JPS6265698A - ウシ成長ホルモンの高レベル産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換え体ＤＮＡ技術による、ウシ成長ホルモ
ンの高レベルの微生物的産生に関する。

この高レベル産生け、ウシ成長ホルモン？符号化した遺
伝子を持った組換え体ベクターによって形質転換された
Ｅ、　ｃｏｌｔ細胞の高密度醗酵によって達成される。

ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）は１９１個のアミノ酸から
なる蛋白であり、まず最初に下垂体前葉中で、Ｎ末に２
６個のアミノ酸が追加結合している前駆物質「前成長ホ
ルモン」として合成される。

この２６個のアミノ酸からなるシグナル配列は、下垂体
細胞から分泌される間に変化會受けて、完全な成長ホル
モンケ生じる。脳下垂体から精製したＢＧＨ２用いた試
用実験で、このホルモン會投与したウシに乳汁産生能の
増加と餌から乳汁への変換率の向上が見られることが証
明された〔マツクリｙＬ　、　Ｊ　、　（Ｍａｃｈｌｉ
ｎ　、　Ｌ　−Ｊｚ）著、２ヤーナル・オプ・デアリー
・サイエンス、ｕ：５７５−５８０［１９７３））。こ
のホルモンの多大な経済的価値が刺激となって、工業的
量のＢＧＨｉ相応な値段で得ることが関心の的となつ九
従って、近年の研究の多くが、この商業的に価値のある
ホルモンを組換え体ＤＮＡ技術を用いて微生物的に合成
する方法？得ることに焦点をおいて行われてきた。当分
野に於て既知の遺伝子クロ−ニング技術や遺伝子操作技
術が、所望の宿主細胞中でのＢＧＨの合成を指揮するこ
とができる調節部位に結合しているＢＧＨ符号化ｃＤＮ
Ａ會含んでいる組換え体表現ベクターケ生成するために
用いられてきた。これらの表現ベクターで形質転換され
ている微生物が所望の成長ホルモンケ生成することが示
されている。例えば、ケラシェツト（Ｋｅｓｈｅｔ　）
等（ヌクレイツク９アシツド争リサーｊ、旦：１９−３
０（１９８１））は、ｐＢＲ３２２によって符号化され
るβ−ラクタミナーゼの部位を有する結合蛋白である完
全な長さのＢＧＨポリペプチドのＢ、　ｃｏ　ｌ　ｉ　
　に於けるクローニング？報告しており、このＢＧＨポ
リペプチドが低レベルでしか表現されなかったことケ報
告している。

アミン末端の様々な部位が欠損したＢ　Ｇ　Ｈポリペプ
チド符号化ベクター會含めて数種の表現ベクターの構成
法が、ヨーロッパ特許出願公開　第０１０３　３９５号
に記載されている。完全なりＧＨホルモンのアミノ末端
の種々の部位が欠損したＢＧＨポリペプチドは生物学的
活性ケ保持しており、また記載されている表現系に於て
完全なりＧＨホルモンよりもずっと高レベルに表現され
るということがわかった。全表現ベクトル（及び、ＢＧ
Ｈ合成全調節する温度感受性リプレッサー符号化遺伝子
會持ったプラスミド）で形質転換された種々の大腸菌（
炎見虻すエ）株に於るＢＧＨの生成率は、小規模培養で
１００■／ｌ以下であった。

これら形質転換株の大規模醗酵については報告がない。

シーバーブ（Ｓｅｅｂｕｒｇ　）等（ＤＮＡ　、　２　
：３７−４５（１９８３））はウシ及びブタ成長ホルモ
ン用ｃ　ＤＮＡのクローニングと、完成な成長ホルモン
符号化表現ベクターの構成法（即ち、ベクターの構成中
に生体外で前シグナル配列部又はシグナル配列部？取り
除く）と會記述している。

Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞＝ｉＢＧＨ表現ベクトルで形質転換
し、ＢＧＨ合成全プラズミドで生じたＥ、　ｃｏｌｉ　
ｔｒｐ調整部位で調整した。形質転換ム」旦細胞の高密
度醗酵で約１．５９／　ｌのＢＧＨが生成したと報告さ
れているが、醗酵条件の記載はない。

クローニングされた遺伝子による蛋白産物を最高表現レ
ベルで得ようとする試みはしばしば失敗する。これらの
遺伝子は数個の異った調整部位に結合するか、又は数種
の宿主細胞株に形質転換されるので、比較分析によると
形質転換株が所望のタンパフケ最高レベル産生ずること
がわかる。今日まで、微生物学的に産生される成長ホル
モンの生成率向上の努力が、主に、細胞表現の増強を目
的として行われる遺伝子操作のレベルで行われてきた。

成長ホルモン葡最高可能な生成率で生成することが可能
な工業的規模の醗酵法の発展がまだ必要である。

本発明は、ＢＧＨ生成に最適な条件下で、ＢＧＨ符号化
遺伝子を含む組み換体ベクターによって形質転換された
Ｅ、　ｃｏｌｔ細胞の醗酵によってＢＧＨ７高レベルで
産生ずる方法會提供する。ＢＧＨ表現は、Ｅ＠　ｃ　ｏ
　ｌ　を宿主株をも形質転換した第２プラスミドの情報
？含む温度感受性リプレッサーによって調整される。本
発明の方法を用いて、１／当りＢ　Ｇ　Ｈｋ　３．６〜
５．９ｇ生成する高密度醗酵を得た。

このＢＧＨ産生法は、λフアージプロモータオペレータ
ーの調節下にウシ成長ホルモンの表現を指揮する表現ベ
クターとλｃＩ８５７温度感受性リプレッサー蛋白の表
現？指揮する表現ベクターとを含む形質転換Ｅ、　ｃｏ
ｌｔ　ｋ水性醗酵培地に接種することからなる。この形
質転換株は、培地中の溶存酸素の濃度が２０〜６０％飽
和にそして培地の温度が約２６〜３０℃に維持されてい
る初期生育期の間、醗酵培地中で生育させられる。この
初期生育期に引き続く誘導期では醗酵培地温度全最低約
４２℃まで上げて温度感受性ｃＩ８５７リプレツサー蛋
白を不活化することによってＢＧＨ合成を誘導し、その
後温度を約３８〜４１℃に好ましくは約４０℃に下げて
から、誘導期の残りの期間、培地中の溶存酸素濃度全約
１０〜４０％飽和に維持して形質転換株の生育會続ける
。この様にして生成したウシ成長ホルモンはその後形質
転換細胞から回収される。

我々は、ＢＧＨ符号化プラズミドによって形質転換され
たＥ、　ｃｏｌｉ株に於るＢＧＨ産生を促進する方法會
開発した。本発明の方法に於てＢＧＨ表現？指揮するプ
ラスミドは、λバクテリオファージに由来するプロモー
タ・オペレータ部位、好ましくはλＰＬプロモータ・オ
ペレータ部位からなる調整部位によってＢＧＨの表現が
指揮される適当なものであれば、どんなりＧＨ符号化プ
ラズミドであってもよい。この調整部位はシャイン・ダ
ルガーノ（５ｈｉｎｅ　−Ｄａｌｇａｎｏ　）　（リボ
ゾーム結合性）部位もまた含んでおり、このシャイン・
ダルガーノ部位はｍｕバクデリオファージに由来するこ
とが好ましい。このＢＧＨ符号化配列は調整部位に結合
されるのであるが、この配列はＢＧＨ又はＢＧＨの生物
学的活性フラグメント等のアミノ酸配列？持つポリペプ
チドの情報符号化ＤＮＡ配列を含む。本明細書中に用い
られている様に、「ウシ成長ホルモン」やｒＢＧＨＪと
いう言葉は、このホルモンのアミン末端の種々の部位が
欠損したり又はこのポリペプチドの生物学的活性ケ破壊
しないようにＢＧＨ配列中の置換や修飾が行われてでき
たフラグメントを含む。このホルモンのアミの末端の種
々の部位が欠損してできたＢＧＨポリペプチドは生物学
的活性全保持していることが示されている。本発明の好
ましい具体例では、ＢＧＨ符号化ブラズミドはΔ９ＢＧ
Ｈ，即ち完全なホルモンの最初の９つのアミン末アミノ
酸が欠如した形のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
符号化している。

有利なことに、このプラスミドはまた、このプラスミド
によって形質転換された細胞を選択する為の選択用マー
カーを符号化する遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子を
も有する。

本発明の方法で用いる形質転換株は、λｃ■８５７リプ
レツサー遺伝子葡もまた含んでいる。この温度感受性突
然変異遺伝子で符号化されたリプレッサー蛋白は、λフ
アージ遺伝子調節部位のオペレータ（ＰＬオペレータ？
含む）と相互に作用して、調節部位でのオペレータから
の遺伝子の転写？防ぐことが知られている。

このリプレッサー蛋白は、種々の形質転換株に於て、組
換え体ベクターによって符号化される所望の蛋白の合成
？調節するのに用いられてきた。

例えば、Ｃ，クイーン（Ｃ，暢ｅｅｎ　）　（ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジエネ
テイクス、２：１（１９８３））、Ｈ、クツパー（Ｈ、
Ｋｕｐｐｅｒ　）　（ヨーロッパ特許出願公告Ｎｏ、０
　０７６　０３７）及びＧ、プエル（Ｇ。

Ｂｕｅｌｌ　）　（ヨーロッパ特許出願公告Ｎｏ、０１
０３３９５）Ｉ’ｊすべてｃ　ｌ８５７リブレツサー會
用いて組換え体ベクターによって符号化された所望の蛋
白の合成？調節する方法？述べている。このＣｌ８５７
遺伝子は、所望の蛋白の遺伝子を運ぶベクター（及びこ
の蛋白の表現を指揮するλプロモーターオペレータ部位
）上又は宿主細胞へ形質転換される別のプラスミド上で
運ばれる。所望の蛋白の合成は、形質転換宿主細胞？２
８〜３２℃の温度で所望の細胞密度に達するまで培養す
ることによって抑制された。我々研究者はその後、残り
の培養期の量温度？４２〜４３℃に上げることによって
ｃ　１８５７リブレツサー會不活化した（即ち所望の蛋
白の合成に誘起した）。

ｃ　ｌ８５７遺伝子は、ＢＧＨ合成を調節するために本
発明の方法で用いられており、恐らく宿主細胞染色体中
ではＢＧＨ符号化プラスミド上又は第２プラスミド上で
運ばれる。本発明のより好ましい具体例でＨ１ｃＩ８５
７’Ｊブレツサー蛋白の表現ケ指揮する第２プラスミド
は、ＢＧＨ符号化プラスミドと共に宿主株へ形質転換さ
れる。我々は、λＰＬプロモータ・オペレータと相互に
作用するｃＩ８５７リブレツサーは３７℃という低い温
度である程度不活化されることを観察しており、この事
は振とうフラスコ培養で封入体が形成される（　ＢＧＨ
合成ケ示す）ことによって証明される。

しかしながら、最も良い結果が得られたのは、１時間温
度ケ４２℃に上げてｃ１８５７リブレツサーに不活化し
た後残りの醗酵期間中温度？！１−４０℃に下げておく
方法であった。

用いる宿主細胞は、細胞を形質転換する為に使用する表
現ベクターがその中で安定に維持される、高密度醗酵に
適したものであれば、どんな形質転換可能なＥ、　ｃｏ
ｌｉ株であってもよい。当分野ではそのような株が多く
知ら詐ており、そのうちの適当な株の一つがＥ、ｃｏｌ
ｉＨＢｌｏｌ（ロイシンΦラクトース争）゛ロリン・チ
アミン１１ｈｒｓ　、　ｈｓｍ　。

５ｕｐＥ　、　ｒｅｃＡ　、　ｓｍ　　）でおる。

本発明の方法に使用するのに好ましい形質転換株はＥ、
　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１　（ＰＬ−ｍｕ　−へ９　（
Ｓｅｒ）ＢＧＨとｐｃＩ８５７）である。これらのプラ
スミド葡含む旦ハ刀土形質転換体の構成法はヨーロッパ
特許出願公告第０　１０３　３９５号に記載されており
、参考の為に本明細書中にその開示？包含しているこの
文献はこれ以後Ｅ　Ｐ　Ｏｏ　　１ｏａ３９５と呼ぶ。

Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢ　１０１　（ＰＬ−ｍｕ　−△９
　（Ｓｅｒ　）　ＢＧＨとｐｃＩ８５７）は、見匹匡ｌ
ＭＣＮｏ、１という名称で、ｎｏ、５３０３０の登録番
号で、メリーランド州のロックビルにある合衆国タイプ
カルチャーコレクションに置かれてきた。本発明の方法
が、ＢＧＨ表現がｃ　ｌ８５７遺伝子生成物の調節下に
ある他の形質転換株？用いてＢＧＨの高レベル産生會す
るのに等しく適用されることは、評価されることであろ
う。

第１図に示されているプラスミドＰＬ　−ｍｕ−Δ９（
Ｓｅｒ　）　Ｂ　Ｇ　ＨＵ、完全なホルモンの最初の９
つのアミン末アミノ酸が欠如しており、通常はＢＧＨ中
に存在しない余分のセリン残基ｉＮ末端に含むＢＧＨポ
リペプチド會符号化している。この余分のセリン残基は
、遺伝子操作の産物として、遺伝子の第５°端に存在す
る。ＢＧＨ符号化配列の表現は、λファージＰＬプロモ
ータ拳オペレータ會含む調節部位、ｒｎｕバクテリオフ
ァージ由来のシャイン・ダルガルノ（５ｈｉｎｅ　−Ｄ
ａｌｇａｒｎｏ　）部位及びＢＧＨ配列に隣接した（及
び５°）開始コドンによって調節される。このプラスミ
ドは、アンピシリン耐性の遺伝子も筐た持っている。

第１図について説明すると、Δ９（Ｓｅｒ）ＢＧＨ遺伝
子は、ｐＢ）Ｌ３２２（Ｇ、サックリツフエ（Ｇ　、　
５ｕｔｃｌｉｆｆｅ　）　、コールド・スプリング・ハ
ーバ−・シンボジア、１９７８）の誘導体であるプラス
ミドｐＰＬＣ２４（厄匹、１５：８１−９３．１９８１
）上にクローニングされていた。このプラスミド上の点
Ａｆｌ、サックリツフエ（Ｓｕｃｌｉｆｆｅ）配列中の
ヌクレオチド４１８０である。プラスミドｐＢＫ３２２
はこの点Ａから反時計回りに、ｐＢ）４３２２配列のヌ
クレオチド３７５のあるｔ３ａｍＨＩ認識部位まで続く
。点Ａから時計回りに見ると、Ｔｎ９０３からの３０１
塩基対フラグメントがあり、その次に２９１塩基対ＰＬ
プロモータが位置している。ＥｃｏＲＩ制限部位は、こ
のプロモータに％ｌＪボソーム結合部位？与えるｍｕ配
列がら開始ＡＴＧコドンまで分割する。Δ９（Ｓｅｔ）
ＢＧＨ構造部に於て、１０から１９０までのアミノ酸が
後に続いておりＢＧＨの最終アミノ酸であるセリン全符
号化している。ＤＮＡが含まれている。

この部分に続いて、非翻訳ＤＮＡの６５の塩基対と、最
初のクローニングの過程でアニーリングされたホモポリ
マーチイル由米の２３のｄＧ／ｄＣ塩基対、そして最後
には農風ＨＩ認識部位が位置しており、この認識部位に
合成りＮＡが入り込んでいる。

第２図中に示されているプラスミドｐｃＩ８５７に、ｃ
Ｉ８５７温度感受性リプレッサー？符号化すると共にカ
ナマイシン耐性遺伝子？運ぶ多重コピープラスミドであ
る。両方のプラスミドによって形質転換されたＥ、　−
ｃｏｌｉ　ＨＢＩ　０１細胞は、ヨーロッパ特許出願公
開第０　１０３　３９５号に記載されていると同様の方
法で、アンピシリンとカナマイシンの両万會補ったルリ
ア（Ｌｕｒｉａ　）肉汁中で生育させることによって選
択した。

得られた形質転換株？、醗酵話中の水性培地に接種する
。水性醗酵培地は、Ｂ、　ｃｏｌｉの高密度生育葡支え
るのに適当なものであればどんな培地でもよい。この培
地は、細胞生育に必要な炭素源、窒素源、塩類及びその
他の栄養素？含んでいる。

適当な炭素源には、グリセロールと水利グルコ−■ ス（セレロース　として市販されている）が含まれる。

適当な窒素源には、カゼインの酸加水分解物〔ハイカー
ゼ　アミノ酸（ＨｙＣａｓｅ　Ａｒｎ１ｎｏ　Ａｃ１ｄ
ｓ）又はカサミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄｓ　
）として市販されている〕、カゼインの酵素加水分解物
〔エヌゼット・アミ：／Ａ　（ＮＺ　　Ａｒｎ１ｎｅ　
Ａ　）、カサトーｙ　（Ｃａ５ａｔｏｎｅ　）及びトリ
プトン（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ　）　）植物性加水分解蛋白
（大豆ペプトン、加水分解コーングルテン、綿実ペプト
ン）、肉ペプトン及び酵母抽出物が含まれる。上述の炭
素源及び窒素源は、単に既知で市販されているものの冥
例に過ぎない。その他の適当な炭素及び窒素源は、当業
者にはすぐにわかることであろう。培地には、宿主細胞
がプラスミドを保持するのに必要なものであればどんな
成分？加えてもよい。例えば、形質転換株Ｅ、　ｃｏｌ
ｉ　ＨＢ　１０１　（ＰＬ−ｍｕ　−Δ９（Ｓｅｒ）Ｂ
ＧＨとｐｃＩ８５７）ｋ醗酵器中で生育させる時には、
抗生物質のアンピシリンとカナマイシン？添加する。

培地温度孕調節する手段と、培地全攪拌し空気にさらす
手段と、取り込み空気に酸素全添加する手段とを備えて
いれば、当分野で知られているどんな従来型の醗酵用器
機ケ用いてもよい。

醗酵用培地に形質転換株の培養物？接種する。

この培養物は、約３０℃で８〜２４時間（又は培養産物
のＡ３．。即ち５５０ナノメータでの吸光度が４〜１０
になるまで）、例えば２００ｒｐｍ回転の攪拌であらか
じめ培養しておくのが有利であり、また３０°で１５〜
２０時間又はＡ５５゜が４〜６になるまで培養するのが
好ましい。この培養物は例えばルリア（Ｌｕｒｉａ　）
肉汁等のどんな適当な培地に生育させてもよい。醗酵器
に接種する培養物の容量は、醗酵器中の培地容量の１１
５ｏ〜１／２ｏ倍であり、１７２５倍であるのが好まし
い。

本発明の方法では、醗酵は２相で行われる。醗酵培地に
形質転換株ケ接種した後、培地中の溶存酸素濃度會２０
〜６０％飽和に好ましくは約５゜チ飽和に維持して初期
培養ケ行う。この初期培養は、溶存酸素濃度全所望のレ
ベルに維持するのに十分な速度で循環空気ケ供給する一
方、適当な機械的手段で！＠酵培地全攪拌することによ
って達成される。循環空気會１分間につき１容量液体当
り０．８〜１．２容量の好ましくは約１．０容量（Ｓ’
ｉ［’Ｐ）の速度で供給し、培地上８００〜１．２００
　ｒｐｍ。

好ましくは約１．００　Ｏｒ　ｐ　ｍの回転数で攪拌す
るのが適当である。攪拌器は１００ガロンの醗酵培地当
り好ましくは約０．５〜２．０馬力の出力？持つモータ
で作動させる。初期培養期間中の培地の温度は、ｃ１８
５７リブレツサー蛋白が活性である一方Ｅ、　ｃｏｌｔ
の生育が維持され、従って形質転換株中のＢＧＨ表現が
抑制されさえすれば、どんな温度でもよい。初期生育期
の間、温度’ｔ２６〜３０℃に保つのが好ましく、約２
８℃に保つのが最も好ましい。

この初期培養は細胞密度（醗酵器から取り出した培養試
料のＡ５Ｂで測定する）が５０〜６ｏに達するまで続け
られ、通常はそれは醗酵培地に接種してから約２３〜２
５時間後である。この時点で、第２醗酵期である誘導期
が始まる。醗酵培地の温度？最低約４２℃（好ましくは
４２℃）まで上げて約１時間この温度に保つことによっ
てｃＩ８５７リプレツサー蛋白？不活化すると共に形質
転換株中でのＢＧＨの産生會誘引する。その後温度全豹
３８〜４１℃に好１しくに約４０”Ｃに下げる。

この温度でＩ”ｊ、ｃＩ８５７リプレツサー蛋白は不活
性であるが、Ｅ、　ｃｏｌｔの生育にとっては４２℃の
条件よりも好都合である。

誘導期の間、培地中の浴存酸累濃度は約１０〜４０％飽
和に維持される。この溶存酸素濃度？維持する為に、ど
んな適当な通気用及び攪拌用手段ケ用いてもよい。本発
明の好ましい具体例に於ては、循環空気７１分間につき
１容量液体当り０．８〜１．２容量、好ましくは約１．
０答［（ＳＴＰ）の速度で供給し、培地？８００〜１．
２０Ｏｒｐｍ。

好ましくは約１．２０　Ｏｒ　ｐ　ｍで攪拌する。攪拌
器は、１００ガロンの醗酵培地当り好筐しくに約０゜５
〜２．０馬力の出力？持つモーターで作動させる。

誘導期の間は酸素消費率が増加するので、所望の浴存酸
累濃度全維持する為に、循環空気源中に存在する酸素ケ
醗酵器へ補給するのが好ましい。醗素會醗酵培地へ供給
するどんな従来の方法音用いてもかまわない。例えば、
酸累源に継なかっている散布器上直接培地に挟入しても
よいし、又は醗酵器に供給する循環空気に酸素？添加し
てもよい。

細胞密度Ａｌ１５ｏが約８０〜１２０になるまで、好ま
しくは１００〜１２３になるまで、誘導期が継続される
。これらの細胞密度は、通常、誘導期開始後約７〜８時
間で到達する。ＢＧＨ合成と細胞生育が完全であること
を示す醗酵パラメターは（１）酸素要求の顕著な低下、
（２）細胞密度（Ａａｓｏ値）がもうこれ以上増加しな
いレベルに達したこと、及び（３１（ｐ　Ｈ調節の為の
）　ＮａｏＨ利用が停止することである。

細胞培養中に使われてｌｌｉ！ｌ酵培地中から無くなる
栄養素は、当分野で知らｎているいずれかの方法で補給
する。醗酵中栄養素？継続的に添加してもよいし、分割
して添加してもよい。栄養素葡醗酵中の細胞密度Ａ＠　
Ｂ６が３０〜３５に達した時と５０〜６０に達した時と
９０〜１００に達した時の３回に分割して添加するのが
好ましい。栄養素の最初の供給は初期培養中に、通常は
接種後約２３〜２５時間に行われる。第２の栄養素供給
は、誘導期會始める為に温度葡上げるちょうど前、通常
は接種後約２３〜２５時間に行われる。第３の栄養素供
給は、誘導期の間に、通常は接種後約２９時間に行われ
る。

添加する栄養素は選んだ醗酵培地の組成によるが、一般
的に炭素源と窒素源を含む。供給栄養素はおよそ等重量
のＮＺアミンＡとグリセロールとから成っているのが有
利である。最初の２回の供給物の各々は醗酵器中の培地
１１当り総量約４５〜６０ｇの混合栄養素からなり、第
３回目の供給物は培地１１当り総量約２０〜２５ｇの混
合栄養素からなるのが好ましい。我々は、接種後１６時
間に各２５０〜のＮＺアミンＡとグリセロール全１１の
水に溶かしたものに９．４１の醗酵培地に添加すると共
に、接種後２４時間に各２５０１１１９のＮＺアミンＡ
とグリセロールと’ｋｌｌの水に溶がしたもの全醗酵培
地に添加することによって優れた結果を得た。我々はそ
して、接種後２９時間には、各１２５ｇのＮＺアミンＡ
とグリセロールとを１１の水に溶かしたものｋＩ！＠酵
器に添加した。

形質転換株によって産生されたＢＧＨｉ、当分野で知ら
ｎているどんな適当な手段で回収してもよい。細胞全醗
酵培地中から例えば遠心分離によって採取してよい。採
取した細胞は、例えば超音波処理、フレンチプレス（Ｆ
ｒｅｎｃｈｐｒｅｓｓ　）　７ｉ用いたり又はリゾチー
ム等の試薬やトリトン・ニックｘｉ　００　（Ｔｒｉｔ
ｏｎ−Ｘ−１００）等の洗剤？用いた処理で、酵素的・
化学的又は機械的手段で溶解する。ＢＧＨ−ｉ細胞溶解
物から精製するには、アフイニテイクロマトグラフイー
、硫酸アンモニウム等からの塩の溶液からの選択的沈降
、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動又は
これらの方法を組合せた方法のすべて盆含むどんな適当
な蛋白精製法ヶ用いてもよい。

本発明の醗酵法では、高密度醗酵で１１当９３゜６〜５
．９ｇのΔ９　（Ｓｅｒ　）　ＢＧＨｙ生成している。

ＰＬ　−ｍｕ　−Δ９　（Ｓｅｒ　）　Ｂ　Ｇ　Ｈ及び
ｐｃＩ８５７で形質転換したＥ、　ｃｏｌｔ宿主で以前
研究を行った研究者達が小規模培養産物から得られたと
しているラジオイムノアッセイ（ＥＰＯＯ１０３３９５
参照）で測定したΔ９ＢＧＨの生成率６１００ｍ９／ｌ
以下である。本発明の方法？用いて、我々はこの形質転
換株？使ったＢＧＨ産生産生レベル上向上ることに成功
した。

本発明の方法は、以下に続〈実施例により詳しく説明さ
れている。実施例は本発明の方法金より詳しく説明する
為のものであり、本発明の範囲？限定する為のものでは
ない。

実施例　１ ウシ成長ホルモンの高度な微生物的産生の条件 １０％（Ｖ／Ｖ　’）のグリセロール？添加したμ工μ
旦　ＨＢＩ　０１　（Ｐｒ、−ｍｕ−Δ９　（Ｓｅｒ　
）　ＢＧＨとｐｃＩ８５７）Ｍ胞であるＡＴＣＣ５３０
３０の試料を、必要とされるまで一８５℃の液体窒素下
に保存した。

９１の培地全入れた醗酵器に接種する材料ｔ１５００属
容量の遮光フラスコ中の２００ゴのＬＢ培地中に得られ
た細胞ケ含むもの全いくつか作成することによって得た
。使用したＬＢ培地の組成は、１１当９１０ｇのトリプ
トンと５ｇの酵母抽出物と１０．９のＮａ（Ｊ並びに、
１００μｇ／ｍＪのアンピシリンと５０μ９７ｍ１　の
カナマイシンであった。

培地のｐＨは７．０に調節した。これらのフラスコは培
地の通気が行われるように乳汁用口過器栓で口？ふさぐ
一方、フラスコケニュープランスウイツク（Ｎｅｗ　Ｂ
ｒｕｎｓｗｉｃｋ　）振とり話中で３０℃に於て１５〜
２０時間２００ｒｐｍで振とうした（Ａ１１６゜値が４
〜６に達するまで）。

使用した醗酵器は、全容量１６１のニュー・ブランスウ
イツク・ミクロゲンであった。４００ゴの接種材料を入
れた醗酵器に先ず９１の液体培地？充填した。

醗酵培地 最初に加えた９１の培地の組成ケ下記に示す。

グリセロール　　　　　　　　　５５．０（ＮＨ４）１
８０４　　　　　　　　　　５　、６ＫｔＨＰＯ４６，
７ ＮａＨ，ＰＯ４３、３ クエン酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　１．１Ｍ
９８０４．７Ｈ，０７，８ Ｆｅ　ＣＩＢ・６Ｈ，００，０１４ Ｚｎ０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
００１４Ｃｕｅｌ、　　・２　Ｈ，００，０００２８Ｃ
ｏ（ＮＯ３）！　・６Ｈ，００，０００２８（ＮＨ４）
２　ＭＯ０４０，０００２８ＥＤＴＡにナトリウム塩）
　　　　　　　　０．１４培地は１５　ｐｓｉｇ　　水
蒸気圧で殺菌（１２１℃で１５〜２０分間）したと同時
にＮａＯＨでｐＨ１６゜８に調節した。醗酵の期間中必
要に応じてＮａＯＨケ添加することでｐＨ葡維持した。

アンピシリンとカナマイシンとを各々の抗生物質濃度が
２５■／Ｌになるように充分な量だけ培地に加えた。抗
生物質溶液は口過によって滅菌した。

醗酵の期間中、醗酵器に３回栄養素ケ追加供給した。第
１の供給物（Ａｓ５ｏ値が３０〜３５の時点）は１１の
水に溶解した２５０ｇのＮＺアミンＡと２５０ｇのグリ
セロールとからなっていた。この添加操作によって、温
度誘導の前に細胞密度Ａ１１ｆｉｏが５０〜６０に増加
した。細胞密度が５０〜６０の時点で（接種後約２３〜
２５時間に）、醗酵器に再度２５０ｇのＮＺアミンＡと
２５０ｇのグリセロールとｒ加え、温度ｔ１時間４２℃
に保つことによってＢ　Ｇ　Ｈの合成？誘導した。Ａｓ
　Ｈ値が９０−１００の時点で、栄養素が残りの誘導期
の間利用されるように、１２５ｇのＮＺアミンＡと１２
５９のグリセロールと會最後に添加した。

醗酵の期間中、溶存酸素（ＤＯ）濃度ｒ１ストリップレ
コーダに接続した直流電流用探り針で常に測定した。導
入空気會酸素で強化することによって、ＤＯ’ｋｌＯ〜
４０％飽和（１−４ｐｐｍ）に誘導期の間維持した。酸
素調節器ヶ備えたガスタンク？使って導入空気中への酸
素の流入會調節した。ガス欠混合した後、酸素強化空気
會口遇してから散布器ヶ通して醗酵器へ入れる。

醗酵器操作 最良の結果が得られる操作条件？この節に記載している
。

１、期間：０〜２４時間 ａ、培地温度；２８°Ｃ ｂ、攪拌速度：１．ｏｏｏａｐＭ Ｃ１攪拌器によるエネルギー人カニ １００ガロン当り１．０〜２．０馬力 ｄ０通気率：１分間当りｌ０Ｌ（ＳＴＰ）ｈ、　２４時
間後に醗酵器から得た培養試料の５５０ｎｍ波長での吸
光度は５０〜６０であった。

２、期間２２４〜３２時間 ａ、培地温度 （１）接種後２４〜２５時間目（１時間）は４２℃（２
）接種後２５〜３２時間目（７時間）は４０℃ｂ、攪拌
速度：１．２０ＯＲＰＭ Ｃ０攪拌器によるエネルギ人カニ １００ガロン当り１．０〜２．０馬力 ｄ１通気率：１分間当りｌ０Ｌ（ＳＴＰ）ｅ、逆圧：　
１　ｉｎ”当り３〜６Ｉｂ８ｆ、溶存酸素：１０〜４０
％飽和 これらの値葡得る為に、導入空気に酸素を強化して混合
してから、混合ガスを散布器を通して醗酵器へ導入した
。

ｇ、最終吸光度：ＡＳ５ｏ値が９９〜１２３ｈ、　　（
栄養素の）追加供給全２４時間後と２９時間後に行った
。

結果 ＲＰＣ分析の為に、醗酵話中の肉汁試料全遠心分離（１
０〜１５．ＯＯＯｘｇ　、１５分）によって採集してか
ら細菌？３〜５容量の緩衝性グアニジン（８Ｍの塩酸グ
アニジン、５０ｍＭのグリシン水酸化す）　ＩＪウム（
ｐ　Ｈ９，８）及び５ｍＭの還元グルタチオン）中に再
懸濁した。得られた懸濁液全２０〜３０分間放置Ｌ７１
＆、５ＤＴ−１８１０型Ｔ６Ｋ　−Ｍａｒ組織ミキサー
で１５〜２０秒間ホモゲナイズした。不溶性細胞破片？
上記と同様に遠心分離で取り除いた後、清澄なりＧＨ抽
出物１ＨＰＬＣでアッセイした。

上記の過程？実際に３回行った結果が下記の如くであっ
た。

？用いた ５２　　　　５　　　　　　　　１１２　　　　５Ｘ１
０　　　　　３．７３５３　　　　３　　　　　　　　
　９９　　　　５Ｘ１０　　　　　３．６１１細胞当り
７　Ｘ　１０’分子のＢＧＨの表現レベル

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法で用いることのできるＢＧＨ表
現ベクターである、プラスミドＰＬ　−ｍｕ−△９　（
Ｓｅｒ　）　ＢＧＨの顕著な特色を表わす説明図、第２
図は、本発明の方法でＢＧＨ産生産生ケチ節のに使用さ
れる温度感受性リプレッサを記号化している、プラスミ
ドｐｃ　ｌ８５７の顕著な特色葡表わす説明図である。 特許　出　願人　　　インターナショナル・ミネラルズ
・アンドΦケミカル・コーボレイション 代理人　弁理士　　　　１）　澤　　博　　昭（外２名
） Ｆｉｇ、　ｌ Ｆｉｇ、２ １Ｐ１５Ａ） 手続補正書（自発）

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）λファージプロモーターオペレーターの調節下に
   ウシ成長ホルモンの表現を指示する表現ベクターと温度
   感受性リプレッサー蛋白λｃＩ８５７の表現を指示する
   表現ベクターとを含む形質転換￥Ｅ．Ｃｏｌｉ￥株を水
   性醗酵培地に接種し、醗酵培地中の形質転換株を培地中
   に溶存する酸素濃度を２０〜６％飽和に培地の温度を約
   ２６〜３０℃に維持した条件下で初期培養し、醗酵培地
   の温度を最低約４２℃まであげて温度感受性リプレッサ
   ー蛋白を不活化することによつて誘導期を引き起こしこ
   の間ウシ成長ホルモンを産生させ、温度を３８〜４１℃
   まで下げて培地中の溶存酸素濃度を１０〜４０％飽和に
   維持した状態で誘導期の残りの期間形質転換株の培養を
   続け、形質転換細胞からウシ成長ホルモンを回収するこ
   とからなる、ウシ成長ホルモンを産生する方法。
2. （２）初期培養期の間温度を約２８℃に維持する特許請
   求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）リプレッサー蛋白の不活化に引き続き温度を約４
   ０℃に低下させてから誘導期の残りの期間中４０℃に維
   持する特許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）初期培養期間中培地中の溶存酸素の濃度を約５０
   ％飽和に維持する特許請求の範囲第１項記載の方法。
5. （５）初期培養期が約２３時間から約２５時間にわたる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）初期培養期が約２４時間である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。
7. （７）誘導期が約７〜８時間の期間である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
8. （８）温度を最低約４２℃まで上げて醗酵培地中の細胞
   密度Ａ＿５＿５＿０が５０〜６０まで達するウシ成長ホ
   ルモンの産生を誘起する特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
9. （９）第９番目のＮ末アミノ酸まで欠失しており１つの
   セリン残基をＮ−末端に有するウシ成長ホルモンの生物
   学的活性フラグメントを形質転換株が生成する特許請求
   の範囲第１項記載の方法。
10. （１０）形質転換株が￥Ｅ．￥￥Ｃｏｌｉ￥ＨＢ１０１
    （Ｐ＿Ｌ−ｍｕ−Δ９（Ｓｅｒ）ＢＧＨとｐｃＩ８５７
    ）即ちＡＴＣＣ５３０３０である特許請求の範囲第１項
    記載の方法。
11. （１１）接種後約１６、２４並び２９時間に栄養素を分
    割して醗酵培地に供給する特許請求の範囲第１項記載の
    方法。
12. （１２）接種後１６並び２４時間に醗酵培地１ｌ当り約
    ４５〜６０グラムの栄養素を培地に加え、接種後約２９
    時間に醗酵培地１ｌ当り２０〜２５グラムの栄養素を培
    地に加えると共に、当該栄養素が約等重量のグリセロー
    ルと酵素的カゼイン加水分解産物よりなる特許請求の範
    囲第１１項記載の方法。
13. （１３）醗酵物中の細胞密度Ａ＿５＿５＿０が３０〜３
    ５に達した時に栄養素の第一分割醗酵培地に添加し、細
    胞密度Ａ＿５＿５＿０が５０〜６０に達した時に栄養素
    の第２分割を添加し、細胞密度Ａ＿５＿５＿０が９０〜
    １００に達した時に栄養素の第３分割を添加する特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
14. （１４）各栄養素分割が約等重量の酵素的カゼイン加水
    分解産物とグリセロールとからなる特許請求の範囲第１
    ３項記載の方法。
15. （１５）１ｌの醗酵培地に対して第１及び第２の栄養素
    を約４５〜６０グラムと第３の栄養素分割を２０〜２５
    グラム添加する特許請求の範囲第１４項記載の方法。
16. （１６）初期培養期の間、１分間につき１容量液体当り
    ０．８〜１．２容量（ＳＴＰ）の速度で循環する空気を
    供給し、醗酵培地を１００ガロンの醗酵培地当り約０．
    ５〜２．０馬力の出力を有する攪拌器で約１，０００ｒ
    ｐｍの回転数で機械的に攪拌することによつて溶存酸素
    濃度を維持する特許請求の範囲第１項記載の方法。
17. （１７）循環する空気を、１分間につき１容量の液体当
    り約１．０容量の速度で供給する特許請求の範囲第１６
    項記載の方法。
18. （１８）当該誘導期の間の溶解酸素濃度を、醗酵物中に
    供給する空気に酸素を添加することによつて１０〜４０
    ％飽和に維持する特許請求の範囲第１項記載の方法。
19. （１９）誘導期の間、１分間につき１容量液体当り約０
    ．８〜１．２容量の速度で酸素混合循環空気を醗酵物に
    供給し、醗酵培地を１００ガロンの醗酵培地当り約０．
    ５〜２．０馬力の出力を有する攪拌器で約１，２００ｒ
    ｐｍの回転数で機械的に攪拌することによつて溶解酸素
    濃度を維持する特許請求の範囲第１８項記載の方法。
20. （２０）循環する空気を、１分間につき１容量当り約１
    ．０容量の速度で醗酵物に供給する特許請求の範囲第１
    ９項記載の方法。