BRPI0915534A2 - produção de ácido carboxílico de ph baixo - Google Patents

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Abstract

PRODUÇÃO DE ÁCIDO CARBOXÍLICO DE PH BAIXO. A presente invenção refere-se a um processo para a produção de ácido dicarboxílico. O processo compreende fermentar uma levedura na presença de um substrato contendo carboidrato e quantidades baixas de oxigênio em um valor de pH no qual pelo menos 50% do ácido dicarboxílico está na forma de ácido. O processo da presente invenção permite produções elevadas do produto de ácido dicarboxílico e é mais econômica do que os processos existentes nos quais o sal é produzido, o qual durante a recuperação tem que ser convertido para o ácido.Também leva a um processamento a jusante mais simples e mais conveniente.

Description

t·, · » 1/16
PRODUÇÂO DE ÁCIDO CARBOXÍLICO DE PH BAIXO Campo da Invenção A presente invenção refere-se ,a um processo para a produção de ácidos dicarboxílicos. Em particular, refere- 5 se a produção de ácidos dicarboxílicos por ferrnentação de uma levedura.
Antecedentes da Invenção Ácidos dicarboxílicos, tais como ácido fumárico e ácido succínico, são compostos importantes que são usados 10 na indústria alimentícia para a preparação e preservação do alimento, na indústria médica para a formulação de produtos médicos e outros usos industriais, tais corno monômeros para (bio)polímeros. Para atender a crescente necessidade de ácidos dicarboxílicos, métodos de produção mais eficientes 15 e mais caros estão sendo desenvolvidos. Tradicionalmente, os ácidos dicarboxílicos são feitos por fermentação de bactérias, que podem produzir grandes quantidades de ácidos dicarboxílicos. Isto é, por exemplo, descrito em US
5.573.931 que descreve um método para produzir ácido 20 succínico em concentrações elevadas empregando-se uma cepa bacteriana. Entretanto, uma desvantagem principal associada com o uso de bactérias para a produção de ácidos dicarboxílicos é a formação de sal de ácido dicarboxílico.
Se bactérias são usadas, o ph durante a fermentação 25 necessita ser mantido na faixa de pH 6-7, que é mais elevado do que os valores de pKa de todos os ácidos dicarboxílicos. Corno uma consequência, a maioria dos ácidos será produzida em sua forma de sal e os sais terão que ser convertidos no ácido. Isto não é prático ou eficiente em 30 processos de produção de grande escala e aumenta os custos da produção. Além disso, qs micro-organismos exceto bactérias foram empregados para a produção de ácidos orgânicos. EP 0 424 384 descreve um processo aeróbico para a produção de ácidos orgânicos por Rhizopus em um meio 5 contendo carbonato de cálcio. ep 1 183 385 descreve células de levedura geneticamente manipuladas com um fenótipo negativo de Crabtree e contendo uma molécula de ácido de núcleo exógeno para a produção de ácido láctico.
Descrição Detalhada A presente invenção refere-se a um processo para a produção de um ácido dicarboxílico. O processo compreende fermentar uma levedura na presença de urri substrato contendo carboidrato e quantidades baixas de oxigênio ern um valor de pH que é abaixo do pKa do ácido dicarboxílico. O processo da presente invenção permite altas produções do produto de ácido dicarboxílico, permite um processamento a jusante mais simples e mais econômico dos que os processos existentes nos quais o sal é produzido o qual em seguida tem que ser convertido para o ácido. Uma vez que os ácidos dicarboxílicos têm mais do que um valor de pKa, q pH deve ser abaixo do pKa mais baixo do ácido dicarboxílico. Para a maioria dos ácidos, o pH tipicamente estará na faixa de pH 1,0 a pH 5,5, preferivelrnente entre pH 2,0 e pH 4,0. Em uma modalidade, o ácido succínico é produzido em um valor de pH de 3,0. Outra vantagem é que devido ao pH baixo o risco de contaminação é reduzido.
A fase de produção do ácido é preferivelmente precedida por uma fase de formação de biomassa para produção de biomassa ideal. Na fase de formação de biomassa o pH é na faixa de pH 2 a pH 7. Preferivelmente,
P ? P 3/16 o pH é na faixa de pH 3 a pH 6, mais preferivelmente, o pH é na faixa de pH 4 a pH 5.
O processo de acordo com a presente invenção é mais econômico e pode levar a um preço de custo mais baixo em 5 30%. Uma das razões é que os custos titulantes são significantemente reduzidos.
O processo pode ser usado para a produção de qualquer ácido dicarboxílico. Os exemplos adequados incluem ácido adípico, ácido fumárico, ácido itacônico, ácido succínico, 10 ácido málico, ácido oxálico. Preferivelmente, ácido dicarboxílico é ácido succínico, ácido fumárico ou ácido málico.
A levedura que é usada no processo pode ser qualquer levedura adequada. Os exemplos adequados de leveduras 15 incluem Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia e Yarrowia, tais como espécies de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyvermoces lactis, Candida sonorensis, Pichia stipidis e Yarrowia lipolytica. Em uma modalidade, o micro-organismo 20 eucariótico usado no processo é um Saccharomyces cerevisiae, um micro-organismo que é um micro-organismo industrialmente interessante amplamente usado.
Em uma modalidade preferida a levedura de acordo com a presente invenção é uma levedura geneticamente modificada.
25 Como usado aqui, uma levedura geneticamente modificada no processo de acordo com a presente invenção é definida como uma célula de levedura que contém, ou é transformada ou geneticamente modificada corn uma sequência de nucleotídeo ou polipeptídeo que não ocorrem naturalmente na célula de 30 levedura, ou contém cópia ou cópias adicionais de uma f 4/16 sequência de ácido nucléico endógena. Urna célula de levedura do tipo selvagem é aqui definida como a célula parental da célula recombinante.
preferivelmente, a Ievedura no processo de acordo com 5 a presente invenção é uma levedura geneticamente modificada compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima heteróloga selecionada do grupo que consiste em uma fosfoenolpiruvato carboxicinase, fumarato redutase e uma fumarase. As modalidades preferidas das enzimas heterólogas são como definidas aqui abaixo.
O termo "homólogo" quando usado para indicar a relação entre urna determinada molécula de ácido nucléico (recombinante) ou polipeptídeo e urn determinado organismo hospedeiro ou célula hospedeira, é entendido significar que na natureza a molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo é produzida por uma célula hospedeira ou organisrnos das mesmas espécies, preferivelmente da rnesma variedade ou cepa.
O termo "heterólogo" quando suado com respeito a um ácido nucléico (DNA ou RNA) ou proteína se refere a um ácido nucléico ou proteína que não ocorre naturalmente como parte do organismo, célula, genoma, ou sequências de DNA ou RNA na qual ele esteja presente, ou que seja encontrado em uma célula ou local ou locais no genoma ou sequência DNA ou RNA que difira daquele no qual ele é encontrado na natureza. Os ácidos nucléicos heterólogos ou proteínas não são endógenos para a célula na qual é introduzida, porém foram obtidos de outra célula ou sinteticamente ou recombinantemente produzidos.
Preferivelrnente a levedura geneticamente modificada b ' ' '"f" " " H « 5/16 compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma fosfoenolpiruvato carboxicinase. A PEP carboxicinase (EC
4.1.1.49) preferivelmente é uma enzima heteróloga, preferivelmente derivada de bactéias, mais preferivelmente 5 a enzima tendo atividade de PEP carboxicinase é derivada de Escherichia coli, Mannheimia sp., Actinobacillus sp., ou Anaerobiospirillum sp., mais preferivelmente Mannheimia succiniciproducens ou Actinobacillus succinogenes. Em uma modalidade a PEP carboxicinase é derivada de Actinobacillus 10 succinogenes (PCKa), onde a PCKa preferivelmente foi modificada para substituir EGY na posição 120-122 com uma sequência de aminoácido de DAF. Preferivelmente, uma célula de levedura de acordo corn a presente invenção é geneticamente modificada com uma PEP carboxicinase que tem 15 pelo menos 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% de identidade de sequência com sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6.
Em outra modalidade preferida uma levedura geneticamente modificada no processo de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de nucleotídeo 20 codificando um fumarato redutase. Preferivelmente, o fumarato redutase é uma enzima heteróloga, preferivelmente um fumarato redutase dependente de NAD(H), que pode ser derivado de qualquer origern adequada, por exernplo, bactérias, fungos, protozoários ou plantas.
25 Preferivelmente, uma levedura no processo de acordo com a invenção compreende um fumarato redutase dependente de NAD(H) heterólogo, preferivelmente derivado de um Trypanosoma sp., por exemplo, um Trypanosoma brucei. Em uma modalidade preferida, a sequência de nucleotídeo 30 codificando um fumarato redutase dependente de NAD(H) é expressa no citosol. No evento que a sequência de nucleotídeo codificando um fumarato redutase dependente de NAD(H) compreende um sinal de alvejamento peroxissômico ou mitocondrial, pode ser essencial para modificar ou deletar 5 vários aminoácidos (e sequências de nucleotídeos correspondentes na sequência de nucleotídeo de codificação) para prevenir alvejamento peroxissômico ou mitocondrial da enzima. A presença de um sinal de alvejamento peroxissômico pode, por exemplo, ser determinada pelo método descrito por Schlüter e outros, Ácido nucléico Research 2007, 35, D815-D822. Preferivelmente, uma célula de levedura de acordo com a presente invenção é geneticamente modificada com um fumarato redutase dependente de NAD(H), que tem pelo menos 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7.
Em outra modalidade preferida, uma levedura geneticamente modificada no processo de acordo com a presente invenção compreende a sequência de nucleotídeo codificando uma fumarase, que pode ser uma enzirna heteróloga ou homóloga. A sequência de nucleotídeo codificando uma fumarase heteróloga pode ser derivada de qualquer origem adequada, preferivelmente de origem microbiana, preferivelrnente de uma levedura, por exernplo, Saccharomyces cerevisiae ou um fungo filamentoso, por exemplo, Rhizopus oryzae. Preferivelmente, uma levedura no processo de acordo com a presente invenção super-expressa uma sequência de nucleotídeo codificnado uma fumarase que tem pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8.
¢ 7/16 Em outra modalidade preferida uma levedura geneticamente modificada no processo de acordo com a presente invenção também compreende urna sequência de nucleotídeo codificando um malato deidrogenase (MDH) que é 5 ativo no citosol na expressão da sequência de nucleotídeo.
Preferivelmente, o MDH necessita de um sinal de alvejamento peroxissômico ou mitocondrial para localizar a enzima no citosol. Um MDH citosólico pode ser qualquer malato deidrogenase hornólogo ou heterólogo adequado.
10 Preferivelmente, uma célula de levedura de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um malato deidrogenase que tem pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de sequência com a sequência de 15 aminoácido de SEQ ID NO: 9.
Em outra modalidade, uma levedura geneticamente modificada no prQcesso de acordo com a invenção compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína transportadora de ácido dicarboxílico, preferivelmente uma 20 proteína transportadora de ácido málico (MAE). Uma proteína transportadora de ácido dicarboxílico pode ser uma proteína homóloga ou heteróloga. Preferivelmente a proteína transportadora de ácido dicarboxílico é uma proteína heteróloga. Uma pròteína transportadora de ácido 25 dicarboxílico pode ser derivada de qualquer organismo adequado, preferivelmente de Schizosaccharomyces pombe.
preferivelmente, uma proteína transportadora de ácido carboxílico é uma proteína transportadora de ácido málico (MAE) que tem pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% ou 100% de 30 identidade de sequência com SEQ ID NO: 10.
Preferivelmente, a levedura usada no processo de acor.do com a presente invenção é uma levedura geneticamente modificada compreendendo uma PEP-carboxicinase heteróloga, uma fumarato redutase dependente de NAD(P)H heterólogo, uma 5 fumarase heteróloga, uma proteína transportadora de ácido rnálico heteróloga e um malato deidrogenase citosólico. As modalidades preferidas destas enzimas são como definidas aqui acima .
A identidade de sequência é aqui definida como uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácido (polipeptídeo ou proteína) ou duas ou mais sequências de ácido nucléico (polinucleotídeo), como determinado comparando-se as sequências. Geralmente, as identidades ou similaridades de sequência são comparadas com o tamanho natural das sequências comparadas. Na técnica, "identidade" também significa o grau de ligação de sequência entre as sequências de aminoácido ou ácido nucléico, conforme for o caso, como determinado pelo pareamento entre os filamentos de tais sequências. Os métodos Preferidos para determinar a identidade são designados para determinar o maior pareamento entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programa de computador preferidos para determinar a identidade e sirnilaridade entre duas sequências incluem BLASTP e BLASTN, publicamente disponíveis de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., e outros, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Os parâmetros preferidos para a comparação de sequência de aminoácido usando BLASTP são b
V h 9/16 abertura de espaço 11.0, extensão de espaço 1, matriz Blosum 62.
O termo "ácido nucléico" corno usado aqui, inclui referência a urn poIímero de deoxirribonucleotídeo ou 5 ribonucleotídeo, isto é um polinucleotídeo, na forma de filamento único ou duplo, e a menos que de outro modo limitado, abrange análogos conhecidos tendo a natureza essencial de nucleotídeos naturais pelo fato de que eles hibridizam para ácidos nucléicos de filamento único de uma 10 maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, ácidos nucléicos de peptídeo). Um polinucleotídeo pode ser de tamanho natural ou uma subsequência de um gene estrutural ou regulador nativo ou heterólogo. A menos que de outro modo indicado, o termo inclui referência à 15 sequência especificada bem como a sequência complementar da mesma.
Em uma modalidade preferida, a Ievedura no processo de acordo com a invenção super-expressa as sequências de nucleotídeos codificando quaisquer das enzimas corno 20 definido aqui acima. Há vários meios disponíveis na técnica para super-expressão das sequências de nucleotídeo codificando enzimas em uma levedura no processo da invenção. Em particular, uma sequêncía de nucleotídeo codificando uma enzima pode ser super-expressa aumentando- se o núrnero de cópia do gene codificando para a enzima na célula, por exemplo, integrando-se cópias adicionais do gene no genoma da célula, expressando-se o gene de um vetor centromérico, de um vetor de expressão de multicópia epissômico ou introduzindo-se um vetor de expressão (epissômico) que compreende múltiplas cópias do gene.
preferivelmente, a super-expressão da enzima de acordo com a invenção é obtida com um promotor constitutivo (forte).
O substrato contendo carboidrato pode ser qualquer substrato contendo carboidrato incluindo melaço, suco de 5 cana-de-açúcar, pentoses e hexoses, tais como glicose, frutose, xilose, arabinose. Preferivelmente, o substrato contendo carboidrato é um substrato contendo glicose, tal como maltose, sacarose, glicose ou um xarope de glicose. O teor de carboidrato do substrato contendo carboidrato é preferivelmente maior do que 50% em peso/peso, mais preferivelmente rnaior do que 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% em peso/peso, mais preferivelmente maior do que 85%, 90%, 95% ou 99% em peso/peso na de teor de material seco.
O processo de acordo com a presente invenção, preferivelmente compreende fermentar uma levedura em condições limitadas de carbono (C). As condições Iimitadas de C são definidas aqui como uma concentração de carboidrato dissolvido abaixo de 1 g/l, preferivelmente abaixo de 0,9 g/l, 0,8 ou abaixo de 0,5 g/l de carboidrato dissolvido. Descobriu-se que a fermentação da levedura em condições de C limitado resultou em uma produção aumentada de ácido succínico quando comparado às condições de C não limitado.
O oxigênio para a fermentação pode ser fornecido em qualquer forma adequada. Em uma modalidade, o oxigênio é fornecido na forma de ar. O oxigênio deve ser fornecido em pequenas quantidades. Isto é refletido na taxa de captação de oxigênio (OUR) e/ou na taxa de captação de oxigênio específica (qo2) da levedura. A OUR na presente invenção é mais baixa do que cerca de 8,0 mmol de oxigênio/l/hora,
preferivelmente mais baixa do que cerca de 5,0, 4,0, 3,0, ou 2,0 mmol de oxigênio/l/hora, mais preferivelmente mais baixa do que cerca de 1,0, ou 0,5 mmol de oxigênio/l/hora, preferivelmente acima de 0,01 mmol de oxigênio/l/hora.
5 a taxa de captação de oxigênio específica (qo2) no processo da invenção varia entre 8 mmol de oxigênio/g de peso seco de biomassa/hora a 0,5 mmol de oxigênio/g de peso seco de biomassa/hora, preferivelmente entre 5, 4, 3, ou 2 mmol oxigênio/g de biomassa/hora a cerca de 0,4, 0,3, ou 0,2 mmol/oxigênio/g de biomassa/hora.
O processo de acordo com a presente invenção pode ser realizado em batelada, alimentado de modo contínuo ou em batelada. Esses modos de fermentação são conhecidos pelos homens versados na técnica. Dependendo do modo de fermentação, a concentração de biornassa durante a fermentação pode variar mais ou menos durante a fermentação. No modo alimentado por batelada e de batelada a concentração de biomassa geralmente aumenta. Consequentemente, a taxa de captação de oxigênio específica geralmente diminui em um modo de batelada e alimentado por batelada.
A temperatura do processo é tipicamente entre 10 e 40 °C, preferivelmente entre 20 e 35 °C, mais preferivelmente entre 30 e 35 °C.
Em uma modalidade do processo de acordo com a invenção, um doador de elétron extra está presente além do substrato contendo carboidrato. O doador de elétron extra é preferivelmente um doador de elétron orgânico. Os exemplos adequados de doadores de elétron orgânicos incluem glicerol, formato e polióis, tais como manitol, sorbitol e xilitol.
FIGURAS Figura 1. Efeito da OUR aplicada na produção de ácido succínico após 90 h em pH 3.
5 EXEMPLOS Exemplo 1. Produção de âcido succínico por Saccharomyces cerevisiae
1.1. Construção de cepa de Ievedura
1.1.1. Construção de construções de expressão A construção de expressão pGBS414PPK-3 foi criada após uma restrição de BamH\/Not\ do vetor de expressão pRS414 de S. cerevisiae (Sirkoski R. S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122(1 ):19-27) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição de BamH\/Not\ consistindo na construção de gene sintético (SEQ ID NO: 1 )de fosfoenolpiruvato carboxicinase (origem Actinobacillus succinogenes). A mistura de ligação foi usada para transformação de E. coli TOPIO (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGbS414ppk-1.
Súbsequentemente, pGBK414PPK-1 foi restrito com Ascl e Notl. Para criar pGbS414ppK-3, um fragmento de restrição de ASC\/Not\ consistindo em fumarato redutase glicossômico de construção de gene sintético de T. brucei (FRDg) (SEQ ID NO: 2) foi ligado no vetor pGBS414PPK-1 restrito. A mistura de ligação foi usada para a transformação de TOPlO de E. coli (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS414PPK-3.
A construção de expressão pGBS415FUM-3 foi criada após uma restrição de BamY\\INot\ do vetor de expressão de S.
cerevisiae pRS415 (Sirkoski R. S. e Hieter P, Genetics,
¶ 13/16 1989, 122(1 ):19-27) e subsequenternente ligando neste vetor um fragmento de restrição de Bam\A\INot\ consistindo na construção de gene sintético de fumarase (origem Rhizopus oryzae) (SEQ ID NO: 3). A mistura de ligação foi usada 5 para a transformação de TOP 10 E. coli (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS415FUM-1. Subsequentemente, pGbk415fUm-1 foi restrito com Ascl e Notl. Para criar pGBS415FUM-3, um fragmento de restrição de ASC\/NOt\ consistindo em construção de gene sintético de malato deidrogenase peroxissômico de S.
cerevisiae (MDH3) (SEQ ID no: 4) foi ligado no vetor pGBS415FUM-1 restrito. A mistura de ligação foi usada para a transformação de E. coli TOPlO (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGbS415fUm-3.
A construção de expressão pgbs416mae-1 foi criada após uma restrição de BamH\/Not\ do vetor de expressão de S.
cerevisiae pRS416 (Sirkoski R. S. e Hieter P, Genetics, 1989, 122(1 ):19-27) e subsequentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição de Bam\A\INot\ consistindo na construção de gene sintético de transportador de malato de Schizosaccharomyces pombe (SEQ ID NO: 5). A mistura de ligação foi usada para a transformação de TOPIO de E. coli (Invitrogen) resultando na construção de expressão de levedura pGBS416MAE-1.
1.1.2. Construção de cepa de S. cerevisiae Os plasmídeos pGBS414ppK-3, pGbS415fUm-3 e pGbs416mae- 1 (descritos em 1.1.) foram transformados por eletroporação em cepa de S. cerevisiae RWB064 (MATA ura3-52 Ieu2-112 tçp1- 289 Mhl::lox adh2::lox gpd1ukan1ox) para criar a cepa SUC-200, super-expressando PCKa, MDH3, FUMR, FRDg e SpmaeI.
14 /16 Todos os genes foram otimizados em par de códon para a expressão em S. cerevisiae de acordo com WO2008/000632.
1.2. Produção de ácido succínico de S. cerevisiae em condições Iimitadas de oxigênio e pH baixo 5 A cepa de levedura SUC-200 (MATA ura3-52 Ieu2-112 trp1-289 adhl::lox adh2::lox gpdl::kanlox, super- expressando PCKa, MDH3, FUMR, FRDg e SpMAEI ), foi cultivada em frascos de agitação (2 x 300 ml) durante 3 dias a 30°C e 220 rpm. O meio foi com base em Verduyn (Verduyn e outros, 1992, Yeast 8, 501-517), porém as modificações em fontes de carbono e nitrogênio foram feitas como mostrado na Tabela 1.
Tabela 1. Composição de meio de frasco de agitação de pré-cultura de Composto Concentração (g/l) C6H12O6 . H2O 20, 0 (NHJ ,CO 2,3 KH2PO4 3,0 MgSO, . 7H2O 0, 5 1 1 Solução da Vitamina" Componente Fórmula Concentração (g/kg) Biotina (D-) C,10.H,1,6.N2,O.3.S 0,05 Pantotenato C18H32CaN2O10 1, 00 de Ca (D+) Ácido C6H5NO2 1, 00 nicotínico Mio-inositol C6H12O6 25, 00
Cloridrato I C12H18Cl2N4OS . XH2O I 1,00 de cloreto de t iarnina
Cloridrato I C8H12ClNO3 i 1,00 de piridoxol
Ácido P- I C,H,NO, Í 0, 20 aminobenzóico bSolução de elementos traços
Fórmula Concentração (g/kg)
C10H14N2Na2O8.2H2O (EDTA) 15 , 00
ZnSO4 . 7H2O 4 , 50
MnCl, . 2H2O 0, 84
CoCl2 . 6H2O 0, 30
CuSO, . 5H2O 0, 30
Na2MoO4 . 2H2O 0, 40
CaCl2- 2H2O 4 , 50
FeSO, . 7H2O 3 , 00
H,BO, 1, 00
Kl 0, 10
Subsequentemente, o teor dos frascos de agitação foi transferido para o fermentador de 1 OL (peso inicial 6 kg),
que continha o seguinte nieio:
Tabela 2. Composição de meio de fermentação principal
Material Bruto Fórmula Concentração
(g/l)
Sulfato de ainônio (NH4) 2SO4 2, 5
Fosfato de KH,PO4 3,0 diidrogênio de potássio
Sulfato de magnésio MgSO, . 7H,O 0, 5
Solução de elemento 1 traço Solução de vitamina 1 O pH foi controlado em 3,0 por adição de KOH a 6 N. A temperatura foi controlada a 300C. A concentração de glicose foi mantida limitada (< 1 g/l) controlando-se a adição de alimento ao fermentador. As taxas de captação de 5 oxigênio diferentes (OUR) foram aplicadas à ferrnentação, que resultou em limitação de oxigênio (Figura 1).
0,33 vvm de fluxo de gás foi aplicado, incluindo 10°o" de CO2 para fornecer CO2 suficiente para produção eficiente de ácido succínico.
LO Os resultados de OUR'S aplicados diferentes na produção de ácido succínico são mostrados na Figura 1. Uma quantidade mínima de aeração foi requerida para manter a produção de ácido succínico ern um pH de 3. Um OUR acima de 5 mmol/l/h resultou em produção de ácido succínico mais L5 baixa.
Durante o cultivo de 90 horas, o crescimento ocorreu a uma concentração de biomassa típica de 8 g de peso seco/l.
Consequentemente, a taxa de captação de oxigênio específica (qo2) diminuiu constantemente durante a fermentação. Uma !0 OUR de 10 mmol/l/h aplicada em uma fermentação se correlacionou COúl uma diminuição de qo2 de 10 a 1,25 mmol/g de peso seco de biomassa/h e uma OUR de 1 mmol/l/h correlacionada com urna qo2 diminuindo de 1 a 0,1 mmol/g de peso seco de biomassa/h.

Claims (10)

REIVINDICAÇÕES
1. Processo para a preparação de um ácido dicarboxílico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende fermentar uma levedura na presença de um substrato contendo 5 carboidrato e quantidades baixas de oxigênio em um valor de pH que esteja abaixo do pKa mais baixo do ácido orgânico.
2. Processo, de acordo corn a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido dicarboxílico é ácido fumárico, ácido málico, ou ácido succínico.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o pH é na faixa de pH 1,0 a pH 5,5.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o oxigênio é fornecido em uma taxa de captação de oxigênio menor do que cerca de 8 mmol de oxigênio/l/hora.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o oxigênio é fornecido em uma taxa de captação de oxigênio específica que varia entre 8 a 0,5 mmol/g de peso seco de biomassa/hora.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende fermentar a levedura em condições de carbono limitadas.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, CARACTERIZADO pelo fato de estar na presença de um doador de elétron extra.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a levedura é uma Saccharomyces cerevisiae.
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a levedura é uma levedura geneticamente 5 modificada.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a levedura geneticamente modificada compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma enzima heteróloga selecionada do grupo consistindo em um piruvato de fosfoenol carboxicinase, fumarato redutase e uma fumarase.
4 V k g ··t
1/1
18
16 |i 14 ||
'iij 12 l d '° Iã8 6
4
2
0 l \ l |l 0 2 4 6 8 10 12 I OUR (mmol/ljh)
Fig.l
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