироблення органічного продукту. Крім того, умови культивування у другому баку можуть бути змінені один раз або змінюватися багатократно так, щоб виробляти не продукт, а біомасу, і со навпаки. Наприклад, умови культивування в другому баку можуть бути анаеробними більшу частину часу з со коротким імпульсним постачанням розчиненого кисню так, щоб періодично створювалися аеробні умови.

Згідно з іншим способом умови культивування можуть змінюватися так, щоб підвищувати метаболічну - з5 енергію мікроорганізму, що культивується, наприклад, шляхом добавлення кінцевого акцептора електронів. рч-

Використовуваний тут термін "метаболічна енергія" стосується енергії (вираженої в АТФ), видобутої даним організмом із енергетичного джерела (наприклад, вуглецевого) За тих самих умов кількість метаболічної енергії, отриманої організмом через метаболізм джерела вуглецю, є більшою ніж кількість енергії, отриманої « від того самого джерела вуглецю за інших умов.

Живі клітини є високоупорядкованими і повинні забезпечувати в собі порядок для того, щоб вижити і рости. - с Для підтримання порядку усередині організму в ньому кожної миті відбуваються тисячі різноманітних хімічних ц реакцій. Наприклад, клітинам потрібна енергія для реакцій біосинтезу, наприклад, таких, як реакції "» полімеризації ДНК, РНК і білків, і для утворення метаболічних продуктів. Клітинам потрібна також енергія для постачання в клітини субстратів, утримання метаболітів, підтримання відповідного тургорного тиску і

ВНнутрішнього рН, а також для забезпечення рухомості. -І Оскільки енергія не може бути ні створена, ні зруйнована, клітинам для підтримання порядку потрібно уводити її із навколишнього середовища. Енергія із навколишнього середовища постачається у формі електромагнітного випромінювання або хімічної енергії. Енергія, отримана із навколишнього середовища, о використовується клітиною за одним з двох загальних біохімічних механізмів - фосфорилювання рівня субстрату | електронного переносу. со У загальному випадку, за анаеробних умов АТФ ("клітинна валюта" за енергію) виробляється шляхом 4) фосфорилювання рівня субстрату. В результаті фосфорилювання рівня субстрату енергія звільнюється із хімічних зв'язків і накопичується, головним чином, у формі АТФ.

У якості утворення рівня субстрату може служити перетворення глюкози на піруват шляхом гліколізу:

Глюкоза-2Піруватин2АТтФгН».

Піруват після цього може перетворюватися на молочну кислоту: о Піруватя2Н.о-Лактат. ко Чиста енергія, вироблена в результаті цих перетворень, є еквівалентною 2 АТФ.

Далі піруват може бути підданий переробці у трикарбонокислотному (ТСА) циклі і генерувати додаткову 60 енергію і атоми водню:

Піруват-3зНаО-3СОоАТФІБН».

Чиста реакція глюкозного дихання має вигляд:

Глюкоза-бнаоО-6СОо4АТФІТ2Н».

Таким чином, шляхом фосфорилювання рівня субстрату повне респіраційне перетворення глюкози на СО 5 65 дає чисту енергію, еквівалентну 4 АТФ і 24 атомам водню.

У механізмі "електронного перенесення" окисно-відновні потенціали сполук, що складають члени "ланцюга електронного перенесення", зрівноважуються так, що кожний член може відновлюватися відновленою формою попереднього члена. Отже відновна сила, як і електрони, може проходити через ланцюг носійних молекул до кінцевого акцептора електронів, яким може бути кисень (О 5), нітрат (МОз) і фумарат. Добавлення кінцевого акцептора електронів, тобто кисню, нітрату або фумарату, в культурне середовище може дати мікроорганізму підвищену метаболічну енергію (наприклад, збільшене вироблення АТФ за тої самої кількості спожитого вуглецевого джерела). Найкращим кінцевим акцептором електронів є кисень.

Якщо в якості кінцевого акцептора електронів використовується кисень, то водень може бути перепущений через ланцюг електронного перенесення і надати клітині додатково 1,5 АТФ на атом водню і 4 АТФ на атом 7/0 кисню. У загальному випадку кількість метаболічної енергії може визначатися шляхом вимірювання відношення кількості спожитого кисню до кількості спожитої глюкози. В Табл.1 наведені дані максимального і мінімального поліпшення енергетичного виходу (молі АТФ на молі глюкози) при добавленні кисню в процесі вироблення в залежності від виходу продукту, який знижується внаслідок втрати пірувату на ТСА-цикл (а отже на дихання).

Максимальне поліпшення у відсотках було одержане, припускаючи, що відношення Р/О складає 3, у той час як 7/5 Мінімальне поліпшення припускає величину Р/О-0,5. В Табл.2 показана оцінена максимальна кількість кисню, витраченого на моль спожитої глюкози. Добавлення кисню може стимулювати мінімальний ріст, що буде ізолювати вуглець для біосинтезу, залишаючи невелику його кількість для дихання (а отже для використання кисню). ю вв 11111111 и нн нн нн п З з 1

Ф зо со о вю111111717111111111воою11111111111111111111111звою со ча з ці 1 вв111о6 вв 11м « о с вв1111м г» - о вв11111111111вм -І со Таким чином, для поліпшення метаболічної енергії мікроорганізмів у клітинній культурі в цю культуру в якості кінцевого акцептора електронів може добавлятися кисень. Тоді як максимальний молярний вихід молочної со кислоти із глюкози складає 2молі лактату на моль глюкози, а молярний вихід АТФ із глюкози складає 2молі АТФ

Ф на моль глюкози, добавлення кисню в якості кінцевого акцептора електронів дозволяє певну кількість пірувату скеровувати в лимонно-кислотний (ТСА) цикл, де він перетворюється на СО 5 і енергію. Отже постачання кінцевого акцептора електронів "підвищує метаболічну енергію" мікроорганізму.

Відведення пірувату в ТСА-цикл приводить до зниження кількості інших продуктів переробки пірувату (таких, як молочна кислота). Наприклад, 1095 зниження виходу може привести до генерування у 2,6 рази більшої (Ф. кількості метаболічної енергії для даного мікроорганізму, 20906 зниження виходу може привести до генерування у ко 4,2 рази більшої кількості метаболічної енергії для даного мікроорганізму, а 5095 зниження виходу може привести до генерування 9-кратно більшої кількості метаболічної енергії для даного мікроорганізму. во Можна очікувати, що на більш пізніх стадіях процесу, коли з'являються високі рівні метаболічних продуктів, наприклад, молочної кислоти, клітина може потребувати більшої кількості метаболічної енергії для підтримання функціонування.

Таким чином, для мікроорганізмів в анагробному культурному середовищі може стати потрібним постачати короткими імпульсами розчинений кисень. Краще, якщо "постачання короткими імпульсами розчиненого кисню" б5 створює культурне середовище з концентрацією розчиненого кисню не більше 0,5 відсотка, а ще краще, якщо в межах приблизно від 0,1 до 0,5 відсотка. В альтернативному варіанті швидкість росту або клітинне утримання мікроорганізмів в процесі анаеробної ферментації можуть бути прискорені добавленням інших кінцевих акцепторів електронів, якими є, наприклад, нітрат або фумарат. Кисень при цьому додається в кількостях, як раз достатніх для збільшення метаболічної енергії мікроорганізму за підтримання продуктивності на бажаному рівні. При цьому повинні бути прийняті заходи щодо уникнення надмірного зниження виходу. Цей метод може бути застосований також для того, щоб поліпшити споживання залишкових цукрів і тим самим ще більше спростити процес відновлення. 6. Способи очищення органічного продукту

Для відділяння виробленого продукту можуть застосовуватися будь-які підходящі способи. Наприклад, для 7/0 видалення біомаси з живильного бульйону можуть застосовуватися загальновідомі способи розділяння, а для видобування органічного продукту із живильного бульйону без мікроорганізмів можуть застосовуватися загальновідомі способи відокремлювання (наприклад, екстрагування, дистиляції й іонного обміну), див., наприклад, (Патент США Мо4,275,234, Патент США Мо5,510,526, Патент США Мо5,831,122, Патент США

Мо5,641,406 і Міжнародна патентна заявка Мо УМУО 93/00440. Крім того, цільовий органічний продукт може відокремлюватися від живильного бульйону як під час його вироблення, так і по закінченні стадії вироблення.

Слід зауважити, що умови культивування у другому баку можуть регулюватися таким чином, щоб процес відокремлювання поліпшити. Наприклад, рН і температуру в другому баку можна відрегулювати таким чином, щоб цільовий органічний продукт преципітував із розчину, або приймав форму, більш підходящу для відокремлювання. Зокрема, величина рН органічних кислот може сприяти преципітації із розчину, коли. рн бульйону є меншим за величину рКа для органічної кислоти. Наприклад, умови культивування при виробленні глутамінової кислоти можуть бути такими, що рН буде складати менше 2,19, тобто менше величини рКа для глутамінової кислоти. Таким чином, регулювання рН, температури і вмісту живильного бульйону може полегшувати відокремлювання органічного продукту. Крім того, можуть вибиратися генетично відрегульовані для конкретного процесу дріжджі, а специфічні умови культивування можуть бути відрегульовані таким чином, щоб сч ов побічні продукти в живильному бульйоні не перешкоджали видобуванню цільового органічного продукту.

Зрозуміло, що описані тут способи і матеріали можуть бути пристосовані і використовуватися в процесах і) культивування будь-якого типу, включаючи без обмеження такі загальновідомі процеси, як "безперервна ферментація" і "періодична ферментація". Крім того, мікроорганізми, використовувані у виробничому процесі, можуть піддаватися відновленню і використовуватися знову у наступних виробничих процесах. Наприклад, для «о зо вироблення бажаного органічного продукту одні й ті самі мікроорганізми можуть використовуватися багато разів.

Стосовно джерела вуглецю немає жодних обмежень, і для вироблення як біомаси, так і бажаного органічного со продукту можуть використовуватися у якості джерела вуглецю, наприклад, алоза, альтроза, глюкоза, маноза, со гулоза, йодоза, галактоза, талоза, мелібіоза, сахароза, фруктоза, рафіноза, стахіоза, рібоза, арабіноза, ксилоза, ліксоза, крохмаль, наприклад, маїсовий крохмаль і пшеничний крохмаль, і гідролізати, якими є, в.

Зв наприклад, гідролізати маїсового волокна та інші целюлозні гідролізати. Крім того, живильне середовище також ї- може бути будь-якого підходящого типу. Наприклад, застосовувати можна стандартне культурне середовище (наприклад, дріжджове мінімальне середовище і середовище УР (дріжджовий екстракт 10г/л, лептонний бульйон 20г/л)), а також такі середовища, як маїсова мерсеризаційна вода і маїсовий мерсеризаційний луг.

Суттєвою перевагою даного винаходу є те, що кращим мікроорганізмам і, зокрема, вирощуваним за аеробних « умов, може потребуватися мінімальна кількість культурного середовища. Анаеробне вироблення, якправило, не 7) с потребує додаткових живильних речовин, і, таким чином, кінцевий продукт може бути відокремлений від відносно чистого ферментаційного бульйону будь-яким відповідним шляхом. Для відділяння органічних кислот ;» від ферментаційних бульйонів може застосовуватися добре відома технологія екстрагування рідких речовин рідинами і забезпечувати при цьому високий ступінь очищення. Але даний винахід дозволяє застосовувати дв також більш прості, менш дорогі і менш енергоємні способи. -І В одному з варіантів здійснення даного винаходу використовуються генетично модифіковані дріжджі негативного фенотипу дикої яблуні у послідовному процесі з "переключенням" метаболічного шляху по

Ш- досягненню критичної густини клітин, коли потребується різкий зріст питомої продуктивності вироблення оо бажаного органічного продукту. Для переключення метаболічного шляху процесу, як правило, використовується перенесення біомаси із високодерованої посудини у практично анаеробну посудину, що викликає кисневе со голодування. Слід зауважити, що в якості джерела вуглецю як у фазі росту, так у фазі вироблення продукту

Ф може використовуватися загальний вуглевод (наприклад, глюкоза або ксилоза). Для успішного здійснення даного варіанту використання генетично модифікованих дріжджових клітин негативного фенотипу дикої яблуні може стати вирішальним фактором. Крім того, питома продуктивність вироблення бажаного органічного продукту ов також може бути визначальною у досягненні позитивного результату. Використовуваний тут термін "питома продуктивність" окреслює кількість виробленого продукту і виражається в грамах органічного продукту,

Ф) виробленого із граму біомаси (сухої маси) за годину, тобто г/(ггодина). Зазвичай, питома продуктивність ко вироблення таких органічних продуктів, як лактат і акрилат, становить більше ніж приблизно 0,1 г/(г година), наприклад, більше ніж приблизно 0,2 г/(г-година) або більше ніж приблизно 0,5 г/(г-година). Завдяки високій 60 питомій продуктивності процесів, здійснюваних згідно з даним винаходом, енергія, необхідна для підтримання клітин, може одержуватися шляхом ферментації за практично анаеробних умов, не звертаючись до аерації для генерування великих кількостей енергії респіраторним шляхом. Слід зауважити, що практично анаеробні посудини аеруються з витратою менше ніж приблизно 0,1 МУМ. В деяких робочих ситуаціях аерація не потребується. Крім того, вихід продукту (тобто грам органічного продукту на грам спожитого джерела вуглецю) у 65 даному варіанті здійснення, як правило, становить більше ніж приблизно 70905 (мас.) і забезпечується без добавлень таких вуглецевих джерел, як етанол і ацетат. У деяких випадках для досягнення питомої продуктивності, достатньої для генерування енергії, потрібної для підтримання клітин, може бути потрібним, крім того, підсилювати шлях процесу від глюкози до пірувату для забезпечення процесу вироблення бажаного продукту необхідними ферментами.

В іншому варіанті здійснення послідовний виробничий процес може бути спроектований таким чином, щоб можливістю стерилізувати була наділена лише високодерована посудина росту. Анаеробна культиваційна посудина працює при температурах, як правило, вище ніж приблизно 352С (наприклад, вище 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 або 4522). Мало які дріжджі дикого типу зможуть вижити і конкурувати з генетично модифікованими дріжджами за таких температур, оскільки рН в процесі вироблення продукту падає. Головною причиною цього є 70 те, що вони не мають шляху підсиленої ферментації, який може генерувати потрібну для утримання клітин енергію. Крім того, дріжджі можуть бути модифіковані так, щоб містити "плазміди-кілери", описані вище, які здатні запобігти виживанню дріжджів інших видів.

Винаходом пропонуються також різноманітні способи культивування дріжджових клітин. Наприклад, дріжджова клітина негативного фенотипу дикої яблуні може культивуватися в живильному середовищі як з 75 величиною органічного рН менше приблизно 3,0, так і такого, що містить гідролізат маїсового волокна. Серед інших способів культивування дріжджових клітин можна назвати, наприклад, культивування дріжджових клітин негативного фенотипу дикої яблуні при температурі більше, ніж приблизно 3523, у живильному середовищі, яке або має величину неорганічного рН менше приблизно 3,0 або містить пентозу чи гідролізат маїсового волокна.

Винаходом пропонується також спосіб одержання органічного продукту. Цей спосіб включає у себе вирощування мікроорганізму в умовах культивування і зміну цих умов культивування на такі, що стимулюють вироблення органічного продукту. В даному способі мікроорганізм має знижену піруватдекарбоксилазну, алкогольдегідрогеназну, альдегіддегідрогеназну і/або ацетил-СоА-синтазну активність і виказує швидкість росту за відсутності етанолу й ацетату, яка складає принаймні 3095 (наприклад, приблизно 35, 40, 50, 75, 100, 150, 20095 або більше) від тієї що спостерігається у відповідного мікроорганізму, який не має зниженої Ге піруватдекарбоксилазної, алкогольдегідрогеназної, альдегіддегідрогеназної і/або ацетил-СоА-синтазної о активністі. Умови культивування, що стимулюють клітинне дихання, як правило, використовуються в тих ситуаціях, де потребується швидкий ріст або де бажаний органічний продукт не може вироблятися без клітинного дихання, у той час як умови культивування, що знижують клітинне дихання, використовуються в тих ситуаціях, де швидкий ріст не потребується або де бажаний органічний продукт може вироблятися без (се) клітинного дихання.

Нижче наведені приклади, які ілюструють даний винахід, не обмежуючи його об'єму, визначеною Формулою со винаходу. Гео)

Приклади

Приклад 1. Рекомбінантна плазміда РНЕЗ/рЗЕН -

Описана в |СНпіеп еї аї. (Ргос. Маг! Асай 5сі., 88(21):9578-9582 (1991) плазміда рОАЮ424 у кількості /Їч«

О,бмкг була перетравлена ферментом рестрикції Ніпа!йї. Перетравлену суміш відділили за допомогою гель-електрофорезу на 0,895 агарозному гелі з використанням ТВЕ-буферу. Після цього від гелю був очищений 5,9 Крр фрагмент, як описано в |ЗатргооК еї аїЇ., Моїесшаг Сіопіпуд, зесопі еайіоп. Соїй Зргіпд Нагрог «

І арогаїогу, Ріаіпміеєм,, ММ (1989)). Була розроблена комплементарна пара 92 рр синтетичних олігомерів з численними сайтами розпізнавання ферменту рестрикції. Перший з них був позначений ма Нез оїїдо і мав таку - с послідовність: 5-СССААОСТТОААТТССССОБОООБАТСССТОСАСОСТАССАСОСОСТАСА ц ТСТАСТАСТОСООССОССТоООАСТСТАСАСООСССААОСТТОоСОо-3 (ЕС. ІЮ МО:1). Другий був позначений "» сотр пев оЇїдо і мав таку послідовність: 5-ССААОСТТОООСССТСТАСАСТООАСОСООССОСАСТАСТАСАТСТАС

БСОТООТАСССТОСАВОБАТСССССОООСААТТСААОСТТОоОоОо-3 (5ЕБЕО. ІЮ МО:2). Ці два комплементарні -| олігомери в кількості 5Х0О0нмолів були піддані відпалюванню один з одним шляхом кип'ятіння протягом 10 хвилин -1 з наступним поступовим охолодженням до кімнатної температури. Дволанцюгова 92 рр (пар основ) ДНК була перетравлена ферментом НіпаїйїЇ і лігована з 5,9 Кор роАба424, перетравленим Ніпаї|ї. Ця суміш лігування була (95) використана для трансформування клітин СОНІТОВ Е. соїї (електромаксимальні клітини І Ме Тесппоіодіев, со 50 КосКміїе, МО) шляхом електропорації, як описано в І(ЗатрбгоокК еї аі., МоіІесшіаг Сіопіпд, зесопа еайіоп. Соїд

Зргіпд Ппагрог І арогайїогу, Ріаіпміем,, МУ (1989)). Рекомбінантні клітини Е. соїї були посіяні на планшети з 4) бульйоном І игіа-Вегіапі, і клітини, що містили плазміду, були відібрані за допомогою 100мкг/мл ампіцилінового антибіотика. Плазмідна ДНК була відділена від ампіциліностійких клонів Е. соїї, в результаті чого були отримані дві плазміди РНЕ5 і р5ЕН (Фіг.1 і 2). Ці плазміди мали різні орієнтації синтетичного олігомеру

Відносно алкогольдегідрогеназного промотора АОНТІ на векторі.

Приклад 2. РСК-ампліфікація нуклеїнової кислоти, що кодує лактатдегідрогеназу із І асіорасійиз Пеїмейісив о і Редіососсуз асіаїйасіїсі іме) Із вирощуваних протягом ночі культур І асіорасійив Пеїмейсиз (Американська колекція типових культур АТОС 10797) і Редіососсивз асіайасіїсі (АТС 25741 ) виділили геномну ДНК за допомогою набору РОКЕСЕМЕФ для 60 відокремлювання геномних ДНК (Сепіга зузіетв, Міппеароїїз, ММ). Для виділення нуклеїнової кислоти, що кодує лактатдегідрогеназу, із геномних ДНК 1 Пеїмеїісивз (ІВ-ІЯй ооїїдов) і Р. асіайасіїсі (ра-ідн оїїдов), були сконструйовані РСК-праймери. Ці праймери конструювалися на основі генних послідовностей для лактатдегідрогеназ у базах даних Сепрапк і мали такі послідовності: 5 їв-їай, 5-ССООбАТССАТООСААСАСАОСАААААССТО-3 (ЗЕО. ІО МО:3); З Івн-їан, 65 5-ССААСАТСТТТАТТОАСОААССТТААСОССАС-3 (ЗЕО. ІО МО 4); 5 ра-їан, 5-ССООБАТССАТОТСТААТАТТСААААТСАТСАААДААО-3: (ЗЕО. ІО МО:5); і З ра-їан,

5-ССААСАТСТТТАТТТОТСТТОТТТТТСАССАДАДО-3 (ЗЕО ІЮ МО:6). Праймери були оптимізовані за допомогою програми Ргітег Юезідпег від фірми 5сі-ей зоїмаге (Юигпат, МС). Разом із Л00НМ праймерів використовувався 1мМкМ геномної ДНК. Для РСК-підсилювання лактатдегідрогеназної (ІОН) нуклеїнової кислоти Використовувалася ДНК-полімераза РіТш (Мемж/ Епдіапа Віоіарв5) так, як описано в ІЗатьгоок еї аї., МоіІесшаг

Сіопіпд, зесопа едікоп. Сода Зргіпу пагрог І арогайогу, Ріаіпміеєм, МУ (1989)|.

Аналогічна методика використовувалася для виділення нуклеїнової кислоти, що кодує І -лактатдегідрогеназу, із геномної ДНК таких мікроорганізмів, як Васіїйи5 зр., наприклад, Васіїйив5 тедайегішт (АТСС 6458), Кпігорив огулае (АТСС 76275) або будь-якого іншого організму, що продукує лактат (включаючи такі мікроорганізми, як 70 грибки і бактерії, а також багатоклітинні організми, якими є, наприклад, ссавці) або із тканини організму, що продукує лактат. Геномну ДНК виділяли із вирощуваної культури організму за допомогою набору РОКЕСЕМЕФ для відокремлювання геномних ДНК ((зепіга зузіетв, Міппеароїїз, ММ). Були сконструйовані відповідні

РСК-праймери для виділення нуклеїнової кислоти, що кодує лактатдегідрогеназу, на основі І ОН-генних послідовностей для цих видів, що є в базі даних Сепрапк. У загальному випадку разом із Т00НМ відповідних праймерів використовували їмкМ геномної ДНК. Для ампліфікації лактатдегідрогеназної (ІОН) нуклеїнової кислоти із відповідної геномної ДНК використовувалася ДНК-полімераза Ріи (Мем Епдіапа Віоїарв) або будь-яка інша підходяща ДНК-полімераза і метод РСК, описаний, наприклад, в |Затьгоок еї аї!., МоіІесшаг Сіопіпод, зесопа едйіоп. Соїд Зргіпд Нагброг І арогайогу, РіІаіпміему, ММ (1989)).

В альтернативному варіанті нуклеїнову кислоту, що кодує лактатдегідрогеназу, виділяли із Кісумеготусев

Іеготоїсіегап3ї АТСС 52709, Ттісподегпта Кеезе/"АТСС 13631, Тогцазрога ргеопепзіз АТСС 36245 або із будь-якого іншого організму, що продукує лактатдегідрогеназу, за будь-якої з таких методик. 1) Бібліотеку геномних кДНК із одного з цих організмів клонували в стандартний вектор експресії рОсС19 Е. сої за допомогою стандартного методу |(ЗатбргооК еї аі., (1989) МоїІесшіаг сіопіпд: а Іарогаїгу тапиаї, 2па ей. Соїй 5ргіпд Нагбог І арогаїогу Ргезз, Соїа Зргіпд Нагброг, М.Х. Цією бібліотекою трансформували мутантний сч ов штам МАМІТ11 ЕЕ. сої (ай р) І(Випси еї а. (1997) "Те ІаДпА одепе епсодіпу (Ше Тептптепіайме Іасіаіе депудгодепазе ої ЕзсПегіспіа соїї," Місгоріооду, 143:187-95), і клітини вирощували в анаеробних умовах у і) середовищі МО, доповненому казаміновою кислотою. Будь-яка Е. соїї, вирощувана в цих умовах, кодує або лактатдегідрогеназу чи є ревертантом дп, або рії. Позитиви (колонії, що утворюються в цих анаеробних умовах росту) відбирають за їхньою І ОН-активністю за допомогою колориметричного аналізу специфічного до молочної Ге зо Кислоти м'якого агарового покриття (ГАЗЗО: Іасійс-асій зресійс зой-адаг омепау), здатного розрізнювати (Щ-СОН ої (0)-ІОН (МУще еї аї.,, 9. Вавіс Місгоріої. 29:707-716 (1989)). Після цього із клонів, які за со припущенням могли експресувати І -лактатдегідрогеназу, виділяли і секвенували плазмідну ДНК. с 2) К. (Пептоіїсіегапз АТСС 52709, Т. геезеі АТСС 13631 і ТогшШазрога ргефогіепвіз АТСС 36245 є еукаріотами, що продукують І-молочну кислоту при культивуванні в анаеробних умовах |МУїНе еї аї.,.. Вавіс ї-

Місгобіо!. 29:707-716 (1989)). Таким чином, згідно з даним способом принаймні один з цих штамів вирощували в ї- анаеробних умовах для індукування лактатдегідрогеназної ферментативної активності. Далі, за допомогою стандартних способів одержували безклітинні екстракти, які піддавали очищенню у відомі способи очищення білка для відділення лактатдегідрогеназного ферменту. Підходящі для цього способи очищення лактатдегідрогенази описані, наприклад, в ІКеПу еї аї., (1978) "Айіпйу сПготайодгарпу ої бБасіегіа! Іасіаіге « Чепуадгодепазев," Віоспет ., 171(3):543-7). Після очищення білка його частково розщепили і піддали з с секвенуванню для визначення амінокислотної послідовності. Отриману амінокислотну послідовність далі використовували у конструюванні дегенеративних праймерів для виділення гена, що кодує лактатдегідрогеназу з із геномної ДНК.

Еукаріотична ІОН, така, як виділена із К. (ПпептоїіоІегап5, або Тгісподегпта гезееї, або Тогціазрога ргеюгіепзіз, може функціонувати краще (з погляду на транскрипційну ефективність, трансляційну ефективність -І мабо білкову активність) в дріжджах К. тагхіапиз порівняно з ОН із бактеріальних джерел, якими є, наприклад, Васі: або І асіорасіПив.

Ш- З) Використовуючи відомі послідовності еукаріотичних лактатдегідрогеназних генів, отримувані із бази 2) даних Сепрапк, конструювали дегенеративні праймери для виділення гена для лактатдегідрогенази із геномної

ДНК еукаріотів К. (пегтоїоіегапв АТСС 52709, Т. геезеї АТСС 13631 або ТогицІазрога ргефгіепзіз АТСС 36245. со Серед ГОН-генних послідовностей для конструювання дегенеративних праймерів використовували

Ф консервований сайт зв'язування МАО і консервований сайт зв'язування пірувату. Разом із 100нмолями праймерів використовували 1їмкМ геномної ДНК. Для підсилення фрагментів І -лактатдегідрогеназної (ІОН) нуклеїнової кислоти згідно з відомими РСК-методами, наприклад, описаними в І(ЗатрбгоокК еї аї., (МоЇІесшаг дв Сіопіпд, зесопіа еййоп, Соїй Зргіпу Нагрог Гарогаюгу, Ріаіпміеєм,, МУ (1989)), використовували ДНК-полімеразу

Ріи (Мем Еподіапа Віоіарв) або будь-яку іншу підходящу ДНК-полімеразу.

Ф) Приклад 3. Клонування ГІ. Пе/їмеїйїсивз і Р. асіадіїасіісі у вектор реКІЇ ка РСК-ампліфіковані І ОН ОМА-продукти були ліговані з векторами рек! (Фіг.З і 4) за допомогою набору для клонування ТА від фірми Іпмігодеп (Сагізрад, СА). Одержану суміш лігування використали для трансформування 6во БНтОВ Е. сої у способи, описані в |ЗатргооК еї аї., МоїІесціаг Сіопіпдо, зесопіа еайіоп. Соїд Зргіпд Нагрог

І арогаїюогу, Ріаіпміему, ММ (1989)). Вектори рСКІІ із вищезазначеного набору дозволяли швидко клонувати

РСК-продукти згідно з рекомендаціями виробника. Вектори рек! з І ОН-генами із |. Неїмеїйісиз і Р. Асіайасіїсі показані на Фіг.4.

Приклад 4. Рекомбінантна плазміда рі й ІДн-НЕ5/рРа ІЯДН-НЕЗ з ІОН генами із І Неїмеїйісиз і Р. Асіайасіїсі 65. У векторі РНЕ5

Вектори рСКІІ, що містили ОН ген із | Пеїмейсивз і Р. асіайасіїсі були перетравлені відповідними ендонуклеазами рестрикції. Подібним чином такими самими ендонуклеазами рестрикції був перетравлений вектор РНЕ5. Після цього до 6,0 Кор вектора РНЕ5 була лігована 1 Кор вставка, що містила ІОН із векторів

РОКІ, за допомогою ДНК-лігази Т4, як описано в |(ЗатбргооК еї аіЇ., МоіІесціаг Сіопіпд, зесопіа еадйіоп. Соїа

Зргіпд пагрог І арогайогу, Ріаіїпміем, МУ (1989)). Отриману таким чином суміш лігування використали для трансформування ОСНІТОВ (електромаксимальні клітини, І їе ТесппоЇодіез, КосКмШе, МО) Е. соїї, і були вибрані рекомбінантні клони для забезпечення стійкості до ампіциліну. ДНК, виділена із рекомбінантних клонів, була проаналізована на підтвердження векторів рі й Іап-НЕЗ Її рРа ІаДН-НЕЗ (Фіг.5). Ці вектори містять гени, що кодують ОН із | Пеїмесіїсив і Р. асідіасісі у векторі рНЕБЗ під керуванням дріжджового /о алкогольдегідрогеназного промотора (АСНТ).

Приклад 5. Клонування ГОН-гена Васіййз взр.. КПігорив огугае. К. (пептоїіоіІегапв,. Тгісподегта гезееї або

Тогціазрога ргеюпепвів для експресії з використанням генного промотора Засспаготусез РОС1

Поряд з тим, що для керування експресією лактатдегідрогеназного гена, клонованого в К. тагхіапив, можна використовувати лактатдегідрогеназний промотор, що знаходиться в КПігориз огулає, К. Шептоїіоіегапв, /5 Тпісподегта гезееі або ТогцІазрога ргеїопепзіз, для керування експресією виділеного лактатдегідрогеназного гена можна використовувати промотор РОСІ1 із Засспаготусевз сегемівіде. Гліколітичні промотори із зЗасспаготусев сегемізіде з успіхом використовувалися для експресії генів в штамах Кіпумегоптусез |Сеїївззеп апа Ноїііепрего, (1997) "Арріїсайоп ої уеазів іп депе ехргезвіоп віцдіев: а сотрагізоп ої Засспаготусев сегемізіде, Напзепша роїутогрна апа Кісумеготусез Іасіїв - а геміем" Сепе, 190():87-97)|.

Таким чином, промотор РОСТІ із Засспаготусевз сегемівіде отримують шляхом конструювання відповідних олігомерних праймерів, використовуючи геномну послідовність Засспаготусез сегемізіде із бази Сепрапк.

Послідовність гена РОС1І ії 1 КЬр ділянки навколо гена РОС1 підсилюють за допомогою методів РОК.

Отримуваний в результаті 4 КЬ фрагмент ДНК містить як промотор, так і термінатори, що керують експресією гена РОС1. Між промотором і термінаторами, що керують експресією гена РОС1, включають численні сайти сч ов ферментів рестрикції так, щоб різноманітні ЇОН-гени могли вставлятися під контролем промотора РОСТІ і термінаторів. 4 КО фрагмент ДНК вставляють у відповідний вектор, яким є, наприклад, шатл-вектор із і)

Засспаготусевз сегемізіде або Е. соїї на основі рОС19. Після цього І ОН-ген уводиться у вектор в одному з численних сайтів клонування під контролем промотора і термінаторів так, що експресія лактатдегідрогеназного гена контролюється промотором РОСТІ і термінатором (Фіг.14). В альтернативному варіанті подібним чином для Ге зо експресії клонованого ГОН-гена в К. тагхіапиз можуть використовуватися інші гліколітичні промотори

Засспаготусез, наприклад, такі, що керують експресією гліцеральдегід-З-фосфатдегідрогеназних або со фосфогліцераткіназних генів Засспаготусез сегемізіає. с

Приклад 6. Ампліфікація лінійних фрагментів гомологічної ДНК для генних розривів піруватдекарбоксилази

Був сконструйований 82 Бр олігомерний праймер (5КтРОСЯІКо), який містив 51 Бр, ідентичних 5'-кінцю ї- піруватдекарбоксилази (РОС) із К. тагхіапиз і 30 рр, ідентичних 5-кінцю промотора АОНІ із векторів РНЕ5. ї-

Праймер 5КтРОСІКО мав таку послідовність: 5-ТАААСАСТАСААТСОСАААСААААОСТССАСАСССА

ААССАААТААТТОСААТОСААСТТСТТТСТТТТТТТТТСТТТТСТ-3 (ЗЕО. ІЮ МО:7). Послідовність для РОС-генів із дріжджів (К. тагхіапиз або У. віїрйз або Н. роїутогрпа) була отримана із зазначеної послідовності від бази Сепрапк. Подібним чином був сконструйований зворотний 79 рр олігомер (З'ятРОСІКО) так, що 54 рр його « були ідентичними З-кіндкю РОС-гена, а 22 Бр - З-кінцю термінатора АОНІ. Олігомер З'ЮтТРОСТІКО мав таку па) с послідовність: 5-ТТАТААААТСАТТААААТССААААТСОТААТТТАТСТСТТТАТССТСТОССТСТСТАСАТ

Й СССООТАСАСОСТОТООТСА-3 (5ЕБЕО. ОО МО:8). Були сконструйовані праймери для ампліфікації лінійного и?» фрагмента ДНК із плазмід рійІЯН-НЕЗ і рРаідй-НЕЗ таким чином, що цей фрагмент містив повний лактатдегідрогеназний ген разом із промотором АОНТ і термінатором (Фіг.б). РСК-ампліфікований продукт також мав кінці, гомологічні послідовностям із: РОС1 К. тагхіапиз; РОСІ1 і РОС2 Матадагута звірів; РОС1 і РОС2 -І Напзепшіа роїутогрна. Реакція ампліфікації була проведена з використанням ДНК-полімерази Ріи (Мем Епдіапа

Віоїаре; Вемепу, МА). В цій реакції разом з 5 одиницями полімерази і 10О0нмолями олігомерів використовувалися

Ш- 10Онг рі пІДН-НЕ5 або рРаїдп-НЕ5. Реакцію проводили згідно з протоколами, описаними в |Затбгоок еї аї., 2) Моїесшіаг Сіопіпуо, зесопа еаййоп. Соїй бргіпуд Нагрог Іарогайогу, Ріаіпміему, ММ (1989)). На Фіг.б6б показаний

Кінцевий лінійний продукт з описаними гомологіями. со Для поліпшення подібності одержання негативного штаму рас К. тагхіапиз були приготовані додаткові

Ф конструкції. Для цього був виділений 5,5 Кор фрагмент навколо 1,7 Кор РОС1-гена К. тагхіапиз (Фіг.6В) за допомогою методів РСК і геномної "прогулянки" (Сіопебесп). Після цього 5,5 Кор фрагмент за стандартними методами був клонований у вектор рСКіІ! клонування із набору ТА (Іпмйгодеп). За допомогою гідролізатів ов рестрикції (ЗатргооК) із 5,5 Кор фрагмента К. тагхіапив була видалена частина довжиною приблизно 370 Бр о поблизу середини 1,7 Кор ділянки РОСТІ кодування. Видалений фрагмент мав таку послідовність: з ниви они У 60 НЕ и сл ек В и а я І З С в ВИІИІуИ ШНМ МООВОВВОТОООВТООТ,ОІХ ОО ОО

Далі, із вектора рРІСОК (Іпийгодеп) за допомогою стандартного метода рестрикції, див. |Затьгоок еї аї. був виділений ген стійкості до канаміцину і його промотор і клонований у сайт в 5,5 Керр, із якого був видалений вищезазначений фрагмент. Ген рРІСОК (Іпмігодеп) стійкості до канаміцину і його промотор були вставлені так, що вставлена ділянка мала таку послідовність:

СТАСААСТТОАДОСААОТТОТСБАТСАОСТОСТСАААТТОСТОСТСТОТААСОСАТОСА

" СТСААСТТОСАСАТТААСТТОААОСТСАВТСОАТТОДОТЗААСТТОАТСАСОоТТОоТОо

САВБСТОСТСАССАОСАТАВОСАААСАСООСТ ПТ ОСТАССАААСТСААСОСААТТАТО

70 АААСТСТОСААСАСТТОСОСТАТОСАСОТАОСААОБАДАТОТСАТАСТТОААСТОовО

АСАСТОАОТОТАВТСТТОАОАААТТСТОААОССОТАТТТТТАТТАТСАСТОАСТСАСТ

САТСАССАСАТССТСТАСОССССАСОСАТССТООСССАССТОСАСОСОССССоб вобСОоСТоАООТсСтТОССтоОТОААСААОСТОТТОСТОоАСТСАТАССАСОССТОДАТ

СОССССАТСАТССАОССАСАЛАСТОДОСОСАСССАСОСТТСАТОАСАОСТТТОТТОоТ

АБСТОСАССАСТТОСТОАТТТТОААСТТТТОСТТТОССАСобААСсбоТтоТОоСсоТТоТ

СВОБДАСАТОСОСТОАТСТОАТССТТСААСТСАССААААСТТ СОСАТТТАТТСААСААА а о а А НЕ ОАЕ а БАД ково крвт тут рн, оті тет я ск пе дяя ІН и ТА т ри ска ов тн пе они а о и АК ан ла ит вот плели сч а ен нн в м з НИ в а кВ Да В КО в о пен нон я А в в ве пн г я ян виш у вмію ЕВ кн Ге; зо Шен ан А и А СО ва ве ов со ходи кл потен паст, Фо нон в о п мн а а ее и КА АЙ АН па кре -

Шк лини нка тв Ана ве ння ни в сс в і вив ва А пев о ви и в п В В В о ТА комета тя « мн шо ни о ВЕ НЕ В СИН ВЕН А ЗІ 70 дей дви А яння ко в ик ий и А н- нин А А вини в нн як Ан їз» ув еие А ви ОА АсАТ ЕВ 15 ПАК, й х ЩІ СА Ао - ЗІ Я й її що 7 ї Що й У щі ОБО -і ши нн в ве Б -І Отримана в результаті конструкція містила ген стійкості 5418, оточений приблизно 5 Керр рас-ділянки, як показано на Фіг.6С. Була приготована подібна конструкція ДНК, яка містила внутрішній ген 418, оточений 2,3 о Крр РОСТІ К. тагхіапиз у векторі рСКІЇ, як показано на Фіг.60).

Го! 20 Приклад 7. Використання лінійного фрагмента ДНК для розірвання ендогенної РОС кодувальної послідовності й одночасної інсерції ІОН кодувальної послідовності м. Описаний в Прикладі 5 лінійний фрагмент ДНК, створений за методом РСК, використовували у трансформуванні К. тагхіапи5х, Матадалута зіїрйв і Напвзепца роіутогрпа. У трансформуванні використовувався протокол, описаний в публікації |МУезоіомузкі-Ї оиме! еї аї., Мопсопумепійопа!| уеєавів іп 22 Віоїесппоіоду: Кіцумеготусев Іасіїв, ей. Кіайз Мої, Зргіпдег мепад, Вегіп, р.138-201 (1996)). Коротко,

Ф! методика полягала в тому, що бмл вирощуваної протягом ночі культури після центрифуги промили електропораційним буфером (ТОнНМ Ттіз-НСІ, 270нМ сахарози, їНМ Масі», рН 7,5). Промиті клітини піддали де інкубуванню протягом 30 хвилин при 302С в інкубаційному буфері (дріжджовий екстракт 5г/л, лептонний бульйон 10г/л, глюкоза 1Ог/л, 258М ОТТ, 20нМ НЕРЕЗ, рН 8,0). По закінченні інкубування клітини знову промили і бо ресуспендували в 4мкл інкубаційного буферу. До цих клітин додали 2Онг ДНК, і клітини піддали імпульсній обробці на приладі Віо-Кай Сепе Риїзег у режимі 1800 вольт, 1000Ом, 25мкФ у 0,4см кюветі.

Клітини висіяли на звичайні УРО (дріжджовий екстракт 10г/л, лептонний бульйон 20г/л, глюкоза 20г/л, агар 15965) планшети, і колонії залишили на регенерацію протягом 72 годин. Кожний із цих планшетів з колоніями реплікували на свіжих УРО-паншетах та інкубували протягом 48 годин. Далі колонії покрили шаром 6,595 м'якого бо агару (0,595 агар у ЗО0мММ Ттіз-НСІ, 187мММ глютамат, рН 8,3). До покритих планшетів додали суміш для забарвлення (3,2мл 195 агару, 1,б6мл 120мМ Ттів, 75мММ глютамат, рН 8,3, О4мл 2мг/мл феназинметосульфату, 7 одиниць глутаматпіруваттрансамінази і 7 одиниць /І()-лактатдегідрогенази із м'яза свині). Дріжджі забарвлювалися у блакитні вінця високої І(жї)-форми протягом 10-120 хвилин. Цей метод є подібним методу, Запропонованому в роботі (Зираеп еї аї., Сападіап 9. Місгобріо!., 28:883-886 (1982)| і модифікованому Бітом

ЇМУЩе еї аї., (У. Вавіс Місгобріої. 29:707-716 (1989)). Колонії відібрали, а відокремлені від колоній ДНК піддали РСК-аналізу і секвенували для виявлення розірваних піруватдекарбоксилазних генів.

В іншому варіанті здійснення клони, описані в Прикладі б і показані на Фіг.бс і ба, піддали травленню двома ферментами рестрикції |(ЗатргооК еї аІД, отримавши приблизно Змкг фрагментної ДНК, що містила 7/0 Гомологічну РОС-ділянку, усередину послідовності якої був уставлений ген стійкості до канаміцину. Цим фрагментом за відомими методами, наприклад електропорації, трансформували К. тагхіапиз з розірванням його рас.

У загальному випадку електропорацію здійснювали таким чином: а) вирощували культуру мікроорганізму в

МЖРАЮ протягом ночі (приблизно 15 годин) в об'ємі 2О0мл; Б) переносили БбООмкл цієї культури до 7/5 Мікровідцентрової пробірки, піддавали її центрифугуванню (ФАК, 4 хвилини, видаляли супернатант; с) планшет промивали їмл холодним ЕВ (ЕВ - електропораційний буфер: 10мМ Ттгіз-НСІ, рН 7,5; 270мМ сахароза; 1мММ

МасІ2); 4) ресуспендували в Тмл ІВ (ІВ - інкубаційний буфер: МРО; 25мМ ОТТ; 20мМ Нерез, рН 8,0); є) струшували (00 800об/хв, 302С протягом З0 хвилин на приладі Еррепдогї Тпептотіхег; її піддали центрифугуванню, промивали один раз ЕВ, ресуспендували в 400мкл ЕВ; 9) додавали Змкг фрагментної ДНК (у воді ТОмММ Ттів-СІ, рН 8,5), інкубували на льоду протягом ЗО хвилин; й) переносили в 0,4см електропораційну кювету; режим імпульсної обробки на приладі Віо-Кад Сепе Риїзег: 10008, 1000Ом, 5ОмкФ; стала часу після імпульсу: приблизно 2Омс; ї) переносили до Змл пробірки Мортона-Клозюра (Могіоп Сіозиге), інкубували без струшування при 302С протягом 1 години; додавали 400мкл рідкого УРАЮ-середовища (УРАЮ: 10г дріжджового екстракту, 20г пептону, 20г глюкози, 100мг аденінгемісульфату, об'єм Тл, без регулювання рН), струшували (Ф Га 8Обоб/хв, 302 протягом 1 години в приладі Еррепдог Тпегтотіхег; додавали 40О0мкл рідкого УРАО і регенерували протягом 4-6 годин; |) піддавали центрифугуванню у мікровідцентровій пробірці (Ф АК, 4 хвилини, о видаляли супернатант, ресуспендували в 400мкл 1М сорбітолу; К) висівали на 200мкг/мл С418-селективні планшети; і І) інкубували при 302С протягом 3-5 днів.

Колонії піддавали скринінгу спочатку другою корекцією покриття на ЗООмкг/мл (3418. Геномну ДНК (Се) відокремлювали від вторинного дріжджового петчу за стандартною методикою геномного препарування со

Ізатьгоок). Далі їх піддавали РСК-скринінгу на 1) наявність фрагмента канаміцину, використовуючи підходящі праймери й умови |ЗатргоокКі|, і 2) відсутність розірваної рас-ділянки, використовуючи підходящі праймери і (зе)

РСкК-умови. Колонії, які були-позитивні по маркеру селекції і негативні по ділянці розриву рас, піддавали м культивуванню і аналізували за допомогою НРІС на фізіологію. Геномну ДНК із цих штамів аналізували за методом Саузерн-гібридизації. -

Приклад 8. Характеристики росту клітин 1. Низький рн і висока температура

Вирощувані протягом ночі культури К. тагхіапиз були інокульовані в БОмл дріджового мінімального « середовища згідно з (|Кіеге еї аЇ., Меаві, 14(5):459-469 (1998)Ї. У якості джерела вуглецю використовували 100г/л глюкози. Вирощувані протягом ночі культури витримувались при 402С і були інокульовані в середовище, - с яке також витримувалося при 40 2С. Добавлення інокулянту привело до зміни рН середовища від 5,5 до 2,5. "» Протягом експерименту рН залишався на рівні 2,5. Концентрацію глюкози вимірювали за допомогою " УЗіІ-мембрани, а оптичну густину (00: оріїса! депзійу) - за допомогою спектрофотометра.

Глюкоза була використана протягом 72 годин, засвідчуючи те, що метаболічна активність протягом цього часу культивування виникає в умовах низького рН і високої температури (Фіг.7). Крім того, в період між 48 і - 72 годинами біомаса трохи зменшилася, вказуючи на те, що катаболізм клітин випереджав анаболізм (Фіг.7). -І 2. Пентозні джерела вуглецю

Вирощувані протягом ночі культури К. тагхіапиз були інокульовані у три 5Омл колби, що містили дріжджове і мінімальне середовище згідно з |Кіеге еї аїЇ., Меаві, 14(5):459-469 (1998)). В усіх трьох колбах містилися со 20 різні джерела вуглецю: в першій колбі містилася 1095 глюкоза, в другій - 1095 ЮО-ксилоза, а в третій 1095

І -арабіноза. Колби інкубувалися при 302С за періодичних вимірювань оптичної густини. м, Через 40 годин вихід біомаси дріжджових культур з глюкозою і ксилозою був однаковий, а у дріжджової культури з арабінозою - менший (Фіг.8). Аналіз росту цих дріжджових культур виявив наявність у ньому початкового запізнення. Так, дріжджі, культивовані з арабінозою, мали початкове запізнення тривалістю в 22 декілька годин, у той час як у дріжджів, культивованих з ксилозою воно виявилося значно більш виразним

ГФ) (Фіг.8). Наявність такого запізнення свідчить про те, що дріжджові клітини потребують певного часу для адаптації до ксилозних і арабінозних вуглецевих джерел. Очевидно, цей час потребується для індукування о синтезу поліпептидів, що за нормальних умов не експресуються.

З. Гідролізат маїсового волокна при низькому рН 60 Культивовані протягом ночі культури К. тагхіапиз були інокульовані у колби, що містили дріжджове мінімальне середовище згідно з |Кіеге еї аїЇ., Меаві, 14(5):459-469 (1998)). В усіх колбах у якості джерела вуглецю містився 3090 гідролізат маїсового волокна. Гідролізат був приготований за допомогою реакції маїсового волокна з 1,295 сірчаною кислотою при температурі 14593 протягом 25 хвилин. Під час реакції геміцелюлоза розпадалася на мономерні продукти - арабінозу, ксилозу і глюкозу. Високотемпературні умови реакції викликали бо деструкцію деякої кількості арабінози і ксилози у фурфурал, а деякої кількості глюкози - у гідроксиметилфурфурал. НРІ С аналіз гідролізату показав наявність у ньому З38,7г/л глюкози, 39,1г/л ксилози, 20,7г/л арабінози і 1,бг/л фурфуралу. Крім того, гідролізат мав рН 1,51. Перед культивуванням дріжджів рн гідролізату маїсового волокна був відрегульований на рівень 3,0). В процесі культивування періодично проводилися вимірювання оптичної густини.

Культивовані з гідролізатом маїсового волокна дріжджові клітини були здатні генерувати біомасу (Фіг.9). 4. Варіювання рн

Вирощувані протягом ночі культури К. тагхіапиз були інокульовані у чотири колби, кожна з яких містила

БОмл дріжджового УРО-середовища (дріжджовий екстракт 1Ог/л, лептонний бульйон 20г/л, глюкоза 20г/л). 7/0 Величини рН середовищ в усіх колбах були різними і регулювалися за допомогою НОСІ. У процесі культивування температура підтримувалася на рівні 302, і крім того періодично вимірювалася оптична густина. В кожній колбі спостерігався процес росту (Фіг.10). 5. Культурні середовища з молочною кислотою і різними рН

Вирощувані протягом ночі культури К. тагхіапиз були інокульовані у чотири колби, кожна з яких містила 75 ЗОмл дріжджового УРО-середовища (дріжджовий екстракт 1Ог/л, лептонний бульйон 20г/л, глюкоза 20г/л), а також 40г/л молочної кислоти. Добавлення молочної кислоти зробило рН 2,8. Величину рН у трьох колбах відрегулювали до зазначеного рівня за допомогою Маон. У процесі культивування температура підтримувалася на рівні 302С, і періодично проводилися вимірювання оптичної густини. В кожній колбі спостерігався процес росту культур (Фіг.11).

Приклад 9. Рекомбінантні клітини, здатні продукувати акриліл-СоА

Організм (наприклад, Е соїї), не спроможний використовувати акрилат у якості джерела вуглецю, трансформували бібліотекою геномних ДНК Сіозігідішт ргоріопісит. Геномну бібліотеку С. ргоріопісит створили за допомогою плазміди рНЕБЗ так, що вона експресувала 10 Крр фрагменти геному С. ргоріопісит.

Трансформовану Е. соїї висівали на селективне середовище, яке в якості джерела вуглецю містило лише Га акрилову кислоту. Росли при цьому лише ті клітини, які були спроможні асимілювати акрилат. Акрилат, зазвичай, асимілюється шляхом ферментоопосередкованої конверсії його на лактат. Лактат, у свою чергу, може і) конвертуватися на піруват і використовуватися клітинами в циклі Кребса.

У разі вибору трансформованих Е. сої із геномної бібліотеки виділяли плазміду ДНК, і вставлений фрагмент піддавали секвенуванню. Секвенований фрагмент сканували по відкритих рамках зчитування для визначення (Те) Ккодувальної послідовності для ферментів, залучених у конверсію між лактатом і акрилатом (наприклад, лактоїл-СоА-дегідрогеназою і СоА-трансферазами). со

Виділені клони, що містили кодувальну послідовність для цих ферментів, уводили у дріжджові клітини, со описані в Прикладі б, які містили лактатдегідрогеназу і не мали піруватдекарбоксилазної активності.

Рекомбінантні дріжджові клітини, що містили уведену нуклеїнову кислоту, вибирали за допомогою 418 (ЗООГг/л). -

Після відокремлення рекомбінантні дріжджові клітини вирощувалися в аеробних умовах на глюкозі з подальшим ч- переключенням умов на анаеробні. Після цього живильний бульйон збирали і аналізували на акрилат за стандартною НРІС-методикою, як описано в |Оаппег еї аї., ВіоФесппоЇодісаІ! ргодисіоп ої асгуїїс асій от ріотазв. Іп: Арріїеа Віоспетівігу апа Віоїесппоіоду, Мої. 70-72 (1998). «

Приклад 10. Рекомбінантні клітини, здатні продукувати аскорбат Вектори експресії модифікували за допомогою генної інженерії таким чином, щоб експресувалися такі поліпептиди: 2,5-діоксовалератдегідрогеназа, - с 5-дегідро-4-деокси-О-глюкаратдегідратаза, глюкаратдегідратаза, альдегіддегідратаза, глюкоронлактонредуктаза ц і І-глюонолактоноксидаза. Нуклеїнокислотні послідовності що кодують ці поліпептиди, виділяли із "» різноманітних мікроорганізмів. Модифіковані вектори експресії трансформували в дріжджові клітини шляхом електропорації. Трансформовані дріжджові клітини аналізували для визначення того, чи продукують вони 1-аскорбат. -І Приклад 11. Рекомбінантні клітини, здатні виробляти ЮО-ксилозу

Вектори експресії за допомогою методів генної інженерії модифікували таким чином, щоб експресувалися 7 такі поліпептиди: 2-дегідро-3-деокси-О-пентаноатальдолаза, ксилонатдегідратаза, ксилонолактоназа «ІК

ОО О-ксилозодегідрогеназа. Нуклеїнокислотні послідовності, що кодують ці поліпептиди, виділяли із Рзейдотопав 8р. Модифіковані вектори експресії трансформували в дріжджові клітини шляхом електропорації. со Трансформовані дріжджові клітини аналізували для визначення того, чи продукують вони Ю-ксилозу або інші б сполуки пентозного джерела вуглецю.

Приклад 12. Рекомбінантні клітини, здатні виробляти цитрат На основі нуклеїнокислотної послідовності аконітази 5. сегемізіде (АСО1, номер доступу М33131 в базі Сепрапк) були сконструйовані РСОК-праймери. Ці праймери використовували для клонування нуклеїнової кислоти, що кодує аконітазу із Кісумеготусев,

Уатадагута або Напзепшціа. Після секвенування були створені лінійні конструкції, як описано в Прикладі 5, які о були використані для дезінтегрування нуклеїнової кислоти, що кодує аконітазу, в дріжджових клітинах. У якості ко маркера селекції використовувався антибіотик 5418 замість продукування лактату, як описано в Прикладі 5. В якості нуклеїнової кислоти, що забезпечувала стійкість до антибіотика (3418, служив бо неоміциновий/канаміциновий ген. Цей ген одержували із вектора рРІСОК (Іпмігодеп) і вставляли у вектор РНЕ5.

Дріжджові клітини трансформували РСК-генерованими лінійними фрагментами, модифікованими так, щоб мати кінці, гомологічні АсО1, як описано вище. Був сконструйований лінійний фрагмент для кодування гена стійкості до (3418. Стійкими до антибіотика були лише ті клітини, які мали інтегрований лінійний фрагмент у місці знаходження нуклеїнової кислоти, що кодує аконітазу. Ці клітини аналізували на підхожу інтеграцію за 65 допомогою РОК. Дріжджові клітини, одержані у цей спосіб, мали частково функціональний ТСА-цикл і, таким чином, могли виробляти цитрат у надлишковій кількості. Цей цитрат переносився крізь мітохондріальну мембрану в живильний бульйон. Крім того, ці дріжджові клітини були наділені екзогенною молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує такий фермент, як АТФ-цитратліазу таким чином, що вони каталізували конверсію акумульованого цитрату на оксалоацетат (див. Приклад 13).

Приклад 13. Рекомбінантні клітини, здатні експресувати цитратліазу в цитозолі

Дріжджові клітини позитивного фенотипу дикої яблуні трансформували плазмідою рРНЕ5З з нуклеїнокислотною послідовністю, що кодує поліпептид з АТФ-цитратліазною активністю. Цю нуклеїнову кислоту виділяють із Е. соїї, Кіерзіейа рпейитопіде (номер доступу Х79817 в базі Сепрапк) або інших опублікованих джерел.

Трансформовані дріжджові клітини аналізували на їх здатність використовувати цукри для вироблення великих 70 кількостей ліпідних накопичень. Дріжджові клітини також аналізували на предмет того, чи виявляли вони

АТФ-цитратліазну активність, як описано в (|Ноїдемжогй еї аї., 9. Сеп. МісгобіоІ., 134:2907-2915 (1998)|.

Дріжджові клітини, що мають АТФ-цитратліазну активність, здатні постачати цитозольний ацетат в аеробних умовах без розкладання альдегіду на ацетат альдегіддегідрогеназою. Крім того, якщо такі дріжджові клітини не мають піруватдекарбоксилазної або альдегіддегідрогеназної активності, вони повинні постачати ацетат для 7/5 біосинтезу шляхом циклу Кребса.

Приклад 14. Рекомбінантні клітини, які не можуть використовувати лактат у якості джерела вуглецю

Дріжджові клітини модифікували таким чином, щоб знизити активність транспортера карбонової кислоти, подібного до поліпептиду УЕМ 1 5. сегемівіае. Такі дріжджові клітини мають знижену здатність переносити лактат, а отже використовують його з меншою ефективністю. Активність транспортера карбонової кислоти в дріжджових клітинах знижували шляхом дезінтегрування локусу, що містить кодувальну послідовність для цього поліпептиду. По-перше, використовуючи дегенеративні праймери, сконструйовані на основі доступної послідовності для ЗЕМ 1 (номер доступу 024155 в базі СепрапКк), із клітини-хазяїна виділили гомолог поліпептиду УЕМ 1. Виділену із клітини-хазяїна нуклеїнову кислоту піддали секвенуванню. Дезінтегрування кодувальної послідовності для цього поліпептиду здійснювали за методикою, описаною в Прикладі 11. Лінійні сч ов фрагменти генерували шляхом кодування ділянок, гомологічних послідовності УЕМ 1, а також усього гена стійкості до (3418. Такий лінійний фрагмент інтегрували у геномну послідовність ОЕМ 1, викликаючи і) дезінтегрування даної активності. Клітини, які не мали активності транспортера карбонової кислоти, ідентифікували за їхньою нездатністю переносити карбонову кислоту, а отже за їхньою нездатністю рости при культивуванні на лактаті. Ге зо Крім того, клітини модифікували таким чином, щоб знизити активність функціонального еквівалента цитохромного поліпептиду 52 5. сегемізіде. Цитохромний поліпептид 52 дає можливість клітинам 5. сегемізіае со піддавати метаболічному перетворенню лактат в мітохондріях. Для цього передусім сконструювали со дегенеративні праймери із цитохромної послідовності 52 Засспаготусез (номер доступу 746729 в базі Сепрапк).

Ізольований клон піддали секвенуванню. За допомогою методів, описаних в (Еавз. Аїїзоп еї аї., іп "Мейїйоавз іп в.

Уеаві Сепеїйісв", Соїй Зргіпд Нагрог Ргезв (1997)) проводили дезінтегрування дріжджового хазяїна, ї- гомологічного цитохрому 652. Ця рекомбінантна дріжджова клітина є нездатною використовувати лактат у якості джерела вуглецю.

Приклад 15. Вироблення лактату у великих кількостях

Були приготовані і вироблені численні варіанти клітин К. тагхіапиз зі зниженою РОС-активністю. Ці « варіанти модифікували таким чином, щоб вони містили різні кількості копій екзогенної молекули нуклеїнової нта) с кислоти, що кодує поліпептид з І ОН-активністю. ГОН-поліпептид одержували із різноманітних джерел. Клітини таких варіантів можуть мати різні питомі продуктивності для молочної кислоти при 4026. ;» Усі варіанти вирощувалися в посудині в аеробних умовах з потоком повітря 1,5 МУМ і 3095 вмістом розчиненого кисню для одержання клітинної густини приблизно бОг/л сухої маси. По досягненні достатньої густини постачання повітря припиняли, і умови в культиваційній посудині переключалися на анаеробні. Основу -і не добавляли. Варіанти з найвищою питомою продуктивністю в анаеробній фазі можуть бути виявлені не тільки за здатністю більш швидкого вироблення молочної кислоти, але також за здатністю досягати більш високої

Ше концентрації за нижчої рН, ніж варіанти з нижчою питомою продуктивністю. Вихід продукту на глюкозі у фазі

Ге) вироблення продукту може перевищувати 90905.

Було вибрано декілька варіантів, які культивувалися у ті самі способи, за винятком того, що потік повітря бо був знижений до 0,1 МУМ, але не виключений повністю. За цих умов кінцевий рН в культиваційній посудині може

Ф бути нижчим, а концентрація лактату може бути вищою, ніж при культивуванні без доступу повітря. Вихід продукту на глюкозі може знижуватися, але залишатися на рівні приблизно 9095. У повторному експерименті, де потік повітря був збільшений до 0,5 МУМ, вихід продукту на глюкозі знизився до рівня менше 8095.

Приклад 16. Вироблення великих кількостей лактату з серією послідовних ферментацій

У процесі з серією послідовних ферментацій у якості інокуляту використовували культуру клітин К. іФ) тагхіапив, які не мали РОС-активності, але мали І ОН-активність. Кожну стадію ферментації здійснювали у ко поступово збільшуваних посудинах, кожну з яких стерилізували безпосередньо перед використанням. Крім того, у кожну посудину подавали потік повітря 1,5 МУМ, а їхній вміст перемішували для підтримання в ньому постійної бо Концентрації розчиненого кисню на рівні вище 1095. Остання посудина мала ємність бОООл. Температуру в посудинах підтримували на рівні 45923 для збільшення виживаності генетично модифікованих клітин К. тагхіапив порівняно з дріжджами дикого типу та іншими мікроорганізмами. Кожну посудину заправляли стандартним культурним середовищем, розрахованим на оптимальне вирощування.

Вміст останньої посудини з густиною клітин 100г клітин/л (сухої маси) переносили до обробленого перед тим 65 паром реактора ємністю З300000л. Для добавлення найкраще використовувати клітини, одержані від фільтрації у попередніх виробничих процесах. Густина клітин в реакторі складала 6 г клітин на літр (сухої маси). Глюкозу добавляли до рівня 8Ог/л. В посудині підтримували анаеробні умови з температурою 42 9С і періодом вирощування 25 годин. Питома продуктивність складала більше 0,5г лактату/грам біомаси за годину) майже до кінця процесу, коли продуктивність починала падати. Як тільки продуктивність починала падати, клітини видаляли і зберігали для повторного використання. Кінцева концентрація лактату складала 75г/л, а рн дорівнював 2,8. Після видалення біомаси розчин концентрували шляхом випаровування до 5095 концентрації лактату. Вільну кислоту (близько 8695 від загального лактату) видаляли шляхом рідинного екстрагування в органічне середовище, звідки її знову екстрагували за більш високої температури у воду. Рафінад, який містив сіль лактату, очищали і спрямовували для повторного використання в якості буферу в культиваційну посудину, 7/0 або підкислювали, наприклад, сірчаною кислотою й очищували.

Приклад 17. Порівняння аеробного вироблення організмів негативного (К. тагхіапиз) і позитивного (5. имагит) фенотипів дикої яблуні

Організми негативного (К. тагхіапив) і позитивного (5. имагит) фенотипів дикої яблуні вирощували кожний в аеробному й анаеробному ферментаційних реакторах періодичної дії. Культивування продукту по партіях 75 Здійснювали при температурі 3093 в лабораторних ферментаторах робочим об'ємом 1,5л. Величину рН в посудинах підтримували на рівні 5,0--0,1 шляхом автоматичного добавлення 2М/л 7" гідроксиду калію (КОН).

Ферментатор обдували повітрям (аеробні культури) або азотом (анаеробні культури) з витратою газу 0,8л/хв. 7 і перемішували зі швидкістю 8О0б0об/хв. Концентрацію розчиненого кисню постійно контролювали за допомогою кисневого електроду (фірма ІпдоЇд, тип 34 100 3002). В аеробних культурах концентрація розчиненого кисню підтримувалася на рівні вище 6095. Через відповідні інтервали часу відбирали 1Омл зразки для визначення сухої маси і концентрацій метаболітів. У якості сполук, потрібних для синтезу жирних кислот, в анаеробні культури добавляли Тмееп-80 і ергостерол.

У період експоненційного росту як суха маса і оптична густина 00660 дріжджових культур, так і концентрація глюкози й етанолу в супернатанті визначалися з відповідними інтервалами часу. Питому с продуктивність вироблення етанолу (Ддетнапої; ММОЛЬ/г/година) обчислювали за такою формулою, використовуючи (5) лінійно-регресійний аналіз: де ає/аєЄ (швидкість зростання концентрації етанолу в культурі, ммоль/л/година) і асСх/ає (швидкість ікс, зростання концентрації біомаси, г/л/година) обчислювалися шляхом диференціювання графіків концентрації со етанолу і концентрації біомаси в залежності від часу у ау/година. Максимальна питома продуктивність на глюкозі оцінювалася по експоненційній частині графіку залежності С, від часу. Для обчислення питомої швидкості о споживання глюкози (Ядіусове: ММОЛЬ/г/година) аЕ замінювали на ас (кількість глюкози, спожитої за годину). ча

В аеробних партіях культур питома швидкість росту штамів Кісумеготусез і Засспаготусез на глюкозі 325 складала відповідно О,4/год. і О0,28/год. Висока концентрація глюкози і зумовлена цим висока питома швидкість - росту культури Засспаготусез давали високі швидкості аеробної спиртової ферментації (Табл.3, Фіг.1). Питома швидкість споживання глюкози штамом Засспаготусез була приблизно в 2 рази вищою, ніж у штаму

Кісулхеготусез внаслідок інтенсивної спиртової ферментації. З точки зору енергетики спиртова ферментація є « для клітин менш ефективним шляхом генерування АТФ. Вихід біомаси на глюкозі у Кіоухеготусез складав З озвиг,а у Засспаготусевз ймагит 0,14г/г. Вихід етанолу на глюкозі був нульовим у штаму Кісуулеготусез с негативного фенотипу дикої яблуні і складав 1,83ммоль/ммоль у Засспаготусез - культурі позитивного фенотипу : » дикої яблуні.

І

- | (г/г), вихід продукту (ммоль/ммоль) і регенерування вуглецю (95) (обчислене тільки для анаеробних культур) на стадії експоненційного росту в партіях культур Засспаготусев имагит і Кісуухеготусев тагхіапиз на мінеральному середовищі з умістом глюкози 295 (маса/об'єм) в с дю 0000001000980000000000990802 о даю 10918911

УНН ПОН ПНЯ ПОН ПН НО ння НО в вют9я19 евнюс 11101111 о В анаеробних партіях культур питома швидкість росту і вихід біомаси в обох штамах були дуже низькими по порівняно з тими, що спостерігалися в аеробних умовах (Табл.3, Фіг.1 і 2). У штамів Кішпумеготусез і

Засспаготусез вихід біомаси складав відповідно 0,07 і О,09г/г. Обидва штами показали високу питому швидкість 60 спиртової ферментації в анаеробних умовах. Це було підтверджене даними вироблення СО».

Таким чином, даний Приклад свідчить про те, що аеробне вироблення біомаси є значно більш швидким, ніж анаеробне, і що вихід біомаси за аеробних умов культивування є вищим в організмів негативного фенотипу дикої яблуні (оскільки в організмів позитивного фенотипу має місце деяка спиртова ферментація при використанні глюкози). Цей Приклад також показує, що продукт ферментації (у даному випадку - етанол) виробляється з бо однаковою швидкістю обома організмами - негативного і позитивного фенотипів дикої яблуні - в анаеробних умовах. Таким чином, анаеробна стадія росту забезпечує високий вихід біомаси, а наступна за нею анаеробна стадія ферментації постачає метаболічну енергію в процес створення продукту, а не в процес росту культури.

Отже процес, в якому вироблення продукту відділене від росту культури, забезпечує більшу технологічну гнучкість і кращий контроль виходу продукції.

Приклад 18. Поліпшене вироблення лактату в штамі-хазяїні, який в природних умовах виробляє І-молочну кислоту: ампліфікація лінійних фрагментів гомологічної ДНК для дезінтегрування піруватдекарбоксилазних генів

Дріжджі Кіпсумеготусевз (Пегтоїіоіегапз (К. (пегтоїсіегапх) є природним виробником І-молочної кислоти

І(Кигігтап апа Геї, (1998) "пе Меавзів, А Тахопотіс Бішау" рр.240-241; ЕІвеміег Зсіепсе В.М.; Атвіегдат, Те 7/0 Мешепапаз). К. (Негтою!егапе мають створюваний природним шляхом лактатдегідрогеназний (ай) ген, котрий дозволяє виробляти І -молочну кислоту. Кількість молочної кислоти, вироблюваної за анаеробних умов, складає приблизно 495 г/г використовуваної глюкози, у той час як решта глюкози, головним чином, конвертується в етанол (42,595 г/г спожитої глюкози), гліцерол (390 г/г спожитої глюкози) і ацетат (0,390 г/г спожитої глюкози).

Таблиця 4

Результати анаеробної ферментації при використанні К. ІНегтоіоіІегапв, починаючи з 100г/л глюкози в середовищах УРАЮ (збагачені середовища) ши ноя По НОЯ НОЯ НОЯ НОТ с зв (вв | оове | аз | 0307

За допомогою консенсусних праймерів, сконструйованих із послідовності, виведеної шляхом порівняння генних послідовностей із К. тагхіапиз і К. Іасіїз була виділена 600 рр ділянка РОСТІ із К. (Негтоіоіегапв.

Фрагмент РОСТІ був підданий секвенуванню |Заподег)| і використаний для виділення 7,5 Кор фрагмента навколо со рай К. «(пегтоіоіІегапз (ФігбЕ) за допомогою методів РСК і геномної "прогулянки" (Сіопейфесп). Далі 7,5 Керр фрагмент був клонований у вектор клонування рекІ! набору ТА (Іпмігодеп). Частина довжиною приблизно 730 ( ьоФтюто рр поблизу середини кодувальної ділянки РОСІ1 була видалена із 7,5 Кор фрагмента К. ІпегтооіІегапв. Частина со рас К. (негтоіоіегапз, видалена шляхом рестрикційного травлення І(Затьгоок), містила таку послідовність:

АБС ОО ОО САВАН КО НЕ ОАЮВЯСАХ ї- кед дк ; пеня снеки вк а зе дл М у в Пи сеся вк е ве НЕ КЕ сечу шу. в

Я А РАСА АН АЛІНИ ОЦ ОНА ВА КАН я

БЕ ОСИЦА Те ТОНУ Сп ЕТ СОВА НОВО АОС ВЕНКВ « но

Во е а зо еВ о о СМ з НУТИ АТАКА АСАД Т: - пу АКОТ ОК ВІЕаЕО ОІСАСАН ї КРАН ОА ИНА А АНА Аа А (95) ОСА А НЕ ЛАНОК СКАН ОАСОЛОДАОС АСКОД ВОМ со 2 ВНЗ (вав Вся

Ф Далі, перетравленнями рестрикції із вектора рРІСОК (Іпмійгодеп) був виділений ген, що кодує стійкість до канаміцину,включаючи його промоторю Ген був клонований у сайт в 7,5 Кер, із якого був видалений 730 рр фрагмент. Ген стійкості до канаміцину і його промотор із рРІСОЯК (Іпмігодеп) мав таку послідовність: іме) 60 б5

ТТАССАСТОТСТТСОСТСТОССАОСТОАСТТСААТСТОСОТСТОТТОБбАСОСАСАТСТ

АСОАСОТССАСОСТАТОАСАТОВОССООТААСТОТААССАСТТОААСОСТТСТТАС

ССТОССОБАСОСТТАСОССАСААТСААСОСТАТОТССТОТТТОАТСАССАССТТооо тТеоТСООТсАСТОТОСОСТТТОААСООТАТСОССООТТСТТАСОСТОАОСАССТоО

СТОТСТОСАСАТТОТСОСТОТСССАТОСОТСТОСОСССАВОССААССАССТАТТО

ТТОСАССАСАССТТОООТААСОСТОАСТТСАСТОТСТТССАСАСААТСТССОССААС

АТСТСТОАСАССАСТОСТАТОАТСАСТОАТСТАОСТАССОССССАТСТОАСАТССАС

АВАТОТАТСАСААССАССТАСАТТАСАСАСАСАССТОТСТАСТТООСТТТОССАТСТ

ААСТТССТТОАССАВАТОСТОССАОССТОТСТАТТОСАСАССССААТТСАСТТОВвСС

ТТОААВССАЛАСОАССАОСАВОСТОАООАООАООТСАТСТСТАСТТТОТТОБАСАТ

САТСААООСАСОСТААСААСССАСТСАТСТТООСТОАСОСТТОСОСТТССАСАСАСОо

АТОТСААВОСТОАСАССААСААСТТОАТТОАСАТСАСТСАСТТСССАТСТТТСОТТА

ССССААТООСТААСОСТТССАТТОАСОАСААССАСССААСАТТООСТОоСТОТСТАС

СТСООТАССТТОТ (Бедцепсе І Мо. ХХ). Далі, перетравленнями рестрикції із вектора рРІСУК (Іпмігодеп) був виділений ген, що кодує стійкість до канаміціну, включаючи його промотор. Ген був клонований в сайт в 7,5 Кор, із якого був видалений 730 Бр фрагмент. Ген стійкості до канаміцину і його промотор із рРІСОК дв (Іпуйгодеп) мав таку послідовність: с

СТАСААСТІСАССААСТТОТССАТСАОСТОСТСААДАТТОСТССТСТОТААСОбАТОСА і)

СТСААСТТОСАСАТТААСТТОААОСТСАСТСОАТТОАСТОААСТТОАТСАСоТТоТо

САССТОСТСАССАВБСАТАВОСАЛАСАСОСОСТПТОСТАССАДАСТСААООСААТТАТС

ААЛАСТОТОСААСАСТТОСОТАТОСАСОСАССААВОСАААТОТСАТАСТТОААСТСОСА що

САСТОАСТОТАСТСТТСАСАААТТСТОАДАСССОТАТ ТТ ТТАТТАТСАСТОАСТСАСТС со

АТСАССАСАТОСТСТАСОССОСАСОСАТОСТОООССАССТОСАСОоСОоСОоСоооо С Ше

БОСОСТОАООТСТОССТоСТОААСААОСТОТТОСТОАСТСАТАССАСОССТОДАТС -

СССССАТСАТССАОССАСАААСТОАСОБАСССАСОСТТОАТОАСАОСТТТОТОТА ча

ССТОбАССАСТТОСТОАТТТТСААСТТТОСТТТОССАСОСААСОоСТоТОоСОоТТОоТо

ОООААСАТОСОТОСАТСТОАТССТТСААСТСАССААААСТТССАТТТАТТСАЛАСАЛАС

ССОСССТССССТСААСТСАССОТААТОСТСТОССАСТОТТАСААССААТТААССААТ «

ТСТОАТТАСАААААСТСАТСОАОСАТСАААТОДААСТОСААТТТАТТСАТАТСАСОСАТ т с ТАТСААТАССАТАТТ ТТ ТОАЛААААСССОТІТСТОТААТОЛАССАСДАААСТСАСССАЄ з ССАСТТССАТАООСАТОССААСАТОСТОСТАТСООТСТОСОАТТССОАСТООТОССАА зо екв кхвистев нт пс як лам окавят не нат не НЕ я о фата в 2 Пенпостач в нн м ве ки ки ши,

Я вн вн 2 Темне вн м ново окт вана яІ» мо АТАНСВАТАТАЯА СМП ТИСИ ТО кат ААТОН ПДК віта в

ЕКС тт опе ство повинен ово ст й СпООООВАсТо топ с птоотЗВАТО: Мважневнсстя ох Щі Е

Кінцева конструкція включала у себе ген ((3418) стійкості до канаміцину, оточений приблизно 6,8 Кор

РОСсС-ділянкою, як показано на Фіг.бї.

Зображена на Фіг.бЕ конструкція була перетравлена двома ферментами рестрикції |(Затрьгоок)| з виходом приблизно З мікрограмів фрагмента ДНК, що містив гомологічну РОС-ділянку і вставлений в середину послідовності ген стійкості до канаміцину. Для дезінтегрування РОС К. (НептоїіоІегап5, остання була трансформована цим фрагментом за допомогою одного із відомих методів -електропорацією. Метод електропорації полягав у тому, що: а) в об'ємі 20мл протягом ночі (приблизно 15 годин) вирощували культуру в

МУРАЮ-середовищі; Б) 50Омкл культури перенесли до мікровідцентрової пробірки, піддали центрифугуванню 7/0 ФАК, 4 хвилини, видалили супернатант; с) промили їмл холодним ЕВ (ЕВ - електропораційний буфер: 10ММ

Ттів-НСЇІ, рН 7,5; 270мММ сахароза; 1мММ МасІі»); 4) ресуспендували в мл ІВ (ІВ - інкубаційний буфер: ХРО; 25мММ

ОТ; 20мММ Нерез, рН 8,0); є) струшували (б 800об/хв, 302 протягом ЗО хвилин на приладі Еррепаог

Тнегтотіхег; У піддали центрифугуванню, промивали один раз ЕВ, ресуспендували в 40О0мкл ЕВ; 9) добавили

Змкг фрагментної ДНК (у воді 10мМ Ттгів-СІ, рН 8,5), інкубували на льоду протягом 30 хвилин; п) перенесли до 75 О4см електропораційну кювету; режим імпульсної обробки на приладі Віо-Кай Сепе Риїзег: 10008, 1000Ом,

БОмкФ; стала часу після імпульсу: приблизно 20мс; ї) перенесли до Змл пробірки Мортона-Клозюра (Могіоп

Сіозиге), інкубували без струшування при 302 протягом 1 години; |) додали 400мкл рідкого УРАЮ-середовища (УРА: 10г дріжджового екстракту, 20г пептону, 20г глюкози, 10Омг аденінгемісульфату, об'єм Тл, без регулювання рН), струшували (2 8О0боб/хв, 302С протягом 1 години в термоміксері Еррепдогї Тпептотіхег; К) додали 4О0Омкл рідкого МРАЮ і регенерували протягом 4-6 годин; І!) піддали центрифугуванню у мікровідцентровій пробірці (4 4К, 4 хвилини, видалили супернатант, ресуспендували в 400мкл 1М сорбітолу і висіяли на 100мкг/мл 6418-селективні планшети; і т) інкубували при температурі 302С протягом трьох-п'яти днів.

Колонії піддали скринінгу спочатку другим покриттям на культиваційний планшет, що містив 200мкг/л (3418.

Із вторинної дріжджової партії видалили геномну ДНК за допомогою стандартного методу геномного Се препарування |ЗатьгоокК). Далі видалений геномний продукт піддали РСК-скринінгу на 1) наявність фрагмента (5) канаміцину за допомогою відповідних праймерів і умов ІЗатрьгоок)| і 2) відсутність дезінтегрованої РОС-ділянки за допомогою відповідних праймерів і умов РОК. Колонії, позитивні по маркеру селекції і негативні по ділянках дезінтегрування РОС, були піддані культивуванню для подальших обстежень, наприклад, геномних ДНК із цих штамів за допомогою Саузерн-гібридизаційного аналізу. (Се)

Зрозуміло, що поданий вище докладний опис винаходу має на меті лише його ілюстрацію і жодною мірою не со обмежує його об'єму, визначеного наведеною нижче Формулою винаходу, яка охоплює також інші його ознаки, переваги і модифікації. (зе) ча

Claims (13)

Формула винаходу М

1. Спосіб вироблення молочної кислоти, що включає у себе: а) надання Кребтрі-негативного мікроорганізму, вибраного з групи, що складається з Кісулеготусез, Ріснпіа « та Напзепціа, який проявляє інгібування споживання кисню при культивуванні в аеробних умовах через наявність високої концентрації глюкози та трансформацією хоча б одного екзогеназного гена, що кодує - с лактатдегідрогеназу; ц Б) культивування Кребтрі-негативного мікроорганізму у першому культуральному середовищі, яке містить "» джерело вуглецю, включаючи глюкозу, та у перших аеробних умовах культивування, які стимулюють клітинне дихання, і с) подальше культивування Кребтрі-негативного мікроорганізму у культуральному середовищі, яке містить -І джерело вуглецю, включаючи глюкозу, у других анаеробних умовах культивування, що стимулюють вироблення молочної кислоти.

ї 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що другі умови культивування включають у себе інгібітор (9) клітинного дихання.

3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вміст розчиненого кисню у першому культуральному середовищі бо складає принаймні 20 95 відносно його кількості за насичених умов культивування у повітрі при атмосферному 4) тиску.

4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що вміст розчиненого кисню у другому культуральному середовищі складає менше ніж 2 90 відносно його кількості за насичених умов культивування у повітрі при атмосферному ТтИСКу.

5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що на етапі 5) вміст розчиненого кисню у першому культуральному о середовищі складає принаймні 50 95 відносно його кількості за насичених умов культивування у повітрі при іме) атмосферному тиску.

6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, друге культуральне середовище має величину рнН, більшу ніж 1,5. 60

7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що мікроорганізм, що проявляє Кребтрі-негативний фенотип, вибирають з групи, що складається з Кісумеготусез (ПегтоїіоіІегапз, Кіоухеготусез Іасіїс та Кісумеготусевз тагіхапив.

8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що вміст розчиненого кисню у першому культуральному середовищі складає більше ніж 20 95 відносно його кількості за насичених умов культивування у повітрі при атмосферному 65 тиску та вміст розчиненого кисню у другому культуральному середовищі складає менше ніж 2,0 90 відносно його кількості за насичених умов культивування у повітрі при атмосферному тиску.

9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що друге культуральне середовище має величину рН, більшу ніж

1,5.

10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що друге культуральне середовище має величину рН, меншу ніж

ЗО.

11. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що мікроорганізм, що проявляє Кребтрі-негативний фенотип, має знижену піруватдекарбоксилазну активність.

12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що мікроорганізм, що проявляє Кребтрі-негативний фенотип, вибирають з групи, що складається з Кісумеготусез (ПегтоїіоіІегапз, Кіоухеготусез Іасіїс та Кісумеготусевз /о тагіхапиз.

13. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що вміст розчиненого кисню у першому культуральному середовищі складає більше ніж 20 95 відносно його кількості за насичених умов культивування у повітрі при атмосферному тиску та вміст розчиненого кисню у другому культуральному середовищі складає менше ніж 2,0 90 відносно його кількості за насичених умов культивування у повітрі при атмосферному тиску. с щі 6) (Се) (ее) (зе) ча м. -

с . и? -І -І (95) ге» ШИ 4) іме) 60 б5